Krooninen sairaus

tiivistelmä

Huolimatta optimaalinen sädehoitoa (RT), kemoterapiaa ja /tai leikkaus, suurin osa potilaista on paikallisesti levinnyt ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) epäonnistuvat hoitoa. Tunnistaa uusia geenikohteet parantaa kasvaimen valvontaa, suoritimme koko genomin RNAi näytöt tunnistaa knockdowns että useimmat toistettavasti lisäävät NSCLC sytotoksisuutta. Nämä näytöt tunnistaa useita proteasomin alayksikköjen parhaimmilla osumia, mukaan lukien ylin osuma

PSMA1

, komponentti ytimen 20 S proteasomin. Säteily ja proteasomin esto osoitti synergiavaikutuksia. Proteasomin esto johti 80-90%: n lasku homologinen rekombinaatio (HR), 50%: n lasku ilmentymistä NF-KB-indusoituva HR geenien

BRCA1

ja

FANCD2

, ja vähennys BRCA1-, FANCD2 ja RAD51 ionisoivan säteilyn aiheuttama pesäkkeitä. IκBα RNAi Knockdown pelastettiin NSCLC radioresistance. Säteilytys hiirten NCI-H460 ksenografteissa jälkeen indusoituvia

PSMA1

shRNA Knockdown selvästi lisääntynyt hiiren eloonjäämisen verrattuna jompikumpi hoito yksinään. Proteasomin esto on lupaava strategia NSCLC säteilylle herkäksi estämällä NF-KB-välitteisen ilmentymisen Fanconin anemia /HR DNA korjaus geenit.

Citation: Cron KR, Zhu K, Kushwaha DS, Hsieh G, Merzon D, Rameseder J, et al. (2013) proteasomiestäjät Block DNA korjaus ja Radiosensitize ei-pienisoluinen keuhkosyöpä. PLoS ONE 8 (9): e73710. doi: 10,1371 /journal.pone.0073710

Toimittaja: A. R. M. Ruhul Amin, Winship Cancer Institute of Emory University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 30 huhtikuu 2013; Hyväksytty: 19 heinäkuu 2013; Julkaistu: 05 syyskuu 2013

Copyright: © 2013 Cron et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat amerikkalainen Society for Radiation Oncology (ASTRO) Junior tiedekunta Ura Research Training Award, yhteinen keskus Sädehoito Foundation Grant, Dana-Farber /Harvard Cancer Center SPORE Developmental Research Project Award Lung Cancer Research, ja National Cancer Institute of National Institutes of Health alle Award Number K08CA172354. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Sädehoitoa (RT) on kriittinen liikennemuotojen hoidossa keuhkosyövän. Se on erittäin tehokas, kun tauti on lokalisoitu, ja parantava annokset voidaan antaa turvallisesti. Esimerkiksi, vaihe I ei-pienisoluisen keuhkosyövän (NSCLC) voidaan käsitellä riittävän suuria annoksia ionisoivan säteilyn (IR), jolloin saatiin 3-vuoden paikallinen valvonta hinnat noin 90% [1]. Tämä johtuu suurelta osin korkeasta biologisesti tehokkaat annokset (BED), jotka voidaan antaa eristää keuhkokasvaimia käyttäen stereotaktisten kehon sädehoitoa. Valitettavasti vain 15%: lla potilaista esittää tällaisia ​​kasvaimia [2]. Kehittyneempiä kasvaimia, jotka ovat huomattavasti yleisempiä, ei voida käsitellä korkeamman BED, koska soluttautuminen tai läheisyys, säteilylle rakenteita kuten keuhkoihin, selkäydin, ruokatorvi ja sydän [3]. Tämä rajoitus selittää korkeamman paikallisen keskeyttäneiden määrää noin 30% [4]. Systeemiset aineet siksi ne annostellaan parantaa säteilyn vasteen. Tällaisia ​​aineita ovat sytotoksiset kemoterapeuttiset joka puolestaan ​​on merkittäviä annosta rajoittavia toksisuuksia ja pieni vaikutus kasvaimen valvontaa. Vain pieni osa kasvaimista esiintyy geneettisiin ominaisuuksiin, kuten EGFR aktivoivia mutaatioita [5] tai EML4-ALK translokaatiot [6], jotka mahdollistavat kohdennettujen hoitomuotojen; lisäasetuksia tarvitaan.

