Krooninen sairaus

tiivistelmä

Aberrant Wnt /β-kateniinin signalointi on voimakkaasti liittyy kasvaimen kehittymisen ihmisen kolorektaalisyövän. Estävät tätä reitti voi sitten tarjota terapeuttisia strategioita sekä kemopreventiossa tähän pahanlaatuinen sairaus. Henryin on ent-kaurane diterpenoidinen eristetty

Isodon

rubescens

var.

lushanensis

, kasvi pitkään käytetty kansanlääkinnässä estämään tulehdusta ja ruoansulatuskanavan sairaus. Tässä tutkimuksessa raportoimme että henryin estää selektiivisesti proliferaatiota ihmisen peräsuolen syövän solut GI

50 arvoa nano-molaarinen alue. Mikrosiruanalyysi ja toimittaja analyysit osoittivat, että henryin toimi uutena antagonisti Wnt-signalointireitin. Henryin vähensi ilmaus sykliini D1 ja C-myc, ja indusoi G1 /S faasin pysähtymisen HCT116-soluissa. Samanaikaisesti henryin ei vaikuttanut sytosoliin ydinvoimaa jakelun liukoisen β-kateniinin, mutta alentunut yhdistys β-kateniinin /TCF4 transkription monimutkainen todennäköisesti läpi suoraan estää sitoutumisen β-kateniinin ja TCF4. Olemme myös analysoidaan rakenne-aktiivisuussuhde keskuudessa ent-kaurane tyyppinen diterpenoidit. Tuloksemme viittaavat siihen, että henryin, uutena estäjä Wnt signaloinnin, voisi olla potentiaalinen ehdokas edelleen prekliininen arviointi paksusuolen syövän hoitoon, ja siten optio syvemmin.

Citation: Li X, Pu J, Jiang S, Su J, Kong L, Mao B, et al. (2013) Henryin, joka on ent-kaurane diterpenoidinen, Estää Wnt Signaling häiritsemällä β-kateniinin /TCF4 Vuorovaikutus peräsuolen syövän solut. PLoS ONE 8 (7): e68525. doi: 10,1371 /journal.pone.0068525

Editor: Chunming Liu, University of Kentucky, Yhdysvallat

vastaanotettu 4 maaliskuuta, 2013 Hyväksytty: 30 toukokuu 2013; Julkaistu: 02 heinäkuu 2013

Copyright: © 2013 Li et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat sekä 100 Talents ohjelma (YL) ja West Light Foundation (JP) Kiinan tiedeakatemia, Major valtion Basic Research Development Program of China (nro 2009CB522300), Natural Science Foundation of China (No. 81173076, 81172939), ja Recruited Top Talent of Sciences and Technology Yunnanin maakunnassa (2009C1120), Kiina. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

peräsuolen syöpä (CRC) on yleinen maligniteetti, että huolimatta edistysaskeleista lääkehoidon ja parantunut diagnoosi, on edelleen suuri haaste hoitolaitos maailmanlaajuisesti. Vaikka tarkkaa sairauden patogeneesiin ei ole selvästi ymmärretty, krooninen tulehdus suolistosairaus katsotaan riskitekijä, joka edistää kehitystä ja etäpesäkkeiden paksusuolisyövän [1]. Lukuisat tutkimukset ovat kuitenkin ehdottaneet, että poikkeava aktivaatio kanonisen Wnt /β-kateniinin signalointireitin tärkeä rooli kasvainten synnyssä. Puuttuessa Wnt-ligandien, β-kateniinin fosforyloituu monimutkainen, mukaan lukien adenomatoottisen polypoosin coli (APC) /DSH /ak- siini /GSK3p, joka sitten ubikitinoituja vajaatoiminnan kautta proteasomin reaktiotien. Kun reitti aktivoidaan sitoutumisen Wnt-ligandien sen membraanireseptorin monimutkainen, β-kateniinin tuhoa kompleksi dissosioituu ja β-kateniinin vakiintuu ja siirtyy tumaan aktivoida kohdegeenin ilmentymistä rinnalla TCF transkriptiotekijöiden [2,3 ].

paksusuolen syöpäsoluja, Wnt /β-kateniinin reitin usein poikkeavasti aktivoidaan [4-6]. Uusimpien raporttien Cancer Genome Atlas Network, Wnt reitin konstitutiivisesti aktivoitu yli 90% ihmisen paksusuolen ja peräsuolen syövän sekä geneettiset epigeneettiset muutokset useita geenejä, jotka osallistuvat Wnt signalointireitillä, kuten β-kateniinin APC ja Axin2 [7]. Aktivointi Wnt /β-kateniinin signaloinnin myöhemmin kasvattaa ilmentymisen Wnt kohdegeenien, kuten sykliini-D1 [8], C-myc [9] ja surviviinin [10], jotka kaikki ovat mukana solujen lisääntymisen, apoptoosia ja solusyklin sääntelyn purkamisen kehittymistä ja etenemistä pahanlaatuinen kolorektaalisyövän fenotyypit [11-13].

