Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Lukuisat vitamiini-D-analogien näytteillä huono hoitovaste, suuri systeeminen toksisuuksia ja hyperkalsemiaa ihmiskokeissa syövän hoitoon. Havaitsimme ensimmäinen ei-hyperkalseemisia syöpälääkkeen D-vitamiinin analogi MT19c muuttamalla A-rengas ergokalsiferoli. Tutkimuksessa kuvataan terapeuttinen teho ja vaikutusmekanismi MT19c sekä

in vitro

ja

in vivo

malleissa.

Menetelmät /Principal löytäminen

Antitumor tehoa MT19c arvioitiin munasarjan syöpäsolujen (SKOV-3) nude-hiirissä ja syngeenisiin rotan munasarjasyöpä malli. Seerumin kalsiumpitoisuus on MT19c tai kalsitriolin hoidetuista eläimistä mitattiin. In silico molekyyli telakointi simulointi ja soluperusteisesta VDR reportterianalyysi paljasti MT19c-VDR vuorovaikutus. Genomewide mRNA analyysi MT19c käsiteltyjen kasvainten tunnistettu lääkekohteita joka todennettiin immunoblottauksella ja mikroskoopilla. Kvantitointi solu- malonyyli CoA suoritettiin HPLC-MS. Sitova tutkimus PPAR-Y-reseptorin suoritettiin. MT19c pienentää munasarjasyövän kasvua vierassiirrekokeissa ja syngeenistä eläinmalleissa aiheuttamatta hyperkalsemiaa tai akuutti myrkyllisyys. MT19c on heikko vitamiini-D-reseptorin (VDR) antagonisti, joka häiritsi vuorovaikutus VDR ja koaktivaattorikompleksien SRC2-3. Genominlaajuisia mRNA analyysi ja western blot ja mikroskopia MT19c käsitelty ksenograftikasvaimissa estivät rasvahappojen nopaliinisyntaasin (FASN) aktiivisuus. MT19c vähensi solujen tasot malonyyli CoA SKOV-3-soluissa ja estivät EGFR /phosphoinositol-3kinase (PI-3K) aktiivisuus riippumatta PPAR-gamma-proteiinia.

merkitys

antituumorivaikutukset ei- hyperkalseemisia agentti MT19c tarjota uuden lähestymistavan suunnitteluun vitamiini-D-pohjainen syöpää torjuvaa molekyylit ja perustelut kehittää MT19c terapeuttisena aineena pahanlaatuiseen munasarjakasvaimia kohdistamalla onkogeeninen

de novo

rasvansynnyn.

Citation: Moore RG, Lange TS, Robinson K, Kim KK, Uzun A, Horan TC, et al. (2012) tehokkuus Non-hyperkalseemisia Vitamin-D2 Derived solunsalpaajaksi (MT19c) ja estäminen rasvahapposynteesissä käytettäessä munasarjasyöpä ksenograftimallissa. PLoS ONE 7 (4): e34443. doi: 10,1371 /journal.pone.0034443

Editor: Olivier Gires, Ludwig-Maximilians Yliopisto, Saksa

vastaanotettu: 06 heinäkuu 2011; Hyväksytty: 02 maaliskuu 2012; Julkaistu: 03 huhtikuu 2012

Copyright: © 2012 Moore et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Kirjoittajat ei ole tukea tai rahoitusta raportoida.

Kilpailevat edut: RKS ja LB on lueteltu keksijät on vireillä patenttihakemus. Heterosyklit ja niiden johdannaiset sekä valmistus- ja terapeuttiseen käyttöön US 2009/0221529 A1. Patentti on annettu Naiset ja Pikkulapset sairaala RI, nykyisen työnantajan tekijän RKS, TSL, KKK, RgM, NK, TCH, KR, JFP, MDP, SC, ja NH. Mikään muu neuvonta, tuotteiden kehittämiseen liittyvät tähän agentti olemassa. Mikään edellä mainittujen seikkojen muuttaa tekijöiden kiinnittymisen kaikkiin PLoS ONE politiikan tietojen jakamisen ja materiaaleja.

Johdanto

epiteelikasvaimet munasarjasyöpä (EOC) on johtava kuolinsyy alkaen gynekologiset syöpäsairauksia. Aikaisen vaiheen syöpiä ovat enimmäkseen oireettomia, ja suurin osa diagnooseista klo esityksen havaittava perustettiin alueellisia tai kaukaisia ​​etäpesäkkeitä [1]. Suurin osa potilaista kokee uusiutuva sairaus, sekä vastustuskyky kemoterapeuttisia aineita. Alhainen eloonjäämisaste pitkälle munasarjasyövän on tehnyt varhainen havaitseminen, ymmärtäminen taudin etiologiaa ja kohdentaminen erityisiä ominaispiirteitä, kuten tärkeimpiä prioriteetteja syöpätutkimuksessa [1].

