Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

aklorhydrian aiheuttama esim atrofinen gastriitti mahdollistaa bakteerien liikakasvu, joka aiheuttaa kroonisen tulehduksen ja vahingoittaa limakalvoilta tartunnan yksilöiden ajo mahasyöpäriskiin ja syöpä.

Enterococcus faecalis

(

E. Faecalis

) voi asuttaa achlohydric vatsat ja siksi halusimme tutkia vaikutusta

E. faecalis

tartunnan tulehdusreaktio, reaktiivisia happiradikaaleja (ROS) muodostumiseen, mitokondrion hengitystä, ja mitokondrioiden geneettinen vakaus mahalaukun limakalvon soluissa.

Methods

erottamiseksi aiheuttamien muutosten bakteerien niille tulehdussolujen perustimme

in vitro E. faecalis

-infektiomallia järjestelmän avulla mahakarsinoo- solulinjassa MKN74. Yhteensä ROS ja superoksidi mitattiin fluoresenssimikroskopialla. Cellular hapenkulutus oli ominaista ei-invasiivisesti käyttäen XF24 mikrotiitterilevypohjainen respirometria. Geenien ilmentyminen tutkittiin microarray, ja vasteen reittejä tunnistettiin Gene Set Analysis (GSA). Valitun geenin transkriptien todennettiin kvantitatiivisella reaaliaikainen polymeraasiketjureaktio (qRT-PCR). Mitokondrioiden mutaatioita määritettiin sekvensoimalla.

Tulokset

Infektio on MKN74 solujen

E. faecalis

aiheuttama solunsisäisen ROS Tuotantoyhteistyö reitin riippumaton oksidatiivisen fosforylaation (oxphos). Lisäksi

E. faecalis

infektio aiheuttama mitokondrio-DNA epävakautta. Infektion jälkeen geenit koodaavat tulehdusreaktio proteiinit olivat kopiointia sääteli taas DNA-vaurion korjaamiseen ja solusyklikontrollin geenit alassäädetty. Solujen kasvu hidastui, kun tartunnan kannattavia

E. faecalis

ja vastasi annoksesta riippuvaisella tavalla

E. faecalis

lysaatti.

Johtopäätökset

Infektio

E. faecalis

indusoi oxphos riippumatonta solunsisäistä ROS vasteen ja vaurioitunut mitokondrioiden genomin mahalaukun soluviljelmässä. Lopuksi bakteerit indusoi NF-KB tulehdusreaktio sekä alentunut DNA-vaurioita vastaus ja solusyklikontrollin geenin ilmentymistä.

Transcript profilointi

Array Express hakunumerolla E-MEXP-3496.

Citation: Strickertsson JAB Desler C, Martin-Bertelsen T, Machado AMD, Wadström T, Winther O, et ai. (2013)

Enterococcus faecalis

Infektio aiheuttaa tulehduksen, Solunsisäinen Oxphos-Independent ROS tuotanto, ja DNA-vaurioita ihmisen mahasyöpä syöpäsoluja. PLoS ONE 8 (4): e63147. doi: 10,1371 /journal.pone.0063147

Editor: Shree Ram Singh, National Cancer Institute, Yhdysvallat

vastaanotettu: 28 elokuu 2012; Hyväksytty: 02 huhtikuu 2013; Julkaistu: 30 huhtikuu 2013

Copyright: © 2013 Strickertsson et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: AMDM on tukee apurahan portugalilaiset Science, Technology Foundation. LFH tukee Tanskan MRC. Jabs tukee Tanskan Cancer Society ja University of Copenhagen SUND. TMB ja OW tukee avustusta Novo Nordisk Foundation bioinformatiikan Centre. CD ja LJR tukevat NORDEA-fondenin. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Mahasyöpä on kymmenen yleisimmistä syövistä, ja jolla on maailmanlaajuinen vuotuinen kuolleisuus on noin 700.000, se on toiseksi yleisin syy syöpään liittyvää kuolleisuutta [1]. Suolen tyyppi mahalaukun syöpä kehittyy läpi sarjan patologisten tapahtumien alkaa krooninen tulehdus, atrofinen gastriitti, suoliston metaplasiaa, ja lopulta syöpä [2].

