Krooninen sairaus

tiivistelmä

Somaattiset mutaatiot on tärkeä rooli kasvaimen aloittamista ja etenemistä. Mutaatio asema kasvain voi ennustaa ennustetta ja ohjata kohdennettuja hoitoja. Valtaosa tekniikat tutkia onkogeenisen mutaatioiden vaativat korkea laatu ja määrä DNA: n tai ovat analyyttisesti haastava. Massaspektrometrialla perustuu mutaatio-analyysi on kuitenkin suhteellisen yksinkertainen ja korkean suoritustehon menetelmä soveltuu formaliinilla kiinnitetyt, parafiiniin upotetut (FFPE) kasvaimen materiaalia. Kohdennettu geenin paneeleja käyttämällä tätä tekniikkaa on kehitetty useiden syöpätyyppien. Nämä nykyiset syöpä hotspot paneelit eivät keskittyneet geenejä, jotka ovat tärkeimpiä naistentautien syöpiin. Tässä tutkimuksessa raportoimme suunnittelu ja validointi uusi, massaspektrometrialla pohjaisen paneelin nimenomaan gynekologisia maligniteetteja ja esittää taajuudet havaittu mutaatioita. Frekvenssi tietoja verkossa Luettelon Somaattiset mutaatiot Cancer, valitsimme 171 somaattisten hotspot mutaatioita 13 tärkeimmät geenejä gynekologisten syöpien, että

BRAF, CDKN2A, CTNNB1, FBXW7, FGFR2, FGFR3, FOXL2, HRAS, KRAS kansallisten sääntelyviranomaisten, PIK3CA, PPP2R1A

ja

PTEN

. Kaikkiaan 546 kasvaimia (205 kohdunkaulan, 227 kohdun limakalvon, 89 munasarja-, ja 25 emättimen karsinoomia) käytettiin testaus ja validointi meidän paneeli, ja tutkimaan esiintyvyyttä ja taajuuksien somaattisten mutaatioiden tämäntyyppisiä syöpä. Tulokset validoitu testaamalla päällekkäisiä näytteitä ja alleelispesifisillä qPCR. Paneeli esitetään tässä käyttämällä massaspektrometriaa näyttää olevan toistettavissa ja suuren läpimenon, ja on hyödyllinen in FFPE materiaalin alhaisen laadun ja määrän. Se antaa uusia mahdollisuuksia opiskella lukuisia gynekologisten kasvainnäytteestä päivittäisessä käytännössä, ja voisi olla hyödyllistä ohjatuissa terapiassa valinnassa.

Citation: Spaans VM, Trietsch MD, Crobach S, Stelloo E, Kremer D, Osse EM , et ai. (2014) suunnittelu suuren tuotantotehon somaattinen mutaatio Profilointi Panel Erityisesti varten gynekologinen Syövät. PLoS ONE 9 (3): e93451. doi: 10,1371 /journal.pone.0093451

Toimittaja: Javier S. Castresana, Navarran yliopisto, Espanja

vastaanotettu: 18 joulukuu 2013; Hyväksytty: 04 maaliskuu 2014; Julkaistu: 26 maaliskuu 2014

Copyright: © 2014 Spaans et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Kirjoittajat ei ole tukea tai rahoitusta raportoida.

Kilpailevat edut: Susanne Muller toimii tiedemies Sequenom, Hampuri Saksa. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen PLoS One politiikkaa jakaa tietoja ja materiaaleja.

Johdanto

Syöpä genomien kuljettaa somaattisista mutaatioista, ja mutaatio spektri vaihtelee kasvaintyyppi ja alatyyppi [1] [2]. Arvioiminen laajan keskeisten syövän geenimutaatioita monissa eri syövissä on potentiaalia tunnistamiseksi kliinisesti merkittäviä mutaatioita. Tutkimukset melanooma, keuhkosyöpä, paksusuolen ja peräsuolen, ja rintasyövät ovat osoittaneet, että somaattisen mutaation asemaa voidaan käyttää ennustamaan ennusteen ja ohjata kasvain-spesifistä hoitoa strategioita [3] – [6]. Gynekologinen maligniteetit edustavat 15-20% kaikista uusista syöpätapauksista naisilla maailmanlaajuisesti, ja numerot edelleen lisäämään [7], mutta karsinogeneesi gynekologisten maligniteettien on monipuolinen ja rooli somaattisista mutaatioista ei ole vielä täysin selvitetty [1].

