Krooninen sairaus

tiivistelmä

Kyky interleukiini-15 (IL-15) aktivoimiseksi monia immuuni antituumorivaikutuksen mekanismeja tekee sytokiinien hyvä ehdokas kiinteiden tuumorien hoidossa, erityisesti munuaissolukarsinooma. Vaikka IL-15 on tällä hetkellä käytetty kliinisissä tutkimuksissa, toiminta sytokiinin munuais- komponentteja ei tutkittu laajasti; me täten tutkittiin miten IL-15 normaaleilla ja kasvaimen munuaisten epiteelisolujen. Tässä olemme analysoineet ilmaisun ja biologisten toimintojen IL-15 on normaali munuaisten proksimaalisten tubulusten (RPTEC) ja niiden neoplastisia kollegansa, munuaisten kirkas lukarsinoomia (RCC). Tutkimus osoittaa, että RPTEC ilmentävät funktionaalista heterotrimeerinen IL-15Rαβγc kompleksi, jonka stimulaatio fysiologisella rhIL-15 on riittävä estämään epiteelin mesenkymaalitransitioon (EMT) sitoutuminen säilyttämään E-kadheriinin ilmentymisen. Todellakin, IL-15 ei ole ainoastaan ​​eloonjäämistekijänä epiteelisolujen, mutta se voi myös säilyttää munuaisten epiteelin fenotyyppi kautta yc-signalointireitin, joka osoittaa, että sytokiini hallussaan monenlaisia ​​toimia epiteelin homeostaasin. Sen sijaan RCC

in vitro

ja

in vivo

tutkimukset paljastavat vika ilmentymisen yc-reseptorin ja JAK3 liittyvä kinaasi, joka vaikuttaa voimakkaasti IL-15 signalointia. Itse asiassa ilman yc /JAK3 pari osoitamme kokoonpanoa ennennäkemättömän toiminnallisen korkea affiniteetti IL-15Rαβ heterodimeeri, joka vastauksena fysiologisen pitoisuuksia IL-15, laukaisee epäsymmetrinen signaali aiheuttaa alas-säätely tuumorisuppressorigeenin geeni E-kadheriinin, suosimalla RCC EMT prosessi. Merkillistä, pelastus IL-15 /yc-riippuvaisen signaloinnin (Stat5: n), kotransfektoimalla yc ja JAK3 RCC, estää EMT palautumisen. Yhteenvetona nämä tiedot korostavat keskeistä roolia IL-15 ja yc-reseptorin signalointi munuaisten homeostaasin kautta valvonta E-kadheriinin ilmentymisen ja säilyttäminen epiteelin fenotyypin sekä RPTEC (up-asetus) ja RCC (alassäätöä).

Citation: Giron-Michel J, Azzi S, Khawam K, Mortier E, Caignard A, Devocelle A, et al. (2012) interleukiini-15 on keskeinen rooli Human Kidney Physiology and Cancer kautta yc Signaling Pathway. PLoS ONE 7 (2): e31624. doi: 10,1371 /journal.pone.0031624

Editor: Eliane F. Meurs, Institut Pasteur, Ranska

vastaanotettu: 15 huhtikuu 2011; Hyväksytty: 16 tammikuu 2012; Julkaistu: 21 helmikuu 2012

Copyright: © 2012 Giron-Michel et ai. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustuksia Agence Française de biolääketieteen, ARC (Association pour la Recherche sur le Cancer) (N: RAC11005LLA), inka, NR-Vaincre le Cancer, AIRC (Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro) IG hanke 5642 ja Italian Ministry of Health. S.A. oli vastaanottaja ARC ja NR-Vaincre le Cancer jatko apurahat. K.K. oli vastaanottaja jatko apurahoja Société Française de Néphrologie, ARC ja NR-Vaincre le Cancer. M.C. oli vastaanottaja apurahan alkaen Fondazione Italiana per la Lotta al Neuroblastooma. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

interleukiini-15 (IL-15) on pleiotrooppinen sytokiini osallistuu luontaisen immuniteetin sekä toimintojen ulkopuolella immuunijärjestelmää. IL-15 toiminnallisen monimuotoisuuden selittyy osittain sen monimutkaisen toimintamekanismi [1], [2], joihin liittyy paitsi liukeneva ja kalvo muodot sytokiinin mutta myös erilaiset IL-15-reseptoreita (IL-15R) erityisiä yhtäläisyyksiä ja signaalitransduktion reittejä [3], [4]. Itse asiassa IL-15 sitoutuu IL-15Rα oma ketju korkealla affiniteetilla (Kd≥10