Krooninen tulehdus ja syöpä on yhdistetty useissa tutkimuksissa potilaiden ja muuntogeenisten hiiret, ja sen uskotaan olevan osallisena patogeneesissä noin 25% kaikista syöpätapauksista maailmanlaajuisesti [2] – [4]. Ominaisuudet syöpään liittyvien tulehdus kuuluu läsnäolo kemokiinien ja sytokiinien tuumorikudoksissa, jolla on potentiaalia stimuloida kasvainta solujen lisääntymistä ja selviytymistä pahanlaatuisia soluja [5], [6]. Krooninen tulehdus suosii myös ylituotantoa DNA vahingoittamatta reaktiivisia happiradikaaleja (ROS), joiden tuotanto voi olla satunnaista oksidatiivinen fosforylaatio (oxphos) reaktioita mitokondriot (oxphos riippuva) tai valmistettu ulkopuolelta mitokondriot yleisimmin nicotinamid tiiniamidiadeniinidinukleotidifosfaatin ( NADPH) oksidaaseja (oxphos riippumaton) (katso katsaus [7] – [9]). Krooninen tuotanto ROS aiheuttaa DNA-vaurioita, jolloin mutaatioiden mikä puolestaan ​​voi aktivoida onkogeenejä ja /tai inaktivoida tuumorisuppressorigeeneille mikä lisää syöpäriskiä kehitys [3].

Yleisin riskitekijä mahasyöpä on krooninen bakteeri-infektio vatsan kanssa

Helicobacter pylori

(

H. pylori

) [10]. Krooninen infektio mahalaukussa

H. pylori

vaikuttaa mahan pH-tasapaino ja voi aiheuttaa aklorhydrian tai hyperchlorhydria [11]. Vaikka tämä bakteeri on luokiteltu luokan yksi karsinogeeniksi, se ei ole aina liittynyt lisääntynyt riski mahalaukun syövän kehittymisen. Esimerkiksi

H. pylori

infektoituneilla potilailla pohjukaissuolihaava ja korkea mahahapon on pienempi riski sairastua mahalaukun syöpään verrattuna niihin yleisestä väestöstä [11] – [13]. Sitä vastoin potilailla, joilla on atrofinen gastriitti ja vähentää mahahapon eritystä on lisääntynyt riski sairastua mahalaukun syöpään [11], [13], [14]. Lisääntynyt syöpäriskin hapoton yksityishenkilöt voisivat johtua bakteerien liikakasvun muiden bakteerien mahalaukun onteloon [15]. Sekä hapoton ihmisissä ja eläinmalleissa bakteerien liikakasvu aiheuttaa krooninen gastriitti, joka kehittyy suoliston metaplasia ja lopulta mahasyövän [16] – [18]. Niistä bakteerit mahassa hapoton hiiristä oli

enterokokkien

lajeja, jotka ovat gram-positiivisia kokit pystyvät selviytymään ympäristössä, jossa pH niinkin alhainen kuin 4,5 [19], [20].

Enterococcus faecalis

(

E. Faecalis

) on jäsen ihmisen pieneliöstöön ja yksi yleisimmistä bakteerien ruoansulatuskanavassa [19]. Tästä huolimatta,

E. faecalis

voi toimia ihmisen taudinaiheuttaja [21], ja on todettu huomattavasti suurempia numerot suullista pahanlaatuisten vaurioiden ja ihmisen paksusuolen syövissä [22], [23]. Tähän liittyen

E. faecalis

pystyy tuottamaan N-nitrosamiinien ja aiheuttamaan geneettinen epävakaus koolonin epiteelisolujen läpi hapettumista DNA [24], [25].

gastriitti liittyy immuunisolujen infiltraatio, että kudos, joka tekee vaikeaksi leikellä toiminnan immuunijärjestelmän soluja, jotka limakalvon limakalvon solut

in vivo

. Siksi käyttäneet

in vitro

kudosviljelmässä malli, joka antoi meille mahdollisuuden tutkia, miten yksittäinen limakalvon solut reagoivat bakteerit ja molekyylitason mekanismeja, joilla suoliston bakteerit, kuten

E. faecalis

aiheuttaa vaurioita mahalaukun epiteelisolujen. Mallin tutkimme vaikutus

E. faecalis

infektio mahalaukun adenokarsinooman soluviljelmissä on ROS tuotanto, soluhengitykseen, kasvu, DNA vaurioita /korjaus ja tulehdusreaktioita.

Materiaalit ja menetelmät

Cell Culture,

E. faecalis

, ja kasvuolosuhteet

Human MKN74 mahalaukun adenokarsinooman soluviljelmissä lähtien Japani Collection of Research Bioresources kantasolupankit (JCRB # JCRB0255) ylläpidettiin RPMI 1640-alustassa (Invitrogen, Carlsbad, CA), jota on täydennetty 10% naudan sikiön seerumia (FBS) (Invitrogen), 100 ug /ml streptomysiiniä ja 100 U /ml penisilliiniä (Invitrogen) 37 ° C: ssa ja 5% CO

2 kosteutetussa ilmakehässä. Infektiot suoritettiin

E. faecalis

kanta (ATCC 29212). Bakteereita kasvatettiin 5% veriagarmaljoilla 37 ° C: ssa. Optinen tiheys (OD) bakteerien kasvatettiin RPMI 1640 -alustassa mitattiin 550 nm: ssä UV-1601 spektrofotometrillä (Shimadzu, Kioto, Japani) (kuvio S1).

