Krooninen sairaus

tiivistelmä

adenovirukset ovat erittäin immunogeenisiä ja tutkitaan mahdollisina levittäjinä immunoterapiaa. Infektiota onkolyyttinen adenovirus seuraa massiivinen autophagy syöpäsoluissa. Tässä oletamme, että autophagy säätelee käsittely adenoviruksen proteiinien antigeenin esittelyä. Tämän hypoteesin testaamiseksi, ensin tutkinut esittely viruksen antigeenien infektoiduista soluista käyttäen vasta-ainetta cocktail viruksen kapsidin proteiineja. Olemme havainneet, että virusantigeenit käsittelivät JNK-välitteisen autophagy, ja että autophagy vaadittiin niiden esittämistä. Yhdenmukaisesti näiden tulosten pernasoluja eristettiin virus-immunisoiduista hiiristä aktivoitiin infektoituneiden solujen MHC II-riippuvaisella tavalla. Sitten hypoteesina, että tämä mekanismi voidaan käyttää generoimaan tehokasta syövän rokote. Tätä varten olemme rakentaneet onkolyyttisten virus jossa yhdistyvät EGFRvIII syövän epitooppia adenoviruksen fiber. Infektio syöpäsolujen tämän kuitu-modifioitu adenovirus johti tunnustuksena tartunnan saaneiden syöpäsolujen erityinen anti-EGFRvIII vasta-aine. Kuitenkin inhibitio autophagy huomattavasti vähentynyt kyky spesifisen vasta-aineen havaitsemiseksi syöpään liittyvien epitoopin infektoiduissa soluissa. Tuloksemme viittaavat siihen, että yhdistelmä adenovirusten kanssa autophagy induktorit voivat tehostaa käsittelyä ja esittämistä syövän antigeenejä osaksi kapsidiproteiineja.

Citation: Klein SR, Jiang H, Hossain MB, Fan X, Gumin J, Dong A, et al. (2016) Kriittinen rooli Autophagy prosessoinnissa adenovirus Capsid-Incorporated Cancer antigeenejä. PLoS ONE 11 (4): e0153814. doi: 10,1371 /journal.pone.0153814

Editor: Maria G. Castro, University of Michigan School of Medicine, Yhdysvallat |

vastaanotettu: 25 tammikuu 2016; Hyväksytty: 04 huhtikuu 2016; Julkaistu: 19 huhtikuu 2016

Copyright: © 2016 Klein et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperin.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat avustusta NIH (P50CA127001, R01NS069964; Cancer Center Support Grant P30CA016672-sekvensointi ja Microarray Facility ja tutkimus Animal Support palvelut), The Marnie Rose Foundation, tahdonvoimaa Foundation, Schissler Foundation, ja American Legion Ylimääräiset. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: JF, CG-M, ja HJ on tekijänoikeuksien Delta-24-RGD , lisensoitu DNAtrix, Inc. (patentti jätetty US 14/148259; Tarttuvuus-parannettu ehdollisesti Replikoitumattoman adenovirus ja sen käyttöjä). J. F. ja C.G-M. ovat perustajat ja konsultti DNATrix, Inc. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen PLoS One politiikkaa jakaa tietoja ja materiaaleja.

Johdanto

Onkolyyttiset adenovirukset, kuten Δ24-RGD (Delta -24-RGD), [1, 2] ovat erittäin immunogeenisiä. [3] nykyisen hypoteesi selittää kasvainten vastainen mekanismi saavilla potilailla onkolyyttisiä adenoviruksia on, että tärkein vaikutus saavutetaan liipaisimen kasvaimia estävän immuunivasteen. [4 ] autophagy on tunnustettu ominaisuus infektoitujen solujen adenoviruksia [5, 6] ja on tärkeä osa hajoamiseen prosessin. [7] Xenophagy [8] ja patogeeniperäinen antigeenin käsittely [9, 10] ovat keskeisiä toimintoja autophagy vuonna soluja viruksia. Autophagy hajoaa solunsisäisen sisällön käsittely epitooppeja voidaan lastata major histocompatibility complex (MHC) esitettäväksi pinnalla immuunijärjestelmän soluja. [9-11] on kuitenkin se tapa, jolla syöpäsolut käsitellä adenoviruksesta peräisin antigeenien ei tällä hetkellä tunneta.

modulaatio autophagy nisäkässoluissa on kuvattu parhaiten soluissa olevien nälkään. [12-14] sen lisäksi, että kanoninen koulutusjakson, [12-14] c-Jun N-terminaalinen kinaasi (JNK) signaalitransduktion -systeemi aktivoituu soluissa olevien autophagy. [15] Lisäksi JNK aktivointi on havaittu soluissa viruksia. [16] huolimatta selkeä rooli että JNK soittaa sääntelystä synnynnäisen ja adaptiivisen immuunivasteen, [17] mukaan lukien kyky voimistavan immuunivastetta viruspatogeeneja jopa säätelystä proinflammatoristen sytokiinien, [18-20] suoraa toimintaa JNK patogeeniperäinen antigeenin käsittely ja esittely ei ole vielä määritelty.

