Krooninen sairaus

tiivistelmä

Colonic mikrobiston käydä imeytymätön ravintokuitua tuottaa ihmeellinen määriä lyhytketjuisia rasvahappoja (SCFAs), jotka hyödyttävät isäntä kautta lukemattomia metabolisen, ravintoketjun ja kemopreventatiivisille vaikutuksia. Kemopreventatiivisille vaikutukset SCFA butyraatti ovat osittain välittyvät induktion p21-geenin ilmentymisen. Tässä tutkimuksessa arvioimme rooli mikroRNA (miRNA) in butyraatti n induktio p21 ilmaisua. Ilmaisu profiilit miRNA HCT-116-solut ja ihmisen satunnaista paksusuolen syöpiin arvioitiin microarray ja kvantitatiivinen PCR. Asetus p21-geenin ilmentymisen miR-106b arvioitiin 3 ’UTR lusiferaasireportterista määrityksiä ja transfektio erityisten miRNA jäljittelee. Butyraatti muuttunut ilmentyminen 44 miRNA HCT-116-solut, joista monet poikkeavasti ilmaistaan ​​paksusuolensyöpä kudoksissa. Jäsenet miR-106b perheen laskivat entisessä ja lisääntynyt jälkimmäisessä. Butyraatti aiheuttama p21-proteiinin ilmentymistä vaimensi käsittelemällä miR-106b matkivat. Mutatoitunut p21 3’UTR-reportterikonstrukteja ilmaistu HCT-116-soluissa vahvisti suoraan miR-106b kohdistaminen. Butyraatti laski HCT-116 lisääntymistä, vaikutus päinvastainen lisäämällä MIR-106b matkivat. Voimme päätellä, että mikrobi-johdettu SCFAs säädellä isäntä geeniekspressiota mukana suoliston homeostaasiin sekä syövän synnyn kautta modulaatio miRNA.

Citation: Hu S, Dong TS, Dalal SR, Wu F, Bissonnette M, Kwon JH, et ai. (2011) mikrobi-Derived lyhytketjuisten rasvahappojen Butyraatilla tavoitteet miRNA-Dependent p21 gene expression in Human Colon Cancer. PLoS ONE 6 (1): e16221. doi: 10,1371 /journal.pone.0016221

Editor: Alfons Navarro, University of Barcelona, ​​Espanja

vastaanotettu: 23 elokuu 2010; Hyväksytty: 16 joulukuu 2010; Julkaistu: 20 tammikuu 2011

Copyright: © 2011 Hu et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustusta Human Microbiome Project (DK083993, HG004858), R37 DK47722 (EBC), K08 DK078046 (JHK), Digestive Disease Research Core Centerin DK-42086 ja University of Chicago, ja ruoansulatuskanavan Research Foundation Associates ”Board (SRD). Harjoittelijat siivitti Research Fellowship Award Crohnin ja Colitis Foundation of America (SH), T35 DK62719 (TSD), ja T32 DK07074 (SRD). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Suurin osa ihmisen satunnaista paksusuolen syöpiä kehittyy vähitellen kertyvät muutokset geenien ilmentyminen muuttaa normaalin paksusuolen epiteelin adenokarsinooma. Tämä prosessi edellyttää vuorovaikutus geneettisten ja ympäristötekijöiden, jälkimmäinen tukema epidemiologinen yhdistyksen välillä lisääntyneen kolorektaalisyövissä ja tekijät, kuten lisääntynyt pitkäikäisyys, altistuminen syöpää ja ruokavalion kehittyneissä maissa [1]. Niistä ehdotettu ruokavalion riskitekijät on alhainen kuitupitoisuus, jotka voivat alentaa hyötyosuutta lyhytketjuisten rasvahappojen (SCFAs), jotka on muodostettu mikrobien anaerobisesta käymisestä ravintokuitua [2]. SCFAs kuten asetaatti, propionaatti, ja butyraatti tuotetaan ihmeellinen määriä ja ovat runsain anionien paksusuolen luminal nesteen ja ulosteet [3]. Näitä mikrobi tuotteita paitsi ovat tärkeä energianlähde paksusuolen epiteelin, mutta myös laajalle levinnyt ravintoketjun vaikutuksia, jotka sisältävät sääntely isäntägeenejä huoltoon osallistuvan suolen homeostaasin [4].

erilaistumaton, erittäin proliferatiivisen pahanlaatuinen solut, butyraatti estää proliferaatiota ja stimuloi niiden erilaistumista läpi erilaisia ​​mekanismeja myös muutoksia DNA: n metylaatio, selektiivinen esto histoni fosforylaation ja histoni deasetylaatiolla (HDAC), ja modulaatio solunsisäisen kinaasisignaloinnin [5] – [7]. Ihmisen paksusuolen epiteelisolulinja (HT29), 221 butyraatti reagoiva osallistuvia geenejä proliferaatiota, erilaistumista ja apoptoosia tunnistettiin [6]. Joukossa geenit muuttaa butyraatti hoito oli paljon mukana solukierron säätelyssä, kuten sykliiniriippuvaiset estäjä p21, GADD45A, ja PTEN [6].