E. faecalis

lysaatti valmistettiin pakastus /sulattamalla bakteerisuspensiota kolme kertaa, kun taas sonikoimalla suspension kunkin jakson välillä.

Infektio Mahalaukun solujen RNA ja DNA: n eristä-

24 h infektioita , 80% konfluentteja MKN74 solut pestiin PBS: llä ja inkuboitiin antibiootti väliaineessa. Yön yli kasvatettuja pesäkkeitä

E. faecalis

lisättiin MKN74 soluviljelmään infektiokertoimella (MOI) 50 bakteeria per solu. 5 päivää infektiot suoritettiin käsittelemällä 65% konfluentteja MKN74 solujen

E. faecalis

MOI 10 tai lysaattia proteiinipitoisuus 40 ug /ul. 24 tunnin välein, solut pestiin PBS: llä ja tuoretta alustaa ja bakteerit tai lysaatti lisättiin. Ohjaus solut käsitellään samalla tavalla ilman bakteerien tai bakteerien lysaattia.

In vitro

tutkimukset tehtiin käyttäen mahasyövän solulinja testata vahingollista vaikutusta

E. faecalis

on mahalaukun adenokarsinoomasolua. Nämä solut eroavat normaaleista mahalaukun epiteelisoluihin kuljettaa useita kromosomipoikkeamakoe, mutta etuna on olla toistettavissa mallijärjestelmä monin tavoin toisintaa tapahtumista vatsassa. Vertaamalla tartunnan saaneiden solujen terveille soluihin kuvaa luotettavasti vaurioita ja muutokset geenien ilmentyminen aiheuttama infektio.

RNA ja DNA eristys

Kun infektio, RNA ja DNA uutettiin lisäämällä Trizol Reagent (Invitrogen) kuhunkin viljelypulloon. RNA eristettiin mukaisesti valmistaa protokollaa. DNA sisältävä välivaiheessa saostettiin lisäämällä 100% etanolia. Näytteitä sentrifugoitiin lämpötilassa 4 ° C, 3500 g 6 min. Fenoli-etanolia supernatantti poistettiin ja jäljelle jäänyt DNA: n uutto suoritettiin käyttäen NucleoSpin kudoksen kit (Macherey-Nagel, Düren, Saksa). RNA- ja DNA-pitoisuudet mitattiin NanoDrop ND-1000 spektrofotometriä. RNA eheys numerot mitattiin 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, Kalifornia) mukaan valmistaa protokollan.

mittaus ROS ja Superoksidi

Kaksi päivää ennen infektiota 8 x 10

4 MKN74 solut maljattiin jokaiseen kuoppaan Lab-Tek

TM Chambered Coverglas (Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts). MKN74 solut värjättiin kaksi tuntia ennen infektiota 2-Plex tunnistus mix. ROS ja superoksidi värjäys suoritettiin käyttäen ROS /RNS Detection Kit (Enzo Life Sciences, Farmingdale, New York) mukaisesti valmistaa ohjeita. MKN74 solut infektoitiin MOI-arvolla 50 30 minuutin ajan ja analysoitiin Zeiss LSM 510 -konfokaalimikroskoopilla käyttäen LSM 510 ohjelmisto (Zeiss, Oberkochen, Saksa). Infektoimattomat värjätään MKN74 soluja käytettiin negatiivisina kontrolleina.

lokalisaatio

E. faecalis

infektion aikana

8 x 10

4 MKN74 solua /kuoppa siirrostettiin 8-kammio lasipohjaisella dia (Thermo Fisher Scientific) 24 tuntia ennen värjäystä. Jotta voitaisiin tunnistaa lokalisoinnin

E. faecalis

infektion jälkeen olemme erikseen värjättiin solukalvon kanssa CellMask

TM Deep Red solukalvon tahra (C10046, Invitrogen) ja bakteerin soluseinän käyttäen BacLight

TM Green bakteeri tahra (B-35000, Molecular probes, Invitrogen) mukaan kaksi protokollien osalta. Solut ja bakteerit pestiin 3 kertaa PBS: ssä ennen infektiota. Solut infektoitiin MOI 100 4 tuntia ja analysoitiin Zeiss LSK 510 -konfokaalimikroskoopilla käyttäen LSM 510 ohjelmisto (Zeiss). Tämä koe toistettiin kolme kertaa ja 8 Champers tutkittiin joka kerta.