Toistaiseksi etenee hoidossa ja diagnosoinnissa paksusuolisyövän edelleen rajoitettu niiden tehokkuutta, kannustavat harkitsemaan vaihtoehtoja liikkuviin eteenpäin. Kansanlääkinnässä, jotkut

Isodon

lajeja, laajalti kasveja, joita käytetään teetä juoda estää tulehduksia, ruoansulatuskanavan bakteeri-infektiot ja jopa kasvaimia. Oletimme, että kemiallisia aineita esiintyy joissakin

Isodon

laji todennäköisesti hallussaan chemopreventive ominaisuuksista sekä kemoterapeuttinen vaikutuksia syöpää vastaan. Meidän edellinen työ, monia kemiallisia ainesosia eristettiin ja karakterisoitu

Isodon

lajeja, mutta tutkimus niiden bioaktiivisten profiili on hyvin rajallinen ja mekanismit puuttuvat [14-16].

Nykyinen tutkimus keskittyy seulonta yhdisteitä, jotka antavat antituumorivaikutuksia, erityisesti paksu- ja syöpäsoluja. Huomasimme, että henryin, joka on ent-kaurane diterpenoidinen, eristetty

Isodon

rubescens

var.

lushanensis

, esiintyi valikoivaa kasvua inhiboivia vaikutuksia ihmisen peräsuolen syövän soluja estämällä Wnt signalointia. Tuloksemme osoittivat, että henryin häiritsee β-kateniinin /TCF monimutkainen vuorovaikutus ja indusoi G1 /S-vaiheessa pidätyksen peräsuolen syöpäsoluja. Niinpä henryin, uusina estäjä Wnt /β-kateniinin koulutusjakson voisi lupaava lääke-ehdokas sekä ehkäisyyn peräsuolen syövän sekä uusia terapeuttisia.

Materiaalit ja menetelmät

reagenssit

RPMI 1640-väliaine, Dulbeccon modifioitu Eaglen väliaine (DMEM), naudan sikiön seerumia (FBS), antibiootteja liuosta, ja trypsiini-EDTA ostettiin HyClone (Logan, UT, USA). Täydellinen proteaasiestäjäseostabletit ostettiin Roche Applied Science (Indianapolis, IN, USA). Hiiren monoklonaalinen anti-CyclinD1 ja anti-β-kateniinin vasta-aineet hankittiin BD Biosciences (San Jose, CA, USA). Kanin monoklonaalista anti-TCF4 ja polyklonaalista anti-fosfo-β-kateniinin-vasta-aine hankittiin Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA). Kanin monoklonaalista anti-p21 hankittiin Epitomics, Inc (Burlingame, CA, USA). Hiiren monoklonaalinen anti-lamiini A /C, anti-β-aktiini, anti-c-Myc-vasta-aineiden ja muiden reagenssien, ellei toisin ole mainittu, ostettiin Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Puhdistettu ihmisen rekombinanttiproteiineja β-kateniinin ostettiin Sino biologisista inc. Puhdistettu ihmisen rekombinanttiproteiineja TCF4 ostettiin Origene. Dual-lusiferaasireportterigeenin määritys järjestelmä hankittiin Promega (Madison, WI, USA). Lipofectamine 2000 ostettiin Invitrogen (Camarillo, CA, USA). QuantiTect SYBR Green PCR Kit saatiin Qiagen (Saksa).

yhdisteet

Henryin ja sen analogien uutettiin

Isodon

rubescens

var .

lushanensis

, kuten aiemmin on kuvattu [14-16]. Yhdisteet liuotettiin dimetyylisulfoksidiin (DMSO).

Solulinjat

Colon syöpäsolulinjoissa (SW480, HT-29 ja HCT116), ihmisen keuhkosyövän solulinjassa A549, ihmisen normaalia keuhkoepiteelin solulinja (Beas-2B) ja HEK293T- ostettiin ATCC. Normaalit paksusuolen epiteelisolulinja (CCD-841-Con) [17] ystävällisesti lahjakas tohtori Lin, Li instituutin Biokemian ja solubiologian, Kiinan tiedeakatemia (Shanghai, Kiina). Soluja viljeltiin mukaisesti valmistajan suositusten mukaisesti. Kaikki väliaine täydennettiin 10% naudan sikiön seerumia (FBS) ja 1% antibiooteilla-antimykootteja (100 yksikköä /ml G-penisilliini, 100 mg /ml streptomysiiniä) (Gibco, Invitrogen, USA).