-11 M), joka antaa tietyn signalointi vasteena IL-15 (NF-KB, Syk). IL-15: llä ja IL-2 IL-2Rp (CD122) ja IL-2Ry: n kanssa (CD132, yc) alayksiköt, jotka muodostavat joko toiminnallisen reseptorin korkean (IL-15Rαβγ, Kd≥10

-11 M) tai keskimääräisen affiniteetin (IL-15Rβγ, Kd = 4 nM) IL-15, jonka avulla signalointi kautta cascade, johon JAK /STAT, MAPK ja PI3-K transduktioreittejä.

yhteinen yc reseptoriketjuun on keskeinen osa neljän kierteen-nippu sytokiinien perheen, jonka avulla kautta yhdessä Janus tyrosiinikinaasin 3 (JAK3), aktivoituminen STAT molekyylien (signaalimuunta- ja aktivaattoreita Transcription) [5]. JAK3 fosforyloi eri loppupään STAT, suhteessa tyypin reseptorin kompleksin mukana. Siten IL-4 pääasiassa signaloi läpi STAT-6, kun taas IL-2, IL-7, IL-9 ja IL-21 toimivat kautta STAT-1 ja STAT-3: n ja IL-15 pääasiassa aktivoi STAT-5 [6], [7], [8]. Sekä yc ja JAK3 ovat välttämättömiä tehtävä kaikki sytokiinireseptorit tämän perheen ja niitä tarvitaan kehittämiseen lymfoidisolujen järjestelmän. Todellakin, geneettisiä vikoja yc tai JAK3 aiheuttaa vakavan yhdistetyn immuunikato (SCID) ominaista puute T, B ja NK-solujen niin hiirillä ja ihmisillä [9], [10], [11]. Kuitenkin on todettava, että SCID potilailla, korjaavat geeniterapian yc voi toimia myötävaikuttamassa Genesis solulymfoomiin [9], [11]. IL-2Ry: n kanssa ketju käy ilmi myös muita kuin lymfoidisoluissa ja havaitaan esimerkiksi tiettyjä kasvainsolujen epiteelisolujen [12], [13], [14] jossa määrä yc on mukana mekanismeja, jotka ohjaavat solujen kasvua. IL-2Ry: n kanssa on havaittu myös normaaleissa epiteelisoluissa, joissa se moduloi signaalin siirtoon eri jäsenten yc perheen, vaikka sen tiettyjä biologisia toimintoja ei ole vielä selkeästi määritelty [13], [15], [16].

ihmisen epiteelisoluja eri kudoksissa tuottavat IL-15, joka toimii ei vain immuunijärjestelmän solut (esim IELs suolistossa), mutta myös epiteelisolujen, pääasiassa kautta anti-apoptoottinen toiminta [17], [18] , [19], [20]. Näin ollen on osoitettu, että ihmisen ja hiiren munuaistiehyiden epiteelisolujen (RPTEC) konstitutiivisesti ilmentävät reseptoria IL-15Rαβγ [15] ja erittävät sytokiini IL-15 [21], jolla on tärkeä rooli munuaisten fysiologiaan autokriininen eloonjäämistekijä . Todellakin, lisääntynyt herkkyys solujen apoptoosiin on havaittu vaurioitunut munuainen IL-15 – /-, IL-15Rα – /- hiirissä, tai akuutin munuaisvaurion aiheuttamaa eri protokollia, jotka indusoivat lasku IL-15-tuotannon epiteelin soluihin [20], [22]. IL-15 parantaa suoliston toiminta edistämällä muodostuminen tiukka liittymissä välillä epiteelisoluihin [23]. Nämä tulokset viittaavat siihen, että IL-15 eloonjäämistekijänä voi olla muita tehtäviä, jotka on vielä tutkittava munuaisten epiteelisolujen [15], [24], [25], [26].

Koska sen immuno -stimulating aktiivisuus useissa prekliinisissä, käyttö IL-15 voi olla käyttökelpoinen sytokiini hoitoon munuaisten syövät. Vaikka IL-15 on parhaillaan testattavana kliinisissä kokeissa hoitoon munuaissyöpää (NCT01021059 Protocol) [2], toiminnot sytokiinin normaaleilla epiteelisolujen sekä kasvainsolujen edelleen heikosti tutkittu. Jotta voidaan paremmin ymmärtää toimintoja sytokiinien, ehdotamme tutkia IL-15 /IL15R järjestelmä ihmisen munuaisen epiteelisolujen normaalin alkuperää (RPTEC) ja solujen kasvaimen alkuperää (RCC).