Normaalioloissa leviämisen säädeltyä toiminnan kautta sykliinien, sykliiniriippuvaisten kinaasien (CDK), ja CDK-inhibiittorit, jotka säätelevät siirtymät G1: stä S-vaiheeseen ja G2 mitoosia ja toimia tarkastuspaikkoina estää replikaatio jos DNA on vaurioitunut [8]. Vastauksena indikoivat signaalit DNA-vaurioita, p21 ja p27 sitoutuvat sykliini-CDK-komplekseja ja aiheuttaa solukierron pysähtymisen [8], [9]. Kuitenkin syövän, tässä säännelty prosessi solunjakautumisen ja kasvua menetetään. Esimerkiksi lakkaa toimimasta G1 tarkistuspiste sykliiniriippuvaiset estäjät p21 on liitetty syövän synnyn ja p21 menetys havaitaan 79% paksusuolen syövän kasvaimia immunohistokemiallisesti [10], [11].

Butyraatilla indusoi p21-geenin transkription kautta p53 riippumaton reitti, johon liittyy ei-kilpaileva esto HDAC [12] – [14]. Kuitenkin se mahdollisuus, että jotkut butyraatti tekemien toimien p21-geenin ilmentymisen ehkä välittyvät miRNA-riippuvaisen translaation mekanismeja ei ole aiemmin tutkittu. HDAC-inhibiittorit ovat viime aikoina tutkittu uusi ryhmä syövän epigeneettisiä hoitoon työkaluja, ja HDAC-inhibiittori, suberoylanilide hydroksaamihappo (SAHA), on FDA: n hyväksymä hoitoon ihon T-solu lymfooma [15]. Lisäksi HDAC-inhibiittorit ovat sekaantuneet miRNA sääntelyn erilaatuisia syöpäsairauksia. Hoito rintasyövän solulinjaa SKBr3 kanssa hydroksaamihappo- HDAC estäjä LAQ824 johtanut merkittäviin muutoksiin -40%: n solun ilmaistaan ​​miRNA [16]. SAHA hoitaa ihmisen keuhkojen A549 johtaneet merkittäviin muutoksiin ilmentymisen 64 miRNA [17]. Vaikutuksesta HDAC estäjä ja mikrobien butyraattiesterituote on miRNA ilmentymistä paksusuolensyöpä kudoksiin ei ole tutkittu.

miRNA ovat ~22 nukleotidin, ei-koodaavat RNA: t, jotka on tärkeä rooli säätelyssä solujen lisääntymistä, apoptoosin, ja erilaistuminen [18]. Suurempi kuin 1000 ihmisen miRNA on tunnistettu, ja useimmat uskotaan kohdistaa satoja geenejä [19]. Häiriöstä miRNA ilmaisun voi edistää syövän syntymistä lisäämällä esikasvaintekijän ilmentymisen tai alaspäin säätäminen tuumorisuppressoreilla [20]. Esimerkiksi miRNA säätelevät monet keskeiset proteiineja signalointipolkujen paksusuolen syövän, esim. MIR-106b perheen vähentää p21 ilmaisun ja vaikuttaa solusyklin etenemisen [21] – [23]. Joukossa miR-106b ennusti tavoitteet, vaiennettu p21 siRNA läheisimmin phenocopies miR-106b voitto toiminto [22].

Tässä tutkimuksessa olemme arveltu, että syöpälääkkeen vaikutuksia mikrobin johdettujen SCFA butyraatti voi välittyä osittain muutosten kautta miRNA ilme. Suoritimme miRNA microarray tutkimuksia ihmisen paksusuolen syövän HCT-116-solut käsiteltiin butyraattia ja todettu merkittäviä muutoksia miRNA profiileja, myös vähentynyt ilmentyminen miR-106b perhe. miRNA mikrosiruanalyysi satunnaisen-tyyppinen ihmisen paksusuolen syöpiä löytyi lisääntynyt ilmentyminen miR-106b perhe. Butyraatti havaittiin indusoivan p21 ilmaus, joka liittyy merkittävä väheneminen solujen lisääntymisen. Lisäämällä miR-106b matkivat kääntänyt lisääntynyt p21 ilmaisun ja laski soluproliferaation aiheuttamien butyraattia. Nämä havainnot ovat paljastaneet ainutlaatuisen mekanismin mikrobien vuorovaikutus isännän geeniekspressiota, johon korjauksilla miRNA profiilien hillitä soluun pyöräily ja estää paksusuolen syövän solujen lisääntymisen.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics Statement

Kirurginen ihmisen paksusuolen koepaloja saatiin paksusuolen syöpäpotilaiden yliopistossa Chicagon Medical Center alle protokolla hyväksymä Institutional Review Board. Kirjallinen suostumus saatiin ennen keräämistä kudosnäytteitä. Kaikki kliiniset tutkimukset, joissa käytettiin ihmisen aiheista tehtiin periaatteiden mukaisesti ilmaistu Helsingin julistuksen.

