Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Noin 60-80%: lla, edenneen pään ja kaulan okasolusyöpä (HNSCC) kuolee viiden vuoden kuluessa diagnoosista. Sisplatiini-kemoterapian on yleisimmin käytetty lievittävää hoitoa näille potilaille. Arvioidaan ennustetekijöiden arvon X-kromosomiin liittyvä estäjä apoptoosin (XIAP) taso mahdollisena biomarkkereiden näillä potilailla, tutkimme suhdetta XIAP ilmaisun ja sisplatiinin vaste näistä potilaista ja niiden ennustetta.

Menetelmät /Principal havainnot

Sixty joilla on pitkälle HNSCC rekrytoitiin tässä tutkimuksessa. Expression of XIAP tutkittiin sekä ennen että jälkeen kemoterapiaa ja korreloi kemoterapian vaste, clinicopathology parametrit ja kliinisten tulosten potilaista. Huomasimme, että XIAP ilmentyi 17 (20,83%) ja 60 kehittyneen HNSCC näytteitä ja ilmentyminen merkitsevästi yhteydessä sisplatiinin vastus (P = 0,036) ja huono kliiniseen tulokseen (P = 0,025). Sisplatiini kemoterapian aiheuttama XIAP ilmentyminen niissä jälkeisessä kemoterapiaa näytteet (P = 0,011), edelleen yhteydessä heikompaan kliiniseen tulokseen (P = 0,029). Monimuuttuja-analyysi osoitti, että vain alkoholin kulutus, imusolmuke etäpesäke ja XIAP taso oli itsenäisesti liittyy ennusteeseen kehittyneiden HNSCC potilaista. Estämällä XIAP ilmaisutapoja siRNA XIAP yli-ilmennetään HNSCC solut huomattavasti lisänneet herkkyyttä sisplatiinihoitoon lähes 3 kertainen ero.

Johtopäätökset /merkitys

Tuloksemme osoittavat, että XIAP yliekspressio on tärkeä rooli taudin kurssi ja sisplatiini-vastus kehittyneiden HNSCC. XIAP on arvokas ennustaja sisplatiinin-vasteen ja ennusteen potilailla, joilla on pitkälle edennyt pään ja kaulan alueen syöpä. Down-regulation XIAP saattaa olla lupaava adjuvanttihoito niille potilaille kehittyneitä HNSCC.

Citation: Yang X-H, Feng Z-E, Yan M, Hanada S, Zuo H, Yang C-Z, et al. (2012) XIAP Onko Predictor Sisplatiinin-kemoterapian Response ja Prognoosi Potilaat, joilla Advanced Head and Neck Cancer. PLoS ONE 7 (3): e31601. doi: 10,1371 /journal.pone.0031601

Editor: Torbjörn Ramqvist, Karolinska Institutet, Ruotsi

vastaanotettu: 1. syyskuuta 2011; Hyväksytty: 10 tammikuu 2012; Julkaistu 5 maaliskuuta 2012

Copyright: © 2012 Yang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat Project National Natural Science Foundation of China (Grant nro 30772433), Project Science and Technology komissio Shanghai kunta (Grant nro 07QA14038), ja Shanghai Johtava Academic Kuri Project (Hanke nro S30206). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Pään ja kaulan levyepiteelisyöpä (HNSCC) on viidenneksi yleisin syöpä maailmassa ja on yleisin kasvain Keski-Aasiassa [1]. Vaikka alkuvaiheen HNSCC on korkea parannuskeinoa hinnat, jopa 50%: lla potilaista esiintyy edennyt sairaus [2]. Näistä pitkälle HNSCC potilasta, 60-80% kuolee 5 vuoden kuluttua diagnoosista [3]. Tällä hetkellä, sisplatiini-kemoterapian on yleisimmin käytetty lievittävää hoitoa näille potilaille. Kuitenkin klinikalla vain rajallinen määrä potilaat hyötyvät sisplatiini-kemoterapian; muut potilaat ovat resistenttejä tämän hoidon ja jotkut kuolee hoitoon liittyvän toksisuuden [4]. Siksi on tärkeää etsiä ennustavia tai mahdollisten biomarkkereita, jotka voivat auttaa tunnistamaan potilaat, jotka saattavat hyötyä sisplatiini-kemoterapian.