tiedot osoittavat, että sekä

in vitro ja in vivo

ensisijainen normaali munuaisten proksimaalisten tubulussoluihin (RPTEC) ilmentävät IL-15Rαβγ reseptorin, kun taas ilmaus yc ketjun ja JAK3 vakavasti heikentynyt munuaisten selkeä syöpäsoluissa (RCC) . Differentiaalinen ilmentyminen yc ketjun ja JAK3 on huomattava vaikutus munuaisten homeostaasin, koska liukoista IL-15 RPTEC kautta yc ketjun signalointireitin säilyttää ilmaus tuumorisuppressorigeenin E-kadheriinin, estämällä niiden epiteelin-mesenkymaalitransitioon (EMT) sitoumus . Sitä vastoin menetys yc ketjun ja JAK3 perusterveydenhuollossa RCC johtaa muodostumista ennennäkemättömän toiminnallisen IL-15Rαβ korkea affiniteetti heterodimeeri, jonka stimulaatio liukoisen IL-15 saa alas-säätely E-kadheriinin ilmentymisen suosii EMT prosessi .

Materiaalit ja menetelmät

Vasta-aineet, sytokiinit, ja reagenssit

Vasta-aineita (Ab: t) vastaan, IL-15 (L-20), IL-15Rα (sc-9172) , IL-2Rp (sc-1046), IL-2Ry: n kanssa (sc-670), JAK3 (sc-513), ja vimentiinistä (sc-73260) saatiin Santa Cruz Biotechnology (Delaware, CA). Vasta-aineita fosforyloidun ERK (4377), fosforyloitu IKB (4921), Stat5: n (9358) fosforyloitua Stat5: n (9356), ja Alexa fluor-konjugoitua kanin monoklonaalista vasta-ainetta vastaan ​​fosforyloidun Stat5: n (3939) saatiin Cell Signaling (Beverly, MA). Vasta-aineet IL-15Rα (AF247), E-kadheriinin (AF648) ja PE-konjugoitu anti-E-kadheriini (FAB18381P) saatiin R R 5′-TGCCTGTGGCCCTGTGGATA; IL-2Rp F 5′-GAATTCCCTGGAGAGATGGCCACGGTCCCA; R 5′-GAATTCGAGGTTTG GAAATGGATGGACCAAGT; yc ketjun F 5′-CCAGGACCCACGGGAACCCA; R 5′-GG TGGGAATTCGGGGCATCG; JAK3 F 5′-CGTTCATGCAGCCTCTTGTTC; R 5′-GCGCA CCGTCCTCCGAATAC; β-aktiini F 5′-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA; R 5′-CTCCTTA ATGTCACGCACGATTTC.

IL-15 sitoutumismääritykset

Ihmisen rIL-15 radioleimattiin jodia (spesifinen radioaktiivisuus noin 2000 cpm /fmol) käyttäen kloramiini-T-menetelmä ja sidoskokeita suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [30]. Epäspesifinen sitoutuminen määritettiin, kun läsnä oli 100-kertainen ylimäärä leimaamatonta sytokiinin. IL-15 sitoutumisen kokeissa RCC7 soluja inkuboitiin kasvavien pitoisuuksien kanssa leimatun rIL-15. Regressioanalyysi sitovan tietojen toteutettiin käyttäen yhden sivuston tasapaino sitova yhtälö (Grafit, Erithacus Software, Staines, Yhdistynyt kuningaskunta), ja tiedot on piirretty Scatchard koordinaatistossa. Eston IL-15 sitoutumisen kokeissa RCC7 soluja inkuboitiin, kun läsnä oli kohonneet pitoisuudet jodatun rIL-15, ja kiinteät pitoisuudet neutraloivat vasta-aineet IL-2Rp (Mikβ1, 10 ug /ml) tai IL-2Ry: n kanssa (mAB2842 , 1 ug /ml) ketjuja. Regressioanalyysi tietojen suoritettiin käyttäen 4-parametrin logistista yhtälöä (Grafit, Erithacus Software).

Plasmidit ja ohimenevän transfektion

pCMV6 koodaavan vektorin täysimittaisen cDNA Myc-DDK-merkitty ORF ihmisen interleukiini 2 -reseptorin gamma (IL2Rγ) hankittiin Origene Technologies Inc (Rockville, MD, USA) ja ihmisen täyspitkän JAK3 cDNA jatkokloonattiin välillä EcoRI-Xhol-restriktiokohtien

pcDNA3.1

eukarioottiekspressiovektoriin oli ystävällinen lahjoitus tri Franck GESBERT (UMR1004, Inserm, Ranska). Plasmidit transformoitiin Top 10 toimivaltainen bakteerisolut mukaan valmistajan protokollan (Invitrogen, Carlsbad, CA), uutetaan käyttäen Maxiprep (Qiagen, Valencia, CA), ja monistettiin viljelemällä Luria-Bertani-ampisilliiniä liemi. cDNA: t transfektoitiin ohimenevästi soluihin mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Lyhyesti, solut maljattiin kuuteen-kuoppaisille levyille (0,25 x 10

