Krooninen sairaus

tiivistelmä

Pim-1 kinaasia, seriini /treoniini proteiinikinaasi, jota koodaa

pim

esikasvaintekijän, on mukana useissa signalointipolkujen kuten säätelyyn solusyklin etenemisen ja apoptoosin. Monet syöpätyyppeihin suuri joko ekspressiotasot Pim-kinaasien ja erityisesti Pim-1 on liitetty aloittamista ja etenemistä pahanlaatuisen fenotyypin. Useissa syövän kudoksissa somaattisten Pim-1-mutantteja on identifioitu. Nämä luonnolliset variantit ovat nonsynonymous yhden nukleotidin polymorfismien vaihtelut yhden nukleotidin esiintyy koodaavan alueen ja johtavat aminohapposubstituutioihin. Tässä tutkimuksessa tutkittiin vaikutusta aminohapposubstituution rakenteellisista vakautta sekä aktiivisuuden Pim-1 kinaasia. Olemme ilmaisseet ja puhdistettiin joitakin mutantteja Pim-1-kinaasi, jolla ilmaistaan ​​syövän kudoksissa ja raportoidaan yhden emäksen monimuotoisuus tietokantaan. Piste mutaatiot varianttien merkittävästi vaikuta konformaatioon natiivin tilan Pim-1. Kaikki mutantit, jotka on ilmaistu liukoisia rekombinanttiproteiineja, osoittavat vähentynyt terminen ja termodynaamisen vakauden ja alemman aktivointi energia-arvoja kinaasiaktiivisuuden. Vähentynyt vakaus liittyy lisääntynyt joustavuus viittaa siihen, että Pim-1 variantteja voidaan mukana laajempi verkosto proteiinivuorovaikutussuhteiden. Kaikki mutantit sitoutuivat ATP: tä ja ATP: a jäljittelevää estäjien kanssa verrattavissa IC50-arvot viittaa siihen, että tutkittu Pim-1-kinaasi-mutantteja voidaan tehokkaasti suunnata estäjien kehitetty villityypin proteiinia.

Citation: Lori C, Lantella A, Pasquo Alexander LT, Knapp S, Chiaraluce R, et ai. (2013) Effect of Single aminohapposubstituution Havaittu Cancer Pim-1 Kinase termodynaamiset vakaus- ja rakenne. PLoS ONE 8 (6): e64824. doi: 10,1371 /journal.pone.0064824

Editor: Annalisa Pastore, National Institute for Medical Research, Medical Research Council, Lontoo, Iso-Britannia

vastaanotettu: 23 tammikuu 2013; Hyväksytty: 18 huhtikuu 2013; Julkaistu: 05 kesäkuu 2013

Copyright: © 2013 Lori et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Kirjoittajat ei ole tukea tai rahoitusta raportoida.

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Pim-1 kinaasia kuuluu perheeseen seriinin /treoniiniproteiinikinaasit (EY 2.7.11.1), joita koodaa

pim

proto-onkogeenien [1] – [3]. Pim-1-lokuksen on alun perin tunnistettu yhteiseksi Provirusvektorit insertiokohtaan Moloney-hiiren leukemiaviruksen aiheuttama T-solulymfooma hiirissä [4]. Koodattu proteiinikinaasi on mukana useissa signalointipolkujen kuten säätelyyn solusyklin etenemisen ja apoptoosin. Kolme Pim perheenjäsenten Pim-1, Pim-2 ja Pim-3 tunnistettu ihmisillä on raportoitu signalointi proteiinikinaaseiksi tärkeä rooli kasvaindiagnostiikassa [5], [6]. Lisäksi monet syövän tyypit osoittavat korkeat ekspressiotasot Pim kinaasien. Esimerkiksi Pim-1 ja Pim-2 on raportoitu olevan erittäin ilmaistaan ​​leukemia, lymfooma, eturauhassyöpä ja useita myelooma ja katsotaan mukana taudin alkamisen ja etenemisen pahanlaatuisen fenotyypin [7]. Lisäksi Pim-1 on tunnistettu keskeiseksi kofaktorina ekspressiota sääteleviä onkogeenisel- transkriptiotekijän c-Myc fosforyloimalla seriini 10 histoni H3 tehostajana alueella Myc locus ja sen kohdegeenien [8].

