Krooninen sairaus

tiivistelmä

kardiotonisiin steroideja käytetään sydämen vajaatoiminnan hoitoon ja rytmihäiriöt ja lupaavia syöpää ehkäisevistä vaikutuksista. Prototyyppinä kardiotonisia steroidi ouabain voi myös olla hormoni, joka säätelee epiteelisolujen adheesiota. Kardiotonisiin steroidit koostuvat steroidiydin ja laktonirengas, ja niiden biologiset vaikutukset riippuvat sitoutumisen niiden reseptoriin, Na, K-ATPaasi, jonka kautta, ne estävät Na

+ ja K

+ ionikuljetus ja aktivoi useiden solunsisäisten signalointireittien. Tässä tutkimuksessa lisäsimme styreenin ryhmän laktonirenkaan on kardiotonista steroidi digoksiinin, jolloin saadaan 21-bentsylideeni digoksiinia (21-BD), ja tutkittiin vaikutuksia tämän synteettisen kardiotonisiin steroidi eri solumalleissa. Molekyylimallinnus osoittaa, että 21-BD sitoutuu kohteeseensa Na, K-ATPaasi heikolla affiniteetilla hyväksyen eri lääkeopillisiin konformaatio sitoutuneena reseptoriinsa kuin digoksiini. Niinpä 21-DB, suhteellisen korkea uM määriä inhiboi Na, K-ATPaasi α

1, mutta ei α

2 ja α

3-isoformeja. Lisäksi 21-BD tavoitteet muiden proteiinien ulkopuolella Na, K-ATPaasi, estämällä usealle viejä Pdr5p. Kun käytetään kokonaisia ​​soluja alhaisissa uM pitoisuuksina, 21-BD tuottaa useita vaikutuksia, kuten: 1) ylössäätöä Na, K-ATPaasi ilmentymisen ja aktiivisuuden HeLa ja RKO syöpäsolujen, jota ei löytynyt digoksiini, 2) solujen erityisiä muutoksia solujen elinkelpoisuutta, sen pienentäminen HeLa ja RKO syöpäsoluja, mutta yhä se normaaleissa epiteelin MDCK-soluissa, joka on erilainen kuin vastaus digoksiinin, ja 3) muutokset solu-solu vuorovaikutus, muuttamalla molekyyli- koostumus tiiviiden liitosten ja ylentävä epiteelin sähkövastus MDCK yksikerroksia, vaikutusta aiemmin löytynyt ouabainia. Nämä tulokset osoittavat, että muutos laktonirenkaan digoksiinin tarjoaa uusia ominaisuuksia yhdiste, ja osoittaa, että rakennemuutoksen käyttöön voitaisiin käyttää suunniteltaessa kardiotonisiin steroidi uusia toimintoja.

Citation: Rocha SC, Pessoa MTC, Neves LDR, Alves SLG, Silva LM, Santos HL, et al. (2014) 21-bentsylideeni Digoksiini A proapoptoottiset Cardenolide syöpäsolut Up-regulation Na, K-ATPaasi ja epiteelikasvaimet tiiviiden liitosten. PLoS ONE 9 (10): e108776. doi: 10,1371 /journal.pone.0108776

Editor: Shree Ram Singh, National Cancer Institute, Yhdysvallat

vastaanotettu 7 huhtikuuta, 2014; Hyväksytty: 25 elokuu 2014; Julkaistu: 07 lokakuu 2014

Copyright: © 2014 Rocha et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Tällä kirjoittajat vahvistavat, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi- ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat FAPEMIG (Fundação de Amparo Pesquisa do Estado de Minas Gerais) APQ-01114-12, APQ-02596-12 , CNPq (Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico) 472394 /2012-6 ja NIH DK081431. Kirjoittajat ovat kiitollisia taloudellista ja rakenteellista tukea tarjoamia yliopiston São Paulo kautta NAP-CatSinQ (Research Core in Catalysis ja kemiallinen synteesi). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

kardiotonisiin steroidit ovat yhteisiä aineita kasvikunnan, jotka antavat kilpailuetua vastaan ​​autioittaminen, joko kasvi, joka syntetisoi ne, tai eläimiä, jotka kertyy niitä ruokavaliosta [1]. Kokeellista näyttöä siitä, että eläimet voivat endogeenisesti koota sydämen steroideja ja että kyseiset aineet on tärkeä rooli verenpaineen säätelyyn, solujen lisääntymisen ja solukuoleman [2], [3]. Perusrakenne kardiotonisia steroideja koostuu steroidi rungon, jossa on cis /trans /cis-konfiguraatio, ja laktoniryhmä asemassa 17β, joka tunnetaan myös nimellä aglykoni. Lisäksi näillä yhdisteillä on usein sokerin kiinnitetty asemassa 3β steroidaalisen ytimen, jota varten ne on yleisesti tunnettu sydänglykosidit. Luonne laktonirenkaan erottaa cardenolides, että tyydyttämättömien butyrolactone rengas, alkaen bufadienolides, joka esittää α-pyrone rengas. Ainoa rakenteellinen ero kahden tärkeimmän cardenolides, joita käytetään terapeuttisesti, digoksiini ja digitoksiini, on yksi ylimääräinen hydroksyyliryhmä (-OH) on digoksiini, joka merkittävästi muuttaa sen farmakokinetiikkaa. Digitoksiini, on enemmän lipofiilinen, osoittaa vahvaa sitoutumista muihin plasman proteiineihin, on lähes kokonaan metaboloituu maksassa ja osoittaa hyvin pitkä puoliintumisaika. Sen sijaan, digoksiinin näyttää heikko sitoutuminen plasman proteiineihin, ei metaboloidu ja erittyy ensisijaisesti muuttumattomana muodossa munuaisten [2], [3].