estäjät apoptoosin proteiinien (IAP: t) edustavat yhdet endogeeninen apoptoosin modulaattoreina nisäkässoluissa, jotka koostuvat kahdeksan jäsentä: XIAP, cIAP1, cIAP2 surviviiniperäiset, NIAP, Bruce, ML-IAP ja ILP-2 [5]. Nämä proteiinit välittävät useita biologisia toimintoja, jotka sisältävät sitoutumisen ja estämällä kaspaasien, säätelemällä solukierron etenemiseen ja modulointiin reseptori-välitteiseen signaalin siirtoon [6]. Niistä, X-kytketty apoptoosi-inhibiittori (XIAP) on yksi tehokas inhibiittori kaspaasien ja apoptoosin. XIAP voivat suoraan sitoutua ja estää sekä aloitteentekijänä ja efektori caspases ja estävät sekä mitokondrioiden riippuvia ja riippumattaman apoptoottisten reittien [7], [8], [9]. Viimeaikaiset havainnot ovat osoittaneet,

in vitro

, XIAP voi aiheuttaa vastustusta kasvainsolut, kun se altistetaan erilaisia ​​apoptoottisten ärsykkeille, mukaan lukien kemoterapia [10], [11]. Kuitenkin, se ei tiedetä XIAP ekspressiotaso voitaisiin käyttää ennustamaan sisplatiinin vaste kehittyneiden HNSCC. Siksi Tutkimuksen tarkoituksena oli selvittää ilmaus XIAP kehittyneissä HNSCC ja sen suhdetta sisplatiinin vaste ja ennusteen näistä potilaista.

Tulokset

XIAP ilmentymistaso liittyy huono kliininen tulos kehittyneiden HNSCC potilaiden

XIAP pääasiassa lokalisoitu sytoplasmassa kasvainsolujen (kuvio 1), jossa on erittäin vaihteleva positiivinen korko 1% -85%. Nucleus värjäytyminen oli ajoittain havaittu jälkeisiä kemoterapiaa näytteitä. Potilaat, joiden kasvaimet ilmaisivat korkeita XIAP oli yleensä huonompi ennuste kuin potilaat, joiden kasvaimet ilmaisivat alhainen XIAP ennalta kemoterapiaa syövän kudoksen (eloonjäämiseen

P

= 0,025, Log Rank testi, kuva 2). XIAP ilmentymisnopeudessa ei korreloi TNM vaiheessa patologisen asteen, tupakointi ja alkoholin historia näistä potilaista on pitkälle edennyt HNSCC (taulukko 1). Vuonna Monimuuttuja-analyysissä, imusolmuke etäpesäke, alkoholin kulutus ja XIAP lauseke (pre-kemoterapiaa) olivat itsenäisiä riskitekijöitä potilaiden ennustetta (taulukko 2).

V: Negatiivinen vertailu PBS: llä sijasta ensimmäinen vasta-aine; B: Alhainen ilmentyminen XIAP (prosenttiosuus positiivisia 25%); C: Korkea ilmaus XIAP (prosenttiosuus positiivisia 25%).

V: Kokonaiselossaoloaika korkoa XIAP tulokset. Potilaat, joiden kasvaimet ilmaisivat korkeita XIAP oli yleensä huonompi ennuste kuin potilaat, joiden kasvaimet ilmaisivat alhainen XIAP ennalta kemoterapiaa syövän kudoksen; B: Kokonaiselossaoloaika korkoa chemoresponse. Potilaat, joiden kasvaimet olivat reagoi kemoterapiaa yleensä oli parempi ennuste kuin potilaat, joiden kasvain oli resistentti kemoterapiaa; C: XIAP tulokset jälkeisen kemoterapiaa näytteitä. XIAP tasot jälkeisessä kemoterapiaa näytteet myös merkittävästi potilaaseen liittyvää yleistä eloonjäämisluvuissa.

XIAP ilmentymisen taso oli kemoterapiaan liittyvän vasteen joilla on pitkälle edennyt HNSCC

Kaikki nämä kehittyneet HNSCC potilaista oli lopettanut yhden jakson kemoterapiaa. Niistä 34 tapausta olivat täydellinen hoitovaste (CR) ja osittainen vaste (PR) ja kemoterapiaa ja 26 tapausta oli etenevä tauti (PD) ja stabiili tauti (SD). Potilaat, joiden kasvaimet ilmaisivat korkea XIAP olivat huomattavasti vastustuskykyisempiä sisplatiini-kemoterapian ja oli yleensä huonompi kemoterapian vasteet (

P

= 0,005, taulukko 1). XIAP ilmentymistasot huomattavasti lisääntynyt jälkeisessä kemoterapiaa HNSCC kudoksissa verrattuna pre-kemoterapian näytteet (

P

= 0,011, taulukko 3). XIAP tasot jälkeisessä kemoterapiaa näytteet myös merkittävästi liittyy yleiseen eloonjäämislukuja näistä potilaista (

P

= 0,029) (kuvio 2), vaikka Monimuuttuja-analyysissä, se ei ollut riippumaton tekijä liittyy potilaiden ”tuloksia.