MTS-määritys ja GI

50 määritys

Solut ympättiin 96-kuoppaisille levyille tiheydellä 5 x 10

3cells /kuoppa ja inkuboitiin 12h on CO

2-inkubaattorissa. Soluja käsiteltiin annoksen vaihtelevat 0,008 4 uM of henryin ja sen analogit, sisplatiiniin positiivisena kontrollina 48 tuntia. Sitten, 20 pl CellTiter 96® vesikerros Solution Reagent (Promega, Madison, USA) lisättiin ja soluja inkuboitiin edelleen 37

° C 1-2h. Solujen elinkelpoisuus mitattiin sitten lukemalla absorbanssi aallonpituudella 490 nm. Seuraavaa kaavaa käytettiin määrittämään solujen kasvun suhteen arvot: 100 * (A490 (näyte, T) – A490 (näyte, T0)) /(A490 (kontrolli, T) – A490 (kontrolli, T0)). GI

50-arvot-pitoisuudet, jotka aiheuttavat 50% solujen kasvun esto-määritettiin ei-lineaarisella regressioanalyysillä käyttäen TableCurve ohjelmistoa.

Microarray ja data-analyysi

SW480-soluja inkuboitiin jossa 4 uM ja henryin tai dimetyylisulfoksidia (DMSO) kontrollina 12 tuntia. Solut hajotettiin TRIzolia (Invitrogen, USA) ja koko RNA: t eristettiin QIAGEN RNeasy Mini Kit (QIAGEN, Saksa) ennen käänteistranskriptio, merkintöjä ja hybridisoimalla Agilent kaikkiaan Human Genome Oligo Microarray (4 × 44K) (Agilent Technologies, Palo Aito, CA). Microarray määritys suoritettiin Shanghai Bio Corporation. Jälkeen GO huomautusta ja reitti analyysi, geenejä, joissa on enemmän kuin 2-kertaiseksi muutos ilmentymisen taso valittiin lisäanalyysiä.

Cell transfektio ja lusiferaasin toimittaja määritykset

reportterigeenin määritykset, solut siirrostettiin 96-kuoppalevyille ja inkuboitiin 37 ° C: ssa, 5% CO

2-inkubaattorissa 12 tuntia. SW480 ja HCT116-solut ko-transfektoitiin 100 ng plasmidien yhteensä, mukaan lukien 80ng on hyvin tunnettu Wnt /β-kateniinin reittiin reagoivat tulikärpäsen lusiferaasireportteriplasmidi SuperTOPflash (ST-Luc) ja 20 ng PRL-SV40 (Promega) ohjaus reportteri plasmidi käyttämällä Lipofectamine 2000 (Invitrogen) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Kukin kuoppa HEK293T-solujen transfektoitiin 200 ng plasmidien yhteensä, mukaan lukien 80ng ST-Luc ja 20 ng PRL-SV40 ja 10 ng β-kateniinin tai 64ng ja wnt1 ja tyhjän vektorin plasmidit kuten on osoitettu. Jotkut 3h transfektion jälkeen soluja inkuboitiin eri pitoisuuksien yhdisteiden 24 tuntia. Solut hajotettiin 50 ui Promega lyysipuskuria kussakin kuopassa, ja lusiferaasin aktiivisuus mitattiin ja normalisoitu PRL-SV40 toimittaja aktiivisuutta. Kaikki kokeet tehtiin itsenäisesti kolmena kappaleena. Tulokset raportoidaan keskiarvot ja keskihajonnat (SD).

Käänteinen transkriptio ja kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR

Kokonais-RNA uutettiin viljellyistä soluista, joissa TRIzol ja käänteistranskriptio suoritettiin käyttäen SuperScript III Reverse Transcription Kit (Invitrogen) oligo (dT) pohjustus mukaan valmistajan ohjeiden. Geenitranskriptien kvantifioitiin reaaliaikaisella PCR: llä käyttämällä SYBR Green I ja β-aktiini käytettiin kontrollina. PRIMES käytettiin:

Human CyclinD1 eteenpäin aluke: 5′-AAGTGCGAGGAGGAGGTCTT-3 ’ja käänteinen aluke: 5′-GGATGGAGTTGTCGGTGTAGA-3’.

Ihmisen C-myc eteenpäin aluke: 5 ”-CTTCTCTCCGTCCTCGGATTCT-3 ’ja reverse-aluketta: 5′-GAAGGTGATCCAGACTCTGACCTT-3’.

Ihmisen β-aktiini-forward-aluke: 5′-CGCGAGAAGATGACCCAGAT-3 ’ja reverse-aluketta: 5’-GATAGCACAGCCTGGATAGCAAC-3 ”.

