Krooninen sairaus

tiivistelmä

Kasvain-aloittavat solut ovat alaryhmän aggressiivinen syöpien, jotka ilmentävät piirteitä jaettu kantasolujen, mukaan lukien kyky itse uudistaa ja erottaa, kutsutaan yleisesti stemness. Lisäksi tällaiset solut ovat resistenttejä kemo- ja sädehoidon aiheuttavat terapeuttinen haaste. Paljastamaan stemness liittyviä toimintoja gliooma-aloittamisen soluja (GICS), transcriptome profiilit verrattiin hermostoputken kantasoluja (NSCs) ja geeni ontologian analyysi tunnistettu rikastuminen Ca

2 + signalointi geenien NSCs ja enemmän varsi kaltaiset (NSC-proksimaalisen) GICS. Toiminnallinen analyysi joukko eri GIC linjojen suhteen herkkyys häiriintynyt homeostaasin käyttäen A23187 ja Thapsigargin, paljasti, että NSC-proksimaalinen GICS olivat herkempiä, joka vahvistaa transcriptome tiedot. Lisäksi Ca

2+ huumeiden herkkyys pienennettiin GICS erilaistumisen jälkeen, jossa voimakkain vaikutus NSC-proksimaalisen GIC, joka tukee stemness liittyvän Ca

2+ herkkyys. NSCs ja NSC-proksimaalisen GIC line ilmaisi suuremman määrän ionikanavien läpäisevä kalium, natrium ja Ca

2+. Toisaalta suurempi määrä ja korkeampia ekspressiotasoja Ca

2 + sitova geenejä, jotka voivat puskuroida Ca

2+, ilmennettiin NSC-distaalinen GICS. Erityisesti ilmaus AMPA glutamaatin reseptorin alayksikköä GRIA1, todettiin yhdistää Ca

2+ herkkä NSC-proksimaalisen GICS, ja laski GICS eriytettävä yhdessä pienentää Ca

2 + huumeiden herkkyys. Korrelaatio korkea ilmentymä Ca

2+ kanavia (kuten GRIA1) ja herkkyys Ca

2+ huumeita vahvistettiin vielä yhdeksän romaani GIC linjat. Kalsium huumeiden herkkyys korreloi myös ilmaisua NSC markkereita nestiinifenotyypin (NES) ja FABP7 (BLBP, aivot lipidejä sitova proteiini) tässä laajennettu analyysi. Yhteenvetona, NSC liittyvä NES

+ /FABP7

+ /GRIA1

+ GICS olivat valikoivasti herkkä häiriöille Ca

2 + homeostaasiin, joka tarjoaa potentiaalinen kohde mekanismi hävittämiseen epäkypsä väestöstä pahanlaatuisten solujen.

Citation: Wee S, Niklasson M, Marinescu VD, Segerman A, Schmidt L, Hermansson A, et al. (2014) Selective Kalsium Herkkyys Immature Gliooma Cancer Kantasolut. PLoS ONE 9 (12): e115698. doi: 10,1371 /journal.pone.0115698

Editor: Alfredo Quinones-Hinojosa, Johns Hopkins University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 24 heinäkuu 2014; Hyväksytty: 26 marraskuu 2014; Julkaistu: 22 joulukuu 2014

Copyright: © 2014 Wee et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Tällä kirjoittajat vahvistavat, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi- ja tukeminen tiedot tiedostoja.