Useat genominlaajuisten tutkimuksia on valmistunut NSCLC, mukaan lukien DNA: n sekvensointi [7], kopiomäärä analyysi [8] ja geenien ilmentymisen profilointi [9]. Nämä tutkimukset tarjosivat puolueeton tunnistamisen yleisimmistä ja tärkeitä geneettiset ja epigeneettiset muutokset keskuudessa 20-25,000 geenien ihmisen genomin [10]. Ne paljastivat kiehtova yhdistysten keskuudessa geenejä ja kliininen covariates, mutta eivät kyenneet suoraan osoittamaan syy-seuraussuhteiden välillä muutoksiin ja hoitotulosten. Sitä vastoin RNA-interferenssi (RNAi) voidaan suoraan osoittaa vaikutuksia vähennetään geenin ilmentymisen solun fysiologiaan ja eloonjääminen [11].

yhdistetyt lyhyt hiusneula-RNA (shRNA) näyttöjä, jossa syöpäsoluja altistetaan useita tuhansia eri shRNA sekvenssit, keskimäärin yksi geeni knockdown solua kohti, on useita kiinnostavia toimintoja. Ensinnäkin vaikutus vakaa shRNA Knockdown useiden solujen kahdentumista voidaan tutkia, verrata ohimenevä transfektioon Sirna (siRNA) sekvenssit lyhytaikainen vaikutus. Niinpä shRNA ilmaisu jäljittelee lääkehoitoja, joita tyypillisesti annetaan useiden viikkojen sijasta päivää. Myös solut kätkeminen eri shRNA sekvenssit tehokkaasti kilpailla toistensa sisällä altaan kuin ne lisääntyä, mikä aiheuttaa osumia, että saadaan selvempi vaikutuksia proliferaatioon [12].

Koska sädehoito on tukipilari NSCLC hoidon geeni silencings jotka johtavat synergistinen sytotoksisuutta yhdistettynä ionisoiva säteily (IR) ovat toivottavia. Monet syövän hoidot ovat lisäaineena luonteeltaan, ja yhdistetään, koska ne johtavat ero sivuvaikutusprofiilit [13]. Tehostemateriaalit hoidot, jotka johtavat enemmän vaikutuksia samanaikainen anto verrattuna lisäaineen vaikutuksista kunkin hoidon antaminen erikseen, voidaan käyttää erityisen hyvin säteilyherkistimet, koska RT toimitus voidaan pakko rajoitetulle määrälle, ja haittavaikutukset voivat olla vähäisempiä ulkopuolella säteilytetty volyymi.

osoittaminen mekanismi sädeherkistävä shRNA voi myös paljastaa biomarkkereita potilaiden valinnassa ja hoidon arviointia. DNA kaksinkertainen katkeamisen (DSB: t) ovat vaikutukset IR parhaiten korreloivat sen sytotoksisuuteen. Yksittäinen korjaamatta DSB riittää aiheuttaa lisääntymis- solukuolemaan kautta G2 pidätyksen tai mitoosi katastrofin [14]. DSB on pääosin korjattu kautta kahden reitin, homologinen rekombinaatio (HR) ja ei-homologisen end-liittymällä (NHEJ) [15]. Gene silencings tai pienmolekyylisalpaajilla joko reitti voi edistää säteilylle herkäksi.

Tässä tarkastellaan proteasomin esto strategiana NSCLC säteilylle herkäksi estämällä DNA: n DSB korjaus. Proteasomin esto on tutkittu useissa kliinisissä tutkimuksissa ilmoittautumalla pienisoluista keuhkosyöpää, vaihtelevin tuloksin. Esimerkiksi vaiheen II tutkimuksessa 114 potilasta hoidettiin bortetsomibin plus gemsitabiinin ja karboplatiinin ensilinjan edenneen NSCLC osoitti vastausprosentti oli 23% ja taudin tarkastusmäärää (vasteet + stabiili tauti) on 68%, mikä antaa aiheen lisätutkimukset [16]. Bortetsomibi ei osoittanut aktiivisuutta monoterapiana vaiheen II tutkimuksessa 14 potilasta, joista kukaan ei osoittivat objektiivisia vasteita, ja kolme (21%) oli stabiili tauti kestävät +3,4-+11,5kuukautta [17]. Perustuu tietoihin, ehdotamme, että proteasomin inhibiittorit voivat olla käyttökelpoisia säteilyherkistimet, koska niiden tukahduttavaa vaikutusta NF-KB-välitteinen geenien ilmentymistä tarvitaan HR-reitin.

Tulokset

Multiple Proteasome geenit ovat Top Hits NSCLC koko Genome RNAi näytöt

koko genomin shRNA näyttö toteutettiin kaksi NSCLC solulinjoissa, A549 ja NCI-H460. Nämä linjat yhteisiä geneettisiä piirteitä, kuten mutaatiot

KRAS

ja

STK11

(aka LKB1). Nämä mutaatiot löytyvät kasvaimia, jotka ovat erityisen aggressiivisia ja resistenttejä, ja joka oli suunnattu hoitoja ei ole käytettävissä [18], [19]. Solulinjat ovat villityypin in

TP53

ja siksi vähemmän todennäköisesti verrattuna mutatoitunut linjat, näytteille perimän epävakaisuuden aikana näytön, joka koskee useita viikkoja [20]. Myös niiden geneettinen samankaltaisuus, kannalta keskeisten onkogeenisten ja tuumorisuppressorigeeneille, lisää todennäköisyyttä, että näytön osumia yhdellä rivillä toistuu toisessa (taulukko S1).