6 solua /kuoppa) ja viljeltiin yön täydellisessä alustassa. Ohimenevä Seosta, joka sisälsi 1,0 ug plasmidi-DNA: ta ja 6 ui Fugene 6 transfektioreagenssia (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN) 100 ul: ssa seerumitonta DMEM-alustassa (Invitrogen), sekoitettiin 20 minuuttia huoneen lämpötilassa ja sen jälkeen lisätään jokaiseen kuoppaan, jossa täydellisessä kasvualustassa 48 tuntia. Tyhjät

pcDNA3.1

vektori transfektoitiin kontrollina.

virtaussytometria Analyysit

Kaikille alla kuvattuja määrityksiä, ostimme fluoresenssi tietoja 10000 solujen FACSCalibur virtaussytometria (BD Biosciences) ja analysoitiin käyttäen CellQuest ohjelmistoa (BD Biosciences). Kolme toistoa käytettiin kunkin kunnossa ja koe toistettiin vähintään kolme kertaa.

Expression of Cellular antigeenejä.

Expression solun pinnan (E-kadheriinin) ja solunsisäinen (vimentiinin, Pan CK) antigeenejä analysoitiin virtaussytometrialla, kuten aikaisemmin on kuvattu [29], [31], [32]. Lyhyesti, suspensiot entsymaattisesti irrottaa soluja läpäiseviksi tai BD Cytofix /Cytoperm reagenssia (BD Pharmingen, Le Pont de Claix, Ranska), ja 10

5-solut suspendoitiin RPMI 1% FCS: ää ja värjättiin konjugoidun vasta-aineita, jotka kohdistuvat edellä mainittujen solujen markkereita. Sen jälkeen solut kiinnitettiin inkuboimalla 1% paraformaldehydillä fosfaattipuskuroidussa suolaliuoksessa (PBS) 20 minuutin ajan huoneen lämpötilassa ja analysoitiin virtaussytometrialla.

Stat5: n Aktivointi.

tutkittu Stat5: n aktivointi in RCCWT (RCC villityypin) ja IL-2Ry: n kanssa ja /tai JAK3-transfektoitujen RCC käsittelemällä soluja 10 pg /ml rhlL-15 40 minuutin aikana. Käsitellyn ja käsittelemättömän solut irrotettiin trypsiinillä, pestiin ja kiinnitettiin inkuboimalla 1% paraformaldehydillä PBS: ssä 20 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Solut tehtiin läpäiseviksi suspendoimalla uudelleen, ja vorteksoimalla, jääkylmään metanolia ja inkuboitiin 4 ° C: ssa 10 minuutin ajan. Solut pestiin 1% BSA PBS: ssä ja inkuboitiin Alexa Fluor 488-konjugoitu hiiren monoklonaalinen vasta-aine fosforyloidun Stat5: n 60 minuutin ajan 4 ° C: ssa.

immunosaostus ja immunoblot-analyysit

Kaikki immunoblottaus (WB) suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [29]. Immunosaostukseen, PBS-pesty solupelletti hajotettiin 1 ml: ssa 1% NP-40 ja 0,1% SDS: ää, 50 mM natriumfosfaattipuskuria, pH 7,8, 150 mM NaCl, 1 mM natriumortovanadaattia, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM AEBSF, aprotiniinia, leupeptiiniä ja pepstatiini (5 ug /ml kutakin). 15 min kuluttua ravistellen 4 ° C: ssa, suspensio sentrifugoitiin (30 min 14000 rpm, 4 ° C). Supernatantti lisättiin 20 ul: aan Sepharose-konjugoidun-M161 (anti-IL-15Rα, 2 ug /ul). 4 tunnin kuluttua sekoittaen 4 ° C: ssa, immuunikompleksien pestiin 5 kertaa 1 ml: aan lysis-puskuria ja levitetään 10% PAGE-SDS. Blotit käsiteltiin kuten aiemmin on kuvattu [29].