Lisääntynyt

de novo

rasvahappojen synteesi on tunnusmerkki syöpä [2], [3]. Otto Warburg ensimmäisenä havaittiin parannettuja anaerobinen Glykolyysivaiheen syöpäsoluissa [4]. Normaalit ihmisen kudokset käyttävät ravintorasvat synteesiin uusien rakenteellisten lipidien, kun taas lakkaamatta lisääntyvien syöpäsoluja tuntemattomasta syystä välttää hyödyntämistä ravintorasvojen ja toteuttaa riippumattomia

de novo

rasvahapposynteesissä jatkuvasti säätää kalvon tuotanto, energiantuotanto ja lipidien proteiinien modifiointiin [4].

De novo

rasvahappojen synteesi sisältää kaksi avainentsyymien; asetyyli Co-A karboksylaasin (ACC) ja rasvahappojen syntaasia (FASN). ACC karboksylaatit asetyyli-CoA muodostamiseksi malonyyli-CoA. Malonyyli-CoA-tuote muutetaan edelleen FASN ja pitkäketjuisten rasvahappojen. Vasta syntetisoitu rasvahapot tallentaa lipolyyttinen PPAR-gamma välttää rasvahappo myrkyllisyys. Siksi vapautettu toiminnot lipogeeniset entsyymien FASN ja ACC mukana

de novo

rasvahappojen synteesi yhdessä lipolyyttinen PPAR-gamma on tärkeä rooli tuumorisolun eloonjäämistä eri tasoilla.

lukuisat tutkimukset ovat osoittaneet yliekspressio FASN ihmisen munasarjan epiteelin syövän (EOC) [5] – [8] ja syövät, rintasyövän [9], eturauhasen [10], paksusuolen [11], keuhkosyöpä [12], kohdun limakalvon [13] ja papillaarinen kilpirauhasen [14]. Oligonukleotidi mikrosiruja koostuu yli 6000 ihmisen geenit tunnistettu rasvahappojen nopaliinisyntaasin (FASN) potentiaaliseksi terapeuttiseksi tai molekyylin tavoite EOC [15]. Tämän jälkeen farmakologinen kohdentaminen FASN luonnollisen tuotteen cerulenin ja synteettinen molekyyli C75 kasvun estyminen munasarja- ja rintasyövän eläinmalleissa [16] – [17]

Nykyisessä tutkimuksessa, osoitamme, että MT19c on uusi luokka antituumoriaine, joka kohdistuu kriittisiä komponentteja

de novo

rasvahappojen synteesiä koneiden munasarjasyövän ksenograftikasvaimissa ja munasarjasyöpä soluja. MT19c on uusi vitamiini-D2 johdettu aine, joka kohdistuu ei hyperkalseemisia vaikutuksia ja näytetään erittäin korkean turvallisuustason indeksit nude-hiirissä. MT19c on heikko VDR antagonisti, joka häiritsee VDR-koaktivaattorikompleksien vuorovaikutusta eikä siihen klassisen kalsitriolin VDR vuorovaikutusta [18]. Pienillä annoksilla MT19c, munasarjojen ksenograftikasvaimissa tai syngeenisen Rotilla osittainen loppuun vasteen ja laajensi eloonjäämisaste merkittävästi verrattuna kontrolliin eläimiin. Tässä tutkimuksessa mainitaan uusi lähestymistapa suunnittelun turvallinen ja tehokas luokka vitamiini-d syöpälääkkeiden, jotka ovat vailla hyperkalsemian sekä klassisen vitamiini-D-tyypin toksisuuksien. Lisäksi tiedoista edellyttäen tässä varmistanut, että nykyinen korostaminen kohdistaminen

de novo

rasvahappojen synteesi entsyymi koneet hoitoon munasarjasyöpä on toteuttamiskelpoinen lähestymistapa hoitoon ihmisen munasarjasyöpä, ja tämän tutkimuksen perusteella MT19c on todettu lupaavaksi ehdokas kliininen arviointi ihmisen munasarjasyöpä potilaille.