Olemme raportoi äskettäin, että JNK ilmaisun ja aktivaatio phoshporylation tarvitaan induktioon tuottava autophagy adenovirusta infektoimissa soluissa. [16] tässä tutkimuksessa havaitsimme, että adenoviruksen rakenteellisia proteiineja vuorovaikutuksessa autophagy lasti-reseptorin proteiinien mikä sen hajoamiselle autophagolysosomes . Autophagy näyttää olevan välttämätöntä, että esityksen adenoviruksesta peräisin antigeenejä, koska inaktivointi autophagy säätimen JNK tai suoraan inaktivoimiseksi autophagy voimakkaasti rajoitettu tunnustamista syövän-tartunnan saaneiden solujen pohjustettu immuunijärjestelmän soluja ja vasta-aineita kapsidin tai syövän erityisiä ektooppinen koodaamia epitooppeja adenoviruksen fiber.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely

U87 MG gliooma, HeLa kohdunkaulan syöpä, ja A549 keuhkosyövän solulinjat olivat kaikki saatu ATCC: ltä. HeLa-soluja viljeltiin DMEM: ssä (1 x), ja A549-soluja viljeltiin DMEM /F-12 50:50 väliaineessa (Invitrogen). U87 MG-soluja (ATCC) viljeltiin MEM, jossa oli 10% FBS: ää ja 1% välttämättömiä aminohappoja. Villityypin ja

JNK1 /2 – /-

hiiri alkion fibroblasteissa (MEF) toimitti Roger Davis (University of Massachusetts Medical School, MA). Villityypin ja knock-out Atg5 MEF (

Atg5 – /-

) ovat antelias lahja Noboru Mizushima (Tokyo Lääketieteen ja hammaslääketieteen University, Tokio, Japani). Villityypin ja knock-out p62 MEF (

p62 – /-) B oli antelias lahja Jorge Moscat (Sanford-Burnham Medical Research Institute, La Jolla, CA). MEF viljeltiin DMEM /F12 50:50 väliaineessa. Soluja viljeltiin 10% FBS: 37 ° C: ssa 5% CO

2 ilmassa.

Kemikaalit ja vasta

JNK estäjä SP600125 ja bafilomysiini A1 ostettiin Sigma- Aldrich, St. Louis, MO, USA). Rapamysiini hankittiin Calbiochem (San Diego, CA, USA). Rekombinantti ihmisen proteiini interferoni-gamma (IFN-γ) hankittiin ProSpec (East Brusnwick, NJ, USA). Vasta-aineet LC3, Beclin 1, ja ubikitiinin ostettiin Cell Signaling Technologies (Beverly, MA, USA). Anti-P62 ja anti-Actin vasta-aineet hankittiin Santa Cruz Biotechnology (Dallas, Texas, USA). Anti-adenoviruksen fiber saatiin ThermoScientific (Waltham, MA, USA). EGFRvIII havaittiin monoklonaalisella vasta-aineella (L8A4) saatu antelias lahja Dr. Bigner (Duke University, NC USA). Allofykosyaniini (APC) konjugoidulla anti-hiiri-vasta-aineita ja fluoreseiini-isotiosyanaatti (FITC) konjugoitua sekundaarista vasta-ainetta, hankittiin Santa Cruz Biotechnology.

Adenoviraaliset tuotanto ja infektion

Δ24RGD ja AdWT adenovirukset tuotettiin kuten aiemmin on kuvattu. [1] Δ24FvIII rakennettiin insertoimalla EGFRvIII epitoopin (LEEKKGNYVVT) [21] tulee HI silmukan kuitua proteiinin aminohappojen 543 ja 544. [22] Ensimmäinen sekvenssi, joka koodaa EGFRvIII epitooppi sisällytettiin kuidun geenin vektorin pXK-F, jotka sisältävät

Xba

I

Kpnl

I-fragmentti pVK503C [23] kautta, kohdennetun mutageneesin. Seuraavaksi Xba I-KpnI-fragmentti tuloksena vektori pXK-FVIII oli co-transdusoitu

Swa

I-linearisoitu pVK500C.delta-24 osaksi

E

.

coli

BJ5183 homologista rekombinaatiota varten, kuten aiemmin on kuvattu [24]. Sitten virus pelastettiin 293-soluihin ja kasvatettiin A549-soluja, kuten aiemmin on kuvattu. [24] Adenovirukset lisättiin soluviljelyalustoihin osoitettuna moninaisuus infektion (MOI).