pääasiallinen farmakologinen vaikutus terapeuttisten annosten digoksiinin ja digitoksiini on niiden positiivinen inotrooppinen vaikutus. Tämä välittyy inhibition sydänlihaksen solun Na, K-ATPaasin, mikä johtaa lisääntymiseen sytosolin tasoilla Na

+ ja toissijaisesti Ca

2+, pienenemisen vuoksi kuljetukseen Na

+ riippuvainen Na

+ /Ca

2+ lämmönvaihdin. Lisääntynyt Ca

2+ sydänlihassolulevy sytosolin johtaa edelleen täytön sarkoplasmakalvostosta Ca

2 +, joka on helposti saatavilla julkaisunsa stimuloitaessa tuottamiseksi tehostetun lihasten supistumisen [3] – [5 ].

yhteydessä solubiologian, on kaksi aluetta, joilla sydämen steroidit ovat hyödyllisiä kohteita: syöpä ja soluadheesion. Molemmat ilmiöt liittyvät läheisesti toisiinsa, kuten menetys soluadheesion joka tapahtuu aikana syövän leviämisen ja etäpesäkkeiden. Vaikutus sydämen steroidien soluadheesiota ymmärretään huonosti ja on kiivasta tutkimusta [6] – [8]. 1960-luvulta lähtien, useita mielenkiintoisia antituumorivaikutukset on havaittu digitalis [9], [10], samoin kuin muut cardenolides [11] – [15] ja siihen liittyvät sydänglykosidien, The bufadienolides [16] – [19].

Ihmisen syöpä on pääasiassa vaikuttaa epithelia [20], jotka solut ovat erittäin polarisoitunut ja sidottu toisiinsa junktionaalinen komplekseja, kuten tiukka liittymissä (TJS). Tämä viimeinen rakenne antaa epithelia kykyään toimia tehokkaasti esteet erottaminen biologisesta osastojen [21]. Menetys TJs osallistuu syövän etenemisen ja etäpesäkkeiden [6], [22], esimerkiksi lasku ilmentymisen tiiviin liitoksen proteiini klaudiini (Cldn) -7, on mukana levittämistä rintasyövän solujen [23] . Lisäksi on tärkeää Na, K-ATPaasi muodostumista liitoskohtien kompleksien on vakiintunut [24], [25], kuten on vaatimus solu-solu-kontaktien varten polarisoitunut ilmentymisen Na, K-ATP-aasin sivusuunnassa solukalvon epiteelisolujen [26]. Mielenkiintoista on, että β

1 alayksikön Na, K-ATPaasi itse toimii adheesiomolekyyli astrosyyteissä [27] ja epiteelissä [28] – [31].

pieneneminen ilmentyminen solun pinnalla β

1 alayksikköä on liittynyt epiteelin-to-mesenkymaalitransitioon, prosessi mukana kasvaimen invasiivisuus ja etäpesäkkeiden [25], [32]. Käsittely useita erilaisia ​​sydämen steroidien aiheuttaa erilaisia ​​vaikutuksia soluliitos. Suuria pitoisuuksia ouabainia (≥300 nM) ja muut sydämen steroidit häiritä tiukka, adherens ja kommunikoi liittymät sekä desmosomeja epiteelisolujen [24], [33], [34]. Päinvastoin, pieninä pitoisuuksina ouabainia (10 nM) lisäävät sinetöinti TJs [35], nopeuttaa solujen päin (määritettynä perusterveydenhuollon kehittämistä värekarvojen [36]) ja lisätä solujen viestinnän viestintä liittymissä [30].

Vaikka tutkimuksia biologisista vaikutuksista saatavilla sydämen steroidien kasvainsoluihin kehittyvät nopeasti, tämä ei päde juuri syntetisoidun kardiotonisiin steroideja. Jotkin synteettiset kardiotonisiin steroideja on testattu niiden syövän vastaista aktiivisuutta [17], [37] – [44]. Oleandrin ja 9-hydroksi-2 ”oxovoruscharin, joka on hemisynteettiseen cardenolide, on alle kliinisissä tutkimuksissa on todettu syövän vastaista aktiivisuutta sekä

vitro

ja

vivo

, vuonna moniresistenssi syöpäsoluissa kulttuureissa [15], [43], [44]. Muut tutkimukset osoittivat, että useita muutoksia sokerin osan digoksiinin ja digitoksiinin, voi lisätä syövänvastainen vaikutus näiden yhdisteiden [45] – [48].