XF24 Microplate perustuu respirometria

respirometria on MKN74 solujen suoritettiin käyttäen XF24 Ekstrasellulaarinen Flux Analyzer (Seahorse Bioscience, North Billerica, MA ). Puolet päällystetty MKN74 solut infektoitiin

E. faecalis

MOI 50 4, 8 tai 24 tuntia, kun taas toinen puoli jäi infektoimattomia. Inkuboinnin jälkeen bakteerit poistettiin käyttäen 4% penisilliini /streptomysiiniä (5 U /ml) ja 4% cefotaxim (100 ug /ml) (ACS Dobfar Generics S.A., Luxemburg, Belgia). Soluja inkuboitiin CO

2 vapaa-inkubaattorissa 37 ° C: ssa 1 tunti, jotta lämpötila ja pH tasapainottumisen. Mikrolevy soluja sitten ladattiin XF24 ja hapenkulutuksen Kunkin kuopan mitattiin yli 100 minuutin kuluessa. Lääkkeet oligomysiini (0,5 uM), FCCP (0,3 uM) ja antimysiiniherkkien (2,0 uM) olivat puolestaan ​​lisättiin kuhunkin kuoppaan. Lisätietoja on saatavilla File S1.

mitokondrio-DNA Epävakaus

taajuus mutaatioita D-silmukka-alue mitokondrion DNA, määritettiin PCR-monistuksella käyttäen alukkeita C6-CA5 (taulukko S1 ). Monistetut fragmentit kloonattiin pCR2.1-vektoriin (Invitrogen) ja insertit 328 pesäkkeet monistettiin käyttäen VectorD silmukan alukkeet (taulukko S1). Monistetut fragmentit puhdistettiin ja sekvensoitiin käyttämällä ABI Prism BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit, ja ABI Prism 3730 DNA Sequencer (Perkin-Elmer, Waltham, Massachusetts). Voit selvittää mutaatioita, sekvenssit käytettiin kyselyitä Cambridge referenssijaksoa saatu MitoMap (https://www.mitomap.org. Accessed Helmikuu 9. 2012).

Microarray ja GSA

RNA RNA eheyden useita 8 tai yli kolmesta ohjaus ja kolme infektion näytteitä (kannattava

E. faecalis

tai

E. faecalis

lysaattia 40 ug /ul) 24 tunnin ja 5 päivää kokeet toimitettiin RH sirukeskuksella Kööpenhaminan yliopistollisessa sairaalassa. RNA monistettiin ja leimattiin käyttäen 3 ’IVT Express kit (Affymetrix, Santa Clara, CA, USA) mukaisesti valmistaa ohjeita. 250 ng kokonais-RNA: ta käytettiin syötteenä. Leimatut näytteet hybridisoitiin GeneChip- Genome U133 plus 2 paneelit (Affymetrix). Taulukot pestiin ja värjättiin phycoerytrin-konjugoitu streptavidiini käyttäen Affymetrix Fluidics Station® 450, ja taulukot skannattiin on Affymetrix GeneArray® 2500 skanneri tuottaa fluoresoivia kuvia, kuten on kuvattu Affymetrix GeneChip® protokollaa. 24 raaka solu intensiteetti tiedostot (CEL-tiedostot) tuotettiin vuonna GeneChip® Command Console® Software (AGCC) (Affymetrix). Raaka CEL-tiedostot olivat yleisesti saatavilla ArrayExpress kanssa hakunumerolla E-MEXP-3496. Esikäsittely mikrosirujen varten geeniperimä analyysi (GSA) suoritettiin R /Bioconductor [26], [27]. Taustan säätö, kvantiili- normalisointi ja lopullinen yhteenvetoa koetin asettaa ilmaisun intensiteetin suoritti GCRMA algoritmilla [28] kullekin koetilalle, erikseen (File S2).

kvantitatiivinen Käänteiskopiointireaktioita PCR

cDNA syntetisoitiin käyttäen SuperScript III ensimmäisen Strand Synthesis SuperMix- varten qPCR (Invitrogen). Geenien ilmentyminen analysoitiin qRT-PCR: llä käyttämällä SYBR vihreämpi q-PCR SuperMix- varten ABI PRISM (Invitrogen). Alukkeet suunniteltiin käyttäen Primer-Blast ohjelmiston NCBI [29]. Reaktiot ajettiin ABI PRISM 7900HT Sequence Detection System (SDS) Applied Biosystems. Data normalisoitiin GAPDH mRNA: n ilmentymisen.

Growth määrityksessä

8000 solut jaettiin kuhunkin kuoppaan kuusi 24-kuoppalevyille ja inkuboitiin 37 ° C: ssa ja 5% CO

2 vähintään kaksi päivää ennen käsittelyä. Soluja käsiteltiin neljänä rinnakkaisena seuraavasti; 4 kuoppiin infektoimattomien kontrollisolujen, 4 kaivot käsiteltiin 400 ug /ul

E. faecalis

lysaattia, 4 kaivot käsiteltiin 40 ug /ul lysaattia, 4 kuopat käsiteltiin 4 ug /ul lysaattia ja 4 kaivot käsiteltiin elinkelpoista

E. faecalis

MOI 10. Yksi levy solujen kiinnittynyt joka päivä. Kiinnitys tehtiin pesemällä PBS: llä ja kiinnittämällä 1 ml 10% formaliinia ja 10 min. Päähuomio solut värjättiin 1 ml 0,1% kristalliviolettia (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri), ja levyjä ravisteltiin 30 min. Solut pestään, kuivataan, ja kristallivioletti uutettiin 500 ui 10%: ista etikkahappoa. Absorbanssi mitattiin 620 nm: ssä PowerWave XS (BioTek Instruments, Winooski, Vermont).