RT-PCR-kokeet suoritettiin kolmena rinnakkaisena ja PCR tehokkuutta annetaan alukkeilla oli välillä 95 ja 100%. Sulamiskäyrät suoritettiin myös seurantaan aluke-spesifinen monistuksissa.

sytosoliin ja ytimen fraktiointi- ja western blotting-analyysi

SW480-soluja käsiteltiin henryin 6-kuoppaisille levyille. Fraktioitu ydin- ja sytosolin lysaatit saatiin käyttämällä ydin- uuttopuskuria ja hypotoninen lyysipuskuria, vastaavasti. Kaikki proteiiniuutto puskurit täydennettiin Complete proteaasiestäjäseostabletit ja fosfataasinestäjällä cocktail (Roche). Proteiinipitoisuus Kunkin raakaa lysaattia määritettiin käyttäen Enhanced BCA Protein Assay Kit (Beyotime, Shanghai, Kiina). Normalisoitu määrät lysaatin näytteet ladattiin SDS-PAGE: lla ja siirrettiin polyvinylideenidifluoridi (PVDF) (Millipore, Bedford, MA, USA). Immunoblottaus suoritettiin käyttäen vasta-aineita havaitaan fosfo-β-kateniinin (Ser33 /37 /Thr41), β-kateniinin, Axin2, CyclinD1, C-myc, surviviinia P21, TCF4, jossa Lamin A /C ja β-aktiini käytettiin lastaus valvonta . HRP konjugoitua anti-hiiri-IgG ja anti-kani-IgG käytettiin sekundäärisiä vasta-aineita. SuperSignal West Pico kemiluminesenssisubstraatilla (Thermo Scientific) käytettiin tunnistamaan kemiluminesenssin ja blotit kuvattiin käyttäen Luminescent Image Analyzer LAS-4000mini System (GE, USA).

Co-immunosaostusanalyysille

SW480-soluja viljeltiin 6-kuoppalevyille, käsiteltiin henryin ja sen analogit enmenol ja minheryin C: ssa 12 tuntia, hajotettiin proteiini lyysipuskuria (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 1 mM EDTA ja proteinaasi-inhibiittorit) ja sentrifugoitiin 14000 x g: ssä 15 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Supernatantti inkuboitiin tietyn primaarisen vasta-aineen yli yön 4 ° C: ssa ja inkuboitiin sitten A /G-Plus agaroosia (Santa Cruz Biotechnology, Inc.) vähintään 2 tuntia. Sitten helmet pestiin viisi kertaa ja suspendoitiin uudelleen 50 ul: ssa SDS-latauspuskuria. Western blot analyysi suoritettiin näytteistä.

In vitro

sitoutumismäärityksellä

vaikutuksen määrittämiseksi yhdisteiden estämisessä β-kateniinin /TCF4 sitova, puhdistettuja rekombinanttiproteiineja p kateniinin (0.8μg) ja TCF4 (0,5 ug) inkuboitiin henryin ja sen analogit enmenol ja minheryin C ilmoitettuina pitoisuuksina 4 ° C: ssa 2 tuntia, vastaavasti. β-kateniinin /TCF4 kompleksit purettiin käyttämällä proteiini A /G PLUS -agaroosihelmien kyllästetty β-kateniinin vasta-aine. Havaitseminen suoritettiin sitten käyttämällä TCF4 vasta-western blotting -analyysi.

Solusyklianalyysiä

HCT116-soluja (5 x 10

5cells /kuoppa 12-kuoppaisilla levyillä) inkuboitiin henryin varten 0h, 12h ja 24h, vastaavasti. Kaikki tarttuneet solut kerättiin ja pestiin kaksi kertaa PBS: llä. Solut kiinnitettiin 70% etanolilla yön yli. Kiinnitetyt solut pestiin PBS: llä, ja sen jälkeen värjättiin 50 ug /ml propidiumjodidia (PI), joka sisälsi 50 ug /ml RNaasi A: lla 30 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Fluoresenssi-intensiteetti analysoitiin FACSCalibur1 virtaussytometrillä (BD Biosciences, San Jose, CA, USA). Prosenttiosuudet solujen jaetaan eri vaiheissa solusyklin määritettiin käyttäen ModFIT LT 2,0.

Tilastot

Data esitetään keskiarvo ± SD, että ilmoitettu määrä suoritetaan itsenäisesti kokeissa. Epälineaarinen regressioanalyysi laskemiseksi GI

50 tai IC

50-arvot tehtiin TableCurve. Tilastollinen merkitsevyys analysoitiin Studentin

t

-testi tai yksisuuntaista ANOVA in SigmaStat 3.1. Erot katsottiin olevan tilastollisesti merkitsevä, kun P 0.05.

