Krooninen sairaus

tiivistelmä

Various nisäkässoluja, mukaan lukien syöpäsolut, irtoa solunulkoinen rakkulat (EV), tunnetaan myös eksosomeiksi ja mikrorakkulat, ympäröiviin kudoksiin. Nämä sähköajoneuvojen rooleja kasvaimen kasvua ja etäpesäkkeiden edistämällä angiogeneesiä. Kuitenkin yksityiskohtainen mekanismi, miten syöpää peräisin EV saada endoteelisolujen aktivoitumisen edelleen tuntematon. Täällä todisteita siitä, että varhainen kasvuvaste-1 (Egr-1) aktivoitumisen endoteelisolujen on mukana angiogeenisen aktiivisuuden kolorektaalisyövän-soluista peräisin EV. Sekä RNA-interferenssi-välitteisen downregulation Egr-1 ja ERK1 /2 tai JNK estäjän merkittävästi estänyt EV välittämää Egr-1 aktivaatio ja endoteelisolujen migraatiota. Lisäksi lipidilautan endosytoosin estäjä esti tehokkaasti endoteelisolujen Egr-1 aktivointi ja muuttoliikkeen aiheuttama syöpä johdettu EV. Tuloksemme viittaavat siihen, että Egr-1 aktivaatio endoteelisoluissa voi olla keskeinen mekanismi, joka osallistuu angiogeenisen aktiivisuuden syövän peräisin EV. Nämä havainnot parantavat ymmärrystä koskien proangiogeeninen toimintaa sähköajoneuvojen erilaisissa patologisissa tiloissa kuten syöpä, sydän- ja verisuonitaudit, ja hermostoa rappeuttavien sairauksien.

Citation: Yoon YJ, Kim DK, Yoon CM, Park J, Kim YK, Roh TY, et ai. (2014) Egr-1 Aktivointi Cancer-Derived Solunulkoisilla Rakkuloilta Edistää endoteelisolujen migraatiota kautta ERK1 /2 ja JNK signalointireitteihin. PLoS ONE 9 (12): e115170. doi: 10,1371 /journal.pone.0115170

Toimittaja: Shilpa J. Buch, University of Nebraska Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 24 kesäkuu 2014; Hyväksytty: 19 marraskuu 2014; Julkaistu: 12 joulukuu 2014

Copyright: © 2014 Yoon et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Tällä kirjoittajat vahvistavat, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperin.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat Mid-ura Tutkija Program kautta NRF se rahoitettiin MEST (nro 2014023004), BK21 Plus (10Z20130012243) rahoittama opetusministeriö , Korea, ja National Research Foundation of Korea (2011-0030049). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Erilaisia ​​nisäkässolujen, kuten syöpäsoluja, makrofagien, endoteelisolujen, verihiutaleita, ja epiteelisolut vapauttavat solunulkoisen vesikkelit (EV) ympäristöönsä plasmasta ja endosomimembraanin osastot [1] – [4] . Näiden nisäkkäiden EV, joka tunnetaan myös nimellä eksosomeiksi ja mikrorakkulat, ovat pallomaisia ​​kaksikerroksisten proteolipids, joiden keskimääräinen halkaisija on 40-250 nm, ja ne on rikastettu eri bioaktiivisia ainesosia, kuten proteiineja, lipidejä, ja geneettisen materiaalin [1] – [9]. Kasvava tulokset ovat osoittaneet, että sähköajoneuvojen pelata pleiotrooppista toimintojen solujen väliseen viestintään: EV stimuloida vastaanottaja soluja aktivoimalla reseptorin ja siirto kalvon proteiineja, molekyylejä, mRNA: t, ja miRNA [4] – [9].