Western blot-analyysi

Solut lyysattiin RIPA lyysipuskuria. Proteiinikonsentraatiot määritettiin käyttämällä Bio-Rad proteiinimäärityksellä. Proteiininäytteet (25 ug) 1 x SDS-latauspuskuria, keitettiin ja pantiin Tris-glysiini-natriumdodekyylisulfaatti-polyakryyliamidigeelielektroforeesi (SDS-PAGE) geeleissä (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Näytteet erotettiin käyttämällä elektroforeesia. Geelit siirrettiin sitten polyvinylideenifluoridia kalvoja, jotka blokattiin käyttämällä 5% rasvatonta maitoa 1 x TBS-T: n (0,025% Tween) 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa ja inkuboitiin sitten yön yli 4 ° C: ssa primaarisen vasta-aineen sopivin laimennoksia. Membraanit pestiin kolme kertaa TBS-T: n (0,05% Tween), ja sitten inkuboitiin huoneenlämpötilassa 1 tunnin ajan sopivan sekundäärisen vasta-aineita (Santa Cruz Biotechnology, 1: 4000) valmistettiin 1% rasvatonta maitoa TBS-T: llä. SuperSignal West Femto kemiluminesenssisubstraatilla (ThermoScientific) ja HyBlot CL autoradiografialla kalvon (Denville Scientific Inc., South Plainfield, NJ, USA) käytettiin visualisoimaan proteiinijuovat.

RNA-interferenssi

Wild-type MEF-solut ympättiin 6-kuoppaisille levyille 24 tuntia ennen pieni-häiritsevä RNA (siRNA) transfektion. INTERFERin (Polyplus transfektio (Illkirch-Graffenstaden, Ranska) käytettiin lisätä siRNA: t soluihin mukaan valmistajan protokollan. Lyhyesti, 50 nM siRNA oligonukleotidit yhdistettiin 10 ul transfektioreagenssia ja lisättiin soluihin 15 minuutin kuluttua inkubaation huoneenlämmössä. siRNA oligonukleotidlen hiiren MHC luokan I, luokan II MHC, ja ei-koodaavat alueet ostettiin Santa Cruz Biotechnology.

Co-immunosaostus

Solut infektoitiin AdWT tai Δ24RGD varten jopa 48 h. Kelluvat ja kiinnittyneet solut kerättiin ja lyysattiin immunosaostuksella (IP) lyysipuskuria (100 mM NaCl, 50 mM Tris-HCI [pH 7,4], 2 mM EDTA, 10% glyserolia, 1% IGEPAL CA-630) . proteiini näytteet esipuhdistettiin proteiini A ja proteiini G-agaroosihelmillä. anti-adenoviruksen fiber tai anti-p62-vasta-aineita lisättiin lysaatit laimennoksena 1: 100, ja kompleksit proteiinien immobilisoitiin proteiini A ja proteiini G (1: 1) agaroosihelmiä. Immunosaostettu näytteitä, esipuhdistettiin helmiä, ja 5% tulo analysoitiin Western-blottauksella. IP tunnistus sekundaarinen vasta-ainetta käytettiin proteiinien havaitsemiseksi sitovat kaikki anti-kani ja anti-hiiri ensisijainen IgGs.

Virtaussytometria

Soluja käsiteltiin kunkin aikapisteissä, trypsinoitiin ja kerättiin fosfaattipuskuroitu suolaliuos (PBS), jossa oli 1% naudan seerumin albumiinia (BSA). Soluja käsiteltiin, kun osoitetaan IFN-γ (300 yksikköä /ml) ja bafilomysiini A1 (Sigma-Aldrich). Elävien solujen värjättiin adenoviruksen antigeenien yhdistelmän avulla hiiren anti-adenovirus (seos) pinnoite (1:75; Millipore, Billerica, MA, USA) ja hiiren anti-adenoviruksen fiber-vasta-aineita (1:75; ThermoScientific) 30 min 4 ° C: ssa. Sen jälkeen, kun solut pestiin, ne värjättiin APC-konjugoidun anti-hiiri-vasta-aineita (1,75; Santa Cruz Biotechnology), 30 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Havaitsemista varten EGFRvIII epitoopin (LEEKKGNYVVT), solut värjättiin monoklonaalisella vasta-aineella (L8A4) ja sen jälkeen FITC-konjugoitua sekundaarista vasta-ainetta värjäystä. Elävät solut analysoitiin käyttämällä BD FACSCalibur (Becton-Dickenson, Franklin Lakes, NY, USA). Kuolleet solut suljettiin pois käyttämällä propidiumjodilla tai etidiumhomodimeeri-1 värjäystä ennen analyysiä. Tulokset edustavat vähintään neljä itsenäistä kokeita.

pemasolu aktivointi

Kaikki eläinkokeet suoritettiin eläinlääkinnän tilat Teksasin yliopiston MD Anderson Cancer Center vakiintuneiden ohjeiden mukaisesti ja opas Care ja käyttö Laboratory Animal. Tutkimuksen hyväksyi yliopiston MD Anderson Cancer Center Institutional Animal Care ja Käytä komitea (IACUC). C57BL /6-hiirten (10-12 viikon ikäisiä) infektoitiin intrakraniaalisesti kaksi injektiota (päivinä 0 ja 3) 1 x 10