Tulokset

Henryin selektiivisesti estää niiden kasvun paksusuolisyövän soluja ja indusoi G1 vaiheen pysähtymisen solusyklin

kasvun estäminen vaikutukset henryin ihmisen syöpäsoluja oli arvioitiin pääasiassa MTS määrityksissä. Kuten kuviossa 1B on esitetty, henryin esillä voimakkaampaa kasvua estäviä vaikutuksia paksusuolen syövän soluja (SW480, HT-29 ja HCT116) kuin muuntyyppisiä syöpä (keuhkosyövän solulinjassa A549), tai normaaleja soluja (ihmisen normaalia koolonin epiteelisolulinja CCD -841-con ja normaali keuhkojen epiteelisolujen linja Beas-2B). Kontrollina, sisplatiini oli samanlaisia ​​estäviä vaikutuksia kaikkien eri solulinjoissa tutkittiin (kuvio 1C). Analyysi GI

50-arvot henryin ja sisplatiinin erilaisista solulinjojen tukee myös havainto, että henryin oli selektiivinen estävä vaikutus paksusuolen syöpäsoluissa (kuvio 1 D). Kasvua estäviä vaikutuksia henryin on SW480-soluissa osoitti ajan annoksesta riippuvaisella tavalla (tuloksia ei ole esitetty). Solusyklin analyysi osoitti, että solut pidätettiin G1 vaiheeseen HCT116-soluissa käsitelty henryin on ajasta riippuva tavalla (kuvio 1 E). Nämä tulokset yhdessä viittaavat siihen, että henryin näytteillä valikoiva kasvun estoa peräsuolen syövän soluja.

(A) rakenteet henryin ja ent-kaurane näkyvät. (B) kasvun inhibointi henryin eri solulinjoissa, mukaan lukien peräsuolen syöpä solulinjoja (SW480, HCT116 ja HT29), normaali paksusuolen epiteelisolujen linja CCD-con-841, keuhkosyöpä A549, ja normaali keuhkojen epiteelisolujen linja Beas- 2B, määritettiin MTS määrityksiä sisplatiinin kanssa, käytettiin kontrollina (C). Soluja käsiteltiin henryin jopa 72 eri pitoisuuksina. Absorbanssi mitattiin 490 nm: ssä. Kaikki näytteet tehtiin kolmena kappaleena ja tiedot esitetään keskiarvona ± SD. (D) mediaani kasvun esto pitoisuus (GI

50, 72) arvot henryin ja sisplatiinin eri solulinjoissa. (E) edustaja histogrammit kuvaa solusyklin jakelun analysoitiin virtaussytometrialla in HCT116-soluissa käsiteltiin 4 uM ja henryin varten 0h, 12 h ja 24 h vastaavasti. Laskennat G1 vaiheessa olevien solujen lisääntynyt huomattavasti käsitellyssä solujen ajasta riippuva tavalla.

Henryin häiritsee Wnt-signalointi CRC soluissa

Tutkiakseen taustalla olevien mekanismien, joiden kautta henryin estää niiden kasvun peräsuolen syöpäsolujen, toteutimme mikrosiruanalyysi ja korjauksilla geeniekspression testattiin vuonna henryin käsitelty SW480-soluissa. Geenit suodatettiin asettamalla kriteeri kertainen muutos 2 (up-säännelty) tai 0,5 (alassäädetty) kuten differentiaalisesti ilmentyvien geenien. Sekä GO huomautusta ja polku analyysi osoitti, että henryin vaikuttaa voimakkaasti Wnt-signalointireitin, sekä muita muuttunut reittejä, jotka liittyvät kolorektaalisyövän biologisia prosesseja sekä Kegg ja BioCarta tietokantoja (kuvio 2A-B).

( A) (B) Microarray määritys ja tietojen analysointi differentiaali-geenin ilmentymistä henryin hoitoon. SW480-soluja käsiteltiin 12 tuntia kanssa 4 uM ja henryin jossa oli 0,5% DMSO: ta käytettiin kontrollina määrityksessä. GO huomautusta ja koulutusjakson analyysi käytettiin päässä BioCarta ja Kegg tietokantoja, vastaavasti. Geenit käännettävät muuttaminen vähintään 2 (säädelty) tai 0,5 (alassäädetty) otettiin ilmentyvät eri geeneistä. Tietojen analysointi ja tilastot syntyi vasta kun osumia 5 kussakin signalointireitin. Edustavia väyliä saatu microarray data-analyysi on esitetty. (C) Henryin estää Wnt reportteri ilmentymisen annoksesta riippuvalla tavalla wnt1 transfektoiduissa HEK293T-soluissa, ja peräsuolen syövän soluja, SW480 ja HCT116. Kolme tuntia transfektion jälkeen Wnt1 ja /tai ST-Luc, DMSO: ssa tai henryin merkityillä annostusta lisättiin soluihin ylimääräisiä 24 ja lusiferaasin aktiivisuus mitattiin sitten. (D) Henryin (4 uM) inhiboi ensisijaisesti Wnt signalointia (ST-Luc) yli NF-KB-signalointireitin (NF-KB-Luc) in HEK293T-soluissa. Wnt signalointi stimuloi transfektoimalla wnt1 ja NF-KB: n signalointi stimuloitiin 25 ng /ml TNFa. Kukin pylväs on keskiarvo ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta. * P 0,05, ** P 0,01, suhteessa ajoneuvon ohjaus. NS, ei merkittävää.