Expression Pim-1-kinaasia voidaan saada aikaan erilaisia ​​kasvutekijöitä. Pim-1 homeostaasiin on tärkeä normaali solujen toimintaa. Pim-1 aktiivisuutta siis tiukasti säädeltyä monilla tasoilla kuten transkription, transkription jälkeinen, translaatio- ja translaation jälkeiset. Useat signaalitransduktioteitä on liitetty sääntely Pim-1 ilme. Esimerkiksi Pim-1 ilmentyminen stimuloi aktivoituminen JAK /STAT-reitin joka käsittää myös sen hajoamista kautta negatiivinen kierre. Pim-1 yli-ilmennetään monissa pahanlaatuinen verisairaus ja viimeaikaisten tutkimusten Pim-kinaasien osoittavat, että on tärkeä rooli myös ulkopuolella verisoluista, kuten soluissa useiden kiinteiden kasvainten [6]. Erityisesti, useita syöpäkudoksissa somaattisten Pim-1-mutantteja on identifioitu [9] – [12]. Monet näistä ovat muunnelmia, nonsynonymous yhden nukleotidin polymorfismit (nsSNPs), yhden nukleotidin vaihtelut esiintyvät koodaavan alueen ja jotka johtavat polypeptidin sekvenssi aminohapposubstituutioita [13]. Tärkeää on, kun kasvutekijä stimulaation Pim-1-proteiinin tasot ovat ohimeneviä ja proteiini on lyhyt puoliintumisaika kennojen hajottavat nopeasti ubikitiinipromoottori järjestelmän.

Useat tutkimukset ovat käsitelleet vaikutus nsSNPs proteiinien vakautta, proteiini-proteiini-vuorovaikutuksia ja proteiini toiminnot [14]. Samalla, luonnollisia variantteja on luetteloitu, jonka tarkoituksena on erottaa luonnostaan ​​esiintyviä geneettisiä eroja, oletettavasti ilman toiminnallista seurauksia (matkustajan mutaatiot) kuin kerätään SNP tietokantaan, ja ne liittyvät tautien kehitystä (kuljettaja mutaatiot) [15], koska OMIM tietokannan [16], Human Gene Mutation Database [17] ja erityisesti havaittu liittyvän syövän (COSMIC) [11].

Computational analyysi tunnistettu mutantteja on ennustettu että noin 30% proteiinia varianttien johtuvat nsSNPs ovat vähemmän stabiileja kuin villityyppinen vaihtoehto [18] kuitenkin, kokeellinen arviointi vakauden yhteisten varianttien tarvitaan edelleen määrittää vaikutus mutaatioiden proteiinien rakennetta ja toimintaa [19].

tässä tutkimuksessa valitsimme nsSNPs tuloksena Pim-1 variantteja, jotka ilmaistaan ​​syövän kudoksissa ja raportoitu SNP tietokanta [9], [11], [20]. Nämä Pim-1 variantteja on kattavasti tunnettu siitä, että vaikutuksen tutkimiseksi yhden aminohapon substituutio Pim-1 lämpö- ja termodynaamisen vakauden ja rakenteen liuoksessa. Tutkimuksemme osoitti, että kaikki mutantit tutkittiin aiheuttamaan merkittäviä epävakauteen Pim-1 kinaasia.

Tulokset

Spektroskooppiset karakterisointi Pim-1 Wild Type ja Mutants Löytyy Cancer

tässä tutkimuksessa on valittu neljä mutaatiota (Y53H, E124Q, E135K ja E142D), jotka kaikki on havaittu syövän yksityiskohtainen proteiinin stabiiliuden ja rakenteellinen analyysi käyttäen spektroskooppisia tekniikoita (Fig. 1). Mutantit sijaitsevat katalyyttisen domeenin Pim-1-kinaasi (Fig. 1A). Y53 sijaitsee N-pään kinaasin koru Keski β arkin kehto ja sen amidi typpi muodostaa vety- sidoksen I66 karbonyyliryhmän beeta-säikeen 3 (Fig. 1 B). Jäännös E124 sijaitsee kinaasi sarana-alueen ja muodostaa suolasillan R122 (Fig. 1 C). Sarana-alue on keskeinen osa säännellään C-terminaali lohko liike saa vaikuttaa E124Q mutaatio. E135 sijaitsee helix aD muodostaa vety- sidoksen Q127, joka on todennäköisesti tärkeä vakauttava tämän kierteen (Fig. 1 C). Lopuksi, E142 on pinnalla paljaana jäännöksen ja konservatiivisen substituution ja aspartaatin ei todennäköisesti ole merkittävää vaikutusta proteiinin stabiilisuuteen, dynamiikka ja rakenne.