Cell Culture

Ihmisen HCT-116 koolonsyöpäsoluihin hankittiin ATCC. Soluja kasvatettiin 37 ° C: ssa runsaasti glukoosia DMEM-alustassa (Invitrogen), joka sisälsi 10% (tilavuus /tilavuus) naudan sikiön seerumia, 50 ug /ml L-glutamaattia, 50 ug /ml streptomysiiniä ja 50 U /ml penisilliiniä. Soluja käsiteltiin 1-2 mM butyraattia 24 48 tuntia ennen sadonkorjuuta kunkin määrityksen. Solut huuhdeltiin kahdesti ja raaputettiin jääkylmään fosfaattipuskuroituun suolaliuokseen (PBS), pelletoitiin (14000 g x 20 sekuntia), sitten lyysattiin RNA: n ja proteiinin uuttamalla.

Ihmisen paksusuolen koepaloja

Kirurginen ihmisen paksusuolen kudos- kasvainkudoksessa ja ympäröivä normaali esiintyvät paksusuolen limakalvo (vähintään 5 cm: n päässä kasvain raja) saatiin vielä peräsuolen kirurgi. Poistamisen jälkeen koepalat välittömästi jäihin ja huuhdeltiin jääkylmällä PBS: llä ennen solu- lyysiä varten RNA.

miRNA mikrosirujen

Yhteensä RNA eristettiin HCT-116-solut ja ihmisen paksusuolen kudosnäytteitä käyttämällä Mirvana ™ miRNA Isolation Kit (Ambion) mukaan valmistajan protokollaa. HCT-116 solua miRNA analysoitiin käyttämällä miRCURY LNA ™ mikrosiru v.11.0 (Exiqon), joka sisältää sieppauskoettimien suunnattu kaikille miRNA ihmisen, hiiren tai rotan rekisteröity miRBase version 13 Sanger Institute. Kaikki näytteet yhdistettiin luoda yhteinen viite. Yksi ug kokonais-RNA: ta kustakin näytteestä ja yhdistetty yhteisen viitteen leimattiin käyttäen miRCURY ™ LNA Array teho -leimauskitillä (Exiqon, Tanska). Hy3 ™ -merkattua näytteitä ja Hy5 ™ -merkattua viitteenä RNA-näytettä sekoitettiin pareittain ja hybridisoitui miRCURY ™ LNA taulukot. Microarray Levyt skannattu käyttäen Agilent G2565BA Microarray Scanner System (Agilent Technologies, Inc., USA) ja kuva-analyysi suoritettiin käyttäen ImaGene 8.0 ohjelmisto (BioDiscovery, Inc., USA). Määrälliset signaalit Taustakorjatun (Normexp offset-arvo 10) ja normalisoitu käyttämällä yleisiä Lowess (paikallisesti painotettu scatterplot tasoittava) regressio algoritmi [24]. Tiedot ilmaistaan ​​normalisoitu log2 transformoitu Hy3 /Hy5 suhde.

Samalla tavalla, ihmisen koolonin kudokseen miRNA analysoitiin Mirvana miRNA Bioarrays v.2 (Ambion), joka käyttää versiota 8.0 ja miRBase sekvenssin tietokanta. Näytteet leimattiin Mirvana miRNA -leimauskittiä ja hybridisoidaan miRNA bioarrays kohti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Taulukot skannattiin käyttäen GenePix4000B yliopistossa Chicagon Functional Genomics Core Facility. Kaikkiaan 12 miRNA profiilien kertyi 6 pariksi paksusuolen kudosnäytteitä.

Reaaliaikainen PCR miRNA

Yhteensä RNA eristettiin pelletoitiin HCT-116-soluissa Trizol (Invitrogen, Grand Island , NY) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Täydentävä DNA syntetisoitiin kokonais-RNA näytteistä uutettu HCT-116-solut tai ihmisen paksusuolen kudoksiin käyttämällä NCode ™ miRNA First-Strand cDNA Synthesis Kit (Invitrogen). Reaaliaikainen PCR suoritettiin kanssa iCycler (Bio-Rad) käyttäen iQSYBR Green PCR SuperMix- (Bio-Rad), jossa miRNA spesifisillä alukkeilla ja universaali qPCR pohjamaali mukaan valmistajan protokolla NCode Kit (taulukko S1). Kaksivaiheisen määrän pyöräily protokollan (45 sykliä 95 ° C 15 sekunnin ajan ja sitten 60 ° C: ssa 15 sekunnin ajan) käytettiin. Ct-arvo määritellään syklin numero, jossa fluoresenssi ylittää kiinteän kynnyksen vertailutason yläpuolella. Pieni nucleolar RNA, RNU48, mitattiin endogeeninen kontrolli [25]. Sukulaiselle kvantifiointiin, kertamuutoksia mitattiin käyttäen ΔΔCt menetelmällä. Kunkin näytteen Ct arvo kunkin miRNA mitattiin ja verrattiin RNU48 kuin ACt, (ACt = Ct

miRNA – Ct

RNU48). Taitteen muutos miRNA kokeellisissa näytteissä suhteessa kontrolliin näytteet määritettiin 2

-ΔΔCT, jossa ΔΔCt = ACt

Unknown -ΔCt

Ohjaus [26]

.