Inhiboivaa XIAP ilmaisu herkistyneet HNSCC solulinjat sisplatiinihoitoon

tutkimiseksi rento suhde XIAP ilmaisun ja lääkevaste potilaiden, käytimme siRNA estämään XIAP ilmaisun HNSCC solulinja CAL27 ja WSU-HN13. Kolme siRNA: t on suunniteltu estämään ilmentymistä XIAP on CAL27 ja WSU-HN13-soluja, ja niiden joukossa, siRNA1 hoitoryhmässä saatu near70%: n vähennys XIAP mRNA: n ekspression sekä soluissa (kuvio 3). Verrattuna negatiivinen kontrolliryhmä, sisplatiini IC50-arvo siRNA1 ryhmässä laski 0,51 ug /ml 0,20 mikrog /ml (

P

= 0,05, kuvio 4) sisään CAL27 ja 4,32-1,82 mikrog /ml WSU -HN13.

Inhibition tehoa siRNA-1, siRNA-2 ja siRNA-3 ilmaus XIAP mRNA tutkittiin CAL27 solussa (ylempi) ja WSU-HN13 cell (Ala) Real-time PCR . XIAP siRNA1 hoitoryhmässä saatiin lähes 70%: n vähennys XIAP mRNA ilmaisun molemmissa soluissa.

XIAP siRNA-1 esti ilmentymistä XIAP proteiinin sekä CAL27 ja WSU-HN13 soluja (ylempi) ja väheni sisplatiini IC50-arvo 0,51 ng /ml 0,20 mikrog /ml CAL27 ja 4,32-1,82 mikrog /ml WSU-HN13 (Ala).

keskustelu

sisplatiiniannoksen pohjainen neoadjuvanttikemoterapian, leikkaus ja sädehoito käytetään pidettävä vakiona järjestelmän kokeneille HNSCC potilaiden korkean riskin; kuitenkin, terapeuttisia vaikutuksia neoadjuvant hoidon pysyvät tuloksettomia johtuen monista satunnaistettuja epäonnistunut osoittamaan selviytymisen etu käyttämällä neoadjuvanttikemoterapian [12], [13]. Vaikka summittaiset anto neoadjuvanttikemoterapian osoitteiden mitään hyötyä potilaan lopputulokseen (viiden vuoden pysyvyys oli 38,33% tutkimuksessamme), löysimme ne potilaat, joille saatiin kliininen vaste oli suotuisampi ennuste (p = 0,001, log-rank-testi ), joka on tietyssä aikaisempien raporttien [12], [13]. Tästä näkökulmasta arvioida miten valikoivasti valita potilaita, jotka olisivat positiivisesti hyötyä neoadjuvanttikemoterapian oli ratkaiseva tekijä onnistuneen hoidon [4].

Tässä tutkimuksessa havaitsimme vahvaa suhdetta ilmentymistason XIAP ja kliinisen vasteen ja ennusteen potilaita, joilla on edennyt HNSCC. Alhainen XIAP ilmentyminen korreloi läheisesti kemoterapiaa vaste ja suotuisa ennuste, kun taas korkea XIAP ilmentyminen voi ennustaa kemoterapian epäonnistumisen ja huono tulos. Tulokset ovat yhdenmukaisia ​​aiempien raporttien osoittavat, että alas-säätely XIAP herkistää syöpäsolut terapeuttisten huumeiden keuhkosyöpä, eturauhassyöpä, munasarjasyöpä ja haimasyöpä [14], [15], [16], [17], [ ,,,0],18], [19], [20]. Mikä tärkeintä, olemme huomanneet, että sisplatiini-kemoterapian suuresti indusoi ilmentymistä XIAP kehittyneissä HNSCC. Korkeampi XIAP taso jälkeisissä kemoterapiaa näytteet myös liittyy huonompi ennuste potilaista. Tuloksemme osoittavat, että XIAP lauseke on ensisijainen syy hoidon epäonnistumisen ja kemoterapian aiheuttama XIAP ilmentyminen johti huonoon ennusteeseen näiden lääkeresistenttiä potilailla. Esivalitut XIAP negatiivinen potilaat voivat hyötyä sisplatiini- neoadjuvant hoitoa. Meidän

in vitro

data ehdotti mahdollisesti arvoa estämään XIAP ilmaisun tehostamiseksi kemoterapiaa.