Immunosytokemia

Solut jaettiin kahdeksan hyvin osastoissa Lab-Tek kudosviljelmässä kammio dioja (1 x 10

5 solua kuoppaa kohti Nunc, Naperville, Ill.), ja yhtymäkohdassa, käsiteltiin tai ei ole 10 pg /ml rhlL-15 5 päivää. Kalvoon värjäys, solut kiinnitettiin kylmällä methanol:acetone (01:01) -20 ° C: ssa 10 minuuttia, pestään sitten estettiin PBS: llä, 3% BSA: lla 60 min. Soluja inkuboitiin anti-ihmis-E-kadheriinin ja FITC-konjugoitua anti-ASO2 vasta yön yli 4 ° C: ssa. Sen jälkeen solut pestiin, inkuboitiin 30 minuuttia, jossa AlexaFluor488-konjugoitu kanin anti-vuohi-vasta-aine. Solunsisäiseen värjäys, solut kiinnitettiin 4% (paino /tilavuus) paraformaldehydillä PBS: ssä ja läpäiseviksi inkuboimalla 1 minuutin ajan 0,5% Triton X-100 PBS: ssä. Soluja inkuboitiin blokkausliuoksella (3% BSA: ta PBS: ssä) ja inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa eri vasta-aineilla. Sitten solut pestiin ja inkuboitiin Alexa Fluor 488-konjugoitu kanin anti-hiiri- tai anti-vuohi-IgG laimennettuna estoliuoksessa ja inkuboitiin 30 minuuttia. F-aktiini organisaatio paljastui värjäämällä solut 0,2 ug /ml rodamiinikonjugoitu phalloidin 20 minuuttia. Solut pestiin PBS: llä, joka on asennettu 4,6-diamino-2-fenyyli (DAPI, Invitrogen, Cergy Pontoise, Ranska), ja visualisoitiin fluoresenssimikroskopialla (Leica, Saksa).

immunohistokemia parafiini- Sulautettu munuaisten kasvain ja normaali näytteet

Biopsies 3 normaalia ja 10 kasvaimen osastoja nefrektomisoiduilla munuaiset munuaissyövän leikeltiin 4 um päälle Superfrost plus dioja. Parafiini liukuu rehydratoitiin arvostellaan alkoholit, ja altistetaan lämmölle-epitooppisup- haku upottamalla ne 0,01 mol /l sitraatti- puskuria (pH 6,0). Leikkeitä inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa anti-IL-2Rp (AB364), anti-IL-2Ry: n kanssa (sc-670) tai anti-JAK3 (07-1488) Abs, PBS-huuhdeltiin ja inkuboitiin HRP-asteen Ab 45 min. Analyysi suoritettiin standardimenetelmillä käyttämällä diaminobentsidiiniä jälkeen counterstaining kohdat hematoksyliinillä. Negatiivinen kontrolli suoritettiin kaikki hoidot jättämällä primaarista vasta-ainetta. Dioja skannattiin käyttäen Aperio skanneri (Vista, CA) ja värjäys kvantitoitiin käyttäen morfometrisiin TRIBVN ohjelmisto (Montrouge, Ranska).

Tulokset

IL-15R ilmentymistä RPTEC ja RCC primääriviljelmien

jotta valottaa toiminta IL-15 munuaisen ihmisen malli, tutkimme IL-15-reseptorin alayksiköt (IL-15Rαβγ) on primääriviljelmien normaali munuaisten proksimaalisten tubulusten epiteelisolujen ( RPTEC) ja selkeä solujen munuaiskarsinoomissa (RCC).

RT-PCR-analyysi (kuvio 1A, ylempi paneeli) osoittaa, että RPTEC suostumuksella positiivinen PBL kontrolli, ilmaisemaan eri transkriptien IL-15Rα ketju ( 432 ja 531 bp), transkriptio IL-15Rβ (542 emäsparia) ja transkriptio että yc ketju (480 emäsparia). Sitä vastoin, vain IL-15Rα ja β-ketjujen, mutta ei yc-ketju, havaittiin joko RCC (RCC5 ja RCC7) tai ACHN solulinjassa. Koska JAK3-kinaasin spesifisesti vuorovaikutuksessa sen vastaavan reseptorin yc-ketju, ja ilmaisun sekä molekyylien on toisistaan ​​riippuvaisia ​​[33], me analysoitiin edelleen, RT-PCR: llä, JAK3 ilmentyminen normaalissa ja kasvaimen munuaisten soluja (kuvio 1A, alempi paneeli). JAK3 kinaasin havaittiin positiivisen hematopoeettisten kontrolli solulinjan TF1β ja RPTEC, kun taas heikko messenger määrän tai poissa (RCC8) havaittiin RCC analysoitu. Ei JAK3 messenger havaittu MCF-7-ohjaus solujen [34].

Analyysi IL-15R ja JAK3-ilmentyminen suoritettiin RT-PCR: llä (A) ja immunoblottaus (B) ensisijaisena normaali (RPTEC) ja kasvainten (RCC5, RCC7, RCC8) epiteelisolujen ja ACHN solulinjassa. Tiedot osoittavat, että RPTEC ilmaista kolme ketjua IL-15R (αβγ) ja JAK3 taas yc ja JAK3 proteiineja ei havaittu RCC. Spesifisiä alukkeita tai Abs IL-15Rα (AF247), IL-2Rp (sc-1046), IL-2Ry: n kanssa (sc-670) ja JAK3 (sc-513) käytettiin. PBL, TF1β, MCF7 ja IFNy-aktivoitu U937-soluja käytettiin kontrolleina. Siivous β-aktiini käytettiin lastaus ohjaus.