Rahoittajat: Swedish Childhood Cancer Foundation PR2013-0084 (www.barncancerfonden.se), ruotsalainen Cancer Foundation CAN 2011/783 (www.cancerfonden.se), Swedish Research Council 2011-4567 (vr.se), Karolinska Institutet (www.ki.se), Linnaeus keskus Developmental Biology regeneratiivisen hoidon (www.dbrm.se). SW osittain rahoittama Karoliinisen instituutin PhD stipendiohjelmaa. MN rahoittivat post-doc apuraha Ruotsin Syöpäsäätiön. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

glioblastoma multiforme (GBM) on erittäin pahanlaatuisten aivosyövän huono ennuste vaikuttaa yksilöiden. Vaikka yhdistelmä leikkauksen, kemoterapian ja sädehoidon, yli 90%: lla potilaista osoittaa toistumisen [1], ja mediaanielossaolosta edelleen niinkin alhainen kuin 14-16 kuukausi [2]. Vaikka pahanlaatuinen gliooma kasvaimet ovat erittäin heterogeeninen, alapopulaatio kypsymättömiä soluja, kutsutaan gliooma aloittamista soluja (GICS) [2] – [6] rinnalla eriytetympää solupopulaatioiden. GICS on osoitettu olevan vastustuskykyisiä sädehoidon ja kemoterapia, ja niiden uskotaan olevan vastuussa kasvaimen uusiutumisen [7]. Heijastava epäkypsyydestä GICS ja niiden kyky erilaistua [8], nämä solut on osoitettu jakaa kantasolujen (stemness) -associated geeniekspression kantasolukkoa, kuten teratooma muodostavien normaali alkion kantasolujen [9] – [ ,,,0],11], ja ehdotetaan, että GICS jatkuvasti täydentämään varastojaan suurimman kasvainsolujen kautta itseuudistumiseen ja erilaistuminen [11], [12]. Suuri osa lääkekehityksen tutkimusta GBM hoito on keskitytty kohdistamaan irtotavarana soluissa, joista suurin osa ei ole kasvainta aloittamista kapasiteettia. Suuri haaste, joka jää kasvaa tehoa syövän hoidossa kohdistaminen GICS koska nämä solut resistenttejä kemo- ja sädehoidon nykyisellä strategioita.

Vaikka useat signalointipolkujen kuten Notch, Hedgehog-Gli, RTK-Akt, BMP /TGF-β, WNT-β-kateniinin ja STAT3 on osoitettu tukemaan itseuudistumista kantasolujen ja kypsymättömiä syöpäsoluja [13], mahdollisia terapeuttisia kohteita, jotka voidaan selektiivisesti poistaa GICS ovat muutamia [14]. Vaihtoehtoinen strategia tehdä GICS vähemmän aggressiivisia osoitettiin BMP indusoi erilaistumisen hoito [8]. Myös dopamiini D2-reseptoriantagonistit on tunnistettu erottautumistaan ​​suhteellisen erilaistumisen vastustuskykyisten leukemiasolujen ja rintasyöpäsolujen aloittamista soluihin [15].

Ionikanavat on pitkään osoitettu roolia koskevat perus- soluprosesseja lisäksi sähkö- ärtyvyyttä ja esimerkiksi kalium ja Ca

2 + kanava signaloinnin ohjaus erilaisia ​​toimintoja kuin proliferaatio ja migraatio kantasoluja ja syövän solulinjoissa [16], [17]. Ca

2+ on myös liitetty syövän solujen eloonjäänti [18]. Äskettäin se oli myös osoittanut, että häiriöitä Ca

2 + kanava alayksikköä pystyy ajamaan maksakasvain-aloittamista solujen apoptoosin [19].

Tässä tutkimuksessa asetimme tutkimaan mekanismeja ainutlaatuinen stemness liittyvä toimintoja glioomasoluihin ja päättelevät, että kantasolujen kaltaisia ​​soluja ovat herkempiä Ca

2+ häiriöitä verrattuna kypsempiä solutyyppejä.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely

GliNS1, G179NS ja G166NS GIC linjat kasvatettiin viljelmässä, kuten aiemmin on kuvattu [6], [11]. Lyhyesti, soluja kasvatettiin ensin palloina ensimmäisellä viikolla ennen siirtämistä laminiinilla päällystetyillä ruokia, joissa ne oli kasvatettu, kuten tarttuva yksittäiskerroksina seerumittomassa ihmisen Neurocult NS-A pohjapinta media (StemCell Technologies), jota oli täydennetty Glutamax, Hepes, N2 , B27 (Invitrogen), EGF (10 ng /ml) ja bFGF (10 ng /ml) (R SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substraatti (Pierce, Rockford, USA)). Bändi voimakkuudet kvantitoitiin käyttäen ImageJ (NIH, USA).