8 pfu /hiiri Δ24RGD kautta opas-miehistö järjestelmä, kuten aiemmin on kuvattu. [1] eläimet lopetettiin kanssa käyttämällä CO

2 kammiossa; pernat poistettiin andsmashed kourun 100 mikrometrin suodattimen, [25] ja pernasoluja pestiin PBS: llä. Punasolut poistettiin ACK hajotuspuskuria (Lonza, Houston, TX, USA). Villityypin ja JNK knock-out MEF ympättiin 1 x 10

5-soluja 6-kuoppalevylle (kolmena kappaleena). Solut infektoitiin 100 MOI Δ24RGD 24 tuntia, trypsinoitiin, ja uudelleen maljattiin 96-kuoppaiselle levylle 5 x 10

4 solua per kuoppa RPMI 1640 media, jossa oli 10% FBS: ää ja 55 uM beta-merkaptoetanolia . Pernasoluja (1 x 10

6 solua) inkuboitiin MEF viljellään 24 tuntia. Kokeita varten, mukaan lukien estävät vasta-aineet, pre-tartunnan MEF-soluja inkuboitiin 2 ug anti-hiiri-MHC-luokan II (IA /IE), anti-hiiri-MHC-luokan I (H-2Kd) (eBioscience, San Diego, CA), tai hiiren IgG: tä (Santa Cruz) 2 tunnin ajan ennen rinnakkaisviljelemällä pohjustettu pernasolua. Pernasoluja inkuboitiin sitten esi-tartunnan MEF-soluja ja estää vasta-aineita 24 h. Hiiri IFN-γ ELISA Kit (ThermoScientific) käytettiin arvioimaan konsentraatio IFN-γ 50 ui median uutetaan co-kulttuuriin. ELISA suoritettiin valmistajan ohjeiden ja absorbanssi analysoitiin kautta Omega mikrolevylukijalla (BMG Labtech, Ortenberg, Saksa).

Tilastollinen

kaksitahoiset Student

t

-testi käytettiin tilastollisen merkittävyyden määrittämiseksi käsiteltyjen ja tartunta-näytteet suhteessa kontrollinäytteisiin. P-arvot alle 0,05 hyväksyttiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

JNK-välitteisen autophagy säätelee esittäminen adenoviruksesta peräisin antigeenien

Pato- antigeenejä voidaan prosessoida autophagolysosomal osaston kautta autophagy, [10] mutta rooli autophagy esittelyssä adenoviruksen epitooppien ei ole vielä määritelty. Käyttämällä cocktail anti-adenovirus-proteiinin vasta-aineita, seuloimme infektoitujen solujen läsnäolo adenoviruksen peptidejä pinnalla elävien, läpäisemättömiksi tehdyissä, infektoidut solut. Näitä tutkimuksia varten otimme etu, että JNK-null-solut ovat puutteellisia varten autophagy. [15, 16] Havaitsimme, että vaikka suurin osa ( 77%)

JNK paino-

MEF-tartunnan AdWT ilmaistuna adenovirusproteiineja niiden pinnalla, kuten havaitaan FACS-analyysit (kuvio 1A), geneettinen ablaatio

JNK1

ja

JNK2

isoformit johti merkittävään laskua solujen prosenttiosuus positiivista adenoviruksen proteiineja. Koska T-solujen aktivaation, osoituksena synteesiä ja IFN-γ, on tunnusomaista menetelmä vahvistaa antigeenin esittelyä kautta vuorovaikutukset epitoopin sisältäviä MHC-molekyylien ja T-solun reseptorin [26], me toteen immuunijärjestelmän merkitystä meidän data mittaamalla IFN-γ by pernasolujen infektoimattomilta hiiret (naiivit) tai adenovirus-käsiteltyihin hiiriin (pohjustettu) yhteistyössä kulttuuria

JNK paino-

tai

JNK1 /2

– /- MEF infektoitiin adenoviruksella. Kuten odotettua, co-viljelmät naiivien pernasolujen adenovirus-infektio

JNK paino-

, tai

JNK1 /2

– /- solut eivät aiheuttaneet merkittävää IFN-γ. Kuitenkin villityypin MEF infektoitiin adenoviruksella pyydetään IFN-γ tuotantoa, kun viljeltiin yhdessä pohjustetaan pernasolua (kuvio 1 B). Sen sijaan viljelmät autophagy puutteesta

JNK1 /2

– /- MEF adenoviruksella-pohjustetaan pernasolujen sisälsivät huomattavasti pienempi erittyvä IFN-γ tasot (kuvio 1 B). Nämä tulokset osoittivat, että autophagy-heikentynyt solut ovat puutteellisia esittämistä adenoviruksesta peräisin antigeenejä immuunijärjestelmälle.