Vahvista ero reseptorin ekspression alayksiköiden ja JAK3-kinaasi proteiinitasolla, immunoblottaus suoritettiin sekä normaaleissa että kasvainsoluissa. Analyysi vahvisti, että RPTEC, RCC ja TF1β solut ilmentävät kaksi suurta bändejä 46 ja 56 kDa spesifisiä IL-15Rα (kuvio 1 B, ylempi paneeli) ja 75 kDa IL-15Rβ ketju (kuvio 1 B, keskimmäinen paneeli) . Puuttuessa yc ketjun RCC vahvistettiin, koska 64 kDa havaitaan ainoastaan ​​positiivinen kontrolli solulinjoissa (TF1β ja IFN-γ käsitelty U937) ja RPTEC (kuvio 1 B, keskimmäinen paneeli). JAK3 molekyyli (116 kDa) havaittiin TF1β ja RPTEC soluja, kun taas immunoblotting ei tunnista kinaasi RCC, sekä MCF-7: n ja IFN-γ käsiteltiin U937-ohjaus solulinjoja, kuten aiemmin on raportoitu [34], [35] (kuvio 1 B, alempi paneeli). Kaikissa edellä mainituissa kokeissa tutkimme myös munuaisten ATCC-CRL-1611 solulinja (ACHN) että näyttö IL-15R ja JAK3 ilmaisun homologisia havaittuun RCC perusnäytteiksi.

Menetys yc ketjun munuaisten kirkas cell carcinoma kudosnäytteistä

jotta voitaisiin vahvistaa meidän

in vitro

data, IL-2Rp ketju, yc ketju ja JAK3 immunohistokemiallista värjäykset suoritettiin normaali ja kasvaimen osat nefrektomisoiduilla munuaiset munuaissolukarsinooma karsinooma. Hematoksyliini värjäys parafiiniin ihmisen munuaisen ilmeni, valomikroskoopilla läsnä glomerulusten (Gl) ja useita distaalinen (Dt) ja proksimaalinen (Pt) tubulukset normaalissa kudosnäytteistä (kuvio 2). Sen sijaan nämä munuaisten rakenteet eivät ole enää läsnä munuaissyöpä osiossa, joka esittää kasvainsolujen selkeitä solun morfologia, tunnettu optisesti kirkas solulima ja terävästi hahmoteltu solukalvon.

hematoksy- värjäystä koepalat 2 normaalista näytteistä paljastaa läsnäolo normaalin munuaisen rakenteiden (glomerulus (Gl), distaalinen (Dt) ja proksimaalinen (Pt) tubulukset), kun taas analyysi kahden eri syövän yksilöitä osoittaa, että normaali kudosrakenne on täysin menetetty ja korvataan kasvainsolujen selkeitä solun morfologia, tunnettu optisesti kirkas solulima ja terävästi hahmoteltu solukalvon. Eroa ei IL-2Rp on havaittu normaalin ja kasvainkudoksen näytteitä, IL-2Ry: n kanssa värjäys, lokalisoitu sekä proksimaalisen ja distaalisen tubulusten normaalissa kudosnäytteistä, ei löydy kasvain näytteissä. Vahva JAK3 värjäytyminen on lokalisoitu sekä proksimaalisen ja distaalisen tubulussoluihin normaaleissa kudoksissa, kun taas hyvin heikko JAK3 proteiinin ekspressio havaitaan kasvainnäytteissä. Kaksi edustavaa näytettä yhteensä kymmenen esitetään kunkin värjäystä. Negatiivinen kontrolli suoritettiin kaikki hoidot jättämällä ensisijainen vasta-aine. Mittaviivat 50 pm. Värjäytyminen kvantitoitiin käyttäen morfometrisiin TRIBVN ohjelmisto (Montrouge, Ranska) ja tulokset esitetään histogrammit.

immunohistokemiallinen värjäys kahdella eri normaali munuaisten yksilöitä paljastaa, että IL-2Rp ketju, yc ketju ja vahvan JAK3 ilme havaitaan päälle proksimaalisen ja distaalisen putkimainen soluja. Sen sijaan, analyysi eri kasvaimen näytteistä löytyi puuttuessa yc-ketju värjäytymistä (P 0,01), jolla on hyvin heikko JAK3 proteiinin ilmentymisen (P 0,01), kun taas mitään merkittäviä eroja (P 0,05), että IL-2Rp ketju ei havaittu normaalin ja kasvaimen kudokset mikä vahvistaa saadut tulokset

in vitro

primaariviljelmissä normaalien ja syöpäsolujen.