tulokset

tehoa tutkimukset MT19c eläinten EOC malleissa

antituumoriteholla of MT19c (Fig. 1A) oli tutkittiin käyttäen ihmisen EOC soluista saatu nude (NU /NU) hiirillä sekä rotan munasarjasyövän perustuu syngeneeisissä rottamallissa Fisher-344 rotilla. Ensimmäisen tutkimuksen SKOV-3-solut suspendoidaan matrigeeliä inokuloitiin subkutaanisti yhteen kylkeen kunkin eläimen. Eläimet jaettiin hoito (n = 20) tai kontrolliryhmään (n = 10). Ajoneuvon tai MT19c (5 mg /kg kehonpainoa), annettiin IP joka toinen päivä 60 päivää hiirille, joilla SKOV-3 peräisin kasvaimia. Eläimet punnittiin (kuvio 1 B, alempi paneeli) ja kasvaimen koko mitattiin (kuvio 1 B, ylempi paneeli) 5 päivän välein. Normaali painonnousu sekä ajoneuvojen ja lääkkeellä käsiteltyjen hiirten havaittiin hoidon aikana. Kasvaimen koko kasvoi valvonnassa eläimillä, joiden keskimääräinen 2-kertainen nousu kasvaimen halkaisija koeaikana. Hoitoryhmässä, kasvaimen koko pieneni merkittävästi viimeisten 15 päivän hoidon 5 8 eläimet, joilla täydellinen vaste (Fig. 1 B, ylempi paneeli). Eläinten eloonjäämisprosentti oli merkitsevää eroa hoitoryhmien ja kontrolliryhmissä (p = 0,0001, Fig. 1 C), joka perustuu Kaplan-Meier-analyysi. Arviointijakson aikana, ajoneuvo käsitellyistä hiiristä saavuttanut päätepisteen (10 mm kasvain halkaisija) 20 päivän kuluessa hoidon taas osan MT19c hoidetuista eläimistä selvisi vasta tutkimuksen loppuun.

(A) kemiallinen rakenne MT19c. (B) Anti-syöpä aktiivisuus MT19c käytettäessä EOC hiirissä. Nude-hiirten (20 käsitelty ja 10 ohjaa) laakeri SKOV-3 peräisin tuumoriksenografteja annosteltiin (IP) joko ajoneuvon ohjaus- tai MT19c (5 mg /kg BWT) joka toinen päivä 60 päivän ajan. Kasvaimen koko laskettiin (ylempi kuva) käyttäen paksuus 5 päivän välein ja paino kirjataan (alempi kuva). (C) Kaplan-Meier selviytymisen analyysi. Kaplan-Meier selviytymisen analyysi MT19c ja ajoneuvojen käsitellyillä hiirillä suoritettiin käyttäen STATA 9 (StataCorp, College Station, TX) ja SAS 9.1 ohjelmisto (SAS Institute, Cary, NC). (D) teho MT19c syngeenisessä EOC rotilla. Fisher 344 rotat (3 eläintä /hoitoryhmä) injektoitiin IP rotan EOC solujen Nuţu-19. 3 viikon kuluttua, joko MT19c (100 tai 500 ug /kg BWT) tai ajoneuvon injektoitiin IP päivittäin 12 päivän ajan. Kasvaimen kudokset kerättiin ja omental paino (D-1), askites tilavuus (D-2) ja painon (D-3) tallennetaan. Mean omental paino ja tilavuus verrattiin Studentin T-testi epätasainen varianssit. Alempi paneeli esittää vaste-indeksi (D-4).

Itsenäisenä lähestymistapa määrittää syövän vastaisen aktiivisuuden MT19c

in vivo

käytimme hyvin määritelty syngeeninen rotta EOC malli [19] Fisher 344 rottaa jaettiin kahteen hoitoryhmään kussakin oli 3 eläintä ja yksi kontrolliryhmä. Nuţu-19 rotan EOC solua injektoitiin IP. 3 viikon kuluttua, joko 0,1 tai 0,5 mg MT19c /kg kehonpainoa tai ajoneuvon injektoitiin IP päivittäin. Keskimäärin 22 ml Vesivatsanestettä kerättiin kontrollieläimiltä tutkimuksen päättyessä (Fig. 1D, askites tilavuus). Useita pieniä kasvaimia (0,1-1,5 cm) on havaittu omentum, suoliston, kalvo, vatsakalvon seinä- ja pinta kaikki muut vatsaontelon elimiä. MT19c hoito vähensi annosriippuvaisesti keskimääräinen askites muodostuminen 0,5 mg /kg kehonpainoa ja tukahdutti kasvaimen kyhmy muodostumista. Vastaavasti, MT19c hoito vähensi annosriippuvaisesti keskimääräinen omental paino (Fig. 1 D). Tässä tutkimuksessa käytimme hyvin pieni annos MT19c verrattuna välittömän myrkyllisyyden tutkimus (400 mg /kg kehonpainoa) tai edellä hiiret ksenograftimallia ja pitkäaikaista myrkyllisyystutkimusta (5 mg /kg kehonpainoa, 10 x suurempi). Huomattavaa on, annoksella 0,5 mg MT19c /kg kehonpainoa kaikki 3 eläimet käsiteltiin osoitti kasvaimen regressio (Fig. 1 D, vaste-indeksi). Yksi eläin osoitti täydellisen vasteen. Eläinten painot sekä kontrolli- ja testiryhmään lisääntyi tämän kokeen (Fig. 1 D).