Real -Aika PCR p21 mRNA

Yhteensä RNA eristettiin pelletoitiin HCT-116-solujen kanssa Trizol. Komplementaarinen DNA syntetisoitiin käyttäen SuperScript III (Invitrogen) ja satunnainen hexonucleotide aluketta. Sense- ja antisense-alukkeina p21 (CDKN1A, NM_000389.3) ovat: 5′-TCACTGTCTTGTACCCTTGTGCTT-3 ’ja 5′-AGAAATCTGTCATGCTGGTCTGCC-3′; GAPDH: 5’-GGCAAATTCAACGGCACAGT-3 ’ja 5′-AGATGGTGATGGGCTTCCC-3’. Reaaliaikainen PCR suoritettiin kanssa iCycler käyttäen iQSYBR Green PCR SuperMix- (Bio-Rad). Kunkin näytteen Ct-arvo p21 mRNA mitattiin ja verrattiin GAPDH endogeeninen valvonnan ACt, (ACt = Ct

p21 – Ct

GAPDH). Kannen muutos miRNA kokeellisissa näytteissä suhteessa kontrollinäytteisiin määritettiin 2

-ΔΔCT.

Western Blot

Pelletöidyt HCT-116-solut homogenisoitiin 10 mM Tris, pH 7,4 , 5 mM MgCl

2, täydellinen proteaasiestäjäseostabletit (Roche Molecular Biochemicals), 50 U /ml DNAasia (Amersham), ja 50 U /ml RNaasia (Ambion). Proteiini kvantifioitiin käyttäen bikinkoniini- happoa menetelmällä. Proteiini solubolized 3X Laemmli luukun ratkaisu kuumentamalla 65 ° C: ssa 10 minuuttia.

Kaksikymmentä mikrogrammaa proteiinia näytteet erotettiin SDS-PAGE: lla ja siirrettiin polyvinylideenidifluoridi (PVDF), 25 mM Tris, pH 8,8 ; 192 mM glysiini; 15% vol /vol metanolia. Membraanit blokattiin 5% paino /tilavuus rasvatonta kuivamaitoa Tween-tris puskuroitua suolaliuosta (TTBS). Primaarisilla vasta-aineilla, jotka ovat spesifisiä p21 (BD Bioscience), Hsc70 (SPA815, Stressgen) ja β-aktiini (Cell Signaling), lisättiin ja inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa. Membraanit pestiin TTBS: llä, inkuboitiin piparjuuriperoksidaasi-konjugoidulla lajien sopivia sekundaarisia vasta-aineita (Jackson Immuno- research, West Grove, PA) 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa, ja kehitettiin käyttäen tehostettua kemiluminesenssia järjestelmä (SuperSignal; Pierce, Rockford, IL).

kvantifiointi kuvien tehtiin skannausdensitometrialla käyttämällä NIH Image J 1,54 ohjelmisto (National Institutes of Health, Bethesda, Maryland).

proliferaatiomääritystä

Solulisääntyminen mitattiin käyttämällä WST-1-reagenssia (Roche Applied Science) mukaan valmistajan protokollaa. HCT-116-soluja viljeltiin 96-kuoppaisella taulu-pohjalevy. Saavuttamisen jälkeen 50% konfluenssiin, kuoppia käsiteltiin ilmoitetun pitoisuuden butyraatti 24 tuntia. Levyt luettiin mikrolevylukijalla 450 nm: ssä ennen ja 45 minuuttia sen jälkeen kun WST-1-reagenssia. Viittaus aallonpituus oli 650 nm. Solujen lisääntyminen laskettiin mukaan valmistajan protokollaa.

Solun transfektio miRNA

TransIT-LT1 (Mirus, WI) transfektioreagenssi käytettiin transfektoimaan HCT-116-solujen muokattua asennuspalveli- 106b (Ambion Pre-mir Mirna prekursorimolekyylit) mukaan valmistajan protokollaa. Kontrolli miRNA (miR-C), joissa on sama GC-pitoisuus, mutta ei sekvenssihomologiaa miR-106b, käytettiin kontrollina. Solut transfektoitiin 48 tuntia ennen sadonkorjuuta.