EV on usein nimitystä ”solujen pölyä”, vaikka solut irtoa EV joko olennaisesti tai säänneltyä [1] – [9]. Lisäksi proteiineja, mRNA: t, tai miRNA vapaaehtoispalveluhankkeisiin eroavat koostumukseltaan riippuen valtioiden luovuttajan solujen [1], [4]. Äskettäin ryhmämme paljasti, että proteiinit paksu- ja peräsuolisyövän soluperäisissä EV on kytketty toisiinsa fyysisen vuorovaikutuksen ja klusterin toiminnallisiksi moduuleja mukana EV biogeneesissä ja toiminto [4], [10]. Lisäksi eritystä EV on yleinen soluprosessin esiintyy yksinkertainen organismeista (Archea tai gram-negatiiviset ja gram-positiiviset bakteerit) monimutkaisiin monisoluisista organismeista, mikä viittaa siihen, että tämä EV-välitteinen viestintä on evoluutiossa säilyneitä [9], [11] – [13]. Yhdessä nämä havainnot viittaavat siihen, että sähköajoneuvojen pelata erilaisia ​​rooleja solujen väliseen viestintään [6], [10]. Kuitenkin patofysiologisia roolit sähköajoneuvojen eivät ole täysin ymmärtäneet.

Angiogeneesi, muodostuu uusia verisuonia ennestään verisuonisto, on monimutkainen ja monivaiheinen prosessi, johon tartunta, muuttoliike, invaasio, proliferaatio ja erilaistuminen endoteelisolujen [14], [15]. Tämä uudissuonittumista tapahtuu erilaisissa normaaleissa ja patologisissa tiloissa [14]. Esimerkiksi, angiogeneesi on tärkeää kasvaimen kasvu ja etäpesäkkeiden happea ja ravinteita kasvavaan kasvaimen [15]. Kasvaimen microenvironment, heterogeeninen solupopulaatio, kuten syöpäsoluja, endoteelisoluja, fibroblasteja, ja immuunijärjestelmän solut moduloi suotuisan ympäristön kasvaimen kasvua ja invaasiota [16] – [18]. Nämä syövän ja strooman solut erittävät verisuonten endoteelin kasvutekijä (VEGF), fibroblastikasvutekijää 2 (FGF2), tuumorinekroositekijä-α (TNF-α), ja IL-6 ympäröivään alueeseen ja nämä tekijät edistävät kasvaimeen liittyviä angiogeneesin [16] – [19].

näiden lisäksi proangiogeeninen liukoisen tekijät, solut käsittävät kasvainkudoksen erittävät EV osaksi solunulkoiseen ympäristöön ja nämä irtoa EV pelata useita rooleja kasvaimen kasvua ja etäpesäkkeiden edistämällä angiogeneesiä, kasvain invaasio, ja immuuni paeta [4] – [8], [20] – [23]. Kun ensimmäinen raportti angiogeenisten toiminnan sähköajoneuvojen peräisin HT1080 ihmisen fibrosarkooma ja DU-145 ihmisen eturauhasen syöpä soluja [5], useat tutkimukset vahvistivat, että sähköajoneuvojen johdettu syöpäsoluja, fibroblasteissa ja syövän kantasolut edistävät

in vitro

ja

in vivo

angiogeneesissä [4], [8], [24] – [28]. Näiden angiogeenisten toimintaa sähköajoneuvojen välittyvät vesicular lipidi (t), proteiineja, mukaan lukien reseptorit ja tetraspanin proteiineja, mRNA: ita, ja miRNA. Kuitenkin yksityiskohtainen mekanismi, miten sähköajoneuvojen saada angiogeeninen aktiivisuus ei ole laajasti tutkittu.

Early kasvureaktio-1 (Egr-1), välitön varhainen geeni ja sinkkisormipolypeptidiin transkriptiotekijä, on ratkaiseva merkitys angiogeneesiä [29] – [32]. Lisäksi seerumialtistus, Egr-1 voidaan nopeasti ja ohimenevästi aiheuttama sytokiini, kasvutekijä, ja ympäristön stressi, kuten hypoksia, nesteen leikkausjännitys, ja verisuonten vammoja [33], [34]. Egr-1 säätelee ilmentymistä proangiogeeninen geenien, kuten VEGF: n, FGF2, ja IL-6 endoteelisoluissa tai TNF-α makrofageissa [31], [34] – [36]. Sisällä kasvainkudoksen, endoteelisolujen, syöpäsolut, fibroblastit, ja kasvaimen infiltroituneen makrofagien voivat ilmaista Egr-1. Lisäksi pienten suonten tiheyksiä kasvainkudoksissa saatu Egr-1-hiirillä ovat alhaisempia kuin ne, jotka saatiin villityypin hiirissä [37] ja alusten rakenteen muodostumista kasvainkudoksessa tukahdutettiin DNAzymes, jotka on kohdistettu Egr-1-mRNA: n [31] , viittaa siihen, että Egr-1 on olennaisia ​​rooleja kasvaimen kasvua ja angiogeneesiä. Tässä suhteessa useat tutkimukset ovat raportoineet, että Egr-1 ilmentymisen syöpäsoluissa, endoteelisolut ja makrofagit liittyy kasvaimen etenemistä [32], [36] – [38]. Yhdessä nämä havainnot viittaavat siihen, että Egr-1 näyttelee tärkeä rooli kasvaimeen liittyviä angiogeneesiin ja syövän etenemiseen.