viime vuosikymmenen aikana, somaattiset mutaatiot ja niiden rooli täsmähoitoihin on tutkittu gynekologisia maligniteetteja mutta ei vielä samassa määrin kuin muiden syöpien, kuten rinta- ja paksusuolen syöpä. Mutaatio profilointi gynekologisten syöpäsairaus, voi tunnistaa uusia lääkekohteita ja auttaa ennustamaan potilaan ennustetta ja kasvaimen hoitovasteen. Tutkimus on paljastanut päällekkäisiä geneettisiä muutoksia sekä vastaavia vaikuttaa signalointireittien eri tyyppisiä gynekologiset kasvaimet [8] – [14].

Kun tutkitaan paljon potilaan materiaalista, kohtaamme kahdenlaisia ​​ongelmia: tekninen soveltuvuus ja kasvainspesifisyys. Nykyään vain pieni määrä geenejä seulotaan kliinisessä käytännössä. On odotettavissa, että tämä määrä kasvaa merkittävästi lähitulevaisuudessa. Siksi nopea ja luotettava tapa havaita mutaatioita tarvitaan. Tämä tekniikka on sopiva DNA: ta formaliinilla parafiiniin upotettuja (FFPE) kudos, joka on usein heikkolaatuista, tai pienistä kudosnäytteistä, joka on alhainen määrä. Matrix laserdesorptio /ionisaatio-of-lennon (MALDI-TOF) on osoittautunut täyttää kaikki nämä kriteerit [15] – [17].

Kuten kasvainspesifisyys nykyään useita onkogeeni paneelit perustuvat eri tekniikat ovat (kaupallisesti) saatavissa. Nämä paneelit ovat onnistuneesti käytetty tutkittaessa suuria määriä kasvain näytteet, jotta voidaan vetää maisemiin somaattisista mutaatioista, jotka luonnehtivat kasvaintyypeille [18] – [22]. Valikoima geenien ja mutaatioiden merkitystä kasvaimen alatyyppejä on menestyksekkäästi johtanut suunnittelun kasvaimen erityisten paneelien [15], [16], [23]. Toistaiseksi ei ole olemassa paneelit saatavilla, jotka on suunniteltu kohdistamaan gynekologiset kasvaimet. Siksi pyrimme kehittämään korkean suoritustehon mutaatio paneeli määritelty gynekologinen syöpäsairauksia.

meta-analyysi COSMIC (Luettelon Somaattiset mutaatiot Cancer) online-tietokanta [24], suoritettiin suunnitella MALDI -TOF-pohjainen, suurikapasiteettisten mutaatio paneeli, joka kattaa somaattisia mutaatioita 13 geenejä, jotka useimmin raportoitu olevan mukana gynekologisia maligniteetteja. Testasimme ja validoitu tämä paneeli joukko 546 kohdunkaulan, kohdun limakalvon, munasarjojen ja emättimen karsinooma näytteitä. Tässä esitämme suunnittelu gynekologinen syöpä erityinen paneeli ja taajuudet somaattisten mutaatioiden tunnistaa käyttämällä sitä.

Materiaalit ja menetelmät

Kaikki ihmisen kudosnäytteitä Tässä tutkimuksessa käytettiin mukainen lääketieteellinen eettiset ohjeet kuvattu Code asianmukaisesta Toissijainen käyttö Human Tissue perustettu hollantilainen Federation of Medical Sciences (www.federa.org, Englanti käännös koodi löytyy here:

https://www.federa.org/sites/default/files/digital_version_first_part_code_of_conduct_in_uk_2011_12092012.pdf).

Patients saavat tietoa toissijainen käyttö kudosta, joka otetaan näyte diagnostiseen käyttöön. Ne voivat aktiivisesti vastustaa toissijainen käyttö. Niinpä näiden ohjeiden, kaikki ihmisen materiaalia käytettiin tässä tutkimuksessa on anonymisoidaan. Tämän vuoksi nimettömäksi menettelyn, retrospektiivinen tutkimus ei edellytä eettinen hyväksyntä Institutional Review Board ja yksittäisten potilaiden lupaa ei tarvita.