Luciferase Reporter Analyysit

Modified pGL3 rakentaa kanssa p21 3’UTR alavirtaan tulikärpäsen lusiferaasi koodaava sekvenssi oli antelias lahja Dr. V. Narry Kim laitoksen Biologiset tieteet, Seoul National University [27]. Kuusi tuntia butyraatti hoidon, HCT-116-solut transfektoitiin väliaikaisesti muutettu pGL3 rakentaa ja PRL-TK plasmidit (Renilla lusiferaasin ohjaa tymidiinikinaasipromootteri, E2241, Promega) käyttäen TransIT LT-1 transfektioreagenssia. Solut kerättiin ravistelemalla 500 ui lyysipuskuria (Promega). Firefly ja

Renilla

lusiferaasiaktiivisuudet lysaatissa määritettiin kolmena kappaleena, jossa on Dual-Luciferase Reporter määritysjärjestelmä, mukaan valmistajan ohjeiden (Promega). Firefly lusiferaasiaktiivisuus normalisoitiin

Renilla

lusiferaasiaktiivisuutta.

Tilastollinen analyysi

Tulokset esitetään keskiarvona ± SEM on esitetty lukumäärä kokeita. Tulokset Useiden kokeiden analysoitiin Studentin t-testiä tai ANOVA käyttämällä Bonferroni korjausta monimuuttujille.

miRNA paneelit, kaksisuuntaista T-testiä laskettu välillä näytteen ja viite määrittelivät miRNA p -arvot ovat pienempiä kuin 0,05. Nämä miRNA sitten valittiin tarkempi tutkiminen on RT-PCR.

Tulokset

Butyraatilla muuttaa miRNA ilmentymistä ihmisen paksusuolen syövän HCT-116-solut, mukaan lukien jäsenet miR-106b perheen

tutkia, mitä vaikutuksia butyraatti on miRNA ilmentymistä paksusuolen syöpäsoluissa, ilmentyminen profiilit miRNA in butyraatti saaneilla HCT-116-soluissa mitattiin käyttämällä mikrosirulla. Vehikkelillä käsitellyssä HCT-116-solut analysoitiin kontrollina. Neljäkymmentäneljä miRNA osoitti merkittäviä muutoksia ilmaisun vastauksena voihappoon hoitoon. Muutokset ilmaus 13 26 miRNA joka laski ja 5 pois 18 miRNA että lisääntynyt vahvistettiin käyttäen reaaliaikaista, kvantitatiivinen PCR (Kuva S1). Kolmekymmentä-yksi 44 miRNA muutoksiin ilme näkyvät lämpökartassa vasemmassa paneelissa kuvion 1A. Useita jäseniä miR-17-92a, miR-18b-106a, ja miR-25-106b klustereita oli merkittävästi vähentynyt vastauksena butyraattia.

A) miRNA mikrosiru profiilit tehtiin RNA uutetaan HCT- 116 solut vehikkeliä tai 1 mM butyraattia ja ihmisen paksusuolen kudokset potilailta, joilla satunnaista paksusuolen syöpä ja viereisen normaali-näkymästä kudosta. Data normalisoitiin käyttämällä yleisiä Lowess regressio algoritmi ja ilmaistaan ​​log pohja 2 muuttaneet suhde näytteen signaalin ohjearvo altaan signaali. Lämpö kartat ovat edustettuina. Punainen väri lämpökartassa edustaa lisääntynyt ilmentyminen verrattuna yhdistetystä viittaus ohjaus, ja vihreä edustaa vähentynyttä ilmentymistä verrattuna yhdistetystä valvontaa. Muutokset ilmentyminen miR-17 – 106 perhe varmistettiin reaaliaikaista PCR B) HCT-116-solut ja C) ihmisen paksusuolen kudoksiin. Tulokset ovat keskiarvoja ± SE, n = 4. * osoittaa p 0,05 näytteen kontrolliin verrattuna.

Expression määriä näitä miRNA arvioitiin myös ihmisen satunnaista paksusuolen syöpien ja ympäröivän normaalin esiintyy paksusuolessa mikrosirujen ja näkyvät oikeassa paneelissa kuvion 1A. MiRNA laski butyraatti saaneilla HCT-116-soluja dramaattisesti lisääntynyt tuumorikudoksissa verrattuna normaaleihin kontrolleihin. Mirs-17, -20a, -20b, -93, -106a ja -106b olivat kaikki väheni vastauksena voihappoon hoitoon. Nämä miRNA jakavat saman siemenen alueen sekvenssi ja täten kohdistuvat samaan sitova sivustoja 3’UTRs kohde mRNA: iden. Käyttämällä reaaliaikaista PCR: ää varmistimme, että butyraatti alassäädetty nämä miRNA HCT-116-solut (kuvio 1 B). Olemme myös vahvisti, että nämä miRNA olivat erittäin yli-ilmentynyt ihmisen paksusuolen syövän näytteistä (kuvio 1C), mikä viittaa siihen, että jotkin syövän vaikutukset butyraatti välittyvät tukahduttamalla miRNA jotka yläreguloituja paksusuolen syöpä.