(a)

JNK p-

ja

JNK

1 /2 – /- MEF-solut oli valeinfektoitu tai infektoitu AdWT (100 MOI) 48 h ja niitä inkuboitiin kahden yhdistetyn sarjaa anti-adenovirus-vasta-aineita (seos, adenovirus- vaippaproteiineista ja adenoviruksen kuitua). Ne inkuboitiin sitten APC-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineen ja analysoitiin virtaussytometrialla. IgG isotyyppiä on käytetty kontrollina. Propidiumjodidia käytettiin arvioimaan solujen elinkelpoisuutta ja analysoida eläviä soluja. Data edustaa positiivisten solujen prosenttiosuuden keskiarvona ± SD. ***

P

0,001 (AdWT-tartunnan

JNK

1/2 – /- MEF versus AdWT-tartunnan

JNK paino-

MEF) (pariton, kaksihäntäinen Student

t-testi)

. (B) Splenosyyttejä eristettiin naiivi ja Δ24RGD-tartunnan C57BL /6-hiirten ja viljeltiin yhdessä

JNK paino-

tai

JNK

1/2 – /- MEF jotka olivat mock-tartunnan tai infektoitiin Δ24RGD adenovirus (100 MOI) 24 tuntia, ennen kuin co-kulttuuriin. 48 tunnin jälkeen ja yhdessä viljelemisen, IFN-γ tasoilla (pg /ml) esikäsiteltyyn väliaineeseen arvioitiin ELISA: lla. Tulokset edustavat IFN-γ tasoilla (pg /ml) keskiarvona ± SD kolmesta itsenäisestä co-viljelmissä. **

P

0,01 (pariton, kaksihäntäinen Student

t-testi

). (C) U87 MG-soluja esikäsiteltiin DMSO, SP600125 (25 uM), tai bafilomysiini A1 (BA1, 10 nM) 30 minuutin ajan, ennen kuin infektio Δ24RGD adenovirus (50 MOI) 48 tuntia. Eläviä soluja inkuboitiin vasta-aineiden kanssa adenoviruksen kapsidin proteiineja, tai IgG isotyypin kontrolli, ja analysoitiin virtaussytometrialla. Prosenttiosuus APC-positiiviset solut kvantitoitiin ja esitetty keskiarvona ± SD (

n

= 3). *

P

0,05 (prosenttia positiivisten solujen hoidon jälkeen AdWT ja SP600125 vs. AdWT ja BA1) (pariton, kaksihäntäinen Student

t-testi

). (D) Merkittävä lisäys esittelyssä adenoviruksen antigeenejä infektoiduissa soluissa Δ24RGD kun rapamysiini lisättiin viljelmiin. U87 MG-solut valeinfektoitiin, tartunnan Δ24RGD, tai tartunnan Δ24RGD ja rapamysiini (100 nM /48 h) 48 h, ja sitten tutkittiin adenoviruksen antigeenejä virtaussytometrialla.

Lisäksi tuetaan rooli JNK ja autophagy käsittelyssä adenoviruksesta peräisin olevat antigeenit, havaitsimme, että hoito autophagy taitava tartunnan viljelmien JNK-inhibiittoreita (SP600125) [27], tai autophagy flux estäjät (bafilomysiini A1 [28]) vähensi prosenttiosuus tartunnan eläviä soluja esitellä niiden pinnalla adenoviruksen proteiineja FACS analyyseissä (kuvio 1 C). Kanssa näiden tietojen perusteella, vastapäätä koe osoitti, että esikäsittely infektoitujen solujen kanssa autophagy-indusoija rapamysiini [29] johti kasvuun solujen prosenttiosuus, jotka positiivisen adenoviruksen epitooppeja FACS seulonta (kuvio 1 D). Yhdessä kaikki nämä havainnot viittaavat vahvasti siihen, että autophagy saattaa olla merkitystä esittäminen patogeeniperäinen antigeenejä adenovirus-tartunnan saaneiden solujen.

MHC-luokan II tarvitaan adenoviruksen antigeenejä

Autophagy osallistuu käsittelyssä peptidien esittely pääasiassa kautta MHC-luokan II molekyyleihin, [10, 11], jolloin päätimme sen määrittämiseksi, onko vasta-aineeseen perustuvat salpaus MHC-luokan II esti tunnustamista tartunnan saaneiden solujen adenovirus-pohjustettu pernasolua. Tätä varten me määrällisesti IFN-γ tuotantoa yhteisviljelmissä adenovirus-pohjustetaan pernasoluja virus-tartunnan MEF esi-inkuboitiin estävät vasta-aineet MHC-luokan I tai II. Havaitsimme, että solut käsiteltiin vasta-aineita luokan II MHC-proteiineja, oli merkittävä inhibitio IFN-γ tuotantoa verrattuna soluihin käsiteltiin vasta-aineita luokan I MHC-proteiinien tai IgG-käsiteltyihin kontrolleihin (kuvio 2A). Vahvista nämä tiedot me haastoi esittely adenoviruksen antigeenejä käyttämällä erityisiä siMHC luokka II (kuvio 2B). Havaitsimme, että alas-modulaatio luokan II MHC-mRNA johti väheneminen solujen esittää adenoviruksen epitooppeja (kuvio 2C). Ilmaisee hallitseva rooli luokan II MHC-prosessissa, osoittivat, että alas-modulaatio MHC-luokan I oli paljon vähemmän vaikutusta esittämiseen adenoviruksesta peräisin antigeenejä kuin teki alas-säätely MHC-luokan II. Nämä tiedot osoittavat, että adenovirus-johdetut antigeenit pääasiassa esitetty kautta MHC-luokan II, hallitseva polun epitoopin esittely proteiinien kautta prosessoidaan autophagy. [10, 11]