Hannon-Elledge kirjasto sisältää 74705 erillistä shRNA sekvenssit ja tavoitteet lähes 18000 geenejä [21]. Transduktion jälkeen tähän kirjastoon ja puromysiiniselektion vakaan integrantit, solut jatkettiin, ja suhteellinen edustus kunkin sekvenssin sisällä altaan määritettiin ennen ja jälkeen kaksitoista populaation kaksinkertaistumista. ShRNA sekvenssit kohdistuu geenien välttämättömiä solujen lisääntymistä valikoivasti menetetty. 1667 geenit kohdistuivat ainakin yhden shRNA sekvenssi, jonka runsaus laski vähintään kaksinkertaiseksi kulkiessa molemmissa solulinjoissa (taulukko S2). Useita proteasomi alayksiköt joukkoon osumia molemmissa solulinjoissa, mukaan lukien ylä- osuma

PSMA1

, alayksikkö ytimen 20 S proteasomin [22] (Fig. 1 ja Taulukko S3).

kaavio 26 S proteasomin esittää useita koko genomin shRNA näyttö osuu seuraavalla värikoodi: top hit (punainen), vahva osuma ( 1 shRNA järjestyksessä kohti geenin molemmissa solulinjoissa, tumma oranssi), vähäinen osuma (1 shRNA sekvenssi per geeni molemmissa solulinjoissa, vaalean oranssi), kymotrypsiinin kaltainen proteolyyttisen katalyyttinen sivusto (ei osuma vaan korostettu suuntaa antava, vihreä). Jokainen osuma on merkitty käyttämällä kahta viimeistä aakkosnumeerista merkkiä geenin Hugo nimikkeistön; esim A1 = PSMA1, B5 = PSMB5, ​​M1 = SHFM1.

proteasomiestäjät herkistää NSCLC-solujen Säteily

doksisykliini-indusoituva shRNA knockdovvn

PSMA1

A549 ja NCI-H460 johti menetys proteiinin ilmentymisen sekä PSMA1 ja PSMB5, ​​toinen alayksikkö ydin 20 S proteasomin ja katalyyttisen kymotrypsiinin kaltainen aktiivisuus (CTL) proteasomin [22] (Fig. 2A). Tämä tulos vahvistaa keskeinen rooli

PSMA1

20 S proteasomin kokoonpano. Hoito pienimolekyylinen proteasomin estäjä bortetsomibiin tai

PSMA1

shRNA knockdown aiheutti menetyksen CTL-aktiivisuuden (kuvio. 2B).

(A) Western blot, joka osoittaa proteiinin tasot PSMA1 ja PSMB5 A549 ja NCI-H460 NSCLC-solujen jälkeen

PSMA1

shRNA knockdown verrattuna ei-hiljentäminen shRNA ohjaus. (B) kymotrypsiininkaltaisten (CTL) proteasomiaktiivisuus määritys A549 (vasemmalla) ja NCI-H460 (oikealla) NSCLC-solujen hoidon jälkeen bortetsomibin, tai

PSMA1

siRNA knockdown. Kaikki tulokset ovat keskiarvo ± SEM ja normalisoitiin DMSO ajoneuvon hallinnan. (C) klonogeeninen -eloonjäämiskoe A549 (vasemmalla) ja NCI-H460 (oikealla) seuraavat IR ja bortetsomibia. Merkitty palkit osoittavat prosenttia kill Bortetsomibin käsiteltyjen näytteiden verrattuna DMSO auton ohjaus kullakin IR annoksella. Kaikki tulokset ovat keskiarvo ± SEM ja normalisoitiin DMSO ajoneuvon hallinnan. (D) Apoptosis detektointimäärityksen NCI-H460 seuraavat 2 ja 4 Gy IR ja 50 nM bortetsomibilla. Palkit osoittavat solujen prosenttiosuus alussa apoptoosin (vasen) tai myöhään apoptoosin (oikealla) kautta anneksiini V ja propidum jodidi värjäys, vastaavasti. Kaikki tulokset ovat keskiarvo ± SD ja P-arvot laskettiin käyttäen kaksisuuntaista Studentin

t

testiä.

Bortetsomibi on aktiivinen aine

in vitro

NSCLC linjat, kuten A549 [23] ja NCI-H460 [24], ja se on aiemmin osoittanut sädeherkistävä ominaisuuksia prekliinisissä tutkimuksissa [25]. Kyky proteasomiestäjät laajentaa vaikutuksia fraktioitua säteilyn, kliininen menetelmä tuottaa päivittäin säteilyn pieninä annoksina minimoimiseksi pitkäaikaisen myrkyllisyyden [26], sen vuoksi tutkittu. Bortetsomibin ja fraktioitu säteilyn tuotti synergiavaikutuksia (Fig. 2C). Synergy havaittiin myös yhden annoksen säteilyä (Fig. S1), vaikka tulos ositetun säteilyn on enemmän kliinisesti merkittävää. Tämä synergistinen vaikutus solujen kuolema välittämä ainakin osittain apoptoosin; 2 Gy IR yksinään ei indusoinut apoptoosia, kun taas yhdistelmä IR- ja bortetsomibin indusoi huomattavasti apoptoosin verrattuna jompikumpi hoito yksinään (Fig. 2D).