miR -106b estää butyraatti-indusoitua p21-proteiinin ilmentyminen

Ennen tutkimukset osoittivat, että 3 ’UTR: p21, joka säätelee syövän solujen proliferaatiota, sisältää kaksi sitoutumiskohtaa miR-17 – 106 siementen sekvenssin (kuvio 2A) ja estävät näiden miRNA eri syöpätyyppien [tarkistetaan 13-15, 22]. Me siis analysoi vaikutukset butyraatti ja miR-106 jäljittelevät on p21 mRNA ja proteiini tasoilla HCT-116-soluissa. Kuten on esitetty kuviossa 2B ja 2C, butyraatti lisääntynyt p21-proteiinin ilmentymisen nelinkertaisesti 24 tunnin kuluttua hoidosta. Eksogeeninen miR-106b matkivat kostutettua butyraatti aiheuttama p21-proteiinin ilmentymisen verrattuna soluihin hoidettiin butyraatti yksin taas ohjata miRNA-molekyylejä ei ollut vaikutusta p21 ilme.

A) Kaavamainen yhteisiä siementen alueiden miR-17 – 106 b perhe, jotka kohdistuvat p21 3’UTR kahdessa kohteessa. HCT-116-soluja käsiteltiin butyraattia (2 mM) tai ajoneuvon ja transfektoitiin miR-106b matkivat tai valvontaa miRNA (miR-C) 24 tunnin ajan ennen sadonkorjuuta. B) Western-blotit p21, β-aktiini ja Hsc70 näkyvät, ja edustavat 4 erillisiä kokeita kaikki samanlaisia ​​tuloksia. C) Densitometria tulokset Western blotit p21 normalisoidaan P-aktiini. D) p21 mRNA runsaus analysoitiin reaaliaikaisella PCR: llä. Tulokset ovat keskiarvoja ± SE, n = 4. * osoittaa p 0,05 verrattuna pohjapinta. # Osoittaa p 0,05 verrattuna kontrolliin.

vaikutuksen määrittämiseksi butyraatti ja miRNA on p21-geenin ilmentymisen, solun p21 mRNA-tasot mitattiin reaaliaikaisella PCR (kuvio 2D). Butyraatti indusoi 3,6-kertainen p21 mRNA abundancy. Sen sijaan miR-106b matkivat ei ollut vaikutusta p21 mRNA: n ilmentymisen.

3’UTR p21 välittää translaation sääntelyn butyraatti ja miR-106b

vaikutuksen tutkimiseksi asennuspalveli- 106b on translaation säätelyyn p21 ilmentymistä, HCT-116-soluja transfektoitiin ohimenevästi muutettu lusiferaasireportteri- vektorit, jotka sisältävät joko villityypin p21 3’UTR tai p21 3’UTRs sisältävät mutaatioita yhdessä tai molemmat miR-106b sitoutumiskohtia (kuvio 3A). Firefly lusiferaasiekspressio käytettiin arvioimaan cis sääntelyn kautta p21 3 ’UTR. PRL-TK ilmentävä Renilla lusiferaasia kotransfektoitiin valvoa transfektiotehokkuuden. Perusolosuhteissa, mutaatiot yksittäisten miR-106b tavoite alueiden p21 3’UTR nukleotidien 468-474 ja nukleotidit 1148-1154 johti 28% ja 26%: n lisäys lusiferaasin aktiivisuuden (kuvio 3B). Lisäksi mutaatiot sekä miR-106b kohdealueilla johti 57%: n nousu lusiferaasiaktiivisuuden, mikä viittaa siihen, että molemmat sitoutumiskohdat välittävät miRNA inhibition pohjapinta p21 ilmentymistä syöpäsoluissa.

A) Kaaviokuva lusiferaasireportterigeenin konstruktit joka sisältää p21 mRNA 3’UTR, joka sisältää kaksi sitoutumiskohtaa varten miR-17-106b perhe. Mutaatiot syntyi näissä miR-106b kohdesivustot. HCT-116-soluja väliaikaisesti kotransfektoitiin tulikärpäsen lusiferaasi pGL3 vektorit, jotka sisältävät villin tyypin tai mutatoituja p21 3’UTR ja PRL-TK Renilla lusiferaasi kontrollivektorilla. Soluja käsiteltiin myös butyraattia (2 mM) tai ajoneuvon ja miR-106b matkivat tai ohjata miRNA-molekyylejä (miR-C). Solut kerättiin luminesenssimittaus 48 tuntia transfektion jälkeen. B) Basal lusiferaasin ilmentymistä toimittaja rakentaa villin tyypin tai mutantit p21 3’UTR. * Osoittaa p 0,05 verrattuna p21 3’UTR C) Lusiferaasiekspressiota soluissa jälkeen butyraattia ja miRNA hoitoa. * Osoittaa p 0,05 verrattuna kontrolliin. Tulokset ovat keskiarvoja ± SE, n = 4.