(a) vale- tai Δ24RGD-tartunnan villin tyypin MEF esi-inkuboitiin vasta-aineiden kanssa vastaan ​​MHC-luokan I, MCH luokka II, tai IgG-isotooppi, ja sitten viljeltiin yhdessä pernasolujen saatu Δ24RGD-tartunnan hiirillä. Kertamuutoksen IFN-γ tasoilla (pg /ml) yhteistyössä elatusaineet näkyy suhteessa valvoa ja esitetään keskiarvona ± SD. **

P

0,01 (pariton, kaksihäntäinen Student

t-testi

). (B) Villityypin MEF-solut transfektoitiin altaan sinc, siMHCI, siMHCII tai yhdistää yhtä suuret määrät siMHC I ja siMHC II: ssa 48 tuntia ja infektoitiin sitten Δ24RGD adenoviruksen MOI 10 vielä 48 tuntia . Kokosolulysaateista analysoitiin käyttämällä anti-MHC-luokan I ja anti-MHC-luokan II vasta-aineita. Vaikutus kunkin siRNA hoidon proteiinitasolla MHC-molekyylien on esitetty. (C) Villityypin MEF-soluihin transfektoitiin altaan sinc, siMHCI, siMHCII tai yhdistää yhtä suuret määrät siMHCI ja siMHCII 48 tuntia, ja sitten infektoidaan Δ24RGD adenoviruksen MOI 10 vielä 48 tuntia. Sitten solut värjättiin havaitsemiseksi adenoviruksen antigeenejä. Propidiumjodidia käytettiin arvioimaan solujen elinkykyä. Data näytetään positiivisten solujen prosenttiosuuden (keskiarvo ± SD). Lasku prosenttia positiivisia adenovirus-infektio, siMHCII-transfektoituja soluja verrattuna adenovirus-infektio, sinc-transfektoitujen solujen oli tilastollisesti merkitsevä. **

P

0,01 (pariton, kaksihäntäinen Opiskelijan

t-testi)

.

Adenoviraaliset rakenteellisia proteiineja vuorovaikutuksessa P62 ja hajoavat autolysosome

Seuraavaksi pyrittiin ovatko rakenteelliset adenoviruksen proteiinit huonontunut autophagolysosomes. Koska P62 kaperoniproteiinin sitoutuu ubikitinoitu proteiineja niiden sitomisen ja hajoamista autophagolysosomes, [30] analysoimme mahdollisia vuorovaikutusta P62 ja kuidun proteiini suorittamalla yhteistyössä immunoprecipitaton kokeita. Osoitimme, että adenoviruksen kuitu proteiini ubikitinoitu aikana adenovirus infektion ja vuorovaikutuksessa p62 (kuvio 3A). Sopusoinnussa rooli autophagolysosome hajoamiseen adenoviruksen kuitua proteiinin vuorovaikutukset p62 ja kuidun proteiini oli selvempää

Atg5

– /- MEF-solut, jotka ovat puutteellisia adenoviruksen indusoiman autophagy [7] ( kuvio 3A). Itse asiassa, yksityiskohtainen tutkiminen kuidun proteiinin tasot useissa aikapisteissä jälkeen adenovirusinfektio paljasti huomattavan korkeampi näiden proteiinien autophagy puutosta

Atg5 – /-

MEF-soluissa verrattuna villityypin

Atg5

MEF (

Atg5 paino-

) tartunnan yhtä suuria määriä villityypin adenovirusten (kuvio 3B). Lisäksi olemme myös havaittu, että kun adenovirusinfektio oli merkittävä lasku solujen prosenttiosuus, jotka esitetään adenoviruksen proteiineja

Atg5 – /-

MEF viljelmiä verrattuna

Atg5wt

MEF (kuvio 3C ). Kuten odotettua, samanlaiset tulokset havaittiin

p62

– /- MEF infektoitiin adenoviruksella, jossa vahvistetaan, että puute

p62

ilmaus johti merkittävään vähentämiseen prosenttiosuuden adenoviruksen takki-positiivisten solujen kanssa nähden adenovirus-tartunnan villityypin

p62

MEF (kuvio 3D), mikä todennäköisesti johtuu puutteellinen p62-välitteistä kuljetusta adenoviruksen proteiinit hoitoa autophagosome. Nämä tiedot Lisäksi ehdotetaan, että adenoviruksen proteiinit hajoavat autophagolysosomes aktiivisessa autophagic vuon johtaen esittely adenoviruksesta peräisin epitooppeja at isäntäsolun pinnalla.