(A) rakenne Pim-1 (ATE koodi: 1XWS ) esitetty nauha kaavio. Mutatoitunut tähteet on korostettu ja tärkein sekundaarinen rakenne elementit näkyvät. ATP jäljittelevää estäjä sekakiteytetyn tässä rakenne on esitetty pallo ja kiinni edustus. (B) Yksityiskohtainen näkymä paikallisen rakenteellisen ympäristönsä mutatoidun jäännös Y53. (C) Yksityiskohtainen näkymä paikallisen rakenteellisen ympäristönsä mutatoidun jäännös E135. (D) Near-UV-CD-spektrit kirjattiin 1,0 cm kvartsikyvettiin 1,4 mg /ml proteiinipitoisuus 20 mM Tris /HCI, pH 7,5, joka sisältää 0,2 M NaCl ja 2 mM DTT. (E) Luonnostaan ​​fluoresenssiemissiospektrit rekisteröitiin 0,04 mg /ml proteiinipitoisuus (295 nm: n virityksellä aallonpituus) 10 ° C: ssa 20 mM Tris /HCl, pH 7,5, joka sisältää 0,2 M NaCl: a ja 200 uM DTT: tä. (F) Far-UV-CD-spektrit kirjattiin 0,1 cm kvartsikyvettiä 0,2 mg /ml 20 mM Tris /HCl, pH 7,5, joka sisältää 0,2 M NaCl: a ja 0,4 mM DTT: tä.

lähes UV CD spektri villityypin Pim-1 on esitetty spektrin osuus kaikista aromaattiset tähteet ja on ominaista kaksi vahvaa negatiivisten huippujen keskitetty 290 nm: ssä ja 269 nm: ssä sekä hienoja rakenne toimintoja 275-280 nm (Fig. 1 D) . E124Q mutantti näyttää lähes UV CD spektrin läheisesti samanlainen kuin villityypin lukuun ottamatta lievää laskua sakon rakenteen 275-280 nm. E142D näyttää lähes UV CD-spektri, joka yllättäen eroaa villityypin taajuuksia 275-280 nanometrin alueella. Lähes UV CD spektri Y53H on dramaattisesti erilainen kuin villin tyypin spektrin ja muut mutantit: sakon rakenteen 275-280 nm katoaa, osakkuudesta 290 nm on vähentynyt huomattavasti, ja negatiivinen elliptisyydestä noin 269 nm on selvästi muuttunut. E135K lähes UV CD spektri muistuttaa Y53H kanssa huomattavasti vähentynyt dikroistinen toimintaa 290-275 nanometrin alueella ja on myönteinen vaikutus alueen alla 275 nm. Fluoresenssiemissio- spektrit villityypin ja mutanttien kaikki keskittyvät samaan maksimiemission aallonpituus noin 345 nm ja eronnut päästöjen fluoresenssivoimakkuuksien (Fig. 1 E). Far-UV-CD-spektrit kaikki mutantit ovat käytännössä päällekkäisiä kuin Pim-1 villityypin ja tyypillisiä alfa ja beta proteiinia, joka esittää paikallista minimi noin 208 nm, 200 nm nollassa ja 1,52 suhde 208 /222 bändejä (Fig. 1 F).

lämpötila riippuvuus Kinase Activity

lämpötilariippuvuus kinaasiaktiivisuuden Pim-1 villityypin ja sen mutantit tutkittiin lämpötila-alueella 10- 42 ° C (Fig. 2A). Optimaalinen lämpötila katalyysi, vakio ATP-pitoisuus, arvioitiin olevan 37 ° C: ssa villityypin ja E142D, noin 35 ° C: ssa E124Q ja Y53H, ja noin 30 ° C: ssa E135K (taulukko 1 ja kuvio. 2A). On huomattava, että kinaasiaktiivisuuden 37 ° C: ssa kaikkien Pim-1-mutanttien on merkittävästi vähentynyt, ja se vastaa 57, 37, 16 ja 3%, että villin tyypin proteiinin E142D, E124Q, Y53H ja E135K, vastaavasti. Aktivointi energia,

E

‡, määräytyy Arrheniuksen yhtälö (1) lämpötila-alueella välillä 10 ° C ja optimaalinen lämpötila kunkin proteiini on pienempi kuin villi tyyppi (Taulukko 1 ja kuvio. 2B). Tämä tulos viittaa siihen, lisääntynyt joustavuus kaikkien varianttien verrattuna villityypin, erityisesti silloin, E135K. Vertailu lämpötilariippuvuus kinaasiaktiivisuuden rakenteelliset termisen suoristumista seurattiin 209 nm: ssä (Fig. 3A), osoittaa selvästi, että kaikki variantit ovat huomattavasti vähemmän lämpö- kestäviä ja joustavampi kuin villityypin.

(A) lämpötilariippuvuus kinaasiaktiivisuuden Pim-1 villin tyypin ja mutanttien. (B) Ei-lineaariset sovitus lämpötilariippuvuus kinaasiaktiivisuuden on Arrheniuksen yhtälön (yhtälö. 1); upotettu osoittaa lineaarista Arrheniuksen juoni samalle datalle. Määritykset suoritettiin olosuhteissa kuvattu Materiaalit ja menetelmät käyttäen 2,7 uM entsyymiä.