butyraatti stimuloi lusiferaasiaktiivisuus 85% kontrolliin verrattuna HCT-116-solut, jotka oli transfektoitu lusiferaasi, joka sisälsi p21-3 ’UTR-vektoriin (kuvio 3C). Butyraatti vaikutuksista lusiferaasiekspressio palautettiin lisäämällä eksogeenista miR-106b jäljittelee, mutta ei määräysvaltaa miRNA-molekyylejä (miR-C). Lisäksi lusiferaasiaktiivisuus HCT-116-solut, jotka oli transfektoitu kimeerisellä vektorilla, joka sisältää sekä mutantti miR-106b kohdesivustot ei muuttunut kanssa butyraatti hoitoon tai butyraatti, kun läsnä on eksogeenisiä miR-106b.

butyraatti vaikutuksesta soluproliferaatiota inhiboituu miR-106b

Koska p21 estää solusyklin etenemistä, tutkimme rooli miR-106b on butyraatti n antiproliferatiivisia vaikutuksia. HCT-116-soluja käsiteltiin useita laimennoksia butyraatti 24 tuntia ja WST-1 proliferaation määritys suoritettiin. Kuten on esitetty kuviossa 4A, butyraatti annosriippuvaisesti inhiboi solujen proliferaatiota. Anti-proliferatiivinen butyraatti pitoisuudet olivat fysiologisen alueella 0,5-20 mM, [28] [29]. Solut, jotka on transfektoitu eksogeenisellä miR-106b tai ohjaus 24 tuntia ennen 2 mM butyraattia altistuminen analysoitiin myös (kuvio 4B). Butyraattia inhiboivan soluproliferaation purettiin lisäämällä miR-106b jäljittelevä molekyylit annoksesta riippuvalla tavalla (kuvio 4B). Sen sijaan ohjata miRNA-molekyylejä (miR-C) ei osoittanut vaikutusta butyraatti inhiboivan solujen lisääntymisen.

HCT-116-solujen lisääntymisen nopeus mitattiin WST-1 leviämisen kit. A) HCT-116-soluja käsiteltiin ilmoitetun pitoisuuden butyraatti tai ajoneuvon 24 tuntia ennen WST-1 mittausta. * Osoittaa p 0,05, verrattuna perustason B) HCT-116-solut transfektoitiin miR-106b matkivat tai ohjata miRNA (miR-C) kanssa ilmoitettuina pitoisuuksina välittömästi ennen käsittelyä, jossa on 2 mM butyraattia. Solut käsiteltiin vain butyraattia analysoitiin ohjaus. * Osoittaa p 0,05 verrattuna butyraatti yksin. Tulokset ovat keskiarvoja ± SE, n = 5.

Keskustelu

Tässä tutkimuksessa tunnistamme, ensimmäistä kertaa, on merkittävä kasvu sääntelyrooli paksusuolen epiteelin miRNA välittämisessä vaikutukset mikrobin johdettujen lyhyt rasvahapon butyraatti isännän geenin ilmentymisen. Mielenkiintoista on, HCT-116-solut, butyraatti tukahdutti monia samoja miRNA kasvoi ihmisen paksusuolen syövissä. Yksi näistä miRNA, miR-106b, havaittiin kohdistaa p21. Butyraatti ja miR-106b hoidettaessa p21 3’UTR lusiferaasireport- konstruktin HCT116-soluissa osoittaa, että butyraatti stimuloimaa p21 ilmentymistä translatorisesti estyy osittain miR-106b. Tämä osittainen inhibitio miR-106b vahvistaa aiemmissa raporteissa, että butyraatti myös säätelee p21 ilmaus kautta miRNA riippumaton mekanismi, kautta estämällä HDAC [7], [13], [14]. Ehdotamme, että mikrobien butyraattiesterituote säätelee solusyklin läpi sekä epigeneettiset ja translaation sääntelyn kautta kaksoisrooli HDAC estäjä ja estäjä miR-106b lauseke (kuva 5).

Butyraatilla estää histoni deactylases (HDAC) , jolloin lisääntynyt histoni asetylaatio, laskivat korkeammat chromatin taitto, ja lisääntynyt transkriptio p21. Butyraatti myös vähentää ilmentymistä miR-106b, ja useita muita miRNA saman siemenen sekvenssin alueella. MIR-106b perheen estää p21 käännös, ja siksi vähentynyt ilmentyminen miR-106b perheen lisäävästi p21 käännös.

Nämä tulokset ovat merkittäviä vaikutuksia suoliston homeostaasiin ja syövän syntymistä. Nämä tiedot viittaavat siihen, että nämä miRNA osansa paksusuolen syövän synnyn ja niiden vähentäminen butyraatti on tärkeä mekanismi sen syöpälääkkeen vaikutuksia. Kuusi näistä miRNA ovat samassa miRNA perhe (miR-17, miR-20a, miR-20b, miR-93, miR-106a, ja miR-106b), jakavat samat siementen sekvenssin, ja siten kohdistaa sama sitoutumiskohtia että 3’UTRs kohde mRNA: iden. Siksi tukahduttaminen niiden kohdegeenien aikana karsinogeeninen prosessi saattaa merkitä kuviollinen soluvaste edistää solujen lisääntymistä ja /tai huolto erilaistumattoman tilan.