jälkeen mikrosiruanalyysi, tarkistimme vaikutus henryin on Wnt /β-kateniinin signalointi käyttäen TOPflash reportterimääritys. Vuonna wnt1 transfektoiduissa HEK293T-soluissa, henryin esti Wnt signaloinnin reportteri ilmentymisen annoksesta riippuvalla tavalla 24 tunnin kuluttua hoidon (kuvio 2C). Wnt-signalointi konstitutiivisesti aktivoitu SW480 ja HCT116-soluissa johtuen APC katkaisu- ja β-kateniinin mutaatio, vastaavasti. Molemmissa solulinjoissa, Wnt signalointia myös inhiboi henryin annosriippuvaisesti (kuvio 2C). Samanaikaisesti, henryin ei ollut selvää vaikutusta aktiivisuutta NF-KB: n signaloinnin reagoiva lusiferaasireportterigeenin (NF-KB-Luc) (kuvio 2D). Nämä tiedot viittaavat siihen, että henryin estää spesifisesti Wnt /β-kateniinin signalointi.

Luonnehtia rakenteen ja tehokkuuden suhteen on henryin, tutkimme toimintaa ylimääräisten henryin vastineita (kuvio 3A) ja tutkitaan niiden vaikutuksia Wnt signalointia ST-Luc reportterimääritys. Kaksi yhdisteiden, phyllostachysin F ja oridonin, joilla ketoni ryhmä C-15 ja 14β-OH, samanlainen henryin, oli myös selvä estävä vaikutus ST-Luc aktiivisuutta. Samaan aikaan henryin analogit enmenol, minheryin ja eriocalyxin B, joka ei ole ketoniryhmä C-15 tai 14β-OH, ei ollut vaikutusta Wnt-reportterin aktiivisuutta (kuvio 3B-C). Sen jälkeen, olemme edelleen tutkitaan kasvun inhibition vaikutukset enmenol, minheryin ja eriocalyxin B. Enmenol ja minheryin C, mikä on yhdenmukaista niiden ei-estävää toimintaa Wnt signalointia, ei esiintynyt kasvua estävää vaikutusta paksusuolen syövän soluja (kuvio 3D). Erityisesti eriocalyxin B osoitti vahvaa sytotoksisuutta paksusuolen ja peräsuolen syövän soluja, keuhko- syöpäsoluja ja jopa normaalin solulinjoissa (kuvio 3D). Tämä laaja kirjo sytotoksisuuden eriocalyxin B voisi johtua sen inhiboiva vaikutus NF-KB-reitin, kuten on raportoitu NF-KB-inhibiittori [18]. Nämä tiedot viittaavat siihen, että ketoniryhmä C-15 ja 14β-OH ovat vastuussa henryin estävä vaikutus Wnt signalointia.

(A) rakenteet henryin ja sen analogit. (B) vaikutukset henryin analogeja on Topflash aktiivisuutta HEK293T soluissa. Solut transfektoitiin Wnt1 ja ST-Luc: ssa 3 tuntia ja sitten inkuboitiin henryin ja sen analogien eri annostukset 24 ja sen jälkeen lusiferaasiaktiivisuudet mitattiin. (C) mediaani kasvun esto (GI

50, 72) ja ST-Luc esto (IC

50, 24) arvot henryin ja sen analogit SW480-soluissa esitetään. (D) vaikutukset henryin analogeja kasvuun eri solulinjojen (48 tuntia). Esitetyt tiedot on keskiarvo ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta.

Henryin estää endogeenisen Wnt kohdegeenin ilmentymisen

tarkastetaan endogeenistä Wnt kohdegeenien meidän microarray ja niiden on todettu, että ilmentymistä Wnt kohdegeenien, kuten Axin2, sykliini-D1, SP5, DKK1, NOS1, PPARS ja FGF20, olivat merkittävästi alassäädetty hoidon jälkeen henryin (kuvio 4A). Vahvistaa inhiboivia vaikutuksia henryin ilmenemistä Wnt signalointia kohdegeenien, käsittelimme wnt1 transfektoitu HEK293T ja SW480-soluja henryin 12 tuntia ja seurattiin ilmentymisen C-myc ja sykliini D1 RT-PCR: llä. Tulokset osoittivat, että henryin vähensivät ilmentymisen annoksesta riippuvalla tavalla (kuvio 4B-C). Olemme myös työssä western blot -analyysit havaita proteiinin ilmentymiä sykliini D1, surviviinia Axin2 ja C-myc in HEK293T-, SW480-solut ja HCT116-solut käsiteltiin henryin. Yhdenmukaisesti edellä esitetyt tulokset, proteiini taso Axin2, sykliini D1, C-myc ja surviviinin vähennettiin henryin 24 tunnin sisällä hoidon (kuvio 4D-F).