proteasomin esto heikentää säteilyn aiheuttamien DNA Double langanvalvoja korjaus vähentämällä Homologinen rekombinaatio

Koska synergiaa proteasomin esto ja säteily, me seuraavaksi ratkaistava, onko proteasomiestäjät vaikuttaa säteilyn aiheuttamien DNA kaksinkertainen katkeamisen (DSB: t) [26] (kuva 3). Vapaalla komeetta määrityksissä, NSCLC-solut korjataan valtaosa DNA DSB: t tuottaman suuren annoksen säteilytys tunnin kuluessa. Sen sijaan, bortetsomibihoidon ennen säteilyn hidastaa merkittävästi korjaus-DNA: n DSB: itä ainakin jopa 8 tuntia säteilytyksen jälkeen (Fig. 3A-B). Tämä pysyvyys DSB voi suurentaa mitoosi katastrofi [27], jonka uskotaan olevan vallitseva syy solukuoleman säteilytettyä kiinteässä syöpäsairauksia.

(A) visualisointi neutraalin comet osoittaa IR aiheuttama DNA: n DSB NCI-H460-soluissa 1, 4 ja 8 tunnin kuluttua 40 Gy IR ja esikäsitellään 50 nM bortetsomibin verrattuna DMSO auton ohjaus. (B) kvantifiointi neutraalin comet kautta oliivi hetkellä (vasemmalla) ja% DNA tail (oikealla) 1, 4 ja 8 tunnin kuluttua 40 Gy IR kanssa ja ilman 50 nM bortetsomibia NCI-H460-soluissa. Kukin tietopiste edustaa 3 itsenäistä koetta uudestaan ​​vähintään 50 solua. Kaikki tulokset ovat keskiarvo ± SD ja P-arvot laskettiin käyttäen kaksisuuntaista Studentin

t

testiä. (B) GFP reportterianalyysi homologiseen rekombinaatioon jälkeen proteasomin esto 24 tunnin kautta bortetsomibiin tai

PSMA1

siRNA taintumisen A549 (vasemmalla) ja NCI-H460 (oikealla). Kaikki tulokset ovat keskiarvo ± SD ja normalisoitiin DMSO ajoneuvon ohjaus (Veh) tai nonsilencing siRNA ohjaus. P-arvot laskettiin käyttäen kaksisuuntaista Studentin

t

testiä.

tarkkailla vaikutuksia Bortetsomibin tai RNAi knockdovvn

PSMA1

DNA huoltoon, GFP reportterlkonstruktiomme HR [28] tuotiin A549 ja NCI-H460-soluissa. Käsittelemättömiin soluihin verrattuna, joita hoidettiin joko bortetsomibilla tai

PSMA1

siRNA havaittiin tilastollisesti merkittävä väheneminen HR-välitteinen korjaus I-

Sce

I-indusoidun DNA DSB (Fig. 3C). Samanlaisia ​​tuloksia havaittiin NHEJ (Fig. S2). Nämä tulokset osoittavat suora vaikutus proteasomeja estävää mekanismeja DNA DSB korjaus, yhdenmukaisia ​​aiempien tutkimusten [29] – [31].

ymmärtää mekanismia HR esto, selvitimme vaikutusta bortetsomibin on ydinaseiden painopiste muodostumista keskeisten proteiinien Fanconi Anemia (FA) /HR reitin. IR aiheuttama RAD51 ydinvoiman painopiste muodostumista, mikä on biomarkkeri HR [32], oli merkittävästi vähentynyt bortetsomibilla tai

PSMA1

RNAi (kuvio. 4A, Fig. S3-S4). FANCD2 proteiinin ilmentymiseen ja IR aiheuttama FANCD2 painopiste muodostumista olivat samalla pieneni bortetsomibilla tai

PSMA1

RNAi (kuvio. 4B, Fig. S3-S4). Lopuksi, IR aiheuttama BRCA1 painopiste muodostumista pieneni merkitsevästi bortetsomibilla tai

PSMA1

RNAi (kuvio. 4C, Fig. S3-S4). Yhdessä nämä tiedot viittaavat siihen, että proteasomin esto voi vaikuttaa HR välittämää korjaus IR aiheuttama DNA DSB: t vähentämällä saatavuutta tai rekrytointi keskeisten FA /HR proteiinit vahingoittaa sivustoja.