Tulokset

transcriptome profilointi tunnistaa stemness liittyviä Ca

2+ geeniekspression GICS

Määritä suhde ihmisen GIC linjojen ja ihmisen sikiön hermostoputken kantasoluja (NSC), me uudelleen analysoi microarray data aiemman tutkimuksen Pollard

et al

[11]. Vaikka ensimmäinen pääkomponentti erillään normaali aivoja NSCs ja GICS (katso [11]), toinen pääkomponentti sijoittui GICS suhteessa niiden samankaltaisuus NSCs, mahdollisesti heijastaa näkökohtia stemness (Fig. 1A). Stemness liittyvä geeni Sox2, NSC merkki BLBP (brain lipidejä sitovan proteiinin, jota koodaa FABP7 geeni) sekä hermosolujen merkki TUBB3 (Tubulin beta III), mikä saattaa heijastaa suuri teho samanaikaiseen hermosolujen erilaistumiseen, olivat ilmaisseet korkein NSCs, ja ekspressiotasot laskivat järjestyksessä GliNS1 ryhmä G179NS G166NS (Fig. 1 B). Vaikka GliNS1 linja transkriptionaalisesti liittyvät NSCs (NSC-proksimaalinen), The G166NS linja, muodostivat distaalisen pään sijoitusta suhteessa NSCs (NSC-distaalinen), jotka ilmentävät merkkiaineita jaettu mikroglian ja reaktiiviset astrosyytit ja tulehdukseen, esimerkiksi IL-6, CXCL2 (MIP-2), ja CCL20 (Fig. 1 B).

(A) GIC linjat arvostivat määräsi suhteessa NSC riviä (toinen komponentti on pääkomponenttianalyysi microarray perusteella mRNA: n ekspression tietoja Pollard et al [11], jossa ensimmäinen komponentti erottelee NSCs ja GICS normaalista aivokudoksesta). GliNS1 on johdettu G144ED rivi Pollard et al tutkimus. (B) Uudelleen analyysi transcriptome profiilien Pollard et al vertaamalla GICS on NSCs osoittaa NSC-proksimaalisen klusterin varren kaltainen GICS korkea samankaltaisuus NSCs, jakaa esim. Sox2 ja BLBP ilme. NSC-distaalinen GIC linjat toisin ilmaistuna microglia markkereita, kuten CXCL2, CXCL5 ja CCL20. (C) De novo RNA-sekvenssianalyysi, ja pareittain vertailuja NSCs ja kolme erillistä GIC riviä (GliNS1, G179NS ja G166NS) osoitti, että NSCs ilmaistuna suurempi määrä geenejä, joilla 10-kertainen geenin ilmentymistä verrattuna kaikkiin GIC linjat. (D) pareittain vertailuissa NSCs että GIC linjat GliNS1, G179NS ja G166NS, yksilöllisesti. Gene rikastamiseen ja geenin ontologian analyysi sekvensoinnin perustuu transcriptome profiileja, jonka tunnuksena rikastuminen Ca

2 + signalointi geenejä NSCs, joka kasvoi paremmuusjärjestyksessä distaalisesti NSC pairwise vertailuissa. (E) pareittain vertailuja NSC-proksimaalisen (GliNS1) ja NSC-distaalinen (G166NS) GICS. Gene rikastamiseen ja geeni ontologian analyysi ehdotti kytkintä Ca