MT19c vaikutuksista seerumin kalsiumtasoa ja toksisuustutkimukset eläinmalleissa

Tällä hetkellä tunnetaan kalsitriolin /vitamiini-D3 analogeja aiheuttaa hyperkalsemiaa. Siksi tutkittiin jos MT19c voi aiheuttaa hyperkalsemiaa eläimille huolimatta muuttunut A-rengas konformaatioon. Eläimillä MT19c ei aiheuttanut hyperkalsemiaa aikana 35 päivää eläinten oikeudenkäyntiä. Kalsitriolin osoitti merkittävästi korkeampi seerumin kalsiumpitoisuus (15,5 mg /dl) lopussa kohtelun kuin MT19c käsitellyissä hiirissä (~ 10 mg /dl), joka oli lähempänä kalsiumpitoisuus kontrolliryhmässä (p 0,05) (Fig. 2A).

(A) seerumin kalsiumpitoisuus hiirillä MT19c hoidon. 8 hiirtä kutakin käsiteltiin MT19c (5 mg /kg kehonpainoa) tai kalsitriolia (10 ug /kg kehonpainoa) tai vehikkeliä (EtOH) ja 35 päivää, veren talteen ja seerumin kalsiumpitoisuus analysoitiin päivänä 35. muutos keskimääräisissä seerumin kalsium- oli merkittävä ( P 0,05) verrattuna ryhmien välillä Studentin T-testi, jossa epätasainen varianssit (B) Akuutti myrkyllisyys tutkimus MT19c. MT19c tai ajoneuvo annettiin nude-hiirissä ja eläimiä tarkkailtiin havaittavaa myrkyllisyyttä. (C) MT19c on VDR-tai -antagonisti seulontaan. VDR-over-ilmentävät VDR-UAS-bla HEK 293T-soluja käsiteltiin 5 h kalsitriolin /vitamiini-D3 (12:01-1 nM, vasen paneeli) tai MT19c (1 nM-1 pM, keskimmäinen paneeli) ja VDR-aktivointi analysoitiin. Analysoida antagonististen vaikutusten määritys suoritettiin (SelectScreen® Solupohjaisilla Nuclear Receptor Profilointi Palvelut: https://www.invitrogen.com) jälkeen solujen stimulaation kalsitriolin /vitamiini-D3 (120 pM) ja hoito MT19c (1 nM -1 pM, oikea paneeli;) 5 h. (D) Tiivistelmä keskeisiä piirteitä MT19c ja niihin liittyviä yhdisteitä. Vertailu MT19c kanssa kalsitriolialtistus ja muiden kliinisesti merkittäviä vitamiini-d johdannaisia.

Akuutti toksisuustutkimus määrittämiseksi turvallisuutta MT19c suoritettiin National Cancer Institute (NCI) kateenkorvattomissa nude-hiirissä. MT19c annettiin intraperitoneaalisesti (IP) annoksilla 400, 200, 100 mg /kg kehonpainoa (yksi eläin /annos) ja eläimiä seurattiin ajan 13 päivää (Fig. 2B) tallentamaan havaittavaa toksisuutta (ks tukeminen Information S1) . MT19c ei osoittanut mitään myrkyllisyyttä tahansa kolmen testatuilla annoksilla. Akuutti myrkyllisyys mittaa pitoisuus, joka vaikuttaa haitallisesti eläinten terveyteen, ja kuolleisuutta on yleisin päätepisteen.

MT19c ei vaikuta VDR transkriptio soluissa

MT19c osoitti heikkoa antagonistinen vaikutus fluoresenssi- polarisaatio määritys käyttäen VDR-ligandia sitovan domeenin ja fluoresoivasti leimattuja koaktivaattorikompleksien peptidi [20]. Voit selvittää transkription säätelyyn VDR soluissa upon MT19c hoitoa käytimme solu-pohjainen toiminnallinen-VDR-reportterianalyysi (GeneBLAzer® Technology, www.invitrogen.com) käyttämällä muunnettuja HEK293 (ks tukeminen Information S1). Nämä HEK293T-solut ilmentävät fuusioproteiinia VDR-LBD-GAL4 DNA: ta sitova domeeni, joka on aktivoitu kalsitriolin ja indusoi transkriptiota beta-laktamaasin reportterigeenin. Transkription aktivoituminen VDR: n läsnä MT19c määritettiin sen jälkeen, kun 5 tuntia esikäsittelyn ohjaus- kalsitriolin (12:01-1 nM) (Fig. 2C, vasen paneeli) tai MT19c (1 nM-1 pM) (Fig. 2C ; keskimmäinen paneeli). Kalsitriolin aiheutti VDR-aktivaatio 10 pM (IC

50~30 pM). MT19c ei osoittanut agonistinen aktiivisuus testatuissa konsentraatioissa. Analysoida antagonistisia vaikutuksia, solut stimuloidaan kalsitriolin (120 pM) käsiteltiin MT19c (1 nM-50pM) (Fig. 2C; oikea paneeli) 5 h. MT19c esti kalsitriolin aiheuttaman VDR-aktivaation vain suhteellisen suuria pitoisuuksia (IC

50~30 uM). Niinpä MT19c tullut erittäin heikko VDR antagonisti eivät ulotu biologista merkitystä. MT19c on noin 1000 kertaa vähemmän voimakas VDR antagonisti kuin TEI-9647 tai ZK159222 [21].