Tässä raportissa osoitettava, että Egr-1 aktivaatio endoteelisolujen tulisi olla keskeinen mekanismi, joka osallistuu angiogeeninen aktiivisuus syövän johdettujen EV. Huomasimme, että Egr-1 aktivaatio peräsuolen syövän soluista peräisin EV edistänyt endoteelisolujen migraatiota kautta ERK1 /2 ja JNK signalointireitteihin ja lipidilautan endosytoosin.

Materiaalit ja menetelmät

Cell kulttuuri

Ihmisen kolorektaalisen adenokarsinooman (SW480), kolorektaalisyövän (HCT116), keuhkon adenokarsinooma (A549), ja fibrosarkooman (HT1080), ja normaalin keuhkoputken epiteelin (BEAS-2B) soluja ylläpidettiin RPMI 1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia (FBS, Invitrogen), 100 U /ml penisilliiniä, ja 0,1 mg /ml streptomysiiniä. Ihmisen neuroblastooma (SH-SY5Y) ja eturauhasen karsinooma (PC3) soluja ylläpidettiin MEM (Invitrogen), jota oli täydennetty 10% FBS: ää, 100 U /ml penisilliiniä, ja 0,1 mg /ml streptomysiiniä. SW480, HCT116, A549, HT1080, SH-SY5Y, PC3 ja BEAS-2B hankittiin American Type Culture Collection. Ihmisen mikrovaskulaarisia endoteelisoluja (HMEC-1 s) viljeltiin endoteelikasvutekijä Medium-2 (EGM-2, Lonza, Walkersville, MD, USA) [5]. Ihmisen napalaskimon endoteelisolut (HUVEC) eristettiin juuri toimitetaan napanuorasta ja ylläpidetään kuten aiemmin on kuvattu [39]. HUVEC-soluja viljeltiin väliaineessa 199 (Invitrogen), jota oli täydennetty 20% FBS: ää, 3 ng /ml FGF2 (R GAPDH käänteinen, 5′-TTCACACCCATGACGAACAT-3 ’; EGR1 eteenpäin, 5’-CCGCAGAGTCTTTTCCTGAC-3 ’; EGR1 käänteinen, 5’-AGCGGCCAGTATAGGTGATG-3 ’. HMEC-1s (2 x 10

5 solua) maljattiin 6-kuoppaisille cell-culture levy käsiteltiin EV (1 ug /ml, 2,0 ml) ja 0,5, 1, 1,5, 2 ja 4 tuntia. RNA uutettiin viljellystä soluista käyttämällä RNeasy Mini Kit (QIAGEN, Valencia, CA, USA). Reaaliaikaisen RT-PCR, kokonais-RNA (100 ng) monistettiin One Step SYBR RT-PCR: llä (Takara Bio, Tokio, Japani) käyttämällä LightCycler 2,0 PCR -järjestelmää (Roche Diagnostics, Mannheim, Saksa). Monistus suoritettiin kuumentamalla näytteet 50 ° C: ssa 2 min, sitten 95 ° C: ssa 10 minuutin ajan, minkä jälkeen toistamalla sykliä 95 ° C 15 sekuntia, 55 ° C 10 sekuntia ja 72 ° C: ssa 10 sec, yhteensä 45 sykliä. Vertaileva Ct menetelmää käytettiin suhteellista kvantifiointia kohdegeenin ilmentymisen vastaan ​​on taloudenhoito geeni, GAPDH [40].