2+ läpäisevä kanavia Ca

2+ sitova geenien NSC-distaalinen GIC linja (ylempi ruutuun). Vuonna tulivuori juoni, geeni nimet vihreä merkitsevät ionikanavan /pumppu /transporter liittyviä geenejä, kun taas geeni nimet violetti merkitsevät Ca

2+ sitovia proteiineja geenejä. Tulivuori juoni vertailua NSC-proksimaalisen ja NSC-distaalinen GICS paljasti suurempi määrä ionikanavia ilmaistu NSC-proksimaalisen GIC (GliNS1).

de novo syvä RNA sekvensointi kolme että GIC linjat käytetty Pollard

et al

tutkimus (GliNS1, G179NS ja G166NS) ja NSC linja (hf5205NS) osoitti, että enemmän geenejä ilmaistiin NSCs kuin GIC riviä (Fig. 1 C, S1), mahdollisesti heijastaa niiden plastisuus ja kyky erilaistua. Parittainen NSC-GIC geenin rikastaminen ja toiminnallinen merkintä (geeni ontologian) analyysi yllättäen osoitti, että Ca

2 + ioni sitoutuminen oli kaikkein merkittävästi muuttunut luokka kaikissa kolmessa solulinjoissa – ero, joka kasvoi enemmän NSC-distaalinen GIC linjat (kuvio . 1D).

Differential ilmaus Ca

2+ provokers ja puskurit liittyy stemness

Sytosoliset Ca

2 + signalointi tasapainottavat eri toimijoiden, kuten Ca

2+ läpäisevä ionikanavia, jotka lisäävät solunsisäistä Ca

2+ (esim jänniteherkkiin Ca

2 + kanavat ja glutamaattireseptorien, tässä kutsutaan Ca

2+ provokers) toisaalta, ja Ca

2 + sideaineita, jotka vähentävät vapaa solunsisäinen Ca

2+ toisella (tässä kutsutaan Ca

2 + puskurit) [26]. Suora pareittain vertaillessaan eri GIC linjat osoittivat, että NSC-proksimaalisen GIC line (GliNS1) ilmaisivat suurempaa määrää ionikanavan geenejä, jotka sisältävät Ca

2+ provokers verrattuna NSC-distaalinen GIC line (G166NS). Nämä vaihtelivat Ca

2 + läpäisevä ionikanavia (esim Glutamaattireseptoreiden: GRIA1, GRIA2, GRIK3 ja säätelyalayksiköt GRIN2B ja GRIN2D), jänniteherkkiin Ca

2 + ionikanavia (CACNA1C /-E /H) ja Ca

2 + aktivoitujen kaliumkanavien (esim KCNN3) (Fig. 1 E). Sen sijaan NSC-distaalinen GIC line (G166NS) ilmaistuna korkeampi anturien solunsisäisen Ca

2+ puskureita (esimerkiksi S100 perheen geenien ja CALB1).

määritellä tarkemmin erojen Ca

2+ geenien ilmentymisen välillä testattujen GIC linjojen ja NSCs, ilmaus Ca

2+ provokers ja puskureita analysoitiin tarkemmin kaikissa kolmessa GIC riviä (S1 Kuva.). Kuten ehdotti edellisessä pareittain vertailuissa, ilmaus glutamaattireseptoreita väheni NSC-distaalisessa GIC linjat (Fig. 2A). AMPA GRIA1 (Ca

2+ läpäisevä ionotrooppisiin glutamaattireseptori-), joka osoitti korkein ilmentymä keskuudessa glutamaattireseptorien, sijoittui GIC linjat identtisen järjestyksessä GliNS1 G179NS G166NS nähdään PCA analyysissä (Fig. 1A), joka perustuu vertailu NSC geeniekspressiota. Sitä vastoin ilmaus Ca