Molecular Docking Simulation (MDS) VDR ja MT19c vuorovaikutus

Suurin osa tällä hetkellä tiedossa kalsitriolin /vitamiini -D3 analogit ovat VDR-agonistit. Molekyylien käsityksen mahdollisesta vuorovaikutusta MT19c kanssa VDR käytimme MDS perustuu rakenteeseen MT19c ja VDR ligandoidun kalsitriolialtistus (ATE ID: 1DB1) [22] hyödyntäen AUTODOCK 4,0 ohjelma [23]. Mahdolliset proteiini-ligandikompleksit valittiin perustuen niiden sitoutumisen vapaan energian ja ulkomuodon kanssa alhaisin telakoituna energia valittiin mahdollisena ehdokkaana MT19c /VDR vuorovaikutusta. Kuva. 3A kuvaa MDS for VDR ja kalsitriolin (vasen paneeli) tai MT19c (oikea paneeli). Sitovaan taskuun VDR, tähteet, jotka ovat kosketuksissa kalsitriolin käytettiin viite (Fig. 3B) ja MT19c samoja jäämiä valittiin kuvaamaan vuorovaikutusta. Havaitsimme, että MT19c hankittu käänteisen majoitusta VDR ligandisitoutumisdomeeni verrattuna kalsitriolialtistus. MT19c on ensimmäinen vitamiini-D-luokan molekyylin osoittaa tämän ainutlaatuisen VDR-LBD vuorovaikutus. Up-side majoitus MT19c in VDR-LBD oli erittäin välillisiä että vammaiset klassisen kalsitriolin VDR vuorovaikutusten jotka määrittävät genominen toiminnot vitamiini-D. Lisäksi avainavaruus heeliksien 11 ja 12 VDR ligandisitoutumisdomeenista jossa kalsitriolia tai antagonisti ZK168281 sivuketju (C-25) sitoutuvat (Fig. 3d, vasen paneeli) on käytössä A-rengas MT19c (kuvio . 3D, oikea paneeli). Mielenkiintoista, MT19c paljasti tiiviimpää vetysitoutumiskapasiteettia välillä karbonyyli A-rengas VDR jäännöksen H397 (2,05 Å) (Fig. 3E, oikea paneeli) verrattuna 25-hydroksiryhmä kalsitriolin (2,8 Å) (Fig. 3E , vasen paneeli). Useita edellä kuvaillut myös laajentuneen muuttunut A-rengas rakenne MT19c että häiritsi luonnollinen konformaatio helices 11,12 ja 13, kun ylösalaisin merkintä VDR-LBD, biologisesti merkityksettömiä vuorovaikutuksia 15 keskeisten aminohappotähdettä VDR-LBD, ja vääristymä helices 11, 12 ja 13, joka mahdollistaa VDR-koaktivaattorikompleksien vuorovaikutukset voivat selittää, miksi MT19c on ei-hyperkalseemisia eläimillä [21].

(A) 3D-rakenteita VDR /kalsitriolin ja VDR /MT19c komplekseja.

Vasen paneeli:

VDR /calcitriol kompleksin (Kalsitriolia keskellä, spiraali 11 = valkoinen väri).

Oikea paneeli:

VDR /MT19c kompleksin (MT19c keskellä, 11 = vaaleanvihreä). MDS suoritettiin käyttäen AUTODOCK 4.0 ohjelman rakennetta MT19 ja kalsitriolin-ligandoidun VDR antamat Protein Data Bank. Kuvia rakenteet luotiin käyttäen UCSF Chimera. (B) sekvenssi VDR ligandin sitoutumiskohdan. Keltainen värikoodi edustaa helices rakenteessa. Vihreä väri koodi edustaa aminohappoja suoraan vuorovaikutusta ligandin (kalsitriolin). (C) Interaction vertailua.

Vasen paneeli:

vuorovaikutus Leu227 ja kalsitriolin.

Right Panel:

vuorovaikutus Leu227 ja MT19c. (D) vertailu helix 12 ja kierteen 11 vuorovaikutus ligandien.

Vasen paneeli:

vuorovaikutus kierteen 11 (violetti), helix 12 (keltainen), ja kalsitriolin.

Right Panel:

vuorovaikutus kierteen 11 (valkoinen), helix 12 (keltainen) ja MT19c. Molemmissa paneelien välistä vuorovaikutusta His397 on helix 11 ja ligandi on kuvattu. (E) väliset etäisyydet Hänen 397 ja ligandeja.

Vasen paneeli:

vuorovaikutus His397 ja kalsitriolin.

Right Panel:

vuorovaikutus His397 ja MT19c.