Useat kirjoittajat ovat kuvanneet synteesin digoksiinin johdannaiset, joissa lisäksi styreenin ryhmien laktonirenkaan ryhmä tuottanut joitakin mielenkiintoisia biologinen aktiivisuus [49], [50]. On kuitenkin olemassa vielä ole raportoitu koskee syövän vastaista aktiivisuutta tai näiden vaikutukset digoksiinin johdannaisten Na, K-ATPaasi aktiivisuutta.

Tämän työn tavoitteena oli tutkia biologisten vaikutusten 21-bentsylideeni digoksiini (21 -BD), joka on digoksiinin johdannainen ylimääräinen styreenin ryhmä C21 hiilen laktonirenkaan, syövän ja normaaleissa soluissa.

Materiaalit ja menetelmät

Yleinen menettely synteesiin 21- bentsylideeni digoksiini

Bentsaldehydiä (0,18 ml, 1,8 mmol), digoksiinin (0,469 g, 0,6 mmol), vedetöntä K

2CO

3 (0,249 g, 1,8 mmol) ja 60 ml metanolia, lisättiin pyöreään pulloon. Kun oli sekoitettu 6 tuntia 70 ° C: ssa, liuotin haihdutettiin pyöröhaihduttimessa. Raaka tuote laimennettiin 20 ml: lla vettä ja uutettiin kuumalla etyyliasetaatilla (3 x 30 ml). Orgaaninen kerros pestiin suolaliuoksella, kuivattiin vedettömällä Na

2SO

4 ja väkevöitiin tyhjössä. Raaka tuote puhdistettiin sitten kautta silikageelipylväskromatografisesti (CH

2CI

2 /MeOH 11:01). Puhdistuksen jälkeen puhdas tuote laimennettiin tetrahidrofurano (THF), saostettiin heksaanilla ja konsentroitiin alennetussa paineessa, jolloin saatiin 21-BD (0,325 g, 0,37 mmol, 62%) valkoisena kiinteänä aineena.

Soluviljelmä

HeLa (ihmisen kohdunkaulan karsinooma, ATCC CCL2) ja RKO-AS45-1 (paksusuolen karsinooma; ATCC CRL-2579) viljeltiin RPMI tai DMEM /HAM F-10 (01:01) väliaineessa (Sigma , St. Louis, MO, USA). CHO-K1 (ATCC CCL61) ja MDCK-II-soluja (koiran munuaisten, ATCC CCL-34) kasvatettiin DMEM: ssä. Kaikki alustat täydennettiin 10% naudan sikiön seerumia (FBS; Hyclone) (CDMEM), 60 mg /ml streptomysiiniä ja 100 mg /ml penisilliiniä. Solut ympättiin tiheydellä 5 x 10

5 solua /cm

2 ja inkuboitiin kosteutetussa ilmakehässä 5% CO

2. Elatusaine vaihdettiin joka 48. h, jotta vältetään ravinteiden ehtyminen.

Hyönteisten soluviljelmässä ja virusinfektiot

Sf-9-hyönteissoluissa kasvatettiin Gracen alustaa, jossa 3,3 g /l laktalbumiinihydrolysaattia, 3,3 g /l yeastolate, ja johon oli lisätty 10% (v /v) naudan sikiön seerumia, 100 yksikköä /ml penisilliiniä, 100 ug /ml streptomysiiniä ja 0,25 ug /ml Fungizonea. Soluja kasvatettiin suspensiossa kulttuureissa, ja siirrettiin 150 mm kudosviljelylevyillä ennen infektiota. Infektiot suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [51]. 72 tunnin jälkeen 27 ° C: ssa, solut raaputettiin viljelymaljoilta, sentrifugoitiin 1500 x

g

10 minuuttia ja suspendoitiin 10 mM imidatsoli-hydrokloridia (pH 7,5) ja 1 mM EGTA: ta. Solut homogenisoitiin jäillä käyttämällä Potter-Elvehjem-homogenisaattoria, ja lysaattia sentrifugoitiin 10 minuutin ajan 1000 x

g

. Supernatantti poistettiin, sentrifugoitiin vielä 10 min ajan 12000 x

g

, ja lopullinen pelletti suspendoitiin 250 mM sakkaroosi, 0,1 mM EGTA: ta, ja 25 mM imidatsoli pH 7,4.

Sytotoksisuusmääritvs

yhdiste sytotoksisuus vaikutus arvioitiin käyttäen MTT (3- (4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -2,5-difenyylitetratsoliumbromidi) tetratsoliumsuolaa kolorimetrisellä menetelmällä (Sigma, St. Louis , MO, USA). Lyhyesti, solut maljattiin 96-kuoppalevyille (1 x 10

5 solua /kuoppa) ja inkuboitiin 24 h 37 ° C: ssa konfluenssiin. Sitten kuopat pestiin viljelyalustalla ja digoksiinin tai 21-BD lisättiin eri pitoisuuksina (0,05-500 uM). Kun oli inkuboitu 24 tai 48 tuntia, levyt käsiteltiin MTT. Lukemat suoritettiin Spectramax M5e mikrolevynlukijaa (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA) 550 nm: ssä. Sytotoksisuus pisteytettiin prosenttiosuutena vähentäminen absorbanssi suhteessa käsittelemätön kontrolli viljelmissä [52]. Kaikki kokeet suoritettiin kolmena rinnakkaisena. Tulokset ilmaistiin keskiarvona LC

50 (lääkkeen konsentraatio, joka vähensi solujen elinkelpoisuuden 50%).