2 + puskurit /effektorit kasvoi käänteinen arvojärjestys GliNS1 G179NS G166NS (Fig. 2B). Tämä oli erityisen silmiinpistävää, että S100A6 geeni, joka on runsaimmin ilmaistu G166NS. Samanlainen mRNA tietoja, western blot-analyysi GRIA1 paljasti 70% ja yli 95% pienempi ilmentyminen G179NS ja G166NS vastaavasti verrattuna NSC-proksimaalisen GliNS1 line (Fig. 2B ja 2E). Western blot-analyysi S100A6 osoitti 45% ja 90% pienempi ilmentyminen G179NS ja GliNS1, vastaavasti, verrattuna NSC-distaalinen G166NS line (Fig. 2C, 2D ja 2E).

ekspression analysointi Ca

2+ provokers kuten yksi läpäisevä glutamaatin reseptorialayksiköitä GRIA1 (A) tai Ca

2+ puskuria S100A6 (B), sijoittui 3 GIC linjat (GliNS1 ja G166NS, n = 5 kussakin. G179NS , n = 2.) mukaan Ca

2+ huumeiden herkkyys, glutamaatin kanavia, kuten GRIA1 ennustaminen suurempi herkkyys ja puskuri ilmaisun ennustamiseen pienempi herkkyys (*** p 0,001; Parittomia kaksisuuntainen t-testi) . (C) Western blot-analyysi osoitti GRIA1 ja S100A6 proteiinin ilmentymisen, jossa β-aktiini kuin latauskontrollina. (D) Proteiinin ekspressiotasoja GRIA1 ilmaistiin prosentteina kertainen muutos, kun verrataan sen GliNS1 (n = 3) ja (E) S100A6 proteiinin ilmentymisen tasot ilmaistaan ​​prosenttiosuutena kertainen muutos, kun verrataan G166NS (n = 3) (** * p 0,001; ** p 0,01, * p 0,05 Yksisuuntainen ANOVA).

GIC Ca

2+ huumeiden herkkyys korreloi transcriptome läheisyys NSCs

lisäksi Ca

2+ provokers ja puskureita, solukalvon lokalisoitu Ca

2+ kuljettajat, kuten natrium-kalsium vaihtimet (NCX) kuuluva SLC8 perheen ja SERCA (Sarco /Endoplasmakalvosto Ca

2+ ATPaasi) pumppu lokalisoitu Endoplasmakalvosto (ER) kalvo, aktiivisesti poistaa soluliman Ca

2+ ylläpitää homeostaasiin [27] – [30]. Tutkia mahdollisia toiminnallisia vaikutuksia differentiaalisen ilmentymisen Ca

2 + ionikanavia ja Ca

2 + sitova geenejä, me seuraavaksi suoritetaan huume-välitteisen haaste Ca

2 + homeostaasiin ja signalointi, että GIC linjat. Solut altistettiin joko kohde itsenäinen kationin (Ca

2 +) A23187 tai SERCA pumpun estäjä Thapsigargin (Fig. 3), jotka lisäävät soluliman Ca

2+ tasoilla kaksi eri mekanismia: A23187 sallimalla Ca

2+ ylittämään yleensä läpäisemätön solukalvon ja Thapsigargin estämällä maahantuonti Ca

2 + ER. GIC linjat osoittivat eroja herkkyydessä sekä A23187 ja Thapsigargin (Fig. 3A ja 3B, vastaavasti), huomattavan kanssa arvojärjestyksen rivien välistä identtinen NSC juurtuneesta transcriptome paremmuusjärjestyksen, jossa NSC-proksimaalisen GliNS1 on enemmän herkkä kuin G179NS, kun taas NSC-distaalinen G166NS oli vähiten herkkä sekä huumeita. Toiminnalliset analyysit osoittavat siten, että NSC-proksimaalinen GICS, jolla on suurempi ilmaus Ca

2+ provokers, ovat herkempiä häiriöille soluliman Ca

2+ sääntelyä kuin GICS kanssa NSC-distaalinen fenotyyppi, jotka ilmentävät korkeampia tasoja Ca

2 + puskureita.