(a) Solulysaatit

Atg5wt

tai

Atg5 – /-

MEF tartunnan AdWT (50 MOI) analysoitiin kuitu /ubikitiini ja kuitu /p62-proteiini kompleksit. LC3-I LC3-II muuntaminen ja p62 ekspressiotasoja analysoitiin tulo näyte (5%). Aktiini näkyy latauskontrollina. (B) Solulysaatit

Atg5wt

ja

Atg5

– /- MEF oli valeinfektoitu tai tartunnan AdWT (50 MOI) varten osoitetut ajat ja analysoitiin adenoviruksen fiber ilme. Aktiini käytettiin latauskontrollina. (C)

Atg5wt

ja

Atg5 – /-

MEF oli valeinfektoitu tai tartunnan AdWT adenovirus (50 MOI) 48 tuntia ja sitten värjättiin vasta-aineilla adenoviruksen kuoriproteiinit, inkuboidaan APC-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineen, ja analysoitiin virtaussytometrialla. IgG isotyyppiä on käytetty kontrollina. Propidiumjodidia käytettiin arvioimaan solujen elinkykyä. Tiedot esitetään prosentteina APC-positiivisten solujen (keskiarvo ± SD) kolmesta itsenäisestä kokeesta. ***

P

0,001 (prosenttiosuus APC-positiiviseksi AdWT-tartunnan

Atg5wt

soluja vs. AdWT-tartunnan

Atg5

– /- solut) (pariton, kaksihäntäinen Student

t-testi

). (D)

p62wt

ja

p62 – /-

MEF tartutettiin AdWT adenovirus (100 MOI) 48 tuntia ja sitten värjättiin vasta-aineiden adenoviruksen kuoriproteiinit, inkuboidaan APC-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineet, ja analysoitiin virtaussytometrialla. IgG isotyyppiä on käytetty kontrollina. Propidiumjodidia käytettiin arvioimaan solujen elinkykyä. Tiedot esitetään prosentteina APC-positiivisten solujen (keskiarvo ± SD) kolmesta kokeesta. ***

P

0,001 (prosenttia APC-positiivisten solujen AdWT-tartunnan

p62

– /- vs. AdWT-tartunnan

p62wt

solut) (pariton, kaksihäntäinen Student

t-testi

).

Generation of Δ24FvIII adenoviruksen

muuttaminen adenoviruksen kapsideja insertoimalla antigeenien sekvenssit on lupaava tekniikka rokotteiden kehittämistä ja syövän rokotteita, [31] ja siksi pyrimme onko autophagy oli tärkein mekanismi käsittelyyn kohdunulkoisen syövän epitoopit koodaama adenoviruksen kuituja. Sitten syntyy kokeellinen malli, joka antaisi meille mahdollisuuden määrittää, onko tietty sarja adenoviruksen fiber voitiin havaita adenovirus-infektoiduissa soluissa. Tätä varten me suunniteltu ja rakennettu kimeerisen adenoviruksen säie- käsittää sekvenssin hyvin tunnettu ihmisen epitooppi (kuvio 4A). Saatu rakenne nimettiin Δ24FvIII, ja käyttää Δ24 kasvaimen selektiivisen selkäranka adenovirus [32] ja koodataan epitooppi LEEKKGNYVVT työnnetään HI-silmukan adenoviruksen fiber-sekvenssin. Tämä peptidi on johdettu liitoskohtien sekvenssi katkaistun proteiinin, joka syntyy mutantti variantti III mutantti EGFR ja on aiemmin osoitettu olevan erittäin immunogeeninen [21] (kuvio 4A).

(a) Kaavamainen esitys n sukupolven VIII kimeerisen kuitua. PCR-mutageneesilla käytettiin lisätä sekvenssin LEEKKGNYVVT epitoopin hypervariaabelin alueen HI-silmukan. Ainutlaatuinen EcoRV-restriktiokohta sisällytetty sallia lisätään kohdunulkoinen sekvenssin välillä glysiini-543 ja asparagiinihappo-544. (B) Kimeerisen kuidun kattaa LEEKKGNYVVT peptidi arvioitiin A549-soluja infektoitiin Δ24FvIII (40 MOI). Proteiini lysaatit alistettiin Western blot-analyysi 72 h kuluttua tartunnasta käyttäen sekä anti-kuitua ja L8A4 anti-LEEKKGNYVVT vasta-aineita. (C) Elävät villityypin