Panel suunnittelu

Ensinnäkin PubMed ja COSMIC [24] haut tehtiin valita geenien ja mutaatioiden sisällytettäväksi gynekologisen-erityinen mutaatio paneeli. valinta perustui onko mutaatio toistuvasti todettu mutatoitunut gynekologisia maligniteetteja. Toiseksi, jotta voidaan kattaa suuri osa raportoiduista yhdistelmälle geeni, yleisimmät mutaatiot valittiin saavan kohtuullisen gynekologinen -tissue-erityisiä kattavuus, koska vain hotspot mutaatiot olivat sopivia analysoitavaksi MALDI-TOF-tekniikalla. Meidän tavoitteena on valita geenejä, joissa vähintään yksi tutkittu gynekologisen syövän tyypit (esim emättimen, kohdunkaulan, kohdun limakalvon tai munasarjasyöpä), vähintään 30% kaikista raportoiduista mutaatioita tapahtui alle 10 eri sivustoja geenissä.

perustaminen gynekologisen erityinen ”hotspot” geeni paneeli – GynCarta 1.0

Consulting PubMed ja COSMIC tietokantoja osoittivat selkeästi lomitus kärkikymmenikköön geenien mutatoitunut kohdunkaulan, kohdun limakalvon ja munasarjasyövän. Harvat somaattinen mutaatio tutkimukset on suoritettu ulkosynnytinsyövän ja siksi tämän kasvaintyyppi olemme luottaneet taajuuksilla samankaltaisissa kasvaintyypeissä (esim levyepiteelikarsinooma ihon muille sivustoille, ja levyepiteelisyöpä pään ja kaulan). Yleisimmin muuntunut geenien tapasimme kriteereillä valittiin paneeliin. Ensimmäinen paneeli me nimetty ”GynCarta 1.0” (Sequenom, Hampuri, Saksa) koostui 89 määritykset (12 kanavanippua) havaitsemiseksi 154 mutaatioita 12 geeniä, jotka tapasimme kriteereillä:

BRAF, CDKN2A, CTNNB1, FBXW7, FGFR2, FGFR3, FOXL2, HRAS, KRAS, sääntelyviranomaisten, PIK3CA

, ja

PTEN

.

Pitoisuus suunnittelu

MySequenom.com verkossa määritys suunnittelun työkaluja käytettiin suunnittelemaan somaattisten mutaation havaitseminen määrityksiä. Enintään multiplex taso 12 määritysten kuoppaa kohti käytettiin. Jos mahdollista, mutantti alleeli laajennuksen piikit suunniteltu ensimmäinen havaittu alleeli huiput ja villityypin laajennus huiput kuin viimeinen havaittu alleeli huiput vähentää vaaraa väärien positiivisten suolasta additiotuotteiden. Kaikki määritykset validoitu villityypin DNA, negatiivisten kontrollien ja valittu tunnettuja positiivisia mutaatio näytteitä.

Mutaatio tunnistus

Mutaatio tunnistus suoritettiin Leidenin yliopiston Medical Center noudattamalla valmistajan protokollan (Sequenom, Hampuri , Saksa) kuten aiemmin on kuvattu [29]. Lyhyesti, villityypin ja mutantti-DNA monistettiin multiplex PCR. Katkaravun alkalinen fosfataasi hoito inaktivoitu ylijäämää nukleotidin. Alukepidennystuotteen reaktio (iPLEX Pro) suoritettiin massa-modifioitu terminaattori nukleotideja, ja tuote täpliksi SpectroCHIP (Sequenom, Hampuri, Saksa). Mutant ja villityypin alleelit olivat sitten syrjiä käyttäen MALDI-TOF-massaspektrometrialla.

Tietojen analysointi

Data analysoitiin MassARRAY typer Analyser ohjelmisto (typer 4.0.22, Sequenom, Hampuri, Saksa). Mutaatiot havaittiin vähintään 5%: iin mutanttialleelin huippu. Kolme tutkijat sokeita kasvaimen tunnistamiseen manuaalisesti tarkistetaan tuotos, ja yksimielisyyteen määritys päästiin. Tilastolliset analyysit tehtiin IBM SPSS tilastojen tietomuokkaaja versio 20.0. Riippumaton Opiskelijat

t

-testi käytettiin vertaamaan lähtötason muuttujia ja Fisherin testiä käytettiin analysoimaan kategorinen ja normaalisti jakautunut numerotietoja.

P

-arvot ≤0.05, mikä vastaa 95%: n luottamusvälit, katsottiin tilastollisesti merkittäviksi. Kaikki testit kaksisuuntaisia.