(A) annosvaste-analyysi (0,01-40 uM) Ca

2+ A23187 ja (B) SERCA Ca

2 + pumppu estäjä Thapsigargin osoitti, että Ca

2+ huumeiden herkkyys listalla tilattu transcriptome samankaltaisuutta NSCs, jossa suurin herkkyys on NSC-proksimaalisen GICS. NSC proksimaalinen GIC oli herkempi (C) 40 uM A23187 ja (D) 0,156 uM Thapsigargin hoitoja verrattuna NSC distaaliseen linjat (* p 0,05; Parittomia kaksisuuntainen t-testi). NSC-proksimaalisen GICS n = 3 ja NSC-distaalinen GICS n = 4.

Alennettu Ca

2+ huumeiden herkkyys upon GIC erilaistuminen

Koska herkkyys Ca

2+ lääkkeet liittyi NSC-ilmaisun profiloida onko eriyttäminen GICS vaikuttaisi Ca

2+ herkkyys tutkittiin. Tätä varten kolmen GIC riviä alistettiin erilaistumisen protokollan naudan sikiön seerumia (FBS). Validointi eriyttäminen tehtiin transcriptome analyysi GIC linjojen ja niiden eriytetty jälkeläisten RNA-sekvensointia (S1 taulukko). Pääkomponenttianalyysin maailmanlaajuista datajoukon osoittivat, että muutokset transcriptome olivat erillisiä ja erillään merkittävästi välillä erilaistumattoman GICS ja eriytetty GICS (diffGICs) (Fig. 4A). Mielenkiintoista, GRIA1 lauseke korreloi Ca

2+ huumeiden herkkyys, vähenivät kaikissa GIC linjat erilaistumisen aikana (Fig. 4B), joka ehdotti, että eriyttäminen tila saattaa vaikuttaa Ca

2+ herkkyys. Toiminnallinen Ca

2+ herkkyys oli siis määritettiin käyttämällä A23187 (10 uM, 48 tuntia) eriytetty GICS ja verrattiin eriytymättömiä GICS paljastaa selvästi pienempi vaikutus solujen elinkykyyn kaikissa GIC linjat kun erilaistumista ja vahvin vaikutus lääkkeen herkkä NSC-proksimaalisen GIC line (GliNS1) (Fig. 4C). Nämä havainnot tukevat edelleen tietojen Ca

2 + herkkyys liittyy epäkypsä NSC kaltainen GICS.

(A) RNA sekvensoinnilla transcriptome kartoitusta seurasi Pääkomponenttianalyysin todennettujen erottelua erilaistumattoman ja eriytetty GICS (GliNS1 , G179NS ja G166NS). Oikea paneeli näyttää immunofluoresenssivärjäyksiä on Differentiaatiomarkkerien GFAP (punainen) ja Tuj1 (vihreä) päällä FBS hoitoa. (B) vertailu GRIA1 ekspressiotasot eriytymättömissä ja eriytetty GICS (n = 6) paljasti vähentää kertainen muutos GRIA1 ilmentymisen, kun seerumin aiheuttaman erilaistumisen kaikissa GIC linjat. (*** P 0,001; Parittomat kaksisuuntainen t-testi). (C) Solujen elävyys analyysi suhteessa herkkyyttä Ca

2 + A23187 erilaistumisen jälkeen kohonneen elinkyky erilaistumista NSC-proksimaalisen GIC line GliNS1 (* p 0,05; Parittomia kaksisuuntainen t-testi).

geenien ilmentyminen korreloi Ca

2+ huumeiden herkkyys

Tutkitaan mahdollisia muita geenejä korreloi Ca

2+ herkkyys, transcriptome tietoja yhdeksästä novel GIC linjat (johdettu riippumattomassa laboratoriossa) verrattiin Ca