MT19c estää EGFR signalointi sekä in vitro että in vivo, mutta ei vaikuta PPAR-gamma ilmaisu

Tunnistaa molekyyli tavoitteet MT19c munasarjan syöpäsolujen Gene Set Enrichment Analysis (GSEA) analyysi genomin laaja mRNA ajoneuvon käsiteltyjen (kontrolli) ja MT19c käsiteltiin kasvaimia päivänä-8, päivä-16 päivää-30 suoritettiin kolmena kappaleena käyttämällä Affymetrix Human Gene 1.0 ST Array (Affymetrix, Santa Clara, CA). Ilmaisu data on talletettu osoitteessa www.ncbi.nlm.nih.gov (acc = GSE23616). MT19C käsitelty ksenograftikasvaimissa osoittivat johdonmukaisesti alhaisempi ekspressiotasot osallistuvien geenien energia-aineenvaihduntaan (p +0,00000000055). Perustuen ekspressiotasoja korkeamman tilastollista merkitystä (p = 0,00000005; sulku kohta), me ryhmittyneet avain metabolisen geenit, jotka olivat joutuneet Ingenuity Pathway Analysis (IPA). Differentiaalinen ilmentyminen EGFR, PI3K, PRKAA2, THRSP, SREBF1, malonyyli Co-A karboksylaasi, Asetyyli-CoA karboksylaasin ja Rasvahapon syntaasin ohjaus ja hoitoryhmässä päivänä-8, päivä-16 ja päivä-30 on esitetty kuvassa. 4A.

(A) Perimän analyysi naiivia tai MT19c käsitelty ksenograftikasvaimissa. SKOV-3 -ksenografteja vehikkeliä tai MT19c (5 mg /kg kehonpainoa) ja kasvainkudoksen kerättiin päivänä-8, 16 ja 30. mRNA kasvaimista analysoitiin Affymetrix microarray sirut kolmena kappaleena ja geenien ilmentymistä on ryhmittyivät GSEA analyysi. Ero geenien välillä MT19c käsitellyt tuumorit ilmaistiin%: n ohjaus (±). (B) Expression of ydinaseiden EGFR (nEGFR) in SKOV-3 Ksenograftikudoksista vehikkeliä tai MT19c. SKOV-3-ksenografteissa käsiteltiin MT19c tai ajoneuvon. Parafiiniin kudoksia käsiteltiin ja värjättiin Alexafluor-konjugoidun fosfori-EGFR-vasta-aine, ja analysoitiin konfokaalimikroskopialla, kuten on esitetty materiaalit ja menetelmät -kappaleessa. EGFR näkyy vihreällä yhdessä tumaväriä DAPI. Suurennus: 40 x 2 (C) Western blot-analyysi fosfo-EGFR ja fosfo-PI-3K ja ilmaisun ydinvoiman EGFR (nEGFR) in SKOV-3-soluissa. (Vasen paneeli): SKOV-3-soluja käsiteltiin 250 nM MT19c. PAGE ja Western blot-analyysi solulysaateista suoritettiin. Aktivoitu fosfo-EGFR ja fosfo-PI-3K tehtiin näkyväksi immunoblottauksella käyttämällä ensisijaista tunnistavien vasta-aineiden lohkaista fragmentteja. Sisäiseksi standardiksi yhtäläistä lastaus (50 ug solun kokonaisproteiinista /kaista) blotit kanssa (tubuliinia vasta-aine. (Oikea paneeli): ilmaus ydin- EGFR (nEGFR) ajoneuvojen (ylempi paneeli), kalsitriolin (2 uM, keskimmäinen paneeli) ja MT19c (250 nM, alempi paneeli) käsiteltiin SKOV-3-solujen immunofluoresenssimikroskopialla. EGFR näkyy vihreällä ja oikeassa sarakkeessa osoittaa DNA (sininen). Suurennus: 40 (D) MT19c tukahdutetaan PI-3K kinaasiaktiivisuutta SKOV-3-soluihin. SKOV-3-soluja käsiteltiin MT19c (0, 250 nM) osoitetun aikavälein. Solulysaatit immunosaostettiin vasta-aineella, joka on spesifinen fosfo-tyrosiinin ja PI3K-vaikutus määritettiin in vitro lipidin kinaasimääritys. PIP- 3 (fosfoinositidi 3-fosfaatti), fosforyloitu lopputuote on esitetty. pylväsdiagrammi näyttää densitometrinen skannauksen tulokset edustavasta kokeesta. (E): tunnistaminen vuorovaikutus MT19c ja PPARy avulla fluoresenssipolarisaatiota. Häiriöt sitoutumisen välillä PPARγ- LBD ja fluoresoiva DRIP2 peptidin MT19c on tutkittu ▪ läsnä ja • agonistin poissa ollessa GW929. Kontrollit olivat ajoneuvo DMSO (▴ kanssa agonisti, ○ ilman agonisti), ▾ leimaamattoman DRIP2 peptidi (positiivinen kontrolli) ja ♦ loisteputki DRIP2 peptidi yksinään (positiivinen kontrolli).