Tilastollinen analyysi

Yhden luokittelu varianssianalyysi (ANOVA) käytettiin testaamaan eroja maksimaalisen hengityskapasiteetti , ATP liikevaihdon ja oxphos riippumaton hapenkulutusta. ANOVA lisäksi käytettiin testaamaan eroja solujen kasvua aikana erilaisia ​​hoitoja, joissa

E. faecalis

. Kun ANOVA osoitti merkittäviä eroja hoitojen, Tukeys rehellisesti merkitsevä menetelmää käytettiin testaamaan eroja hapen kulutuksen hinnat tai solujen määrä. mtDNA mutaatio taajuudet arvioitiin chi-neliö ja Fisherin testiä. ROS tulokset ilmaistiin keskiarvoina vähintään kaksikymmentä riippumatonta mittausta ja analysoitiin parittomalla kaksisuuntaisella

t

-testi. qRT-PCR Tulokset ilmaistiin keskiarvoina vähintään kolmen itsenäisen kokeen mitataan kolmesta teknisestä rinnakkaisnäytteiden ja analysoitiin parittomia kaksisuuntaisella

t

-testi. Erot tietokokonaisuudet katsottiin merkitsevä p-arvot ≤0.05. Virhepalkit = ± SEM, ellei toisin ole mainittu.

tunnistaminen säänneltyjen reittejä tehtiin GSA menetelmällä, GAGE ​​[30], parannettu hyödyntää käytettävissä induktio-tukahduttaminen tietoja (paljon tietoa ja laskelmat katso File S2). Väylät edustivat luetteloita geenien (geenin sarjat) ladattavissa Molecular allekirjoitukset Database (MSigDB) 3,0 [31]. C2 kokoelma kuratoituja geenin sarjaa (kanoninen reittejä ja geenien ilmentymistä allekirjoitukset geneettisten ja kemiallisten häiriöiden) geenien symbolit tunnisteita. Gene set p-arvot korjattiin useita testaus arvioimalla vääriä löytö määrä ja merkitys asetettiin arvoon 1%.

Tulokset

E. faecalis

infektio aiheuttaa solunsisäisten ROS ja superoksidituotantoa

Muut ja olemme aiemmin osoittaneet, että hapoton gastriini KO hiiri oli bakteerien liikakasvun kanssa

enterokokit

jotka eivät normaalisti ole osa mahalaukun kasviston [ ,,,0],20]. Vaikka

enterokokkien

yleisesti ajatellaan olevan matalapatogeeniseksi, jatkuva liikakasvua hapoton hiirissä liittyy tulehdusvastetta ja lopulta nämä hiiret kehittävät mahasyövän [20], [32]. Luonnehtia patologisen prosessin sisällä mahan soluissa tutkimme, miten bakteerit vaikuttavat mahalaukun epiteelisolujen. Käyttämällä koettimia seuranta solunsisäisen ROS, olemme havainneet, että 30 minuuttia infektion stimuloi merkittävästi solunsisäisten ROS muodostumiseen (kuvio 1A). Koettimilla, jotka ovat spesifisiä superoksidituotannon osoitimme, että ROS koostui pääasiassa superoksidia MKN74 soluissa (kuvio 1A). Fluoresenssi-intensiteetti kvantifioitiin käyttäen LSM 510 ohjelmiston ja tilastollisesti merkittävä kasvu solunsisäisen ROS ja superoksidi infektoituneissa soluissa verrattuna terveille ohjaus soluihin havaittiin (kuvio 1 B). Emme löytäneet mitään todisteita siitä, että ehdotettu invaasio soluista bakteerit niin voimme päätellä, että solunsisäinen ROS oli tuottanut tartunnan solujen eikä sisäistetty

E. faecalis

(kuvio 1 C-D).