2 + herkkyys tiedot altistumisesta Thapsigargin (72 h altistus) (Fig. 5A ja S2 taulukko). 7 ulos 9 riviä on osoitettu kerrata vanhemman kasvain (S3 taulukko). Analyysi korrelaatio (Pearson) välillä NSC-markkereita ja herkkyys Thapsigargin (1 uM) paljasti merkittävän korrelaatio nestiinin (NES) (Fig. 5B, harha merkitty punaisella jätettiin analyysistä) ja aivojen lipidien bindig proteiini (BLBP /FABP7) (Fig. 5C) mRNA: n ekspression, kun taas mitään korrelaatiota ei löydetty Sox2 (tuloksia ei ole esitetty). Western blot-analyysi Lisäksi todennettiin, että kalsium lääkeherkillä linjat (U3017-MG ja U3084-MG) ilmaisi enemmän BLBP proteiinia kuin vähemmän herkkä linjat (U3013-MG ja U3035-MG) (Fig. 5D). Korrelaatioanalyysin vahvisti myös korrelaatio herkkyys Thapsigargin ja GRIA1 ilmentymistä (Fig. 5E), joka tukee analyysi proteiinin tasot Western blot, kuten GRIA1 proteiinin ilmentyminen havaittiin vain herkillä GICS (Fig. 5F). Lisäksi geenin rikastaminen ja geeni ontologian analyysit hiljaista geenien solukierron säätelyssä, happi, RNA ja makromolekyylistä aineenvaihduntaa, eikä yllättäen Ca

2 + -välitteisen signalointi kuten korreloi Ca

2+ huumeiden herkkyys (Fig. 6A) .

(A) Yhdeksän novel GIC linjat tehtiin Thapsigargin annos-vaste-analyysi (0,1-100 uM), näyttää erilaisia ​​vastauksena kohtalainen lääkeannoksia. (B, C) Plot korrelaatio solujen elinkelpoisuuden jälkeen Ca

2+ lääkeainealtistukseen (Thapsigargin, 1 uM) ja (B) NES ja (C) FABP7 /BLBP mRNA ilmaisun. U3047-MG pidettiin Peränpitäjänä että NES kuvaajan (merkitty punaisella) ja syrjäytyneiden analyysi. (D) Western blot-analyysi osoittaa BLBP (FABP7) proteiinin ilmentymistä valituissa Thapsigargin herkillä (U3017-MG ja U3084-MG) ja vähemmän herkkiä (U3013-MG ja U3035-MG) solulinjat, jossa β-aktiini kuin latauskontrollina. (E) Plot korrelaatio solujen elinkelpoisuuden jälkeen Ca

2+ lääkeainealtistukseen (Thapsigargin, 1 uM) ja GRIA1 mRNA: n ilmentymisen. (F) Western blot-analyysi osoittaa GRIA1 proteiinin ilmentymistä valituissa Thapsigargin herkillä (U3017-MG ja U3084-MG) ja vähemmän herkkiä (U3013-MG ja U3035-MG) solulinjat. β-aktiini käytettiin latauskontrollina.

(A) korrelaatio analyysi genomin laaja mRNA: n ilmentymisen (mikrosiruanalyysi) ja herkkyys Thapsigargin (1 uM) 9 ylimääräisiä GIC linjat, haetaan 785 geenit joka korreloi Ca

2 + huumeiden herkkyys. Gene rikastamiseen ja ontologian -analyyseissä osallistuminen vaikuttavien geenien leviämisen, happi ja RNA aineenvaihduntaa, kataboliaa ja Ca

2 + välitteisiä signalointi. (B) 385 geenit positiivisesti korreloivat hyvin herkäksi suodatettiin ensin geenien ilmaisi myös suurempi NSC-proksimaalisen GIC line GliNS1 ja sen jälkeen Myös vaimentua tämän linjan päälle erilaistumista, joka havaittiin vähentävän Ca