Koska monet miRNA sijaitsevat myös introni alueilla koodaavat geenien miRNA vaste todennäköisesti koordinoidaan transkriptionaalisesti aktivoida geenien kokonaisnäytöstä prosessi syövän. Esimerkkinä olennaisia ​​havaintomme, MIR-106b-25 polykistronisesta sijaitsee intronin 13 MCM7 kromosomissa 7q22.1 [23]. MCM7 (minikro- ylläpito proteiini 7) säätelee DNA: n replikaatiota aikana S-vaiheen. Lepäävissä soluissa, ihmisen MCM7 mRNA-tasot ovat lähes huomaamaton, mutta sen ilmentyminen indusoidaan, kuten solujen solusykliin. MCM7 promoottori on kolme E2F sivustoja, kolme GC laatikkoa, ja E box [30]. Maksasolukarsinoomassa (HCC), ilmaus miR-106b esiaste vahvasti korreloi MCM7 ilme, mikä osoittaa, että miR-106b-25 polykistronisesta on koordinoidusti transkriboidaan vaikutuksesta MCM7 promoottori. Ilmentymisen korkeita tasoja, transkriptiotekijän E2F1 HCC korreloi myös lisääntynyt miR-106b ilmentymistä [31]. Mahalaukun syöpäsoluja, E2F1 näyttää myös säädellä miR-106b-25 ilmentyminen samanaikaisesti kasvaa MCM7 ilmaisun [32]. Hiiren fibroblasteissa transformoidaan EIA ja ras, butyraatti vähenee E2F1 selostukset ja proteiinia sekä promoottoriaktivoinnilla [33]. Siten butyraatti saattaa käyttävän vaikutustaan ​​miR-106b ilmaisun kautta laski E2F1 ilmaisua, vaikka lisätutkimuksia HCT-116-solut tarvitaan tutkia tätä mahdollisuutta.

Kuten aiemmin todettiin, häiriöstä miRNA ilmaisun voi vaikuttaa syövän synnyn, kun mirna tavoitteet ovat tuumorisuppressoreilla tai onkogeenien. Vaikka hoito miR-106b johtaa vähentyneeseen p21-proteiinin ilmentyminen, p21 mRNA-tasot eivät muutu, mikä on sopusoinnussa ennen raportteja, että miR-106b säätelee p21 läpi translaation eston sijaan mRNA vakaus [32]. Vaikka miR-106b säätely p21 ilmentyminen on kuvattu monissa solutyypeissä, on ristiriitaisia ​​tietoja mekanismia. Ihmisen maitorauhasen epiteelisoluissa ja normaalin keuhkon fibroblastit, miR-106b vähensi p21-mRNA: n noin 40% [22]. Sen sijaan HCC, p21 ilmentymistä ei havaittu korrelaatiota ilmentymisen miR106b-25 klusteri, eikä näytä olevan tavoitteeksi näiden miRNA tässä solutyypissä [31]. Vuonna ihmisen mahakarsinoo- peräisin oleva solulinja, miR-106b tukahdutettu p21-proteiinin ilmentymisen, mutta ei aiheuttanut merkittävää muutosta p21 mRNA tasoilla [32].

Yhteenvetona olemme löytäneet uuden toimintamekanismi butyraatti n syöpälääkkeen vaikutuksia johon modulaatio miRNA profiilien ja kääntäminen riippuvaa geeniekspressiota. Yhtenä esimerkkinä, butyraatti indusoi p21, keskeinen säätelymolekyyli solusyklin pidätyksen, tukahduttamalla jäsenet miR-106b perhe. Butyraatti esto miR-106b liittyy myös merkittävä lasku syövän solujen lisääntymisen hinnat. Jälkimmäinen on päinvastainen lisäämällä miR-106b matkii. Nämä havainnot ovat paljastaneet ainutlaatuinen esimerkki mikrobien säätely isäntä geeniekspressiota että hidastaa solujen pyöräily ja estää paksusuolen syövän solujen lisääntymisen.

tukeminen Information

Kuva S1.

Butyraatilla merkittävästi muuttaa ilmaus neljäkymmentäneljä miRNA HCT-116-soluissa. HCT-116-soluja käsiteltiin 1 mM butyraattia 24 tuntia. Eristetty kokonais-RNA alistettiin miRNA array hybridisaatio. Neljäkymmentäneljä miRNA osoitti merkittäviä muutoksia ilmaisun vastauksena voihappoon hoitoon. Microarray data normalisoitiin käyttämällä yleisiä Lowess regressio algoritmi ja ilmaistaan ​​log pohja 2 muuttaneet suhde näytteen signaalin ohjearvo altaan signaali. Muutokset miRNA ilmentyminen varmistettiin käyttäen reaaliaikaista, kvantitatiivinen PCR 13 26 miRNA että vähentynyt ja 5 18 miRNA tuo lisääntynyt.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0016221.s001

( TIF)

Taulukko S1.