MKN74 infektoidut solut

E. faecalis

30 minuuttia MOI50. (A) edustaja fluoresenssimikroskooppiin kuva MKN74 värjättyjen solujen ROS havaitsemiseksi koettimet (vihreä) ja superoksidi havaitsemiseksi koettimet (oranssi) Scale viivoilla = 50 pm. (B) kvantifiointi fluoresenssin voimakkuus käyttäen LSM 510 ohjelmisto. Tilastollisesti merkittävä lisääntynyt solunsisäinen tuotanto ROS (p 0,01) ja superoksidi (p 0,02) infektoiduissa soluissa verrattuna terveille kontrollisoluihin ei havaittu. * Tarkoittaa merkitsevää eroa. (C) Fluoresenssi kuva osoittaa MKN74 solukalvon (punainen) ja

E. faecalis

(vihreä) 4 tunnin kuluttua infektion. Reunustavat kuvat osoittavat YZ ja XZ tasossa. (D) Split kuva C. Merkkejä bakteerien hyökkäystä solujen havaittiin.

Infektio vähentää mitokondrioiden toimintaa ja lisää oxphos riippumaton hapenkulutus

lähde ROS löytyi seuraavat bakteeri-infektio voi olla joko tuotettu solunulkoisia bakteereja [33] ja /tai tuotettu soluissa [34], [35]. Solunsisäinen ROS voidaan joko syntyy käytettäessä oxphos-riippuvaisten tai riippumattomalla tavalla. Tutkia ja myöhemmin luonnehtivat mahdollisen solunsisäisen ROS tuotanto liittyy

E. faecalis

infektio; mittasimme kuinka bakteeritartunta vaikuttaa mitokondrioiden hengitystä mittaamalla ATP liikevaihdon, hengitysteiden kapasiteetti ja oxphos riippumaton hapenkulutus (kuva 2). Sen varmistamiseksi, että tulokset heijastuvat hengitystä ja MKN74 solujen ainoastaan, kaikki bakteerit poistettiin ennen mittauksia. Ei ollut merkitsevää eroa ATP liikevaihdon ohjaus soluja kasvatettiin 4-24 tunnin ajan, kun taas merkittävä 2- ja 4-kertainen pieneneminen (p 0,001) ATP liikevaihdosta oli läsnä välillä ohjaus solujen ja infektoituja soluja inkuboitiin 8 ja 24 tuntia vastaavasti (kuvio 2A). Vastaava korrelaatio havaittiin hengitysteiden kapasiteettia, jos kapasiteettia infektoidut solut olivat myös merkittävästi 2- ja 4-kertainen aleneminen (p 0,01) verrattuna kontrollisoluihin, kun 8 ja 24 tuntia infektion (kuvio 2B). Oxphos riippumaton hapenkulutus kontrollisolujen oli muuttumattomina soluja kasvatettiin 4-24 tunnin ajan. Sitä vastoin oxphos riippumaton hapen kulutus infektoitujen solujen bakteerien kasvoi -50% koko hapenottokyvyn 4 tunnin kuluttua tartunnan tullut ensisijainen hapen talteenottolaitteet (p 0,001) (kuvio 2C). Tämä viittaa siihen, että

E. faecalis

vuorovaikutuksessa epiteelisolujen asiakkuutta ROS muodostumista ja hapen kulutusta muiden solunsisäisten entsyymisysteemeihin kuin oksidatiivinen fosforylaatio. Expression of NOX1-5 ja Duox1-2 tutkittiin mahalaukun solulinjassa; kuitenkin, ilme ei vaikuttanut infektio (taulukko S2).

MKN74 soluja inkuboitiin tai ilman

E. faecalis

4, 8 tai 24 tuntia. Bakteerit poistettiin ja hapenkulutuksen mitattiin käytettäessä XF24 Solunulkoisilla Flux Analyzer. (A) ATP liikevaihdon, (B) hengitysteiden kapasiteetti ja (C) oxphos-erillinen hapenkulutus määritettiin tekstissä kuvataan. ▪ = Ohjaus solut, ο =

E. faecalis

infektoiduissa soluissa. (N = 3-6, virhe palkit osoittavat S.D. ** ja *** tarkoittaa merkitsevää eroa p 0,01 ja p 0,001 vastaavasti).

E. faecalis

aiheuttama infektio mitokondriaalisen DNA epävakautta

Olemme aiemmin osoittaneet, että tartunta taudinaiheuttajien

H. pylori

kantojen aiheuttama mutaatiot mitokondrion genomissa ihmisen soluviljelmissä [36]. Koska infektio

E. faecalis

solunsisäisten ROS tarkastelimme jos se aiheutti myös genomista mtDNA epävakautta. Yleinen esiintyvyys mitokondrioiden D-silmukka-alue mutaatiotapahtumaa oli merkitsevästi korkeampi MKN74 soluviljelmissä tartunnan

E. faecalis

(45,5%) kuin ei-tartunnan ohjaus soluviljelmissä (23,0%; p 0,01) (kuva 3). Lisäksi infektoidut solut oli suurempi määrä siirtymiä (36,4%) kuin kontrolli-soluja (21,8%; p 0,05). Deleetiot (0% ohjaus /3,9% tartunnan), insertiot (1,1% ohjaus /2,6% tartunnan) ja transversioita (0% ohjaus /2,6% tartunnan), jälkimmäinen on tyypillisesti nähdään seurauksena ROS, havaittiin useammin tartunnan solut. Siten infektio