(A) Pim-1 villityypin ja mutanttien kuumennettiin 10 ° C: sta 72 ° C: ssa 0,1- cm kvartsikyvettiä 0,2 mg /ml 20 mM Tris /HCl, pH 7,5, joka sisältää 0,2 M NaCl: a ja 0,4 mM DTT: tä. Puoliläpäisevän aktiivisuus 209 nm seurattiin jatkuvasti jokaista 0,5 ° C. (B) ensimmäinen derivaatta samat tiedot kuin (A). (C) PMTV tallennettuja tietoja samassa esitetyissä kokeissa (A).

Terminen Unfolding

lämmönkestävyys Y53H, E124Q, E135K ja E142D tutkittiin seurataan jatkuvasti elliptisyyden muutoksia 209 nm: n lämpötila-alueella välillä 10 ja 72 ° C: ssa. Tiedot mutantteja verrattiin villityypin proteiiniin (Fig. 3A). Parametrin valittu verrata siirtymäkaarien Pim-1 villin tyypin ja mutanttien on sulamislämpötila (T

m) määritellään keskipisteessä denaturointi- prosessin lasketaan piirtämällä ensimmäinen derivaatta molaarisen elliptisyyden arvoja, lämpötilan funktiona (Fig. 3B). Lämpötila aiheuttama elliptisyytenä muutoksia 209 nm, jossa tärkein amplitudi havaittiin, esiintyy näennäinen osuuskunnan siirtyminen E124Q ja E142D, T

m arvot 40,0 varten E124Q ja 44,0 ° C: ssa E142D. Sillä E135K siirtyminen näkyy yhteistyöhaluttomampiin kanssa T

m-arvo 45,0 ° C ja ilman havaittavaa kertymistä piirtyy väli (s), mikä viittaa siihen, että korvaaminen E135 lysiinitähteellä voi aiheuttaa osittaisen paikallisen kehittymässä ja /tai että tämä muunnos voi esiintyä heterogeeninen populaatio taitettu toteaa. Villin tyypin ja Y53H, näennäinen kolmen tilan terminen siirtymät viittaavat kertyminen piirtyy välituotteiden kaksi T

m arvoja. Ensimmäinen muutos tapahtuu T

m-arvot (T

m1) 40,5 ja 40,0 ° C, toinen (T

m2) 54,0, 52,0 ° C: ssa villityypin ja Y53H, vastaavasti (taulukko 2 ). Lämpötilan aiheuttama elliptisyys muutoksia villin tyypin ja mutanttien ovat kohdakkain lämpöä aiheuttama lisäys valomonistinputken jännite (PMTV) yli 370 V (Fig. 3C), mikä viittaa siihen, että lämpötila-indusoidun kehittymässä liittyy proteiinien aggregaatiota [ ,,,0],21]. Aggregaatiota tapahtui myös kun lämpö skannaukset suoritettiin alemmalla kuumentamisnopeudella kanssa siirtymä ilmeisen T

m alentaa lämpötiloja; eroja ilmenee T

m villityypin ja variantit olivat samat kuin ne, jotka mitattiin korkeammalla kuumennusnopeus (tuloksia ei ole esitetty). Havaitut siirtymät ovat peruuttamattomia, kuten on esitetty spektrit mitattiin lopussa jäähtymisvaiheessa, jotka eroavat natiivien proteiinien mitataan alussa termisen siirtymiä. Lisäksi tarkastus kyvetin lopussa jäähtymisvaiheessa paljasti, että läsnä on suuri määrä sakkaa kaikissa näytteissä.

Effects of Pim-1 mutaatiot ATP ja inhibiittori Sidonta

Mutaatiot havaittu syöpä ovat usein syynä lääkeresistenssin. Olimme siis kiinnostuneita jos estäjä sitovia vaikuttaisi tutkituissa mutaatioita. Ongelman me seulotaan useita tunnettujen Pim-1 inhibiittorit beta-karboliini ja imidazopyridazole luokka [22], [23] lämpötilan muutos määrityksissä [24]. Seulonta sarjaa vastaan ​​estäjän johdannaisten ei havaittu merkitseviä eroja lämpötilan muutos arvojen viittaa siihen, että kaikki mutantit sitoutuvat nämä inhibiittorit samanlaisia ​​sitovia vakio (taulukko S1 ja taulukko S2). Tämän vahvistaa mittasimme entsyymi kineettistä tietoa osajoukko estäjiä. IC 50-arvot Pim-1-inhibiittorit K00487, K018444a ja K00207a olivat 0,048, 0,010 ja 0,007 mM, vastaavasti, Pim-1 villityypin. Nämä arvot olivat hyvin samankaltaisia ​​PIM-1 variantteja, jotka lukuun ottamatta IC50-arvot K00487 ja K00207a, jotka olivat 1.8- ja 1.4-kertainen kasvoi Y53H. Me päätteli siksi, että spesifinen estäjä sitoutuminen ei merkittävästi vaikuta tutkittu mutaatiot.