On huomattava, että toisin kuin useimmat tutkimukset, havaitsimme välistä positiivista alkoholinkulutuksen ja eloonjäämisaste kehittyneiden HNSCC tutkimuspotilaat. Mielenkiintoista, samanlainen tulos on julkaistu viime aikoina, mikä ehdotti erot meidän tietojen ja kulttuuriperinne saattaa johtua eri juomatavat: kehittyneen HNSCC potilaita Kiinasta usein joi nestettä käsitellään erittäin runsaasti alkoholia (yleensä 50%) , kun taas länsimaalaiset yleensä kuluttaa juomia paljon alhaisempi pitoisuus alkoholia. Tällainen suuria pitoisuuksia alkoholi voi stimuloida suun limakalvojen ja tuhoavat bakteerit tasapaino, vaikuttavat taudinkulku kehittyneiden HNSCCC [21]. Emme voi sulkea pois sitä mahdollisuutta rajallinen otoskoko ja /tai muita tekijöitä, jotka ovat voineet vaikuttaa tähän havaintoon.

Tutkimus oli retrospektiivinen tapauskontrollitutkimuksessa ja oli joitakin rajoituksia. Tässä tutkimuksessa, päätimme IHC arvioida XIAP ilmaisun sijasta kvantitatiivisia menetelmiä ensisijainen, koska ei ole saatavilla tuoretta koepala kudoksiin. Vaikka IHC on puolikvantitatiivinen menetelmä, se on nyt yleisimmin käytetty, yksinkertaisin ja kustannustehokkain protokolla kliinisessä työssä [22]. Myös nopeus korkea XIAP ilmaisun edeltävässä kemoterapiaa näytteissä oli vain 20,83%, kun taas kemoterapiaa vaste (CR + PR) potilaista oli 43,34%. Se on enemmän kuin todennäköistä, että monet tekijät voivat vaikuttaa yleiseen lääkevaste kehittyneiden HNSCC; XIAP ilmaisu voi olla vain yksi monista tekijöistä.

havainnot Nykyisessä tutkimuksessa on mahdollisesti tärkeitä kliinisiä. Ensimmäinen, meidän tutkimus osoitti, ensimmäistä kertaa, että XIAP: n ilmentyminen liittyy kemoterapiaan vasteen ja sitä voidaan käyttää biomarkkerina ennustaa kliinisiä tuloksia kehittyneitä HNSCC potilailla, erityisesti niille, jotka ovat saaneet sisplatiini kemoterapeuttisen hoidon. Toiseksi, XIAP ilme voi olla hyödyllinen biomerkkiaine valita potilaita, joilla on suurin mahdollisuus hyötyä sisplatiinin-pohjainen neoadjuvanttikemoterapian. Lopuksi välisen syy XIAP ekspressiotason ja kemoterapia vastaus osoittaa, että alas-säätely XIAP saattaa olla lupaava adjuvanttihoito pitkälle HNSCC potilaille.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics selvitys

Tämä hyväksyi tutkimuksen eettisen komitean yhdeksäs kansan sairaalan Shanghai Jiao Tong University School of Medicine ja suoritettava suositusten Helsingin julistuksen. Ei tietoisen suostumuksen (kirjallinen tai suullinen) saatiin käyttöön takautuvasti kudosnäytteitä potilaista tässä tutkimuksessa, joista monet olivat kuolleet, koska eettinen komitea, joka luopua tarvetta suostumusta, ei katsonut sen tarpeelliseksi. Kaikki näytteet olivat anonyymejä.