Egr-1 tumaansiirtymiseen

HMEC-1s levytettiin 24- sekä soluviljely- levyille (Corning Inc.) ja lasipeitinlevyille (Fisher Scientific) tiheydellä 5 x 10

4 solua per kuoppa, ja annettiin kiinnittyä yön yli. Soluja käsiteltiin SW480-johdettujen EV (1 ug /ml, 0,5 ml), kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä, ja inkuboitiin kanin anti-Egr-1-vasta-ainetta (Cell Signaling Technology, Hitchin, Iso-Britannia) ja sen jälkeen AlexaFluor488 vuohen anti- kani-lgG-vasta-ainetta (Invitrogen). Tumat vastavärjättiin Hoechst (Sigma-Aldrich). Kuvat visualisoitiin alle FV1000 Olympus -konfokaalimikroskoopilla (Olympus) ja hankitut FV1000-ASW 3.0 -ohjelmisto (Olympus). Prosenttiosuus Egr-1-positiivisten solujen kvantifioitiin laskemalla solut yhteistyössä lokalisoitu fluoresenssisignaalien.

vaikutuksen tutkimiseksi signaloinnin inhibiittorit (Biomol Research Laboratories, Plymouth Meeting, PA, USA) tai metyyli- β-syklodekstriini (MβCD; Sigma-Aldrich) on Egr-1 tumaansiirtymiseen, HMEC-1s käsiteltiin ERK1 /2-estäjä (PD98059, 20 uM), p38 MAPK estäjä (SB203580, 10 uM), JNK estäjä (SP600125, 20 uM), Akt-inhibiittori (BML-257, 20 pM), tai MβCD (10 mM) läsnä ollessa tai poissa ollessa SW80-johdettujen EV (1 ug /ml).

RNA-interferenssi-välitteisen downregulation Egr -1

sirna (siRNA) ja Egr-1 (Bioneer, Daejeon, Korea) lopulliseen pitoisuuteen 50 nM transfektoitiin HMEC-1s käyttäen Welfect-Q (Welgene, Taegu, Korea). Ei-hiljentäminen salattu siRNA käytettiin negatiivisena kontrollina. 48 tunnin kuluttua soluja käytettiin reaaliaikaista RT-PCR analyysi määrittää tason Egr-1 mRNA: n ekspression, Egr-1 tumaansiirtymiseen määrityksiä, ja naarmujen haavan paranemista määrityksissä. SiRNA-sekvenssit olivat seuraavat: salattu siRNA, 5′-CCUACGCCACCAAUUUCGU-3 ’; Egr-1 siRNA-1, 5’-CAGUAUCAUCUCCAUCAUA-3 ’; Egr-1 siRNA-2, 5’-AGUUUGCCAGGAGCGAUGA-3 ’; Egr-1 siRNA-3, 5’-GUGCAAUUGUGAGGGACAU-3 ’.

EV oton

SW480-johdettu EV leimattiin Dil: n kanssa (Invitrogen) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Lyhyesti, SW480-johdettu EV (100 ug) inkuboitiin Dil: n kanssa (1 uM) 15 minuutin ajan 37 ° C: ssa ja sentrifugoitiin 100,000

g

2 h 4 ° C: ssa (tyypin 90 Ti kiinnitetty roottori jossa on k-kerroin 126,4). Pelletit, Dil-leimattuja EV, pestiin fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella, ja sen jälkeen ultrasentrifugoinnilla 100000

g

2 h 4 ° C: ssa (tyypin 90 Ti kiinnitetty roottori, jossa on k-kerroin 126,4), suspendoitiin uudelleen fosfaattipuskuroituun suolaliuokseen. HMEC-1s esikäsiteltiin ilman tai MβCD (10 mM), 0,5 h, ja sitten inkuboitiin Dil: n kanssa-leimatun SW480-johdettu EV (1 ug /ml, 0,5 ml) 1 h. Sitten solut kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä ja tumat värjättiin Hoechst (Sigma-Aldrich). Kuvat visualisoitiin alle FV1000 Olympus -konfokaalimikroskoopilla (Olympus) ja hankitut FV1000-ASW 3.0 -ohjelmisto (Olympus).

Tilastolliset analyysit

Kaikki arvot ilmaistaan ​​keskiarvoina ± S.D.