Soluble IL-15 laukaisee ero solun signaalin RCC ja RPTEC

Tietääksemme IL-15Rαβ heterodimeeri vasta kuvattu IL-2Ry: n kanssa – /- hiirien, joka esittelee tehokkaan sitoutumisen ja endosytoosin radioleimatun IL-15 [36]. Kuitenkin kirjoittajat eivät tutkia, IL-15Rαβ heterodimeeri esiintyy esimuotoiltu monimutkainen tai on muodostettu seuraavien IL-15 sitova jolloin syntyy funktionaalista heterodimeerin.

arvioimiseksi IL-15 sitova yc-negatiivinen RCC, ensin analysoitiin radioaktiivisesti ihmisen rekombinantti-IL-15 (rhlL-15) sitoutumisen RCC7-soluihin Scatchard juoni analyysi (kuvio 3A). Data osoittaa, että läsnä on yksi ainoa luokan suuren affiniteetin reseptorit (Kd = 375 pM, 413 IL-15 sitoutumiskohdat solua kohti). Erityiset IL-15 sitoutuminen kumosi kokonaan anti-IL-2Rp mAb Mikβ1 (kuvio 3A, upotus), kun taas neutraloivat anti-IL-2Ry: n kanssa mAb: tä ei ollut vaikutusta erityistä IL-15: n sitoutumiseen, mikä viittaa siihen, että sitoutuminen todellakin heijastuu läsnä IL-15Rα /IL-2Rp monimutkainen.

A) Scatchard juoni analyysi: Effects of anti-IL-15Rβ ja yc mAb: t IL-15 sitoutumisen RCC. IL-15 sitoutumisen kokeissa RCC7 soluja inkuboitiin kasvavien pitoisuuksien kanssa radioaktiivisella jodilla rIL-15 läsnä vai ei seuraavista neutraloivan mAb: t: anti-IL-2Rp: n ja IL-2Ry: n kanssa. Epäspesifinen solujen sitoutuminen määritettiin, kun läsnä oli radioaktiivisella jodilla rhIL-15 ja 100-kertainen ylimäärä leimaamatonta rhIL-15. Soluun sitoutuneen (B) ja sitoutumaton (vapaa, F) fraktiot mitattiin, ja erityisiä sitoutuneen fraktion laskettiin vähentämällä ei-spesifinen sitoutuminen solusta-sitoutunut fraktio. Ordinaatalla piirretään suhde tietyn sidotun fraktion (ilmaistuna sivustot solua kohti) yli kokonaispitoisuus (sidottu plus ilmainen) radiojodatun rIL-15 (ilmaistuna pM). On abskissa sitoutuneen osan (ilmaistuna sivustot solua kohti). Korkean affiniteetin erityisiä IL-15: n sitoutumiseen (Kd = 375 pM, 413 IL-15 sitoutumiskohdat solua kohti), joka oli täysin kumottu neutraloivan vasta-aineen vastaan ​​IL-2Rp (upotus), mutta ei yc-ketju, ehdotti läsnäolo RCC IL-15Rα /IL-2Rp: n kanssa kompleksin. B) Detection of IL-15Rαβ kompleksin immunosaostuksella (IP), anti-IL-15Rα (M161) tai hiiri-IgG-proteiini G-Sepharose-konjugaatin yhteensä lysaatti (TL) ja RCC7. Immunosaostettiin komplekseja pyyhittäisiin joko anti-IL-2Rp (sc-1046) ja anti-IL-15Rα (sc-9172). C) Stimulation 10 ja 40 min fysiologisella (10 pg /ml) ja supra-fysiologista (10 ng /ml) rhIL-15 indusoi fosforylaation MAPK ERK1 /2 ja IκBα vuonna RPTEC ja RCC7, kun taas Stat5: n aktivointi oli havaittu vain RPTEC. Histogrammit edustavat densitometrian vertailu kunkin tekijän normalisoida p-aktiini 3 eri RCC (RCC5, RCC7, RCC8) ja 3 RPTEC erissä. * P 0,05 vs. kontrolli, Mann-Whitney testi. Eräässä kokeessa edustaa yhteensä kolme on esitetty.