Näytteitä

Ensinnäkin koulutus joukko 51 FFPE näytteistä (26 kohdunkaulan, 17 endometriumin, 6 munasarja- ja 2 ulkosynnytinsyövän näytettä) käytettiin tehokkuuden testaamiseen suunnitellun paneelin. Sen jälkeen pieniä teknisiä muutoksia ja parannuksia paneelin, potilaiden määrä kunkin kudos- tyypin jatkettiin.

Kaikkiaan DNA 548 kasvain näytteitä kohdunkaulan (

N =

209), kohdun limakalvon (

N =

227), munasarjojen (

N =

89), ja emättimen (

N =

25) kohdunkaulan potilaiden eristettiin. Kaksi kohdunkaulan syöpä näytettä epäonnistui kaikille massaspektrometriaa määritykset ja jätettiin muihin analyyseihin. Seuraavat perustason parametrit kerättiin: ikä, FIGO (International Federation of Naistenklinikka ja synnytysten) vaihe, histopatologinen diagnoosi, kasvaimen tarvittaessa ja ihmisen papilloomaviruksen (HPV) positiivisuuden ja kirjoita kohdunkaulan ja emättimen kasvaimet (taulukko 1).

DNA eristys

DNA eristettiin FFPE kudoksesta lohkoissa 505 näytettä ja tuore (FF) kudosta 43 munasarjojen karsinoomat. Kolmesta viiteen halkaisijaltaan 0,6 mm kudoksen ytimet muuttuvan pituuden otettiin FFPE korttelin päässä valitun alueen, joka käsittää ~ 70% kasvainsoluja. 34 näytettä, kasvaimen solut hajanaisesti jakautunut, ja siksi mikro-leikkely suoritettiin 10 hematoksyliinillä-värjätty 10 um: n osia, jotta saadaan suuri osa kasvainsolujen. DNA eristäminen suoritettiin edellä kuvatulla tavalla [25] sen jälkeen DNA: n puhdistus (NucleoSpin Tissue Kit, Machery-Nagel, Saksa) tai suoritettiin täysin automatisoitu käyttäen Kudosten valmistelu System (Siemens Healthcare Diagnostics, NY, USA) [28].

DNA laatu

DNA kaikkien näytteiden eristettiin ja testattiin laatua; 493 (90%) näytteistä teki ≥1 DNA laatua käyttämällä PCR, ja tämä pidettiin riittävänä. Kaksi näytettä, sekä kohdunkaulan karsinoomien DNA laatu pisteet 0, epäonnistunut kaikissa määrityksissä, jolloin onnistumisprosentti 99,99%. Molemmat näytteet jätettiin pois lisäanalyysistä. Yleensä näytteet heikkolaatuinen DNA olivat todennäköisesti epäonnistua joissakin testeissä, mutta 27 pois 48 näytettä (56%) ja DNA laatupisteet 0 analysoitiin onnistuneesti kaikissa määrityksissä ja 40 ulos 48 (83%) alhainen laatu analysoitiin menestyksekkäästi yli 90%: n määrityksissä. Prosenttiosuus onnistuneesti analysoiduista näytteistä ei eronnut merkitsevästi FFPE ja Tuorenäytteissä. Tämä vahvistaa sen, että MALDI-TOF-mutaation havaitseminen menetelmä on erittäin sopiva analyysi laadultaan huonompi, FFPE-uutettua DNA: ta.

Validation

Yhteensä 546 kasvainnäytteet mukana tässä tutkimuksessa. Arvioida määrityksen toistettavuus, 57 (10%) testattiin kahtena kappaleena ja toinen 26 (5%) kolmena kappaleena. Alun perin havaitut mutaatiot näistä näytteistä 95% (40/42) vahvistettiin kahtena ja 97% (30/31) vahvistettiin kolmena kappaleena. Non-malli (

N

= 4) ja villin tyypin valkosolujen DNA (

N

= 2) kontrollia sisällytettiin kuhunkin multiplex saada negatiivisia ja villityypin MALDI-TOF-spektri. Lisäksi varten random30% (163 näytettä),

KRAS

ja

PIK3CA

mutaatioita validoitiin käyttäen alleelispesifistä qPCR kuten aiemmin on kuvattu [26] 7 mutaatio variantteja

KRAS

(p.G12C, p.G12R, p.G12S, p.G12V, p.G12A, p.G12D, p.G13D) ja 3 mutaation variantteja