(A) Henryin alas-säätelee ilmentymistä Wnt kohdegeenien mikrosirulähestymistavassa määrityksessä. (B-C) Henryin estää sykliini D1 ja C-myc ilmentyminen wnt1 transfektoiduissa HEK293T solujen ja SW480-soluissa. Solut käsiteltiin osoitetulla annoksilla henryin varten 12hours. Tasot sykliini D1 ja C-myc mRNA: t määritettiin reaaliaikaisella PCR: llä ja normalisoidaan P-aktiini. (D) vaikutukset henryin ekspressioon Axin2, CyclinD1 ja surviviinia proteiinien wnt1 transfektoiduissa HEK293T-soluissa. Solut transfektoitiin wnt1 3 tuntia ennen henryin hoitoa. (E) vaikutukset henryin ekspressioon Axin2, CyclinD1 ja surviviinia proteiinien SW480-soluissa. (F) vaikutukset henryin ekspressioon CyclinD1, surviviinia, C-myc ja P21 proteiinien HCT116-soluissa. Solut käsiteltiin henryin 6, 12, 24 ja solu-uutteet analysoitiin kanssa western blottaus osoitti proteiineja. β-aktiini käytettiin latauskontrollina. * P 0,05, ** P 0,01, suhteessa ajoneuvon ohjaus.

Henryin häiritsee yhdistyksen β-kateniinin /TCF monimutkainen

Yksi tunnusmerkki aktivointi Wnt signalointia on vakautus- ja ydinvoiman kertymistä β-kateniinin peräsuolen syöpäsoluja. Tarkistimme vaikutus henryin tasosta ja jakelu β-kateniinin SW480-soluissa. SW480-soluja käsiteltiin 24 tunnin ajan kanssa henryin eri pitoisuuksina ja yhteensä β-kateniinin ja fosforyloitua muotoa β-kateniinin tutkittiin (kuvio 5A). Samaan aikaan ydin- ja sytoplasman β-kateniinin tutkittiin käyttämällä western blot analyysiä. Tulokset paljastivat, että henryin hoito ei vaikuta tasoon koko ja fosforyloitua muotoa β-kateniinin, eikä jakelun β-kateniinin ydinvoiman ja sytoplasman osastojen (kuvio 5B), mikä viittaa siihen, että henryin kohdistettu Wnt polun alavirtaan β-kateniinin . Yhdenmukainen edellä seurauksena aktiivisuus ST-Luc että HEK293T solujen β-kateniinin yliekspressoitu heikkeni huomattavasti henryin sekä stabiloitua muotoa β-kateniinin johtuen S37A-mutaatio (kuvio 5C). LiCI: n on estäjä GSK-3β, joka estää fosforylaation ja sitä seuraavan hajoamisen β-kateniinin, mikä johtaa vakauttamiseen β-kateniinin [19]. Ei ole yllättävää, henryin antagonisoi LiCl aiheuttama aktivointi kanoninen Wnt signalointi sekä (kuvio 5C). Yhdessä nämä tiedot viittaavat siihen, että henryin ei vaikuta vakauttaminen β-kateniinin tai sen tumaansiirtymiseen, vaan kohdistuu Wnt signalointia myötävirtaan siitä.

(A) Henryin ei vaikuta kokonaisvahingoista β kateniinin ja pho-β-kateniinin SW480-soluissa. (B) Henryin ei vaikuta jakelu β-kateniinin sytosolissa ja tumassa murto SW480-soluissa. SW480-soluja käsiteltiin osoitetuilla annoksilla henryin 24 tuntia. Solu-uutteista tai fraktiot valmistettiin ja analysoitiin western-blottauksella. Lamin A /C ja β-aktiini käytettiin lastaus valvonta ytimien ja soluliman proteiineja, vastaavasti. (C) Henryin antagonisoi Wnt signalointia stimuloidaan LiCl tai β-kateniinin. HEK293T-solut transfektoitiin ohimenevästi ST-Luc ja β-kateniinin tai konstitutiivisesti aktiivisen β-kateniinin (S37A) plasmidit, vastaavasti, tai käsitelty LiCl (20 mM). Noin 3h transfektion jälkeen tai hoitoon, henryin lisättiin ja soluja inkuboitiin vielä 24 tuntia. Kukin pylväs on keskiarvo ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta. (D) Henryin, mutta ei enmenol ja minheryin C, vähensi TCF4 tasot liittyvät β-kateniinin SW480-soluissa annoksesta riippuvalla tavalla. Soluja käsiteltiin osoitetuilla annoksilla henryin ja sen analogien enmenol ja minheryin C: ssa 12 tuntia ja immuunijärjestelmän-saostus suoritettiin β-kateniinin vasta-hiiri-IgG kontrollina, ja sen jälkeen TCF4 havainnoitiin Western-blottauksella. (E) Henryin suoraan häiritsee vuorovaikutus β-kateniinin kanssa TCF4 in vitro sitoutumismäärityksellä. Ihmisen rekombinantti β-kateniinin (0.8μg) ja TCF4 (0,5 ug) sekoitettiin, inkuboitiin eri pitoisuuksia henryin ja sen analogien enmenol ja minheryin C, ja seos altistettiin samanaikaisesti immunosaostus β-kateniinin vasta-ainetta ja Western blotting-analyysi jossa TCF4 vasta-aineen hiiren IgG kontrollina käytetty. (F) kvantifiointi Länsi blotit esitetty D ja E. ohjelmistoa ImageJ käytettiin analysoimaan voimakkuudet bändejä. Aineisto esitetään keskiarvona ± SD kolmesta kokeesta. Hen, henryin, En, enmenol, Min, minheryin C.