Apoptosis Assay

Comet määrityksessä.

yksisoluiset geelielektroforeesilla määritys (comet) suoritettiin aikaisemmin julkaistujen menetelmien [53], [54]. Tätä varten CHO-K1-soluja käsiteltiin 20, 35 tai 50 uM digoksiinin tai 21-DB, jotka ovat pitoisuuksia, jotka eivät vaikuta solujen elinkelpoisuuteen mukainen MTT-määritystä. Solut ympättiin 24-kuoppaisille levyille. Seuraavana päivänä solut pestiin kahdesti PBS: llä, ja inkuboitiin 3 h, kun vastaavia yhdisteitä elatusaineissa ilman seerumia. Negatiivisen ja positiivisen kontrollin ryhmät käsiteltiin PBS: llä, ja metyyli-metaanisulfonaatti (400 uM), vastaavasti. 24 tunnin kuluttua solut pestiin kahdesti PBS: llä ja irrotettiin käyttäen trypsiini-EDTA-liuosta. Trypsiini inaktivoitiin 3,0 ml täydellistä alustaa, jota seurasi sentrifugointi (5 min, 150 x

g

). Sitten pelletti suspendoitiin uudelleen 500 ul: aan PBS: ää, ja 30 ul: n solun suspensioita sekoitettiin 70 ui matalan sulamispisteen agaroosia (0,5%). Nämä seokset asetettiin objektilaseille esipäällystetty normaalin sulamispisteen agaroosia (1,5%) ja peitetään peitinlasit. Peitinlasit poistettiin viiden minuutin kuluttua, ja kalvot upotettiin yöksi lyysiliuosta (NaCl 2,5 M, EDTA 100 mM, Tris 10 mM, pH 10, Triton X-100 1% ja DMSO: 10%). Seuraavaksi levyjä pestiin PBS: llä ja pidettiin 40 minuutin ajan vaakasuorassa elektroforeesi laatikko täytetään kylmällä emäksistä puskuria (EDTA 1 mM, NaOH 300 mM, pH 13). Elektroforeesi suoritettiin 0,86 V /cm ja 300 mA (20 minuuttia) ja objektilasit neutraloidaan myöhemmin (0,4 M de Tris, pH 7,5), kiinnitettiin metanolilla ja värjättiin etidiumbromidilla. Visual analyysit suoritettiin alla fluoresenssi [55], [56].

fosfatidyyliseriinin translokaation.

HeLa-solut maljattiin 60 mm petrimaljoille klo yhtymäkohdassa ja inkuboitiin yön yli CDMEM. Ne käsiteltiin sitten 2 uM digoksiinin tai 50 uM 21-BD CDMEM 6, 12 tai 24 h. Inkuboinnin jälkeen keskeytettiin solut talteen kasvatusalustasta sentrifugoimalla 150 x

g

, 20 ° C: ssa 5 minuutin ajan. Kiinnittyneitä soluja saatiin lievä proteaasikäsittely 1 ml Accutasella plus 3 ml PBS), sentrifugoitiin, kuten edellä on esitetty, ja lisättiin soluille saatu media. Anneksiini-V sidottu ulompi seloste solukalvon mitattiin comercial kit (anneksiini-V-Fluos Stainig kit, Roche, Saksa) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Lyhyesti, solususpensiota inkuboitiin seoksen kanssa, jossa anneksiini-F-FITC ja propidiumjodidilla suolaliuoksessa puskurissa 15 minuutin ajan. Solususpensio analysoitiin virtaussytometrialla (FACSCalibur-virtaussytometrillä, Fow Jo ohjelmisto).

Epiteelinläpäisevää sähkövastus (TER) B

MDCK-soluja viljeltiin Transwell läpäisevä tukien (3415, Corning Inc., NY, USA) epiteelin sähkövastus mitattiin EVOM ja EndOhm-6-järjestelmä (World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA). Lopullinen arvot saatiin vähentämällä vastus haudeliuoksessa ja tyhjä insertin. Tulokset ilmaistaan ​​ohmia · cm

2 (Ω · cm

2) prosentteina kontrolliin.