PIK3CA

(p.E542K, s. E545K, p.H1047R), ja konkordanssin oli 99,4% saavutettiin. (Kuvio 1) GynCarta paneeli havaittu enemmän mutaatioita kuin alleelispesifisten qPCR teki. Tämä voitaisiin selittää sillä, että massaspektrometrialla pystyy havaitsemaan Mutanttialleelit alemman taajuuden (alas 5%) kuin alleeli-spesifinen PCR: llä on (alas 20%). Se, että emme löytäneet mutaatiot villityypin kontrolli-DNA tai jossakin H

2O negatiiviset kontrollit vahvistaa uskoa siihen, että nämä ylimääräiset mutaatiot ovat totta mutaatioita sijasta vääriä positiivisia.

välistä yhdenmukaisuutta MALDI-TOF mutaatio genotyypityksen (GynCarta, Sequenom, Hampuri, Saksa) ja alleelispesifiset qPCR 3

PIK3CA

ja 7

KRAS

mutaatioita määritettiin 164 (30% kokonaismäärästä kohortti 546 karsinoomien) näytteiden tulosten validoinnissa. Concordance laskettiin kaikille villityypin-villityypin ottelut (1546 yhteensä) ja kaikki mutaatio-mutaatio ottelut (45 yhteensä) kaikissa reaktioissa (164 * 10, 1640 yhteensä). Epäonnistui vastineita ole jätetty huomioimatta, koska vertailu ei ollut mahdollista (4 * 3

PIK3CA

ja 4 * 7

KRAS

; 40 yhteensä). Tämä johti konkordanssin (1546 + 45) /(1640-40) = 0,994. WT = Villityypin; MUT = mutantti.

parantaminen paneeli ja luoda GynCarta 2,0

Kun ensimmäinen mutaatiostatuksesta dataa GynCarta 1,0 ja kirjallisuusraportteja uusien onkogeenisten mutaatioiden pystyimme parantamaan GynCarta 1.0 paneeli poistamalla määrityksissä mutaatioita, joita ei ole havaittu (

CDKN2A

D108Y, D108XA, Y108XC;

FGFR3

Y373C, A391E, K650Q, K650E, K650T, K650M, S371C;

KRAS

G13S ja

sääntelyviranomaisten

G13V, G13A, G13D, G13C, G13R, G13S) ja lisäämällä 10 uutta hotspot mutaatioita jo mukana geenejä. Näin kattavuus

FGFR2

ja

PIK3CA

nostettiin 59%: sta 71% ja 72%: sta 76%: iin. Lisäksi määrityksiä, jotka olivat osoittaneet olevan vaikea tulkita, koska pieni artefakti huiput olivat parantuneet. Aikana testauksen ja validoinnin aikana,

PPP2R1A

, uusi geeni, oli syntynyt kirjallisuudesta [27] – [29]. Yhdeksän mutaatiot Tämän geenin lisättiin myös paneeliin, mikä luo ”GynCarta version 2.0”. Täydellinen yleiskatsaus mutaatiot sisältyvät GynCarta 2.0 mutaatio paneeli on esitetty taulukossa 2, jossa lisätty määrityksissä luettelossa lihavoituna. Analyysit varten GynCarta 2,0 järjestettiin siten, että yhteensä 13 kanavanipun voitaisiin käyttää analysoida koko paneeli, keskittämällä uudet määritykset 4 kanavanippua. Nämä 4 kanavanippua käytettiin analysoimaan 497 näytteet vahvistuksen asetettu.

Tulokset

Mutaatiot tunnistettiin käyttämällä GynCarta 1.0 ja 2.0

Mutaatio genotyypityksen käyttäen GynCarta 1.0 paljastui 395 mutaatioita 273 (50%) näytteistä. Eniten mutaatiot havaittiin kohdun limakalvon karsinoomat (177 näytettä (64%)), jota seuraa munasarjojen karsinoomat (33 näytettä (37%)), kohdunkaulan karsinoomat (67 näytettä (33%)), ja emättimen karsinoomat (5 näytettä (20% )).

PIK3CA

mutatoitiin useimmin (122 näytettä), jonka jälkeen

PTEN

(97 näytettä) ja

KRAS

(64 näytettä). Ei mutaatioita löydettiin

BRAF

ja

FOXL2

.