P

arvot laskettiin yksisuuntainen tai kaksisuuntainen varianssianalyysi (ANOVA), jossa Bonferroni korjaus, joka perustuu vertailuihin asianmukaiset vertailunäytteet testataan samaan aikaan.

Tulokset

SW480-johdettu EV edistävät

in vivo

ja

in vitro

angiogeneesissä

EV vapautuu SW480-soluja puhdistettiin viljelmän supernatanteista yhdistelmällä differentiaalisentrifugointia , ultrasuodattamalla käyttäen 100 kDa ontelokuitukalvossa, ultrasentrifugointi päälle sakkaroosi tyynyt, ja jodiksanoli tiheysvaihteluista raportoitu [8]. Yhdenmukainen aiempien tutkimuksen [8], puhdistettu EV tiheys oli ~1.098 g /ml elätellen CD81 ja CD63, EV markkeriproteiinien (Fig. 1A). Kuitenkin nämä puhdistettu EV ei sisältänyt GM130 (

cis

-Golgi proteiini) ja sytokromi

c

(mitokondrion proteiini apoptoottisten kappaleiden): näiden kahden proteiinin ovat tunnettuja ei- vesicular proteiineja (Fig. 1 B). Ensin osoitti, että sähköajoneuvojen peräisin SW480 paksu- adenokarsinoomasolua aiheuttama

in vivo

uudissuonittumisen (Fig. 1 C ja 1 D). Kun SW480 johdettuja EV sisällä matrigeelin injektoitiin ihonalaisesti hiiriin, massiivinen muodostuminen CD31-positiivisten aluksen kaltaisia ​​rakenteita havaittiin (Fig. 1 C). Sitä vastoin mitään selvää alus muodostumista havaittiin Matrigel ilman EV. EV merkittävästi indusoi 10,4-kertaisen lisäyksen CD31-positiivinen alue Matrigel verrattuna käsittelemättömään kontrolliin (Fig. 1 D).

(A, B) EV vapautuu SW480-soluja puhdistettiin viljelmäsupernatanteista yhdistelmä differentiaalisentrifugointia, ultrasentrifugointi päälle sakkaroosi tyynyt, ja jodiksanoli tiheys kaltevuudet. Jokainen osa jodiksanoli tiheysgradientit analysoitiin Western blotting havaitsemiseksi CD81 ja CD63, markkeriproteiinien sähköajoneuvojen (A). Puhdistettu EV: tä murto 3 analysoitiin Western blottauksella havaitsemiseksi ei-EV markkeriproteiinien (GM130 ja sytokromi

c

). SW480-johdettu kokosolulysaatissa (WCL; 10 ug) ja SW480-johdettu EV (EV; 10 ug) ladattiin Western blotting -analyysi (B). (C, D) Matrigel läsnä ollessa tai poissa ollessa SW480-johdettu EV (20 ug) injektoitiin ihonalaisesti C57BL /6-hiiristä. Jälkeen 7 päivää, koko-mount värjäys Matrigel anti-CD31-vasta-aine tehtiin (n = 5). Edustavia konfokaali Z-pino valokuvia koko kiinnikkeet värjättiin CD31 (vihreä) on esitetty paneelissa C. Mittaviivat edustaa 100 um. Fluoresenssin CD31-värjäys Z-pinon tason Matrigel mitattiin, kuten on kuvattu menetelmät (D). (E) vaeltavien aktiivisuus SW480 johdettujen EV arvioitiin naarmun arpeutumisprosessit määrityksessä. Konfluentit HMEC-1 s naarmuuntunut ja käsiteltiin SW480-johdettujen EV (1 ug /ml); Sitten määrä siirtynyt solujen paljaaksi vyöhykkeellä arvioitiin 12 tunnin kuluttua (n = 3). (F) proliferatiivisen aktiivisuuden SW480-johdettujen EV (1 ug /ml), arvioitiin arvioimalla mitoosin markkeri PH3. Kun oli kulunut 24 tuntia, PH3 ja tumat värjättiin anti-PH3-vasta-aineen ja Hoechst, vastaavasti ja arvioidaan konfokaalimikroskopialla. Prosenttiosuus PH3-positiivisten solujen HMEC-1s kvantifioitiin laskemalla solut yhteistyössä paikallinen fluoresenssisignaalien (n = 3). Positiivisena kontrollina, HMEC-1s käsiteltiin EGM-2, jota oli täydennetty erilaisia ​​angiogeenisten tekijöiden, kuten EGF: n, FGF2, VEGF, ja IGF1. Tiedot esitetään keskiarvona ± SD. *,