Immunofluoresenssikoe

Kun TER mittauksia, MDCK monokerrokset pestiin kolme kertaa jääkylmällä PBS /Ca

2+, kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä 30 min ajan 4 ° C: ssa, läpäiseviksi 0,1% Triton X-100: ssa 5 minuutin ajan, blokattiin 30 minuutin ajan 3% BSA: ta ja käsiteltiin 1 h 37 ° C: ssa tietyn primaarisen vasta-aineen. Yksisolukerrokset huuhdeltiin sitten 3 kertaa PBS /Ca

2+, inkuboitiin sopivan FITC tai vanhuspalvelut-leimattujen vasta-aineiden 30 minuuttia huoneen lämpötilassa ja huuhdottiin edellä kuvatulla tavalla. Suodattimet solut irrotettiin veitsellä ja asennettu Vectashield (Vector Labs, Burlingame, CA, USA). Valmisteet tutkittiin Leica konfokaali SP5 mikroskooppi (Leica Microsystems, Wetzlar, Saksa). Otetut kuvat tuotiin FIDŽIN, versio 2.8 (National Institutes of Health, Baltimore, USA), jotta saataisiin mahdollisimman ennusteisiin ja osaksi GNU-kuvankäsittelyohjelma (GIMP) normalisoida kirkkautta ja kontrastia kaikki kuvat ja rakentaa lukuja.

immunoblottauksella

Western blot-analyysi kokosolu-uutteissa suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [57]. Lyhyesti, MDCK ja HeLa-solut pestiin PBS: llä ja liukoiseksi radioimmunosaostuskokeella (RIPA) puskuria [10 mM piperatsiini-

N

,

N ’

bis (2-etaanisulfonihappo), pH 7,4, 150 mM NaCl, 2 mM etyleenidiamiini-tetraetikkahappoa (EDTA), 1% Triton X-100, 0,5% natrium- deoxicholate, ja 10% glyserolia], joka sisälsi proteaasi-inhibiittoreita (Complete Mini, Roche Diagnostics, Indianapolis, IN). Proteiinipitoisuus solulysaatin mitattiin (BCA-proteiinimääritysreagenssilla, Pierce Chemical, Rockford, IL) ja valmistettiin SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesilla (PAGE) keittämällä näytepuskurissa. Erotetut proteiinit electrotransfered on polyvinylideenidifluoridimembraanille kalvo (Hybond-P, GE Healthcare, Little Chalfont, Buckinghamshire, Yhdistynyt kuningaskunta). Proteiinit kohteisiin Sitten havaittiin kanssa polyklonaalisia tai monoklonaalisia vasta-aineita erikseen ilmoitetaan, jonka jälkeen laji sopivia peroksidaasikonjugoidun vasta-aineita (Zymed Laboratories, South San Francisco, CA) ja kemiluminesenssiosoitusta (ECL PLUS, GE Healthcare).

Detection of Na, K-ATPaasi ja klaudiini ilmaisun kautta reaaliaikainen kvantitatiivinen RT-PCR

reaaliaikainen kvantitatiivinen RT-PCR (RT-qPCR), uutettiin kokonais-RNA solusta näytteitä TRIzolia (Life technologies, USA). Keskittymä arvioitiin kautta spektrofotometrisesti kanssa Nanodrop ND2000 (Thermo Scientific, USA). Kaikki käänteistranskriptaasi-reaktiot suoritettiin käyttäen 5 ug RNA: ta Superscript III (Invitrogen, USA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Kaikki RNA-näytteet käänteistranskriptio samanaikaisesti minimoida muun variaatio liittyy käänteistranskriptioreaktio. Reaaliaikainen kvantitatiivinen PCR suoritettiin ABI Prism 7500 nopeana sarjana tunnistusjärjestelmä (Applied Biosystems) käyttäen Go Taq qPCR Master Mix (Promega, USA). Seuraavat alukkeet ja pitoisuudet tuotto (Murphy et al, 2004): Na, K-ATPaasi α

1 alayksikköä (GenBank NM_000701): Fw (300 nM): 5′-TGTCCAGAATTGCAGGTCTTTG-3, Rv (300 nM ): 5′-TGCCCGCTTAAGAATAGGTAGGT-3 ’; Na, K-ATPaasi β

1 alayksikköä (GenBank NM_001677): Fw (300 nM): 5′-ACC AAT CTT ACC ATG GAC ACT GAA-3 ’, Rv (300 nM): 5’-CGG TCT TTC TCA CTG TAC CCA AT-3 ’; Cldn-2 Fw GGTGGGCATGAGATGCACT, Rv CACCACCGCCAGTCTGTCTT; Cldn-4 Fw TGCACCAACTGCGTGGAGGATGAG, Rv ACCACCAGCGGGTTGTAGAAGTCC. Kohdistetun PCR-olosuhteet olivat seuraavat: 50 ° C 2 minuuttia, jota seurasi 40 sykliä 95 ° C 15 sekuntia ja 60 ° C 1 min. Kukin näistä alukesarjoista syntyy ainutlaatuinen PCR-tuotteen, joka on vahvistettu saatu sulamisen käyriä. PCR-määritykset suoritettiin kolmena kappaleena, ja tiedot yhdistettiin. Suhteellinen kvantitatiivinen mittaus kohdegeenin tasojen suoritettiin käyttäen ΔΔCt menetelmää Livak et al. [58]. Endogeenisen siivous ohjaus geenejä, käytimme glyseraldehydi 3-fosfaattidehydrogenaasi (GAPDH, GenBank NM_002046) ja ribosomaalisen 18S-alayksikön geenit (GenBank NR_003286) [59]. Seuraavia alukkeita ja pitoisuudet käytettiin: GAPDH Fw (300 nM): 5’-ATGTTCGTCATGGGTGTGAA-3 ’, GAPDH Rv (300 nM): 5′-GGTGCTAAGCAGTTGGTGGT-3′, 18S Fw (300 nM): 5’-CAGCCACCCGAGATTGAGCA- 3 ’, 18S Rv (300 nM): 5′-TAGTAGCGACGGGCGGTGTG-3’.