(A) jälkeen bortetsomibi × 24 tuntia tai

PSMA1

knockdown × 72 tuntia, A549 tai NCI-H460-soluissa oli säteilytetty kiinnitettiin sitten 6 tunnin kuluttua. RAD51 pesäkkeitä havaittiin immunofluoresenssilla. Solut, joissa ≥5 pesäkkeitä pisteytettiin positiivisiksi (n 100). Kaikki tulokset ovat keskiarvo ± SEM. P-arvot laskettiin käyttäen kaksisuuntaista Studentin t-testiä. Kuvat osoittavat edustaja kuvien NCI-H460 käsitelty bortetsomibin, bar = 10 pm. (B) Kuten (A), mutta FANCD2, mukaan lukien Western blot ja immunofluoresenssimenetelmällä. (C) Kuten (A), mutta BRCA1.

proteasomin esto Blocks NF-KB indusoima Fanconin anemia /Homologinen rekombinaatio Genes

vieressä tutkitaan suhdetta proteasomin esto ja FA /HR-reitin kautta NF-KB signalointi. Dalton ja työtovereiden [33] aiemmin osoitti, että bortetsomibin pienenee FA /BRCA geeniekspressiota useita myeloomasolujen, ja että NF-KB transkriptionaalisesti ylössäätelee FA /BRCA reitin. Esimerkiksi NF-KB: n sitoutuu suoraan promoottori

FANCD2

, joka perustuu elektroforeettisen liikkuvuuden siirtymän määrityksellä (EMSA) (Fig. 5A). Yksi mekanismi, jolla bortetsomibilla downregulates NF-KB-reitin kautta estämällä proteasomin-välitteisen hajoaminen IκBα [34]. IκBα, joka sitoo NF-KB: n solulimassa, ja fosforylaatiota IκBα inhibiittorilla NF-KB: n kinaasien (IKKS) vapauttaa NF-KB: n, joka mahdollistaa sen saapumista tumaan [35]. Bortetsomibi myös downregulates NF-KB-reitin indusoimalla tumaansiirtymiseen of IκBα, mikä tukahduttaminen NF-KB: n p65 /50-riippuvaisen transkription [36].

(A) Kaavio NF-kB tahoja

FANCD2

ja

BRCA1

geenejä. (B) ilmentymisen qPCR on

FANCD2

seuraavat proteasomin esto ± 30 nM (A549) tai 50 nM (NCI-H460) bortetsomibiin tai ± indusoituvaa

PSMA1

shRNA, ja ± 10 Gy IR. Kaikki arvot on normalisoitu ACTB ja kaikki tulokset ovat keskiarvo ± SEM. (C) Kuten (B), mutta BRCA1. (D) NSCLC solujen eloonjäämiseen bortetsomibin ja IR osittain pelastaa

IkBα

siRNA Knockdown kun suoritetaan etukäteen. Solujen elinkelpoisuus määritettiin käyttäen ATP luminesenssi-pohjainen määritys mittaamalla suhteellinen luminescent yksikköä (RLU). Kaikki tulokset ovat keskiarvo ± SEM.

Siksi pyrittiin määrittämään, onko IR aiheuttama transkriptio FA /HR geenit

FANCD2

ja

BRCA1

on pienentynyt proteasomin esto. Transkriptio

FANCD2

ja

BRCA1

nousi 30 minuutin kuluessa säteilytys, ja oleellisesti estämään sekä bortetsomibilla tai

PSMA1

RNAi (kuvio. 5B-C). Tämä lyhyt aikaskaala voisi selittää lyhytaikainen vaikutus DSB korjaus havaittu komeetta määrityksessä. Luoda syy, teimme pelastus kokeilu NSCLC soluissa esikäsitelty IκBα siRNA. Sitten solut altistettiin proteasomin esto ja säteilytys. IkBa Knockdown pelastettiin radioresistance ja solujen eloonjäämistä Bortetsomibin käsiteltyjä soluja (Kuva. 5D). Nämä tiedot luoda rooli proteasomiestäjät kuin säteilyherkistimet, eston kautta NF-KB indusoima FA /HR geenit (Fig. 6).

Proteasome esto bortetsomibilla tai

PSMA1

knockdown tulosta lisääntymiseen IκBα, mikä puolestaan ​​vähentää NF-KB: n sitoutumisen promoottorien FA /HR geenejä, mukaan lukien

FANCD2

ja

BRCA1

. Tämä vähentää saatavuutta näiden DNA korjaukseen proteiinien rekrytoinnissa DNA vaurioita sivustoja, mikä vähentää RAD51 keskittyy muodostumista ja HR induktion jälkeen DNA kaksinkertainen katkeamisen ionisoivan säteilyn.

yhdistelmä Proteasome esto ja säteily parantaa Kasvain Ohjaus

vieressä pyrittiin määrittämään, onko proteasomin esto voi olla hyödyllinen strategia

in vivo

. Huono tunkeutuminen Bortetsomibin kasvaimiin voi rajoittaa sen tehokkuus kiinteässä maligniteettien [37]. Siksi testataan onko indusoituva

PSMA1

RNAi knockdown tehostaa valvontaa ksenograftien käsitelty fraktioitua sädehoitoa (RT).

Hallitse fraktioitua RT, käytimme pieni eläin säteilyn tutkimuksen alusta (SARRP), joka voi toimittaa CT-ohjattu konforminen RT kasvaimiin hiirissä [38], [39]. Tämä alusta takaa täydellisen hoito kasvain samalla minimoida säteilyttäminen uninvolved kudoksiin. Se helpottaa myös tilavuudeltaan arviointia kasvaimen kasvun ja osittain korreloi (r = 0,61), jossa mittaharppimittauksilla (Fig. 7A-B).