E. faecalis

indusoi mutaatioita mahalaukun soluissa (kuvio 3).

mutaatiot havaitaan mtdna D-silmukka-alueen infektion jälkeen. MKN74 solut infektoitiin

E. faecalis

MOI 10 5 päivää. Infected MKN74 soluviljelmissä oli huomattavasti suurempi määrä yhteensä mutaatioiden ja siirtyminen mutaatioita kuin ei-tartunnan saaneet ohjaus soluviljelmissä. * Merkitsee merkittävästi erilainen käsittelemättömien solujen p 0,05.

infektio aiheutti NFKB hallitsevat tulehdusreaktio ja ROS vastaus

kasvattavan biologista tietoa solu vasteita mahalaukun solujen

E. faecalis

infektio teimme mikrosiruanalyysi tutkii maailmanlaajuisia muutoksia geenien ilmentyminen soluissa tartunnan elinkelpoinen

E. faecalis

tai käsitelty

E. faecalis

lysaattia. Sen sijaan keskitytään ilmaisun yksittäisten geenien käytimme GSA [30] tunnistaa polkuja ja prosessien aktivoida tai inhiboida infektio. Keskittyminen sarjaa geenien sijaan yksittäisiä geenejä kasvaa kestävyys, herkkyys ja biologista merkitystä jopa kohtalaisen säänneltyjen sarjaa geenejä. Tämä saavutetaan lisäämällä signaali-kohina-suhde, jolloin on mahdollista tulkita vähäisiä muutoksia yksittäisten geenien [37]. GSA testattu 2403 geenin sarjaa ja johti 484 säännelty väyliä tilastollisesti merkitsevä joko live infektioiden ja /tai lysaatti ärsykkeitä (kuva S2). Keskittymällä niihin väyliä tilastollisesti merkitsevä live-infektioita, jotkut geenin sarjaa katsotaan parhaiten luonnehtivat olevassa tutkimuksessa manuaalisesti jaettiin kolmeen ryhmään (kuviot 4, 5 ja 6). Tutkitaan tulehdus ja ROS,

E. faecalis

infektio aiheutti merkittävän säätely ylöspäin useita reittejä immuunivasteisiin liittyvä, mukaan lukien klustereita kemokiinireseptoreita ja kemokiinin signalointi geenejä, geenit osallistuvat G-proteiiniin kytketyn reseptorin ligandin sitoutumisen, ja NFKB aktivoivat geenit (kuvio 4, ylempi kuusi geeni sarjaa). Lisäksi kaksi geeniä sarjaa, joka sisältää geenejä vastaa tulehdusreaktioita hapettunutta fosfolipidiä olivat vahvasti sääteli. Hapettunutta fosfolipidiä tuotetaan ROS ja toimivat tulehdusta tavalla [38], [39] (kuva 4, geeni asettaa seitsemän ja kahdeksan). Tukeminen läsnäolo ROS, geenin joukon 30 geenien tiedetään ilmentyvän vastauksena ROS on aktivoitu (kuvio 4, pohja geeniperimä). On tunnettua, että ROS ovat tärkeitä lipopolysakkaridi (LPS) -indusoituun tuotanto useita pro-inflammatoristen sytokiinien [40] kuitenkin, gram-positiiviset bakteerit, kuten

E. faecalis

eivät ilmaise LPS. Siksi tutkittiin, kuinka ilmentyminen yksittäisten koodaavien geenien proinflammatoristen sytokiinien ja kemokiinien oli suoritettu vasteena ei-LPS-stimuloitua infektion aikana 24 tunnin ja 5 päivää infektiot (taulukko 1). Lukuisat geenit osallistuvat NFKB tulehduksellinen polku olivat merkittävästi säädelty aikana

E. faecalis

infektio, mukaan lukien interleukiini-1β (IL-1SS), interleukiini-1-reseptoriin liittyvän kinaasin 2 (IRAK2), VEGF, IL-8, IL-23α, IL-11, ja tuumorinekroositekijä-α (TNF α), joista useimmat voidaan edelleen levittää NF-KB: n aktivoitumisen vasteena [41] – [44]. Näistä oli useita sytokiineja aikaisemmin tunnistettu

H. pylori

välitteisen infektioita, kuten IL-8 ja verisuonten endoteelin kasvutekijä (VEGF), jotka molemmat liittyvät angiogeneesiin ja edenneessä mahasyövässä, IL-1SS, joka on tehokas estäjä hapon eritystä, ja myös TNF-α, joka on säätelijänä solujen lisääntymistä, erilaistumista ja apoptoosia [43] – [45]. Lisäksi sytokiini-IL-23α, joka edistää kasvaimen esiintymistiheys ja kasvua [46] ja on erittäin tuotetaan