P

0,05; **,

P

0,01; ***,

P

0,001; N. S., ei ole merkittävä.

vieressä tutkineet proangiogeeninen aktiivisuutta SW480 johdettujen EV ihmisen endoteelisoluihin, HMEC-1s

in vitro

. Scratch haavan paranemista määritykset paljastivat, että sähköajoneuvojen indusoi 4,1-kertaisen lisäyksen määrä siirtää endoteelisolujen paljaaksi vyöhykkeeseen verrattuna käsittelemättömään kontrolliin (Fig. 1 E). Lisäksi EV voimakkaasti stimuloi endoteelisolujen proliferaatiota: prosenttiosuus PH3-positiivisten solujen lisääntynyt 8,9-kertaiseksi, kun stimuloitumattomassa solujen (Fig. 1 F). Positiivinen kontrolli, EGM-2 täydennetty monipuolinen angiogeenisten tekijöiden, kuten EGF, FGF2, VEGF, ja IGF1, myös indusoi sekä endoteelisolujen migraatiota ja proliferaatiota. Vaeltavien ja proliferatiivista toimintaa SW480-johdettu EV havaittiin myös muissa endoteelisoluissa, HUVEC-(tuloksia ei ole esitetty). Siksi meidän tiedot osoittavat, että SW480 johdettuja EV on

in vivo

ja

in vitro

angiogeenisten toimintaa.

SW480-johdettu EV indusoi Egr-1 aktivaatio endoteelisoluissa

Egr-1 on keskeinen merkitys kasvaimeen liittyvät angiogeneesiin [29] – [32]. Meillä on siis tarkastellut mahdollisuutta aktivoitumisen endoteelisolujen Egr-1 SW480 johdettujen EV (Fig. 2). Reaaliaikainen RT-PCR-analyysit paljastivat, että hoito SW480-johdettu sähköajoneuvojen aiheutti nopean ja tilapäisen korkeus on Egr-1 ilmentymisen transkriptionaalisella tasolla ihmisen endoteelisoluissa, HMEC-1s ja HUVEC-soluja (Fig. 2A). Käytimme HMEC-1s seuraavissa kokeissa. Lisäksi EV muista ihmisen syöpäsoluja (HCT116 kolorektaalikarsinooma, A549 keuhkoadenokarsinooma, HT1080 fibrosarkooma, PC3 eturauhassyöpä, ja SH-SY5Y neuroblastooma) indusoi myös Egr-1 mRNA: n ekspression ihmisen endoteelisoluissa, kun taas EV normaalista ihmisen keuhkoputken epiteelisolujen (BEAS-2B) ei (Fig. 2B). Tutkimme lisäksi Egr-1 aktivaatio stimulaation jälkeen SW480-johdettu EV. Sähköajoneuvojen aiheuttama nopean ja tilapäisen ilmentymisen ja ydinvoiman translokaation Egr-1-proteiinin HMEC-1s; suurin vaikutus havaittiin 1 h kuluttua EV hoidon (Fig. 2C ja 2D). Yhdessä syöpää johdettu EV indusoi Egr-1 aktivaatio lisäämällä sen ilmaisun ja tumaansiirtymiseen endoteelisoluissa. Nämä havainnot viittaavat siihen, että Egr-1 aktivaatio voisi olla kriittinen moduloimiseksi EV-indusoitua angiogeneesiä.