Urea aiheuttama Equilibrium Unfolding Siirtymät

Pim-1 villityypin ja varianttien reversiibelisti avautua ureaa 10 ° C: ssa 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, joka sisälsi 200 uM ditiotreitolia (DTT) ja 0,2 M NaCl. Lisäävät urean pitoisuuksia (0-8 M) rakennetta Pim-1-mutanttien analysoitiin kauko-UV-CD: n ja fluoresenssispektroskopia ja verrattiin vaikutus kohdistuu villityypin. Luontainen fluoresenssiemissiovoimakkuudessa 345 nm Pim-1 villityypin ja variantit muutosten jälkeen 30 minuutin inkuboinnin 10 ° C: ssa, riittävä aika tasapainon saavuttamiseksi (Fig. 4). Juoni suhteellista fluoresenssin intensiteetin muutoksia vastaan ​​kasvaa denaturanttia keskittyminen näyttää monimutkainen profiileja villityypin ja kaikki mutantit (Fig. 4), mikä viittaa ei kahden valtion kehittymässä prosessi ja väestön denaturointi- väli (s). Monimutkaisuus piirtyy profiilien voidaan katsoa johtuvan multi-domain arkkitehtuuri Pim-1 sisältävien tryptofaanitähteitä sekä N-terminaalin ja C-terminaalin lohkoa proteiinin. Lopussa siirtymisen, yli 7 M ureaa, luontaisen fluoresenssin emission intensiteetti 345 nm: ssä laski noin 1,3-kertaisesti (kuvio. 4) ja maksimaalinen fluoresenssiemissio aallonpituus siirtyy noin 357 nm joko villityypin ja kaikki variantit (tuloksia ei ole esitetty). Samoista näytteistä avulla seurataan fluoresenssiemissio- muutokset (Fig. 4) aikana kehittymässä siirtymisen niitä käytetään mittaamaan pitkälle UV ympyrädikroismilla elliptisyytenä (Fig. 5), jonka avulla suoraan vertailu fluoresenssituloksiin. Urea aiheuttamat muutokset 222 nm elliptisyyden kaikki mutantit ovat samanlaisia ​​kuin villityypin, näyttää sigmoidal riippuvuus urean konsentraatio ja seuraa ilmeinen kahden tilasiirtymän ilman havaittavaa välituotetta (Fig. 5). Kehittymässä prosessi on täysin palautuvia laimentamisen denaturointiaineen joko villityypin tai kaikista mutanttien (Fig. 5), jossa siirtyminen midpoints välillä 4,23 ja 5,34 M ureaa (taulukko 2). Taulukossa 2 esitetään termodynaamiset parametrit arvoihin, jotka saatiin villityypin ja mutantti-muotoja Pim-1: n kauko-UV-CD-siirtymän tiedot. Pim-1 villityypin on huomattavasti stabiilimpi kuin kaikki vaihtoehdot, kuten on esitetty vertailu Δ

G

arvot, että tapauksessa E135K on noin 3,5 kertaa pienempi kuin villityypin (taulukko 2) . Väheneminen Δ

G

voidaan pääasiallisesti tarkoitettu alempaan

m

todetut arvot kaikille varianttien suhteen villityypin. Nämä tulokset osoittavat, että muutos liuotin paljas pinta-ala kun piirtyy on pienempi kaikille Pim-1 vaihtoehtoja kuin villityypin proteiini. Huomattavaa on, että

m

määritetyt arvot Pim-1 villityypin ja sen muunnelmat (taulukko 2) on viisi kertaa pienempi kuin ennustettiin monomeerinen proteiini 272 aminohappotähteen edetessä urea [25]. Alhainen arvot

m

voivat liittyä usean valtion tasapaino piirtyy mukaisesti saatujen tulosten seuranta kehittymässä prosessia luontainen fluoresenssiemissiovoimakkuudessa (Fig. 4).

normalisoitu suhteellinen fluoresenssivoimakkuudet 345 nm; jatkuva viivat edustavat epälineaarinen regressio sovitus suhteellinen fluoresenssivoimakkuudet 345 nm yhtälöön. 5 lasketaan, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. Palautuvuus kohdat on esitetty tyhjät ympyrät ja ei sisälly epälineaarinen regressioanalyysi. Kaikki spektrit rekisteröitiin 10 ° C: ssa, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. (A-C) jae natiivi (

f

N), ensimmäinen väli- (

f

I1), toinen väli (

f

I2) ja laskostumattomassa (

f

U) todetaan, laskettuna kuvattu Materiaalit ja menetelmät käyttäen termodynaamisten muuttujien saatu sopii tasapainotilan kehittymässä siirtyy yhtälöön. 5, on esitetty villityypin (A), E124Q (vihreä) (B) ja E135K (vaaleanpunainen) (C).