Molekyylimallinnus analyysit

Aluksi, digoksiini, ouabaiini ja 21-BD (kuvio 1A) ja tehtiin puhdistettu kautta puoliempiirisiä PM6 menetelmä [60] toteutetaan Gaussian 09 W ohjelmistojen [61]. Kiteen rakenne Na, K-ATPaasi (kohdeproteiinin) kompleksoitu ouabainia saatiin Protein Data Bank (PDB ID: 4HYT [62], jossa on 3,40 Å resoluutio, käyttäen α

1 alayksikköä Na, K- ATPaasi). Magnesium- ioni ja kolme interstitiaalinen vesimolekyylien pidettiin sitoutumiskohtaan. Seuraavaksi jäykkä uudelleen laituriin ouabainia suoritettiin vahvistamaan järjestelmäämme. Myöhemmin digoksiini ja 21-BD telakoitiin vastaan ​​ATPaasi. Telakka-analyysit suoritettiin käyttäen AUTODOCK Vina 1.0.2 [63]. Levitetty hakualgoritmi oli Iteroidut Local Search Global Optimizer globaalin optimoinnin. Tässä prosessissa peräkkäin vaiheet mutaation kanssa ja paikallisten optimointi (jäljempänä Broyden-Fletcher-Goldfarb-Shanno [BFGS] menetelmä) tehtiin, ja kukin vaihe seuraa Metropolis- kriteeri [64]. Tässä tutkimuksessa, verkolla laatikko rakennettiin tutkia kaikki aktiiviset kohdat, jotka määriteltiin kuution geometrisen keskustan ouabainia, jonka mitat ovat 20 x 20 x 24 Å, erillään olevia 1 Å ja X, Y ja Z koordinaatit -27,065, 20,469 ja -69,469, vastaavasti. Kaikki molekyylimallinnusta luvut rakennettiin käyttäen DS näyttölaitetta 3.1 [65].

(A) kemiallinen rakenne ouabainia, digoksiinin, ja 21-BD. (B) Vasen: koko rakenne Na, K-ATPaasi (ATE: 4HYT) osoitti kiinteässä nauha edustus, jossa alfa-helix, beeta-levyt ja käännökset ovat punainen, sininen ja harmaa, vastaavasti; oikea: kohokohta sitoutumispaikan ouabainia esitetty putkeen edustus. Katko- punaiset viivat osoittavat vetysidoksia. Vain polaarinen vetyatomit osoitti parempaa visualisointia. Lääkeopillisiin konformaation, (C) digoksiini ja (D) 21-BD; polaarisia ja ei-polaarisia vuorovaikutuksia kuvattu magenta ja vihreä väri, vastaavasti. Katkoviivat osoittavat vetysidoksia. Jäännös vuorovaikutukset värikoodattu esitettyjä asetettu mittakaavassa.

valmistus Pdr5p solukalvojen

Plasmamembraanit sisältävä yliekspressoitu Pdr5p proteiini valmistettiin

Saccharomyces cerevisiae

mutanttikanta AD124567, kuten aiemmin on raportoitu [66].

fraktiointi solulysaateista ja valmistelu membraanifraktioiden

yhteensä 2,5 x 10

5-soluja kasvatettiin 75 cm

2 kulttuuri pulloja ja digoksiinia ja 21-BD. 48 tunnin kuluttua hoidon, solut pestiin kolme kertaa kylmällä PBS: llä ja romuttaa viljelmän pullon kumikaavinta on kalvovalmisteen puskuria (6 mM Tris [pH 6,8], 20 mM imidatsolia, 0,25 M sakkaroosi, 0,01% SDS: ää, 3 mM EDTA ja 2 mM PMSF). Solut homogenisoitiin Potter-Elvehjem homogenisaattorilla käyttäen kymmenen stokes jäissä. Sitten ne sonikoitiin ultraääni disruptor jäissä 10 s 45%: n teholla. Näyte sentrifugoitiin 20000 x g 90 min ajan 4 ° C: ssa. Supernatantti heitettiin pois ja pelletti suspendoitiin uudelleen 250 ul: aan kalvon valmistamiseksi puskuria. Lopuksi, tämä näyte sonikoitiin 10 s 25% teholla, kunnes täydellinen homogenointi.