tumaan, β-kateniinin on sitovat transkriptiotekijöitä, TCF-perheen säätelemään kohdegeenin ilmentymistä. Me tarkistanut henryin heikentää β-kateniinin /TCF vuorovaikutusta. SW480-soluja käsiteltiin henryin oli immuuni-saostetaan β-kateniinin vasta-aine tai hiiren IgG: tä kontrollina, ja TCF4 havainnoitiin Western-blottauksella ja blotit analysoitiin ImageJ varten intensiteetin bändejä. Tulokset osoittivat, että henryin voimakkaasti inhiboi TCF4 ja p-kateniinin annoksesta riippuvalla tavalla SW480-soluissa, mutta ei sen analogit enmenol ja minheryin C (kuvio 5D, 5F), joka on sopusoinnussa estävää toimintaa Wnt signaloinnin ja syöpäsolujen kasvua yhdisteiden.

sen määrittämiseksi, onko henryin voi suoraan häiritä vuorovaikutusta β-kateniinin kanssa TCF4, in vitro sitoutumisen määritykset suoritettiin puri fi ed yhdistelmä-β-kateniinin ja TCF4 proteiineja. Tulos osoitti, että henryin voimakkaasti inhiboi TCF4 ja p-kateniinin in vitro sitoutumismäärityksissä, kun taas sen analogit enmenol ja minheryin C ei esiintynyt mitään vaikutusta, kuten odotettua (kuvio 5E, 5F).

Keskustelu

kohdistaminen Wnt signalointi voi edustaa lupaavaa strategia hävittämiseksi pahanlaatuisen sairauden epänormaalin aktivoitumisen tämän reitin. Siten, että yksilöidään uusia estäjiä Wnt /β-kateniinin signalointireitin ovat erittäin tärkeitä ja merkitys. Tämä inhibitio voidaan saavuttaa häiritsevät vuorovaikutusta β-kateniinin /TCF [20], tai CREB sitovan proteiinin (CBP) [21]. Vakauttava Axin2 [22,23] ja aktivointi CK1α myös otettiin tehokkaita mekanismeja estämään Wnt signalointia kohdennettuihin terapeuttisten vastaan ​​paksusuolen syöpää [24]. Aiemmissa tutkimus, useita yhdisteitä on todettu olevan kyky keskeyttää β-kateniinin /TCF yhdistys suoraan, kuten PKF115-854 ja CGP049090 yms.

Viime vuosina on tapahtunut merkittävää kiinnostusta etsittäessä Wnt /β-kateniinin signaloinnin antagonistien luonnontuotteista [25]. Monet rakennetyypit luonnontuotteiden on tunnistettu, jotka estävät Wnt /β-kateniinin signalointi, kuten Murrayafoline [26], Tetrandrine alkaloidi [27], kurkumiini [28], EGCG [29,30], fl avonoids [31, 32], Magnolia [33] ja muut [34,35]. Äskettäin resveratrol ilmoitettiin, joka kykenee inhiboimaan Wnt signalointia myötävirtaan β-kateniinin, mikä edistää tukahduttaminen paksusuolensyöpä tumorigeneesin [36].

Henryin, joka on ent-kaurane diterpenoidinen, eristetty

Isodon

rubescens

var.

lushanensis

ensisijaisesti aiheuttama peräsuolen syöpä solujen kuolemaan jättäen normaalin paksusuolen CCD-Con-841 ja normaali keuhkojen epiteelin Beas-2B solujen vähemmän vaikutusta (kuvio 1 B, D). Olemme tunnistaneet signalointireittejä vaikuttaa henryin paksusuolen syöpäsoluissa microarray-määrityksellä, joista Wnt-signalointireitin havaittiin olevan voimakkaasti muuttunut yksi. Yhdenmukainen microarray tiedot, sekä wnt1 transfektoiduissa HEK293T-solujen ja peräsuolen syövän soluja, henryin esti Wnt-reagoiva toimittaja aktiivisuutta annoksesta riippuvalla tavalla (kuvio 2C). Henryin vähentynyt endogeenistä Wnt kohdegeenien (kuva 4A-F) ja häiritsi yhdistyksen β-kateniinin /TCF transkriptio monimutkainen todennäköisesti suoraan estämällä sitovan O f β-kateniinin ja TCF 4 (kuvio 5D, 5E, 5F).