10

6 NCI-H460-soluissa, jotka on transfektoitu doksisykliini-indusoituvan

PSMA1

shRNA injisoitiin kylkiin 6-8 viikkoa vanhoja NCR nude-hiirissä. Kun kasvaimet olivat saavuttaneet 3 mm: n halkaisija (päivä 0),

PSMA1

pudotus aloitettiin doksisykliinin juomavettä. Viikkoa myöhemmin, RT aloitettiin antaa yhteensä viisi 4 Gy jakeet joka toinen päivä käyttäen pieni eläin säteilyn tutkimuksen alusta (Sarr). (A) Orthogonal kuvia kartion säde tietokonetomografia (TT), saadaan käyttämällä SARRP, hiiren, jossa on ihonalaisen ksenograftin. (B) Korrelaatio tilavuuden kasvaimen mittauksen avulla SARRP kartiokeila CT verrattuna perinteisiin jarrusatulat. (C) hoito kaava. (D) Hiirille jälkeen seurasi kunnes kasvaimet saavuttivat 2 cm halkaisijaltaan, eläimet tuli kuolemaisillaan tai 100 päivää. (E) Kaplan-Meier-analyysit suoritettiin pairwise log-rank testejä arvioimaan eroja selviytymistä. Numerot elossa 10 hiirtä ryhmässä päivänä 100 on esitetty suluissa. RT vs. RT +

PSMA1

Knockdown, log rank

P =

0,0003.

Hiiret istutettiin NCI-H460-soluissa kätkeminen doksisykliini-indusoituva

PSMA1

shRNA konstrukti. Viikon kuluttua aloittamisesta

PSMA1

Knockdown, kasvaimia säteilytettiin annoksella 20 Gy viidessä jakeet. Sen jälkeen RT hoitoja,

PSMA1

Knockdown lopetettiin, ja hiiriä seurattiin jopa 100 päivää sen jälkeen kasvaimen muodostumisen (Fig. 7C). Hoitamaton hiiret osoittivat nopean kehityksen kasvaimia. Hiiret käsiteltiin joko RT tai indusoituva

PSMA1

Knockdown kasvainsoluissa osoitti myös progressiivinen kasvaimen kasvua ja huono selviytymistä. Hiiret käsiteltiin samanaikaisesti molempien hoitojen kuitenkin osoitti vähäistä tai ei ksenografti kasvua ja 100% eloonjääneitä (Kuva. 7D-E). IR aiheuttama FANCD2 painopiste muodostumista pienensi myös kasvaimen näytteet osoittavat indusoituva

PSMA1

taintumisen (Fig. 8A). Väheneminen näillä pesäkkeitä voi toimia tulevaisuudessa biomarkkerina vähentämiseksi IR aiheuttama aktivointi FA /HR-reitin seuraava proteasomin esto. Runsaasti lisää IR aiheuttama γ-H2AX pesäkkeitä kasvaimen yksilöitä säilyi 1, 6, ja 24 tuntia

PSMA1

Knockdown kontrolliin verrattuna, mikä osoittaa, viivästynyt DNA: n DSB korjaus. (Fig. 8B-C).

(A) FANCD2 immunofluoresenssilla 10 Gy säteilytetty vs. säteilyttämätön NCI-H460 ksenograftien talteen hiiristä tai ilman doksisykliinihoidon aiheuttama

PSMA1

shRNA ilmentyminen kasvaimen solut. Bar = 10 um. (B) γ-H2AX immunohistokemia NCI-H460 ksenograftikasvaimissa kanssa tai ilman doksisykliini aiheuttama

PSMA1

shRNA pudotus, talteen hiiristä 1, 6, ja 24 tunnin kuluttua 10 Gy säteilytyksen. Bar = 10 um. (C) kvantifiointi immunohistokemiaa γ-H2AX (B). Solut, joissa ≥5 pesäkkeitä pisteytettiin positiivisiksi (n 400 solua). Kaikki tulokset ovat keskiarvo ± SEM. P-arvot laskettiin käyttäen kaksisuuntaista Studentin t-testillä.

dramaattisia tuloksia havaittiin

PSMA1

Knockdown ovat vastakkaiset kuin aiemmin havaittu bortetsomibin kanssa

in vivo

, mukaan lukien geneettisesti hiiren malleissa (GEMMs) keuhkojen adenokarsinooma [40]. Koska tulokset

PSMA1

Knockdown, kyky Bortetsomibin ja radiosensitize NCI-H460 -ksenografteissa tutkittava, saattaa olla suurempi kasvaimia tuhoavaa vaikutusta tämän yhdistelmähoitoa. Ei ollut merkitsevää eroa eloonjäämisen hoidettujen hiirien sädehoidon kanssa tai ilman bortetsomibilla (kuva S5). Sen määrittämiseksi, onko tämä johtui huonosta kasvain huumeiden levinneisyys, kymotrypsiinin kaltainen proteasomiaktiivisuus tutkittiin käsitellyt kasvaimet tai ilman bortetsomibilla verrattuna kasvaimiin tai ilman PSMA1 knockdown. Oli huomattavasti proteasomin esto seuraavista PSMA1 Knockdown verrattuna seuraaviin bortetsomibiin (kuva S6). Tämä viittaa siihen, että rajoitettu tehoa havaittu bortetsomibilla

in vivo

saattaa liittyä huono kasvain huumeiden levinneisyys, mikä selittäisi eroja tuloksiin

in vitro

ja

in vivo

.