Na, K-ATPaasi valmiste rotan aivopuoliskojen

Brain pallonpuoliskon aikuisilta Wistar rottia nopeasti talteen jälkeen dietyylieetteri anestesian ja mestaus. Käytettyjen protokollien käyttöön rotat hyväksynyt Institutional komission eettinen eläinten käyttöä, prosessi koodin DFBCICB011 ja sopeutui Opas hoito ja käyttö Laboratory Animals julkaisemassa US National Institute of Health (NIH julkaisu nro . 85-23, tarkistettu vuonna 1996). Aivokudoksissa, jota käytetään lähteenä ouabaiini-herkkien (α

2 /α

3) Na, K-ATPaasi-isoformit, homogenoitiin 250 mM puskuroidussa sakkaroosi, 2 mM ditiotreitolia, 0,1 mM PMSF ja 5 mM Tris /HCl (pH 7,4), jossa on moottorikäyttöinen Teflon Potter-Elvehjem-homogenisaattoria. Sen jälkeen, kaotrooppinen käsittelemällä 2 M KI suoritettiin 1 tunnin ajan jatkuvasti sekoittaen, jota seurasi sentrifugointi kolme kertaa 100000 x

g

1 tunti. Lopullinen pelletti suspendoitiin uudelleen 250 mM sakkaroosia, 0,1% natriumdeoksikolaattia ja 20 mM maleaatti /Tris (pH 7,4), sitten säilytettiin yön yli -20 ° C: ssa ja poikkeavalla tavalla sentrifugointi sulatuksen jälkeen [67]. Pelletit suspendoitiin uudelleen samaan puskuriin ilman PMSF ja varastoitiin nestemäisessä N

2.

Na, K-ATPaasi-valmisteen hiiren munuaisten

Kidney kudosta eristettiin aikuisen hiiren ja oli homogenisoitiin 250 mM sakkaroosi, 0,1 mM EGTA, ja 25 mM imidatsoli pH 7,4, käyttäen moottorikäyttöinen Teflon Potter

–

Elvehjem homogenisaattorilla. Sitten näyte sentrifugoitiin 4500 x

g

10 min. Saatu supernatantti sentrifugoitiin 70000 x

g

1 tunti. Lopullinen pelletti suspendoitiin uudelleen homogenisoimalla liuokseen ja käytettiin Na, K-ATPaasi-aktiivisuuden määrityksiä. Kaikki koemenettelyn joihin hiiret hyväksynyt Kansasin yliopistossa Medical Center Institutional Animal Care ja käyttö komitea.

NTPaasi Analyysit

entsymaattinen toiminta määritettiin käyttäen ATP substraattina standardissa väliaineessa (50 ui lopullinen tilavuus), joka sisälsi 100 mM Tris-HCI, pH 7,5, 4 mM MgCI

2, 75 mM KNO

3, 7,5 mM NaN

3, ja 0,3 mM ammoniummolybdaattia, kun läsnä oli 3 mM ATP: tä. Reaktio aloitettiin lisäämällä 13 ug /ml solukalvon valmisteet, sitten pidettiin 37 ° C: ssa 60 min ja pysäytettiin lisäämällä 1% SDS: ää, kuten aikaisemmin on kuvattu [68]. Vapautunut epäorgaaninen fosfaatti (Pi) mitattiin, kuten on kuvattu muualla [69]. Kantaliuoksia käyttäen DMSO, 21-BD ja digoksiinia lisättiin jopa 5% v /v lopullinen pitoisuus. Ero ATPaasi-aktiivisuuden läsnä ollessa tai puuttuessa 3 uM oligomysiini vastasi Pdr5p-välitteisen ATPaasiaktiivisuus.

mittaus vaikutus 21-BD Na, K-ATPaasi-aktiivisuutta

aivot pallonpuoliskolla valmisteita inkuboitiin 37 ° C: ssa 2 tunnin ajan alustassa, joka sisälsi 87,6 mM NaCl: a, 3 mM KCI, 3 mM MgCI

2, 3 mM ATPNa

2, 1 mM EGTA, 10 mM natriumatsidia ja 20 mM maleiinihappo /Tris (pH 7,4), ja solukalvon valmisteita inkuboitiin 37 ° C: ssa 1 h 120 mM NaCl, 20 mM KCI, 2 mM MgCI

2, 3 mM ATPNa

2 ja 50 mM HEPES, (pH 7,5), sekä ilman ja 1 mM ouabaiinin tai kasvavien pitoisuuksien 21-BD ja digoksiini. Na, K-ATPaasi-aktiivisuus määritettiin mittaamalla Pi vapautuu mukainen kolorimetrinen menetelmä on kuvattu aiemmin [69], ja spesifinen aktiivisuus oli pidetään erotus, ja ouabaiini-resistenttejä ATPaasi toimintaa [70].

ouabaiinin sitoutumisen

HeLa-solut maljattiin 24 multi-kuoppalevyille yhtymäkohdassa ja viljeltiin yön yli. Yksisolukerrokset olivat sitten nopeasti pestiin kolme kertaa kaliumia suolapuskurissa (140 mM NaCl, 1,8 mM CaCl

2, 5 mM sakkaroosia, 10 mM Tris-HCl pH 7,4 huoneen lämpötilassa) ja inkuboitiin 30 minuutin ajan yhteensä sitovia (0,1 × 10

-6

3H-ouabainia plus 0,9 × 10

-6 kylmä ouabainia in kaliumia suolaliuospuskurissa) varovasti sekoittaen ja huoneenlämpötilassa. Sitten monokerrokset pestiin neljä kertaa, 1 min, jääkylmällä 0,1 M MgCl

2 ja liuotetaan 400 ul: aan SDS 1%.