2+ huumeiden herkkyys , noutaminen joukko yhdeksän geenejä, mukaan lukien AMPA koodaus GRIA1.

geenien tunnistamiseen tässä tietoaineistoa, joka myös liittyy NSC-proksimaalisen stemness allekirjoituksen GICS, asetettu edelleen suodatetaan geenejä, joka myös (1) oli suurempi ilmaisun GliNS1 verrattuna G166NS ja (2) on vaimentua heti erilaistumista (Fig. 6B). Tämä hakea lyhyen luettelon yhdeksän geenejä, joista kaksi koodin ionikanavia, jotka voivat lisätä soluliman Ca

2+ (Ca

2+ provokers) eli GRIA1 ja sisäänpäin tasasuuntaajan K

+ kanava KCNJ4 , joka voi osallistua säilyttää depolaroiduissa kalvojännite tarvitse aktivoida jänniteherkkiin Ca

2+ kanavat ja Ca

2+ läpäisevä glutamaattireseptoreihin. Yhteenvetona korrelaatio toiminnallisten Ca

2+ huumeiden herkkyys ja geenien ilmentymisen ehdottaa osallistumista kohti herkkyys huumeita herättivät Ca

2+ ylikuormitus, verkosto geenien mukana ylläpitää Ca

2+ homeostaasin ja kalvojännite.

Drug reactome analyysi jakautuu Ca

2 + indusoituun geeniekspressiota globaalissa transcriptome

tunnistamiseksi solunsisäisiä vasteita Ca

2+ taustalla ero taso Ca

2+ herkkyys GICS, NSC-proksimaalisen GliNS1 ja NSC-distaalinen G166NS altistettiin A23187 7 tuntia, jonka jälkeen transcriptome analyysi RNA sekvensoinnilla ( ”lääke reactome mapping”) (S4 taulukko). Kaikkein Ca

2+ lääkeherkillä GIC linja GliNS1, geenien merkittävästi muuttunut ilme (Benjamini oikaistu p-arvo 0,05) analysoitiin geenin rikastaminen ja geeni ontologian, joka osoitti, että solusyklin liittyviä geenejä muutettiin (kuvio . 7B ja S2 kuvassa.), mikä viittaa solusyklin pysähtymisen ennen solukuolemaan. Ei yllättäen, osallistuvat geenit ER stressin vastaus myös rikastettua, samoin kuin geenin RNA-aineenvaihduntaan. Mielenkiintoista on, että RNA-aineenvaihduntaa mukana geenien myös korreloivat Thapsigargin herkkyys edellisessä kokeessa (Fig. 6A).

Transkription vastauksena lisääntyneeseen sytosolin Ca

2+ (A23187), tutkittiin RNA-sekvensoinnilla jälkeen 7 tuntia lääkkeen altistumisen NSC-proksimaalisen GIC linjan GliiNS1 ja NSC-distaalinen line G166NS. Volcano kuvaajia merkitsevästi (p 0,05) muuttunut geeniekspressio GliNS1 (A) ja G166NS (C) jaetulla aiheuttama geenien merkitty punaisella ja vihreällä (Ca

2 + aktivoida transkriptiotekijä NFATC2). Huomaa erot x-akselilla on korkeampi kaikki globaalit geeni-ilmentymisen indusointi in GliNS1. (B) Gene rikastamiseen ja geenin ontologian analyysi geenien kanssa merkittävän muutoksen ilmaisu (p 0,05) GliNS1, jonka tunnuksena osallistuvat geenit solusyklin etenemisen sekä ER /Golgin liittyvät toiminnot ja solujen stressin vastaus. (D) Gene rikastaminen analyysi geenien vaimentua vähintään 3-kertaisesti GliNS1 ja voimistunut vähintään 1,5-kertaisesti G166NS.

Geenit, joilla on muuttunut ilme jälkeen lääkealtistuksen piirrettiin keskiarvo lauseke arvo (ennen