keskustelu

tämän tutkimuksen tarkoituksena oli luoda perusteet proteasomin esto strategiana NSCLC säteilylle herkäksi. Me perusteltu, että koska DNA kaksinkertainen katkeamisen (DSB: t) korreloi sytotoksisuuden ionisoivan säteilyn (IR) [26], aineet, jotka viivästyttävät korjaus näiden taukojen voivat toimia säteilyherkistimet. Niinpä havaitsimme pienenemistä homologinen rekombinaatio (HR) seuraava proteasomin esto, merkittäviä viivästyksiä DNA: n DSB korjaus sekä

in vitro

ja

in vivo,

ja kevyemmästä IR-indusoitua ja vahingot site lokalisointi DNA: n korjaukseen proteiineja. Proteasomiestäjät toiminto, ainakin osittain, estämällä NF-KB-reitin häiritsemällä hajoamiseen IκBα, joka estää loppupään NF-KB: n aktiivisuuden [34], [35]. Bortetsomibi laski IR-indusoitua seuraavat proteasomin esto Fanconin anemia (FA) /BRCA-geenien, joista suurin osa on oletetun NF-KB: n sitoutumiskohtia [33]. Mikä tärkeintä, me pelastettiin bortetsomibilla aiheuttama radioherkkyyttä hiljentämällä IκBα, joka tukee ehdotetun mekanismin. Proteasomiestäjät Siten näyttää siltä, ​​radiosensitize NSCLC häiritsemällä DNA: n DSB korjaus vähentämällä ilmentymisen avaimen NF-KB: n indusoitavissa HR geenejä.

Vaihtoehtoinen selitys vaikutuksia proteasomin inhibitio on radioherkkyyttä kautta apoptoosin . Monet tutkimukset ovat osoittaneet apoptoosin lisääntyminen seuraavissa bortetsomibihoidon [41]. Apoptoosi ei ole osoitettu, koska vallitseva solukuoleman säteilytettyä NSCLC. Esimerkiksi suurina annoksina kuten 20 Gy säteilytys A549 tai NCI-H460-soluissa, jolloin saadaan määriä apoptoosia vain 5-35% [42]. NCI-H460-soluissa joille annettiin 2 Gy IR ja bortetsomibilla osoittivat lisääntynyttä apoptoosia verrattuna jompikumpi hoito yksinään. Huomattavaa on, että pysyvyys DNA DSB: t säteilytyksen jälkeen soluja altistetaan proteasomin estäjinä voidaan myös itse edistää apoptoosin.

Havaitiin kasvun hidastumista NSCLC ksenograftien seuraavista proteasomin esto yhdistettynä RT. GEMMs keuhkosyövän voidaan vahvistaa vaikutuksen ensisijainen keuhkokasvaimia käsitelty

in situ

. Exploring tämä useissa GEMMs voi olla lisäetu tunnistaa genotyyppejä jotka erityisesti reagoivat proteasomin esto. Esimerkiksi kasvaimet johtuvat hiiristä kätkeminen indusoituva

KRAS

ja

TP53

mutaatioita vastasi bortetsomibille, toisin kuin kasvaimet hiiristä kanssa mutantti

KRAS

ja villin tyypin

TP53

[40]. Havaitsimme selviä eroja selviytymisen indusoituvan proteasomin Knockdown NSCLC ksenografteissa ilmentävät villityyppistä

TP53

, joka on ristiriidassa näiden tuloksia. Ehdotamme, että yhdistettynä säteily saattaa potentiaalin hyödyntämiseksi proteasomin esto useammanlaisiin kasvaimen genotyyppien.

hyväksyminen proteasomiestäjät klinikalla edellyttää parannuksen kasvaimen toimitukseen. Bortetsomibi tuotti suhteellisen vähän proteasomin esto meidän ksenograftin tutkimuksessa verrattiin Doksisykliinille aiheuttama

PSMA1

shRNA knockdown. Strategiat lukien liposomaalisen kotelointi, jota on menestyksellisesti käytetty doksorubisiini [43], tai käyttämällä toisen sukupolven proteasomiestäjät kuten carfilzomib, marizomib tai MLN9708 [44] voi parantaa kiinteä kasvain tunkeutumista ja proteasomin esto.

tulokset proteasomin esto NSCLC hoidetuilla potilailla ilman sädehoitoa on sekoitettu [16], [17]. Proteasomin esto tutkittiin samanaikaisen kemosädehoito yhdessä vaiheen I tutkimuksessa kahdentoista potilaista [45]. Tässä annoksen suurentamista tutkimuksessa potilaat, joilla patologisesti dokumentoituja Vaihe IIIA-B sairaus, saivat viikoittain karboplatiinin ja paklitakselin yhdessä bortetsomibilla 0,3-0,7 mg /m