Molar elliptisyydestä 222 nm ([Θ]

222 ) raportoitu poistamisen jälkeen korkean taajuuden ääntä ja matalan taajuuden satunnaisen virheen SVD. Jatkuva linjat ovat epälineaarinen regressio yhtälö. 3 dataa vaihtelevalla denaturoivaa ainetta pitoisuuksina, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. Reversiibeliyttä pistettä (tyhjät symbolit) on esitetty selvyyden vuoksi vain villityypin ja eivät olleet mukana epälineaarinen regressioanalyysi. Kaikki spektrit rekisteröitiin 10 ° C: ssa, kuten on kuvattu materiaalit ja menetelmät.

urea-indusoidun kehittymässä siirtymiä seurataan suhteellista fluoresenssin intensiteetin muutokset (Fig. 4) analysoitiin käyttäen neljän tilasiirtymän mallin kaavaan 5, kuten on esitetty materiaalit ja menetelmät. Termodynaamisen parametrit suhteessa kehittymässä prosessi on esitetty taulukossa 3. Tulokset osoittavat, että ensimmäinen siirtymä natiivissa tilassa (N) ensimmäisen välituotteen (I

1) esiintyy Pim-1 villityypin ja kaikki mutantit alle 1 M ureaa, jossa on suurempi Δ

G

arvoa E124Q ja alemman Δ

G

arvoa E135K. Toinen Siirtyminen I

1 toiseen väli- (I

2) esiintyy hyvin samankaltainen ureaa pitoisuusalue kaikille Pim-1-mutanttien tutkinut ja Δ

G

arvot E142D ja Y53H viittaavat vakauttaminen väli näiden kahden vaihtoehdon (taulukko 3). Δ

G

arvo suhteessa viimeiseen siirtymistä denaturoitu tila (U) on merkittävästi suurempi villityypin verrattuna variantteja. Mukaisesti saadut tulokset pitkälle UV CD sigmoidal siirtymiä (taulukko 2), summa Δ

G

arvoa kolmelle siirtymiä on suurempi villityyppisen, verrattuna muihin mutantteja, jossa ottamatta E142D joiden Δ

G

tot on samanlainen kuin villityypin. Erityisesti Δ

G

tot of E135K on merkittävästi pienempi kuin kaikkien muiden vaihtoehtojen. Ristiriita termodynaamisesta parametrien saadaan kauko-UV-CD ja fluoresenssin intensiteetti tukee voimakkaasti läsnä kehittymässä välituotteita. Puute havaittavan välituotteen kauko-UV-CD-levy voi osoittaa, että välitilojen havaita fluoresenssin ovat konformationaalisia muutoksia, jotka esiintyvät lähellä yhtä tryptofaanitähteiden, vaihtoehtoisten tertiäärisen järjestelyjä. Se on vakiintunut, että fluoresenssin intensiteetti on erittäin herkkä ympäristön fluoroforin ja pidetään yhtenä suorinta signaaleja, joita voidaan käyttää valvomaan termodynamiikka piirtyy siirtymien [26]. Arvioidaan murto kertyminen eri lajien upon urea aiheuttama piirtyy, tasapainojakauma neljän lajin, N, I

1, I

2 ja U funktiona denaturoivaa keskittymä voi saattaa käyttövalmiiksi asennettu arvot Δ

G

1, Δ

G

2, Δ

G

3,

m

1,

m

2 ja

m

3 esitetty taulukossa 3. tasapainojakaumaa N, I

1, I

2 ja U on samanlainen villityypin (Fig. 4A) ja kaikki muunnokset, kuitenkin joitakin eroja voidaan havaita (Fig. 4B-C). Osa N (

f

N) kasvatetaan E124Q (Fig. 4B) ja merkittävästi pienempi E135K (Fig. 4C), ja samanlainen kuin villityypin (Fig. 4A ) kaikkien muiden Pim-1 variantteja (tuloksia ei ole esitetty). Osa I

1 (

f

I1), joka kertyy 1,0 M ureaa kaikkien niiden lajien, on hieman suurempi varten E135K ja pienempi E124Q. Murto jakelu toisen denaturointi- väli- I

2 (

f

I2), joka kertyy noin 4,0 M ureaa, näyttää hieman korkeampi varten Y53H, E124Q ja E135K, verrattuna villityyppiin (tuloksia ei ole esitetty). Erityisesti villityyppisen ja kaikki variantit kehittymässä välituotteiden I

1 osoittavat samaa maksimaalinen emissioaallonpituutena N keskitetty noin 345 nm, kun taas I

2 siirretään noin 348 nm. Yksityiskohtainen analyysi Pim-1 kehittymässä siirtymiä viittaa siihen, että merkittäviä eroja domain plastisuus ja suoristumista esiintyy Pim-1 mutantteja verrattuna villityyppiseen proteiiniin.