(A) HMEC-1 s ja HUVEC-solut inkuboitiin SW480-johdettujen EV (1 ug /ml) tai käsittelemätön kontrolli. mRNA eristettiin käsittelemätön kontrolli solut tai solut, joita käsiteltiin EV 0, 0,5, 1, 2, ja 4 h ja analysoitiin käyttäen reaaliaikaista RT-PCR: llä (n = 3). Arvot edustavat Egr-1-mRNA /GAPDH mRNA normalisoitiin käsittelemättömiin kontrollisoluihin. (B) HMEC-1 s käsiteltiin EV (1 ug /ml), jotka ovat peräisin HCT116 kolorektaalikarsinooma, A549 keuhkoadenokarsinooma, HT1080 fibrosarkooma, PC3 eturauhassyöpä, SH-SY5Y neuroblastooma, ja BEAS-2B normaaleissa keuhkoputken epiteelisoluissa 0,5 h ( n = 3). (C, D) In ​​HMEC-1s, tumaansiirtymiseen ja Egr-1-proteiinin stimulaation jälkeen SW480-johdettujen EV (1 ug /ml) 0,5, 1, 2, ja 4 h-seoksessa analysoitiin konfokaalimikroskopialla (n = 3) . Tumat ja Egr-1-proteiineja värjättiin Hoechst (sininen) ja anti-Egr-1-vasta-ainetta (punainen), vastaavasti. Co-lokalisoitu fluoresenssisignaalien (violetti) osoittavat translokaatio Egr-1 tumaan. Edustavia kuvia on esitetty paneelissa C. Mittaviivat edustaa 30 um. Prosenttiosuus Egr-1-positiivisten tumien määritettiin mittaamalla solujen lukumäärän tuman colocalized signaaleja, että koko soluja (D). Tiedot esitetään keskiarvona ± SD. *

P

0,05; **

P

0,01; **

P

0,001; ns, ei ole merkittävä.

Egr-1 siRNA vaimentaa endoteelisolujen migraatiota aiheuttama SW480 johdettuja EV

vieressä tutkittiin miten Egr-1 EV aiheuttaman endoteelisolujen migraatiota käyttämällä siRNA. Kun tutkimme kolme Egr-1 siRNA: t, olemme huomanneet, että Egr-1 siRNA-1 tehokkaimmin vähensi Egr-1-mRNA: n tason endoteelisoluissa, mutta salattu siRNA ei esitetty tässä estovaikutus (Fig. 3A). Endoteelisolujen käsitelty Egr-1 siRNA-1 salpasi tehokkaasti EV aiheuttaman Egr-1 aktivointi (Fig. 3B) ja maahanmuuttoa havaittu scratch arpeutumisprosessit määrityksissä (Fig. 3C ja 3D), kun taas salattu siRNA eivät osoittaneet näitä estäviä vaikutuksia . Siten tuloksemme osoittivat, että EV-indusoitua ja ydinvoiman translokaation Egr-1 endoteelisolujen pitäisi edistää EV aiheuttama endoteelisolujen migraatiota.

(A) HMEC-1 s transfektoitiin 50 nM salattujen siRNA tai Egr-1 siRNA-1, Egr-1 siRNA-2, tai Egr-1 siRNA-3. mRNA: t eristettiin soluista 48 tunnin kuluttua ja taso Egr-1-mRNA analysoitiin käyttäen reaaliaikaista RT-PCR: llä (n = 3). (B) NMR-translokaatio Egr-1-proteiinin stimulaation jälkeen SW480-johdettujen EV (1 ug /ml) 1 h analysoitiin salattu siRNA (50 nM) tai Egr-1 siRNA-1 (50 nM) transfektoitiin HMEC-1s (n = 3). (C, D) Konfluentteja HMEC-1s transfektoitiin salattu siRNA (50 nM) tai Egr-1 siRNA-1 (50 nM) oli naarmuuntunut ja käsiteltiin SW480-johdettujen EV (1 ug /ml); Sitten määrä siirtynyt solujen paljaaksi vyöhykkeellä arvioitiin 12 tunnin kuluttua (n = 3). Lukumäärä siirtynyt solujen hiertyneelle vyöhykkeellä kunkin ryhmän esitetään paneelissa D. Mittaviivat edustaa 100 um. Tiedot esitetään keskiarvona ± SD. *

P

0,05; **

P

0,01; ***

P

0,001; ns, ei ole merkittävä.