Atg5

ja

Atg5

– /- MEF-soluihin infektoitiin Δ24FvIII MOI 150: ssa 48 tuntia ja sitten värjättiin L8A4, jota seurasi FITC-konjugoidulla sekundaarisella vasta-aineet virtaussytometriaa analyysejä. Etidiumhomodimeeri-1 värjäystä käytettiin jättää kuolleita soluja. Prosenttiosuudet FITC-positiivisten eläviä soluja merkitty oikeassa yläkulmassa jokaisen kuvaajan. Väheneminen useita positiivisia soluja Δ24FvIII-tartunnan

Atg5

– /- verrattuna Δ24FvIII-tartunnan villityypin

Atg5

solut oli tilastollisesti merkitsevä. Data on esitetty keskiarvona ± SD kolmesta kokeesta. ***

P

0,001 (pariton, kaksihäntäinen Student

t-testi

). (D) HeLa-solut infektoitiin Δ24FvIII MOI 40. IFN-γ (300 yksikköä /ml) ja /tai bafilomysiini A1 (BA1, 100 nM) lisättiin median 6 h tai 24 h infektion jälkeen, vastaavasti. Elävät solut värjättiin L8A4 48 h infektion jälkeen ja inkuboitiin sitten FITC-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineita havainnollistaa positiivisten solujen virtaussytometrillä. Etidiumhomodimeeri-1 värjäystä käytettiin jättää kuolleita soluja. Kuvaaja keskiarvoja kolmesta kokeesta ± SD. *

P

0,05; **

P

0,01 (pariton, kaksihäntäinen Student

t-testi

).

Solut infektoidaan F_21 ”\\ o” Humphrey, 1990 # 149 ”thEGFRvIII-johdettu syövän epitooppia

erittäin spesifisen vasta-aineen vastaan ​​tuotettuja EGFRvIII peptidi [21], me dokumentoitu, että kimeerisen kuidun helposti havaita Δ24FvIII-infektoiduissa soluissa (kuvio 4B). Oletimme, että ektooppinen Humaani -epitooppi insertoituna adenoviruksen kuitua käsiteltiin kautta autophagy ja esitetään infektoituneiden solujen pinnalla. Näin ollen, sen jälkeen, kun villityypin ja autophagy puutteesta

Atg5

– /- MEF-soluihin infektoitiin Δ24FvIII pinnat elävien solujen olivat tutkitaan läsnäolo LEEKKGNYVVT käyttämällä spesifisen vasta-aineen [21] ja FACS-analyysit. Olemme osoittaneet, että suuri osa villin tyypin

Atg5

MEF positiivisesti tunnistetaan anti-LEEKKGNYVVT-vasta-ainetta (kuvio 4C ). kuitenkin positiivisten solujen prosenttiosuuden oli merkittävästi vähentynyt autophagy puutteesta

Atg5

– /- MEF-solut infektoitiin Δ24FvIII adenovirus (kuvio 4C). Samanlaiset tulokset saatiin, kun HeLa-solut infektoitiin Δ24FvIII adenoviruksella ja autophagy vuon blokattiin bafilomysiini A1. Näin ollen, prosenttiosuus HeLa esitteleviä soluja LEEKKGNYVVT peptidi pieneni dramaattisesti, kun tartunta-viljelmiä käsiteltiin bafilomysiini A1 (kuvio 4D). Tämä viittaa vahvasti siihen erityisiä aktivaation antigeeni-koneet infektion aikana, esittämisen LEEKKGNYVVT peptidin kasvoi lisäyksen jälkeen IFN-γ, joka transkriptionaalisesti aktivoida MHC, [33] ja viljelmiä infektoitiin Δ24FvIII adenovirus (kuvio 4D). Lopuksi, mikä myös osoittaa roolia autophagy käsittelyssä LEEKKGNYVVT, bafilomysiini A1 esikäsittely indusoi estovaikutus, joka antagonisoi ja merkittävästi vähentynyt positiivinen modulaatio antigeenin esittelyn välittämien IFN-γ (kuvio 4D).

Keskustelu

Tuloksemme todistaa ensimmäistä kertaa, että esto autophagy adenovirusta-tartunnan saaneiden solujen estää tehokkaan esittämisen adenoviruksesta peräisin ja kuituja sisällytetään syöpään epitooppeja. Olemme myös osoittaneet, että adenoviruksen proteiinit vuorovaikutuksessa autophagy lastin-reseptorin p62-proteiini, mikä viittaa vahvasti siihen, että p62 voi tehdä adenoviruksen kapsidin proteiineja on autophagosome. Mielenkiintoista on, että p62 on ehdotettu toimivan mahdollisena anturi virusinfektion ja yhteys viruksen proteiineja ja autophagy. [34] Se, että p62 sitoutuu adenoviruksen fiber erittäin suositeltavaa, että autophagy oli mukana adenoviruksen proteiinien hajoaminen.