Cell Culture

Ihmisen HNSCC solulinjaa CAL27, joka oli resistentti sisplatiinihoidolle, saatiin American Tissue Cell Collection (Manassas, VA, USA) ja viljeltiin DMEM (Gibco, USA), johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia (FBS), 1% glutamiinia ja 1% penisilliini-streptomysiiniä. WSU-HN13 solulinjassa [23] on lahjakas University of Maryland Dental School (Baltimore, MD, USA) ja myös DMEM: ssä (Gibco, USA), johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia (FBS), 1% glutamiinia ja 1 % penisilliini-streptomysiiniä.

potilaille ja kasvain näytteet

Sixty joilla on pitkälle HNSCC (kliinisessä vaiheessa III /Iva; UICC /AJCC. 7 toim., 2010) rekrytoitiin tässä tutkimuksessa. Kaikki potilaat ovat hyväksyneet sisplatiini-pohjainen neoadjuvanttikemoterapian seuraa radikaali tuumoriresektion kahden kolmen viikon loppuun kemoterapiaa laitoksella Suu- ja leukakirurgia, yhdeksäs Kansan sairaalan Shanghai Jiao Tong-yliopiston tammikuusta 1999 joulukuuhun 2004

kliininen vaste kemoterapia arvioitiin vähintään 2 viikon kuluttua potilasta valmistunut kemoterapia mukaan vasteen arviointiperusteet kiinteitä kasvaimia (RECIST) [24]. CR määriteltiin täydellinen häviäminen kaikki mitattavissa leesioiden, ilman ulkonäkö uusia leesioita. PR-määriteltiin vähenemiseen kaksiulotteisesti mitattavissa vaurioita vähintään 50 prosenttia summasta tuotteiden niiden suurimpien kohtisuorien mittojen ja puuttuminen etenemisen vaurioista, ilman ulkonäkö uusia vaurioita. SD [9] määriteltiin vähenemiseen kasvaimen tilavuus on vähemmän kuin 50 prosenttia tai määrän lisääminen yhden tai useamman mitattavan leesioita on vähemmän kuin 25 prosenttia, ilman ulkonäkö uusia leesioita. PD on määritelty koon kasvua vähintään yhden kaksiulotteisesti mitattavissa leesion vähintään 25 prosenttia ja ulkonäkö uusia leesioita. Potilaiden ennusteeseen viittaavia tietoja on esitetty taulukossa 4. Kaikki potilaat saivat standardin parantava operaatioiden negatiivinen resektio marginaali. Kaikki potilaat saivat leikkauksen jälkeistä sädehoitoa kahden-kuuden viikon loppuun leikkausta. Yhteensä annos primaarikasvaimen alueen ja kaulan positiivisen solmujen oli 6000cGy ja primaarikasvaimen ja kaulan negatiivisten solmujen on 5000 cGy.

Western Blot analyysi

Yhteensä proteiini hajotettiin 2 x hajotuspuskuria, joka sisälsi 125 mM Tris-HCl (pH 6,8), 5% paino /tilavuus SDS: ää ja 24,75% glyserolia. 40 ug proteiineja erotettiin käyttämällä 12% SDS-PAGE: lla ja siirrettiin sitten PVDF-kalvoille. Yön yli inkuboinnin jälkeen monoklonaalisella hiiren anti-ihmis-XIAP (BD, USA) laimennoksena 1:4000 ja yhden tunnin inkubaatio IRDye 800CW vuohen anti-hiiri-vasta-ainetta (LI-COR, USA), signaali on skannattu ja analysoitu käyttämällä Odyssey Infrared Imaging System (LI-COR Biosciences, USA). β-aktiini (Sigma-Aldrich, USA) käytettiin sisäisenä kontrollina.

Reaaliaikainen PCR

Kokonais-RNA eristettiin käyttäen TRIzol-reagenssia (Invitrogen, USA). 1 ug kokonais-RNA: wasreverse cDNA: ksi käyttäen oligo-dT-aluketta ja PrimeScript II RTase (TaKaRa, Japani) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Reaaliaikainen PCR suoritettiin lämpösyklilaitteeseen Dice Real Time System (TaKaRa, Japani). Alukkeet PCR suunniteltiin Primer Express ohjelmisto v3.0 (Applied Biosystem, USA). Alukkeen sekvenssit XIAP olivat: 5′-CCGGCTGTCCTGGCGCGAAA-3 ’ja 5′-GCTCGTGCCAGTGTTGATGCTGA-3’. Alukkeen sekvenssit β-aktiini olivat: 5′-CCTGGCACCCAGCACAAT-3 ’ja 5′-GGGCCGGACTCGTCATACT-3′, ja aluke sekvenssejä GAPDH olivat: 5’-AATTGAGCCCGCAGCCTCCC -3 ’ja 5′-ACCAGGCGCCCAATACGACC-3’. Kaikki alukkeet erotetaan ainakin yksi introni vastaavaan genomista DNA: ta. Dissosiaatiokäyrä analyysi oli kaikissa reaktioissa sulkea epäspesifisten vahvistusta. Suhteellinen määrä XIAP mRNA taso laskettiin standardin ΔΔCT menetelmiä [25]. Sekä β-aktiini ja GAPDH käytettiin sisäisenä kontrollina.