Keskustelu

Tutkimus edustaa, tietojemme mukaan ensimmäinen spektroskooppiset ja termodynaaminen luonnehdinta ihmisen kinaasi Pim-1 ja eräät sen sairauden asiaan mutantteja löytyi syöpä. Olemme tutkineet vaikutusta aminohapposubstituution lämpö- ja termodynaaminen stabiilisuus villityypin Pim-1 ja verrataan näiden tuloksia neljän Pim-1 variantteja, Y53H, E124Q, E135K ja E142D, raportoitiin SNP: tietokantaan [9] – [12] , [15], [20]. Tutkiminen Pim-1 kiderakenteen osoitti, että useimmat mutaatiot sijaitsevat lähellä rakenneosat tärkeä kinaasi toiminta ja jotka muodostavat polaarisia vuorovaikutuksia naapurimaiden jäämiä.

pistemutaatioita varianttien merkittävästi vaikuta konformaatioon natiivi tila Pim-1. Erot lähes UV CD välillä mutanttien ja villityypin viittaavat siihen, että kolmannen asteen koskettimet muutu merkittävästi kaikkien mutanttien ja että yksittäinen aminohappo korvaaminen vaikuttaa Pim-1 tertiäärisen rakenteen ja johtaa syvällisiä muutoksia koko proteiinin tertiäärinen kertaiseksi. Erityisesti korvaaminen Y53 histidiinillä johtaa dramaattisia tertiäärinen rakenne muuttuu, kun paljastui menetyksestä sakon rakenteen 260-280 nm (Fig. 1 D). N-terminaalinen lohko mutantti Y53H näyttää merkittävimmät muutokset asteen kontakteja, kuten on päätelty perusteella lähes UV CD spektrin. Huomattavaa on, että lähes UV CD spektrin E124Q mutantti näyttää enemmän samanlainen kuin villityypin, luultavasti siksi, että muutos on ladattu polaarisen Glu jäännös kaadetaan varauksettomat polaariset Gln jäännös on vain vähäinen vaikutus tertiäärirakenteeseen ja sen vakaus .

Tyr53 jäännös sijoitettu keskelle beeta-säikeen 2 ja sen amidityppi on vety-sitoutunut I66 karbonyyli beeta-juosteen 3. Y53H, korvaaminen Y53 polaarisella histidiinin voi johtaa uuteen vetysidos kanssa H68 (Fig. 1). Lisäksi, läheisyys Y53 ja fosfaattia sitovaa P-silmukka, joka on alueella, joka on tärkeä rooli spesifisyys ja affiniteetti estäjien [27], viittaavat siihen, että tämän tähteen mutaatio voi vaikuttaa inhibiittorin sitoutumisen.

toinen mutaatio löytyy syöpä, E124Q, koskee jäännös sijaitsee sarana-alueella (121-126). OE2 ja E124 muodostaa suolan sillan kanssa H11 viereisten R122 (Fig. 1). Vaihdosta E124 glutamiini (E124Q) tuhoaa suola silta sarana-alueen, joka voi määrittää liikkuvuus N-terminaalisen (33-121) ja C-terminaalinen (128-305) lohkoa. Erityisesti, koska ulokkeiden usein kiertää tai lähellä ympäri saranan, kun estäjien sitoutumisen mutaatio E124 merkittävästi muuttaa dynaamisten ominaisuuksien Pim-1, ja se voi muuttua inhibiittorit affiniteetti. Kiinnostavaa kyllä, tämä glutamaatti-arginiini suola silta ei ole läsnä Pim-2 isoformi mahdollisesti edistää epävakaan tämän proteiinin [28].

palautuvuus urean aiheuttama tasapaino kehittyvät alhaisessa lämpötilassa mahdollistaa määrällisen määritys vaikutus mutaatioiden termodynamiikan Pim-1 kehittymässä. Kaikki mutantit, jotka on ilmaistu liukoisia rekombinanttiproteiineja, osoittavat vähentynyt terminen ja termodynaamisen vakauden (taulukko 2 ja 3). Epävakautta vaikutus kaikkien aminohapposubstituutioita on erityisen ilmeistä lasku sulamislämpötilan seurataan sekundäärisen rakenteen muutosten, joka viittaa suurempi joustavuus variantit, joissa on suhteessa villityyppiin. Väheneminen sulamislämpötilan kaikkien Pim-1-varianttien tutkittu korostaa lisäksi merkittävä lasku Δ

G

H

2

O suhteessa urea aiheuttama suoristumista verrattuna villityyppiin. Nämä tulokset ovat yllättäviä, koska kaikki mutantit ovat vähemmän stabiileja kuin villityypin ja Pim-1 on proto-onkogeeni, joten voidaan päätellä, että Pim-1 variantit ovat vähemmän tehokkaita kuin onkogeenien kuin villityypin. Kuitenkin vähentynyt vakavuus liittyy lisääntynyt joustavuus, kuten alempien aktivointi energia-arvoja kinaasiaktiivisuuden havaittiin kaikissa variantit verrattuna villin tyypin, viittaa siihen, että Pim-1 variantteja voi olla mukana laajemmassa verkossa proteiini vuorovaikutusten.