Syöpäsolut järjestää energiaa vaatimuksen suuntaamalla lipogeeniset /lipolyyttinen aineenvaihdunnan tasapaino säätää ja ylläpitää syövän kasvua määrittelemällä uudelleen toimintoja EGFR, PPAR-gamma, ja rasvahappojen synteesi ja glykolyysiin koneet [24]. Kohdistaminen EGFR ja muut aineenvaihdunnan on, siis, oletetaan parantaa munasarjasyövän hoidossa tulos [6], [25]. Ymmärtää vaikutus MT19c on EGFR ja sen loppupään signalointiryöpyn munasarjasyövän, tutkimme vaikutus MT19c on EGFR ja PI-3kinase aktiivisuuden SKOV-3-solujen Western blot -analyysillä, mikroskopia ja

in vitro

PI-3kinase aktiivisuuden määritys.

Geenien ilmentyminen (GSEA) analyysi osoitti, että MT19c tukahdutettiin EGFR kasvaimissa käsitelty päivänä-8. Lisäksi käsitellyt kasvaimet jopa päivä-30 osoitti merkittävää downregulation EGFR vähäisessä aktivointi EGFR käsitellyt kasvaimet jopa päivä-16 osoittaa vastatoimia vaivaa vastaan ​​huumeiden toimintaa havaittiin (Kuva. 5A). Seuraavaksi validoitu microarray tiedot EGFR immunohistokemiallisella analyysi käsiteltiin SKOV-3-ksenografteissa vehikkeliä tai MT19c (5 mg /kg kehonpainoa). Kalvot pikajäädytettii korjattu kasvaimia ajoneuvosta tai huumeiden käsiteltyjen eläinten Fig. 1B immunosaostettiin värjättiin FITC-EGFR-vasta-aine (R (Keskimmäinen paneeli): retentioaika malonyyli-CoA ajoneuvon käsitelty SKOV-3-soluja; (Oikea paneeli): retentioaika malonyyli CoA MT19c (500 nM) käsiteltiin SKOV-3-soluissa.

tutkimiseksi toiminnallinen vaikutus MT19c on EGF-reseptorin ilmentymisen munasarjasyöpäsoluja tarkastelimme EGFR lokalisointi SKOV-3-solujen

in vitro

käsittelemällä MT19c. SKOV-3-soluja käsiteltiin MT19c (100 nM) tai kalsitriolia (2 uM) 12 tunnin ajan seerumittomassa olosuhteissa. Soluja käsiteltiin kuten on esitetty materiaalit ja menetelmät -kappaleessa. Mikroskooppinen tutkimus ajoneuvon käsiteltyjen solujen osoitti selkeitä ja ehjä solun morfologiassa kanssa transmembraanisen EGFR värjäys seurassa muutamalla ytimet voimakkaasti värjätty (Fig. 4C, ylempi vasen paneeli). DAPI värjäys osoitti myös ehjä rakenteellinen eheys DNA ja kromatiinin (Fig. 4C, ylempi oikea paneeli). Toisin kuin ajoneuvo, kalsitrioliksi käsitellyt solut osoittivat erittäin voimakasta ja erityistä tumavärjäystä takia ydin- translocalization ja osoittanut puute transmembraanisen värjäyksen (kuvio. 4C, keskimmäinen paneeli). Toisaalta, toisin kuin kalsitriolin, MT19c hoito ei edistää EGFR ydin- translocalization ja vahva transmembraanisen EGFR värjäytyminen keskuudessa solupopulaation samanlainen vehikkelillä käsiteltyihin soluihin havaittiin (Fig. 4C, alempi paneeli). Harvat ytimet tiheä ydin- tahra MT19c käsitelty solupopulaatiossa, itse asiassa, olivat muistuttaa apoptoosin kuin tumaansiirtymiseen. Todettiin, että ksenograftikasvaimissa osoitti voimakkaampaa sytosolin värjäytymistä kuin transmembraanisen värjäytyminen havaittiin viljeltiin SKOV-3 munasarjasyöpäsoluja, mahdollisesti osoittaa ero kasvaimen mikro-ympäristöön sekä tyypin solujen (Fig. 4B ja 4C). Western blot analyysi lääkkeellä käsiteltyjen SKOV-3-soluja osoitti, että MT19c tukahdutetaan EGFR aktivointia 12 tuntia hoidon (Fig. 4C, vasen paneeli).