Vahvista läsnä ollessa IL-15Rα /IL-2Rp kompleksin heterodimeeri, mahdolliset vuorovaikutukset IL-15Rα ja IL-2Rp-ketjujen RCC tutkittiin suorittamalla samanaikainen immunosaostus kokeita RCC7 solulysaateista immunoadsorptiolla Sepharose-konjugoidulla anti-IL-15Rα (M161) (kuvio 3B). Anti-IL-2Rp immunoblottausta osoittaa, että läsnä on erityisiä 75 kDa: n proteiinin (ylempi paneeli), kun taas anti-IL-15Rα blot, suoritettiin samalla kalvo, osoittaa spesifisten nauhojen 56 ja 46 kDa: n (alempi paneeli), mikä osoittaa, että IL-2Rp: n ja IL-15Rα reseptorin alayksiköt ovat olennaisesti niihin liittyvien, muodostaa IL-15Rαβ heterodimeeri ilman sytokiinia.

sen määrittämiseksi, onko IL-15Rαβ monimutkainen ilmentyy RCC on toimiva, tutkimme signaalitransduktion aktivointi normaalissa ja kasvaimen munuaisten solut käsiteltiin fysiologisella (10 pg /ml) ja supra-fysiologista (10 ng /ml), rhIL-15 (kuvio 3C). Stimulaation rhIL-15 (10-40 min) indusoitu RCC7 fosforylaation MAPK ERK1 /2 sekä pitoisuuksilla, kun taas mitään Stat5: n fosforylaatiota ei havaittu, vaikka läsnä oli 10 ng /ml rhlL-15 (kuvio 3B, yläpaneeli ). Sen sijaan RPTEC ilmentävät heterotrimeerisen reseptori monimutkainen, MAPK: ERK1 /2 ja Stat5: n indusoitiin vasteena 10 pg /ml ja 10 ng /ml rhlL-15. Lisäksi on nopea fosforylaatio IκBα keskeinen tapahtuma aktivointi transkriptiotekijä NF-KB: n, in RPTEC ja RCC7 vasteena fysiologisiin rhIL-15 pitoisuus (kuvio 3B, alempi paneeli), mikä osoittaa, että IL-15Rαβ kompleksi sitoo IL-15 korkealla affiniteetilla ja on toiminnallinen.

Soluble IL-15 ohjaa E-kadheriinin ilmentymisen munuaisten epiteelisolujen

E-kadheriinin tehtävänä on ylläpitää vuorovaikutuksia epiteelisolujen ja on usein alassäädetty aikana syövän etenemistä [37]. Näin ollen tutkimme vaikutuksia rhIL-15 E-kadheriinin ilmentymisen sekä RCC7 ja RPTEC immunofluoresenssilla analyysi (kuvio 4A) ja immunoblottauksella (kuvio 4B). Arvioida vaikutuksen rhIL-15 normaalein RPTEC käytimme solumallin jossa riisto kortikosteroidit, jotka ovat voimakkaita indusoijia E-kadheriinin [38], sekä ilman päivittäistä väliaineen uusiminen johtaa viiden päivän lasku E-kadheriinin ilmentymisen, vaikuttamatta solujen elinkykyä (97%, tuloksia ei ole esitetty). Immunofluoresenssianalyysi (kuvio 4A) esittää, että normaaleissa epiteelisoluissa RPTEC ensimmäisen kanavien (p2) näyttää epiteelin kaltainen morfologia ominaista korkea kalvo E-kadheriinin ilmentyminen (pohjapinta d0) toisin kuin viisi päivää vanhaa RPTEC (pohjapinta-d5 ), joilla on alhainen E-kadheriinin ilmentymisen puuttuessa päivittäin väliaineen uusiminen. Lisättiin 10 pg /ml rhlL-15 viiden vuorokauden ajan säilyttää alkuperäisen E-kadheriinin tasolla ja näin ollen epiteelin kaltainen morfologia. Toisin kuin RPTEC, RCC7 päivänä 0 ja päivänä 5 näyttö heikko E-kadheriinin ilmentymisen, joka katoaa 5 päivää ja rhIL-15 käsittelyä (kuvio 4A). Immunoblottaus-analyysi (kuvio 4B) osoittaa selvästi päinvastaiset vaikutukset ja rhIL-15 ilmentyminen kypsän 120 kDa: n E-kadheriinin muodossa RPTEC verrattuna RCC (päivä 5).

Immunofluoresenssianalyysi (A) ja immunoblottaus ( B) osoittavat, että 5 päivää rhIL-15 hoitoa (10 pg /ml) säilyttää kalvo E-kadheriinin ilmentymisen ensisijaisen normaaleissa epiteelisoluissa RPTEC, kun se indusoi sen alas-asetuksen RCC7. Keskipitkällä kulttuuri RPTEC ei muutettu jotta aiheuttaa lasku E-kadheriinin ilmentymisen. Hoito rhIL-15 uudistettiin päivänä 3. histogrammit edustavat densitometria vertailu E-kadheriinin immunobloteilla normalisoida p-aktiini 3 eri RCC (RCC5, RCC7, RCC8) solut ja 3 RPTEC erissä.