ERK1 /2 ja JNK signalointireittejä osallistuvat EV aiheuttama Egr-1 aktivaatio ja muuttoliike endoteelisolujen

vieressä tutkineet signalointireittejä mukana EV-välitteistä Egr-1 aktivointi. ERK1 /2-estäjä (PD98059) ja JNK estäjä (SP600125) lähes täysin tukahdutetaan Egr-1 tumaansiirtymiseen endoteelisolujen stimulaation jälkeen SW480 johdettuja EV, mutta p38 MAPK estäjä (SB203580) ja Akt estäjä (BML-257) ei ollut vaikutusta (Fig. 4A ja 4B). Lisäksi havaitsimme, että PD98059 ja SP600125 hoitoja lähes täysin tukossa EV aiheuttaman endoteelisolujen migraatiota vaikka nämä inhibiittorit osoitti mitään näkyvää vaikutusta pohjapinta endoteelisolujen migraation (Fig. 4C ja 4D). Lisäksi PD98059 tai SP600125 lähes kokonaan esti

in vivo

angiogeenisten toiminnan SW480 johdettujen EV (Fig. 4E ja 4F). Kaikki nämä havainnot osoittivat, että ERK1 /2 ja JNK signalointireitteihin ovat välttämättömiä Egr-1 aktivointi, endoteelisolujen migraatiota, ja

in vivo

angiogeneesiä.

(A, B) HMEC-1 s esikäsiteltiin signaloinnin inhibiittorit 1 h ja sen jälkeen stimuloitiin 1 h SW480-johdettujen EV (1 ug /ml). Tumaansiirtymiseen ja Egr-1-proteiini analysoitiin käyttämällä konfokaalimikroskopialla (n = 3). Tumat ja Egr-1-proteiineja värjättiin Hoechst (sininen) ja anti-Egr-1-vasta-ainetta (punainen), vastaavasti. Co-lokalisoitu fluoresenssisignaalien (violetti) osoittavat translokaatio Egr-1 tumaan. Edustavia valokuvia on esitetty paneelissa A. prosenttiosuus Egr-1-positiivisten tumien määritettiin mittaamalla solujen lukumäärän tuman colocalized signaaleja solua yhteensä (B). (C, D) Konfluentteja HMEC-1 s naarmuuntunut ja käsiteltiin SW480-johdettujen EV (1 ug /ml) läsnä ollessa tai ilman signalointia estäjät; Sitten määrä siirtynyt solujen paljaaksi vyöhykkeellä arvioitiin 12 tunnin kuluttua (n = 3). Edustavia valokuvia konfokaali mikroskooppinen kuvantaminen on esitetty paneeli C ja määrä siirtynyt solujen hiertyneelle vyöhykkeellä kunkin ryhmän esitetään paneelissa D. ERK1 /2-estäjä, PD98059 (20 uM); p38 MAPK estäjä, SB203580 (10 uM); JNK-inhibiittori, SP600125 (20 uM); Akt estäjä, BML-257 (20 uM). (E, F) C57BL /6-hiiriä injektoitiin subkutaanisti Matrigelillä sisältävät SW480-johdettu EV (20 ug) kanssa PD98059 (20 pM) tai SP600125 (20 uM). Jälkeen 7 päivää, koko-mount värjäys Matrigel anti-CD31-vasta-aine tehtiin (n = 5). Edustavia konfokaali Z-pino valokuvia koko kiinnikkeet värjättiin CD31 (vihreä) on esitetty paneelissa E. fluoresenssivoimakkuuksien CD31 Z-pinon tasossa matrigeelin mitattiin, kuten on kuvattu menetelmät (F). Mittaviivat paneeleissa A, C, ja E edustaa 30, 100, ja 100 pm, vastaavasti. Tiedot esitetään keskiarvona ± SD. ***

P

0,001.

Endocytosis estäjä estää Egr-1 aktivaatio ja endoteelisolujen migraatiota aiheuttama SW480 johdettuja EV

Mahdollisena osallistuminen of lipidilautan endosytoosin EV oton [41], [42], tutkimme rooli lipidilauttoihin EV sisäänottoa endoteelisolujen. Dil-leimattu EV otto estyi merkittävästi hoidon jälkeen MβCD (10 mM) (Kuva. 5A). EV-indusoidun endoteelisolujen kulkeutuminen paljaaksi vyöhykkeelle estyi täysin MβCD hoitoa (kuvio. 5B). Lisäksi endoteelisolujen käsiteltiin MβCD täysin tukossa EV-aiheuttama Egr-1 aktivointi (Fig. 5C ja 5D).