Koska EGFR suoraan säätelee monia kriittisiä toimintoja PI-3kinase [ ,,,0],5], analysoida PI-3kinase aktiivisuuden SKOV-3-solujen hakemuksesta MT19c (250 nM) teimme PI-3kinase toimintaa [26]. PI3-kinaasi (PI3K) reitin säätelee monia solun toiminnoissa kuten solujen aineenvaihduntaa, solujen eloonjäämistä, ja apoptoosin syövän ja phosphotidylionositol-3,4,5-trifosfaatti (PIP-3) on avain välittäjäaine PI-3kinse signaalitransduktion [ ,,,0],27]. PIP-3 syntetisoidaan phosphotidylionositol-4,5-difosfaattia (PIP-2) [28]. Perustuu immuunisaostustesti, havaitsimme, että MT19c hoito (250 nM) vaimentua PIP-3 tuotanto merkittävästi 12 tunnin kontrolliin verrattuna (kuvio. 4D). Pikseli tiheyden mittaus loading spot edustavat PIP-3 määrän valvontaa lysaatin eluoitiin ohutkerroskromatografisesti (TLC) oli 14480 yksikköä taas MT19c käsiteltiin näytteellä 9 kertaa vähemmän kvantitatiivinen synteesi PIP-3 (pikselimäärä 1304) (Fig. 4D, alempi paneeli). Yllättäen, PIP-3 tuotanto oli voimakkaasti säädelty 2-kertaiseksi ensimmäisen 3 tunnin kuluessa hoidon osoittaa pro-selviytymisen paineen hakemuksesta lääkkeen. Edelleen ymmärtää vaikutusta MT19c ilmenemistä PI-3kinase, Western blot suoritettiin. MT19c (250 nM) käsittely osoitti downregulation PI-3kinase fosforylaatiota SKOV-3-soluissa 12 tunnin kuluessa, (Fig. 4C, vasen paneeli).

MT19c ei vaikuta PPAR-gamma komponentti Rasva-aineenvaihdunnan munasarjan syöpäsolut

EGFR yli-ilmentyminen aktivoi PPAR-gamma-toiminto syöpäsoluissa niiden suojaamiseksi palmitaatti myrkyllisyys [24]. PPAR-gamma on mahdollinen kohde ehkäisyyn ja syövän hoitoon [29]. Tutkimme vuorovaikutusta MT19c kanssa ytimen reseptorin PPAR-gamma tekemällä fluoresenssipolarisaatiota määritystä. Koska PPAR-gamma-agonisti (GW949) emme havainneet vuorovaikutusta PPARy ja koaktivaattoriproteiinin DRIP2. Vastaavasti, kun läsnä on agonistin GW949 ilman häiriöitä vuorovaikutuksen VDR ja DRIP2 havaittiin.

MT19c tukahdutetaan Rasvahappo-syntaasin ilmentymistä ksenograftikasvaimissa

EGFR /PI-3Kinase parantaa lipogeneesiä syöpä solut aktivoimalla lipogeeniset rasvahappo nopaliinisyntaasin (FASN) koneet yhdessä PPAR γ [5]. Yliekspressio FASN ihmisen munasarjan epiteelin syövän (EOC) on osoitettu [7] – [10]. Oligonukleotidi mikrosirut näyttö tunnistettu rasvahappojen nopaliinisyntaasin (FASN) mahdollisina molekyyli tavoite EOC [17]. Genominlaajuisia mRNA analyysi naiivia ja MT19c käsiteltiin ksenograftikasvaimissa selkeästi MT19c toimia FASN ilmaisun MT19c käsitelty munasarjasyövän ksenograftin (p = +0,00000000055) (Fig. 4A) [30].

Havaitsimme kautta immunoblottauksella että MT19c hoito tukahdutti ilmaus FASN ja asetyyli Co-A-karboksylaasin (ACC) in SKOV-3-solut (Fig. 5A) aika riippuvaisesti. Tutkimme, onko MT19c säätelee FASN ja ACC käsitellyissä ksenograftikasvaimissa. Hakkuut ksenografteissa on naiivi ja MT19c hoitoryhmien immunosaostettiin värjättiin FASN vasta-aineella ja analysoitiin fluoresenssimikroskopialla erottaa FASN värjäytymistä kontrolliryhmässä verrattuna hoitoryhmässä. Vaikka ajoneuvo käsitellyt tuumorit osoittivat voimakasta ja homogeeninen värjäys ympäri lipidipisaroita upotettu kudoksissa (Fig. 5D, vasen yläpaneeli), MT19c käsitellyt tuumorit osoittivat merkittävää puutetta värjäys tai osittain /jäljellä värjäyksen (kuvio. 5E, oikea yläpaneeli). Havaitsimme läsnäolo 2 rasva kenttien koko kudoksen osassa, jotka oli tiheästi värjättiin valvonnassa. Samoin vain kaksi rasva-kentät havaittiin lääkekäsitellyissä ksenografti-osastossa ja FASN värjäytyminen niiden ympärillä oli merkittävästi pienempi kuin vehikkelillä käsiteltyihin kontrollisilkkipaperia. Suoritimme fluoresenssin voimakkuus mittauksia koko kudosleikkeiden sekä valvonnan ja lääkkeellä käsiteltyjen kudosten ja laskettiin keskiarvo ja integroitu optinen tiheys (IOD). Kuten on esitetty kuviossa. Kuva.