3H aktiivisuus mitattiin näytteitä 350 ul tuikelaskennalla. Yhteensä

3H-ouabainia sitoutuminen kilpaili lisäämällä koko sidontaratkaisu tarvittavan määrän 21-BD päästä pitoisuudet ilmoitetaan tulokset. Osajoukko yksisolukerrosten altistui kilpailivat sitova liuos (yhteensä sidontaratkaisu plus 0,5 × 10

-4 M kylmä ouabainia) mitata epäspesifinen sitoutuminen ja vähennä sen koko sitoutumisaste.

Tilastolliset analyysit

Tilastolliset analyysit suoritettiin GraphPad Prism-ohjelmiston, versio 5. tulokset ilmaistaan ​​keskiarvona ± keskivirhe keskiarvon. Tilastollinen merkitys yksisuuntainen varianssianalyysi (ANOVA), jota seurasi Bonferronin valittu paria vertailutestillä, asetettiin

P

0,05 (*),

P

0,01 (**), tai

P

0,001 (***) vs. kontrolli kunnossa, ja ”n” edustaa määrää itsenäisen kokeen.

tulokset

Me syntetisoitiin 21-BD yksinkertaisen stereo selektiivinen vinyloginen aldolireaktion, mukaan Xu et ai. [50], ja tunnettu lopputuote kautta perinteisen NMR, HRMS ja IR-analyysi (kuvio 1A, kuvio S1 ja Data S1).

suorittamiseksi molekyylimallinnus- analyysit aloitimme geometrinen optimointi ligandien kautta semi-empiirinen lähestymistapa, korjata geometriset parametrit, kuten bond pituudet ja rakenteellisia parannuksia. Uudelleen telakka rakenne saadaan ohjelmiston AUTODOCK Vina, osoittaa, että puhdistettu ja kristallografinen ligandi on sama konformaatio aktiivisessa, joiden neliöllisen keskiarvon poikkeama-arvo 2,24 Å parasta ratkaisua, joka osoitti tarkkuutta käytetyt menetelmät (katso kuva S2A). Kuvio 1 B esittää simulaation telakointi ouabainia sen sitoutumiskohtaan Na, K-ATPaasi α

1 isoformi. Kuten on esitetty, entsyymi säilyttää toisen rakenneosia ATPaasi perheen (kuvio 1 B, vasemmalla) ja että aktiiviseen kohtaan koostuu Gln111, Glu117, Pro118, Asn122, Leu125, Glu312, Ile315, Gly319, Val322, Ala323, Phe783, Phe786, Leu793, Ile800, Arg880 (kuvio 1 B, oikealla), kanssa tunnettujen rakenteiden [71].

näiden molekyylimallitus analyysien me typistetty ouabain, digoksiinin ja 21-BD Na, K-ATPaasi ( Kuva S2B ja kuvio 1C ja D). Simulaatiot johti sitova energioita ouabainia, digoksiini, ja 21-BD -9,8, -1,9, ja -10,0 kcal /mol, vastaavasti. Nämä tiedot viittaavat siihen, että 21-BD voi olla samanlainen sitoutumisaffiniteetti Na, K-ATPaasi kuin ouabaiinin ja digoksiini. Kuitenkin nämä molemmat viimeksi yhdisteillä eri lääkeopillisiin konformaatioita on sitoutumiskohdan, lähinnä tasolla laktonirenkaan. Kuviot 1C ja D korosta tärkein molekyylien väliset vuorovaikutukset ligandien ja kohdeproteiinin. Digoksiini sitoutuu entsyymiin kautta vetysidoksella Thr797, Asp884 ja Lys905 aminohappoja. Sähköstaattisen ja hydrofobinen vuorovaikutus esiintyy Glu117, Asn120, Asp121, Asn122, Ile315, Gly319, Val322, Ala323, Arg880, Asp884, Tyr901, Glu908 ja Gln111, Leu125, Phe316, Phe783, Phe786, Leu793, Arg886, Phe909, Arg972, vastaavasti (kuvio 1C). Toisin kuin luonnolliset sydänglykosidit, 21-BD komplekseja Na, K-ATPaasi kautta Gln111, Glu312, ja Thr797 vetysidokset. Lisäksi, aromaattinen rengas saavuttaa hydrofobinen tasku on muodostettu pääasiassa Cys104, Val322, Ala323, Glu327, Ile800 (kuvio 1 D). Lisäksi lääkeopilliseen konformaatio on täysin erilainen kuin luonnollisen glykosidit, jonka aromaattinen osa sitoutuu vesimolekyylejä ja magnesium-ionin.

suoraan määrittää sitoutumisen 21-BD, että ouabain sivuston Na, K- ATPaasi, ensin testata, jos synteettinen steroidi voisi kilpailla

3H-ouabainia sitova HeLa-soluissa, jotka ilmentävät α

1 isoformin Na, K-ATPaasi [72]. Kuten on esitetty kuviossa.