2 kahdesti viikossa, sädehoidon aikana, kun annosta nostettiin 61,2 Gy 34 päivittäin jakeet, jonka jälkeen kirurginen resektio. Ei ollut odottamattomia välitön myrkyllisyys aikana kemosädehoito; Grade 2-3 myelosuppressio oli yleinen, odotetusti karboplatiinin ja paklitakselin. Valitettavasti kuitenkin kolme yhdeksästä potilasta, joille tehtiin kirurginen resektio kuoli leikkauksen jälkeen; kaksi kuoli kaksi-kolme päivää leikkauksen jälkeen ja kolmas kuoli 21 päivää leikkauksen jälkeen. Todettiin, että viivästynyttä toksisuutta oli kova ja arvaamaton. Kuitenkin kaikki kolme potilasta oli tehty oikean pneumonectomy annokset ovat suuria neoadjuvant kemosädehoito. Oikea pneumonectomy seuraava neoadjuvant hoito on liittynyt merkittävästi lisääntynyt kuolleisuusriski riippumatta lisäämällä uusia systeemisiä aineita. Esimerkiksi on ollut raportoitu 18% hoitoon liittyvän kuolleisuuden jälkeen oikean pneumonectomy, verrattuna 4% korko jälkeen vasemmalle pneumonectomy, kun neoadjuvant sädehoito mediaani annos 54 Gy samanaikaisen kemoterapian [46].

Mikä oli huomattava noin faasin I tutkimuksessa [45] oli korkea patologisten täydellinen vaste (pCR) havaittu hoidetuilla potilailla neoadjuvant kemosädehoito lukien bortetsomibi. Näytteet viidestä yhdeksästä potilaista (56%), joille tehtiin kirurginen resektio oli PCR: n ja lisäksi kaksi osoitti 99% kuolion. Tätä voidaan verrata myönteisesti 17,7% pCR verrattuna vuoteen INT-0139 seuraavat neoadjuvant kemosädehoito joukossa 164 potilasta, joille tehtiin resektio [47]. Nämä tiedot viittaavat siihen, että huolellisesti, proteasomin esto voi olla syytä tutkia edelleen yhdistettynä radikaaliin kemosädehoito, ehkä nonsurgical ehdokkaita tai vasemman puolinen tai muita kasvaimia, jotka eivät edellytä oikeutta pneumonectomy varten resektio.

Lopuksi, proteasomin estäjät voivat suhteettoman hyötyä potilaille, joiden kasvaimet luottaa HR välittämän korjaus säteilyn aiheuttaman DNA DSB: itä. Esimerkiksi korkea RAD51 proteiinin ilmentyminen on liittynyt vähentynyt selviytymisen NSCLC potilaiden [48]. Myös huonosti eriytetty NSCLC kasvaimet ovat lisääntyneen ilmentymisen HR geenien [49]. Vuonna analyysi Julkaistujen microarray tietojen 442 potilaista [9], korkea

RAD51

ja

BRCA1

olivat kukin liittyy pienentynyt kokonaiselinaikaa (Kuva S7). Nämä ominaisuudet voivat toimia biomarkkereita ennustavan vasteen proteasomi estäjien säteilyherkistimet. Myös vähennykset säteilyn aiheuttamista DNA: n DSB korjaus proteiinia pesäkkeitä, kuten FANCD2 ja BRCA1, hoidon jälkeen proteasomiestäjät, voivat toimia biomarkkereita vastauksena käsitellyissä kasvaimissa.

Materiaalit ja menetelmät

Reagenssit

Bortetsomibi ostettiin Selleck Chemicals (Houston, TX). 800 mM varastot DMSO säilytettiin -20 ° C: ssa, ja ennen käyttöä laimennettiin ja säilytettiin 4 ° C: ssa jopa viikon. Kaikki hoidot olivat loppukonsentraatioon 30 nM A549 tai 50 nM NCI-H460, ellei toisin mainita. Seuraavia vasta-aineita käytettiin lueteltujen laimennoksina Western immunoblot: PSMA1 (ARP40417, Aviva Systems Biology, San Diego, CA, 1:2000), PSMB5 (BML-PW8895, Enzo Life Sciences, Farmingdale, NY, 1:1000), FANCD2 (sc-20022, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, 1:200), vinkuliini (sc-25336, Santa Cruz Biotechnology, 1:1000), anti-hiiri (NA931v, GE Healthcare UK United, Little Chalfont, Buckinghamshire , UK, 1:3000) ja anti-kani (NA934v, GE Healthcare UK United, 1:3000) piparjuuriperoksidaasi sidottu toissijainen vasta-aineita. Seuraavia vasta-aineita käytettiin lueteltujen laimennoksina immunofluoresenssilla: BRCA1 (sc-6954, Santa Cruz Biotechnology, 1:50), RAD51 (PC-130, EMD Millipore, Billerica, MA, 1:1000), FANCD2 (sc-20022 https://array.nci.nih.gov/caarray/project/details.action?project.experiment.publicIdentifier=jacob-00182.