siRNA Knockdown

kolme anti-XIAP siRNA kunkin kohdistaminen kaksi silmukoitumisvarianttia XIAP ja yhden FAM-leimatun negatiivinen kontrolli siRNA (ei- kohdesekvenssi), syntetisoitiin GenePharma (Shanghai, Kiina). Sekvenssit olivat: siRNA1: GGUCAGUACAAAGUUGAAATT, siRNA2: GCAGGUUGUAGAUAUAUCATT, siRNA3: CCGGAAUCUUAAUAUUCGATT ja negatiivinen kontrolli: AAUUCUCCGAACGUGUCACGU. Transfektio suoritettiin käyttäen Lipofectamine 2000 (Invitrogen, USA) ja noudattamalla valmistajan protokollaa.

immunohistokemia

Pre- ja post-kemoterapiaa edustaja kudosta parafiiniblokit leikattiin 5 um: n leikkeitä vakio immunohistokemiallisella värjäyksellä (IHC ). Sen jälkeen kun lämmön aiheuttama antigeenin hakuja sitruunahappo-puskurissa (pH 7,0) 20 minuutin ajan ja estää 5% vuohen seerumissa 30 minuuttia, levyt inkuboitiin hiiren monoklonaalinen anti-ihmis-XIAP (BD, USA) laimennoksena 1: 100 4 ° C: ssa yön yli. Poisjättäminen ensisijaisen vasta-aineen toimi negatiivisena kontrollina. Sitoutunut vasta-aine detektoitiin Super Sensitive IHC Detection System (BioGenex, USA), mukaisesti valmistajan protokollaa. Leikkeitä visualisoitiin diaminobentsidiinitetrahydrokloridilla (Sigma, USA) liuos ja vastavärjättiin Harris hematoksyliinillä. Värjäytyminen tulos määritettiin laskemalla 1000 kasvainsolujen kolmella 100 x suurennus kentät kaksi riippumatonta patologia ja lisäksi luokitella heikkoa ilmentymistä (prosenttiosuus positiivisia 25%) ja korkea ilmaisun (prosenttiosuus positiivisten tulosten määrä ≥25%) .

Drug Sensitivity Pitoisuus

solut maljattiin 96-kuoppaisille levyille tiheydellä 4 x 10

3 solua /kuoppa, ja inkuboitiin vielä 24 tuntia. 6 h transfektion jälkeen negatiiviseen kontrolliin tai siRNA, väliaine poistettiin ja korvattiin tuoreella kasvualustalla, containingone sarjalaimennoksia DDP vielä 72 tuntia, mukaan lukien negatiivinen kontrolli ilman DDP. Sitten 20 ul: aan steriiliä MTT väriainetta (3- [4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli] -2,5-di-fenyylitetratsoliumklo- bromidi, 5 mg, liuotettiin 1 ml: aan fosfaattipuskuroitua suolaliuosta, Sigma, USA) lisättiin viljelyalusta lopulliseen pitoisuuteen 0,5 mg /ml ja inkuboitiin 37 ° C: ssa 4 h. Tämän jälkeen formatsaanikiteet liuotettiin 150 ul: aan dimetyylisulfoksidia 10 minuutin ajan. Spektrometriaa absorbanssi 490 nm: ssä mitattiin mikrolevylukijalla. Kukin koe suoritettiin kolmena kappaleena.

Tilastollinen analyysi

SPSS 17.0 ohjelmistopaketti käytettiin tilastolliseen analyysiin. Taajuudet verrattiin Fisherin testiä, × 2 ennakoimattomia testi, tai ei-parametriset testit tarvittaessa. Arvioimme selviytyminen ja time-to-etenemisen käyrät käyttäen Kaplan-Meier menetelmällä ja verrattiin niitä käyttäen kaksipuolista log-rank-testi. Useita logistista regressiota että käytettiin Coxin suhteellisten riskien mallia käytettiin määrittämään, onko molekyyli ominaisuudet kasvainten itsenäisesti ennustettu selviytymisen meidän kohortin kehittyneiden HNSCC potilaista. P 0,05 katsottiin tilastollisesti merkittäviksi.