on huomattava, että siirtyminen keskikohtien spektrin muutokset kaikkien mutanttien eivät ole merkittävästi muuttuneet suhteessa villityypin; täten määrä pieneni Δ

G

H

2

O arvot johtuu pääasiassa laskusta

m

arvoja. Siten vaikutus aminohapposubstituutio on Pim-1 vakautta voidaan pääasiassa tarkoitettu lasku muutosta liuottimen paljas pinta-ala päälle piirtyy kaikkien Pim-1 vaihtoehtoja.

Yhteenvetona tuloksemme osoittavat, että vaikutusta havaittu mutaatio syövän kudoksissa on suunnattu paikallisten muutosten tertiaarisen rakenteen, joka kuitenkaan ei vaikuta sitovan tyypin I estäjät tutkittu.

Materiaalit ja menetelmät

kohdennettu mutageneesi

Pim-1 villityypin entsyymi plasmidi saatiin SGC (Oxford). Quick Change Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene) käytettiin viemään yhden mutaatiot villityypin Pim1 plasmidia käytettiin templaattina. Mutageenisen käytetyt oligonukleotidit on lueteltu taulukossa 4.

Protein Expression and Purification

Rekombinantti Pim-1-proteiini on ilmennetty ja puhdistettu, kuten on kuvattu [29] pienin muutoksin. Pim-1

villityypin ja mutanttien ilmaistiin

E. coli

BL21 (DE3). 10 ml yön yli kasvatettua viljelmää kasvatettiin 37 ° C: ssa 1 l LB elatusaineessa, joka sisälsi ampisilliinia, kuten antibioottia lopullisena pitoisuutena 50 ug /ml, kunnes optinen tiheys OD

600 saavutti 0,6. Viljelmää jäähdytettiin jäillä 20 minuutin ajan, sitten proteiinin ilmentyminen indusoitiin yön yli lisäämällä 0,5 mM isopropyyli-β-D-tiogalaktosidi (Sigma-Aldrich) ja kasvatettiin yön yli 15 ° C: ssa energinen ravistellen. Viljelmä kerättiin sentrifugoimalla ja suspendoitiin uudelleen 50 ml: aan sitoutumispuskuria (50 mM Hepes, 500 mM NaCl, 5 mM imidatsoli, 5% glyseroli, pH 7,5), joka sisälsi 0,5 mM

tris

(2-karboksietyyli) fosfiinia (TCEP), ja varastoitiin -20 ° C: ssa käyttöön asti. Solut sulatettiin jäällä täydennetty proteaasinestäjät (Complete, Roche) ja hajotettiin sonikoimalla. Lysaatti kirkastettiin sentrifugoimalla ja supernatantti ladattiin DE52-pylvästä (GE Healthcare), joka oli aiemmin tasapainotettu sitomispuskurilla ja 0,5 mM TCEP: tä, poistamiseksi nukleiinihappoja. Läpivirtausfraktio ladattiin Ni-NTA (Ni

2 + – nitriltriacetate) affiniteettikolonniin (GE Healthcare) esitasapainotettuna Binding puskurilla. Pylväs pestiin sitoutumispuskurilla eluoimiseksi heikosti sitoutuneet epäpuhtaudet. Rekombinanttiproteiini eluoitiin kulkemaan kolonnin sitova puskuriliuokset, joka sisälsi kasvavia imidatsolia pitoisuudet (50 mM, 100 mM, 150 mM ja 250 mM, vastaavasti). Kerätyt eluaatit täydennetty lopulliseen pitoisuuteen 10 mM DTT: tä ja testataan puhtaus SDS geelillä käyttäen precasted geeliä järjestelmä (Invitrogen). Puhtaat jakeet inkuboitiin yön tupakan etch virus proteaasi (Pro-TEV), poistaa heksahistidiinimerkki. Digestion jälkeen proteiini konsentroitiin 2 ml: aan Millipore keskittimien ja ladattiin Superdex 200 300/10 geelisuodatuspylvästä on AKTA FPLC-järjestelmä oli aiemmin tasapainotettu 50 mM Tris /HCl: ää, 0,25 M NaCl, 10 mM DTT, pH 7,5, virtausnopeus 1,0 ml /min. 2 ml: n fraktiot otettiin talteen ja puhdas proteiini tunnistettiin SDS-PAGE. Proteiinikonsentraatio määritettiin spektrofotometrisesti käyttäen molaarinen absorptiviteetti on 48930 M

–

1 cm

-1at 280 nm, joka perustuu molekyylimassa on 35,685 kDa.

Spektroskooppiset