H. pylori

asuttivat limakalvon [47] oli säädelty yhdessä, IL-11, joka on perietaalisolun sytokiini, joka estää mahahapon eritystä, edistää atrofinen gastriitti ja mahalaukun kasvaimen kehittymisen [48], [49]. Muiden geenien havaittiin näyttämään korkea, ja huomattava ilmaisulliset tason infektion aikana oli IL-1α, IL-32, kasvuerilaistumistekijä 15 (GDF15) ja, kemokiini (C-C-motiivi) ligandin 22 (CCL22). Lisäksi, ylös-säätely superoksididismutaasi 2 (SOD2), joka muuntaa superoksidi vetyperoksidia, havaittiin. IL-8, interferoni säätelytekijänä 1 (IRF-1) ja TNFa todensi qRT-PCR (kuva 4 B).

(A) Osa GSA tuloksen. Osuudesta geenin asettaa huomattavasti rikastettu MKN74 infektoiduissa soluissa 24 tuntia, osajoukko geenin sarjaa manuaalisesti valittu yhdessä tulehdusvastetta ja vastaus ROS. Numerot kova Suluissa tehokas määrä geenien geeniperimä. Otsikko kunkin geeniperimä vastaa otsikon annetut MSigDB verkkosivuilla. Numerot värillisiä ruutuja mukautetaan p-arvot (q-arvot), musta osoittavat tilastollista merkittävyyttä 1% FDR. (B) Karakterisointi qRT-PCR selostukset koodaavat tärkeitä sytokiinien ja kemokiinien jälkeen

E. faecalis

infektio 24 tuntia (MOI50) ja 5 päivää (MOI10). * Merkitsee merkittävästi erilainen käsittelemättömien solujen p 0,05.

(A) Osa GSA tuloksen 24 tunnin kuluttua infektion. Gene sarjaa liittyy DNA-vaurioiden korjauksessa samalla kokoonpanolla kuin kuvio 4 A (B) karakterisointi selostukset koodaavan tärkeitä geenien MMR jälkeen

E. faecalis

infektio 24 tuntia (MOI50) ja 5 päivää (MOI10). * Merkitsee merkittävästi erilainen käsittelemättömien solujen p 0,05.

DNA-vaurion korjausta alaspäin säädellään aikana

E. faecalis

infektio

polku analyysi osoitti, että geenien ilmentymistä osallisena DNA-vaurioiden korjaus oli merkitsevästi alassäädetty verrattuna terveille soluviljelmien 24 tunnin kuluttua infektion (kuvio 5A). qRT-PCR vahvisti, että ilmaus useiden mismatch korjaus (MMR) geenien alassäädetty kuluttua sekä 24 tunnin ja 5 päivän

E. faecalis

infektion (kuvio 5, B). 24 h tartunnan saaneiden solujen PMS1 ja MSH6 oli merkitsevästi alassäädetty (4-kertainen ja 1,8 kertaiseksi; P 0,001). Merkittävä alas-säätely MSH2 (3-kertainen), MSH3 (1,9-kertainen), MSH6 (2-kertainen), ja PMS1 (3-kertainen) (p 0,05) (kuvio 5, B) soluissa havaittiin 5 päivää infektion. Ilmaisullisella taitettava muutoksista valittujen DNA-vaurioiden korjaus geenit tartunnan jälkeen on esitetty taulukossa S3. Nämä tulokset viittaavat siihen, että

E. faecalis

infektio alas-säätelee suuria DNA korjaukseen reittejä johtaa perimän epävakaisuuden samanlainen tartuntojen

H. pylori

[36], [50], [51].

Infektio

E. faecalis

estää solusyklin ohjaus ja kasvua MKN74 solujen

arvioimiseksi muutoksia solujen kasvun aiheuttama

E. faecalis

infektio, tutkimme vaikutus bakteerien ilmentymisen solusyklikontrollin geenien ja MKN74 solujen kasvua. Gene sarjaa käsittää solusyklikontrollin ja Checkpoint geenien alassäädetty 24 tunnin kuluttua infektion elävien bakteerien viittaa merkittävä hidastuminen soluproliferaatiota vaan myös lisääntynyt riski mutaatioiden uusia soluja (kuvio 6). Sitä vastoin näiden reittien oli säädelty infektoiduissa soluissa bakteeri-lysaatin viittaa siihen, että nämä solut olivat edelleen jakamalla 24 tunnin kuluttua (kuvio 6). Me seuraavaksi mitattiin solujen lisääntymistä 5 päivää ja havaitsi, että elävien bakteereiden aiheuttamia MKN74 soluproliferaation hidastaa tai pysäyttää kokonaan (kuvio 6 B).