Mutaatio genotyypitys käyttämällä GynCarta 2,0 havaitsimme ylimääräinen 36 mutaatiot: 4

FGFR2

ja 5

PIK3CA

.

PPP2R1A

mutaatioita havaittiin 27 näytettä (7 kohdunkaulan, 18 endometriumin, 2 munasarja- ja 0 emättimen näytettä).

Koska paneeli version 1.0 ja 2.0 oli joitakin päällekkäisiä määrityksissä, pystyimme vertailemaan tulokset sekä paneelit. Emme havainneet mitään poikkeavia mutaatio puheluja, mutta pystyimme analysoimaan määrityksiä, joita oli vaikea tulkita GynCarta 1,0 koska näissä määrityksissä oli parantunut GynCarta 2.0. Olemme myös saaneet onnistunut lähtö 3 näytettä, jotka oli epäonnistunut GynCarta 1.0. Mutaatio taajuudet Kunkin lokuksen on koottu taulukkoon 3. mutaatio spektri visualisoidaan kuvassa 2.

kirjo ja taajuudet mutaatioiden tunnistaa käyttäen MALDI-TOF in 546 gynekologiset karsinoomia. Mutaatio spektri on esitetty (ylhäältä alas) kohdunkaulan (

N

= 205), kohdun limakalvon (

N

= 227), munasarjojen (

N

= 89) , ja emättimen karsinoomat (

N

= 25). Vasemmalta oikealle,

N

on näytteiden määrä kanssa mutaatio,% on prosenttiosuus mutatoitunut näytteitä kohortin, ja pylväät edustavat prosenttiluvut graafisesti: sininen, 4 mutaatiot näytettä kohti (

N

= 6); punainen, 3 mutaatiota per näyte (

N =

29); vihreä, 2 mutaatiot näytettä kohti (

N =

65); ja keltainen, 1 mutaatio per näyte (

N =

189).

havaittu mutaatio taajuudet olivat verrattuna ennustettu määrä mutaatioita perustuu raportoitu yleisyys COSMIC tietokanta [23] ja joka on korjattu paneelin kattavuutta (taulukko 4).

PIK3CA

mutaatioita havaittiin kaksi kertaa niin usein kuin ennustettiin kohdunkaulan syövän (

N

= 23 ennusti ja

N =

51 havaittu) ja kohdun limakalvon syöpä (

N

= 32 ennusti ja

N =

71 havaittu).

PTEN

mutaatioita havaittiin myös useammin kohdun limakalvon syöpään kuin ennustettu (

N =

35 ennusti ja

N =

104 havaittu). Ei kuitenkaan

PTEN

mutaatioita havaittiin ulkosynnytinsyövän vaikka

N =

8 mutaatioita ennustettiin [19].

Lisäksi ei

BRAF

tai

FOXL2

mutaatioita havaittiin tässä kohortin huolimatta suuri kattavuus sekä geenien paneelin. Tämä voi selittyä sillä, että

FOXL2

liittyy vahvasti follikkeliepiteelisolujen on kasvaimia munasarjoissa [30], alatyyppi munasarjasyövän joka jätettiin Tutkimuksemme kohortissa.

GynCarta 2.0 voidaan käyttää erottamaan kasvaintyypeissä

visuaalinen kuva yhteenveto mutaatio taajuudet eri kasvaintyypeissä näkyy kuvassa 2. Kuten kuvassa 2, gynekologiset kasvaimet osoittavat huomattavia päällekkäisyyksiä somaattisista mutaatioista, vaikka kudosspesifisiä profiilien voidaan myös ymmärtää.

endometriumin syövät on korkein mutaation taajuus, jossa 78% näytteistä, joissa on vähintään yksi mutaatio. Ennustetusti, useimmin mutatoitunut geenien gynekologiset syövät ovat geenit Pakt /mTOR-reitin, mutta kuitenkin tämän reitin, mutaatioprosessiin taajuudet vaihtelevat kasvaintyypeille. Munasarjasyöpä,

KRAS

on useimmin mutatoitunut geeni (18%), kun taas

PIK3CA

vaikuttavat eniten kohdunkaulan syöpä (24%) ja

PTEN

endometriumin syöpä (39%). Vaikka numerot vulvar karsinoomat mukana ovat pieniä, ulkosynnytinsyövän näyttää olevan erilainen mutaatiotapahtumaa spektrin verrattuna muihin gynekologisia maligniteetteja kanssa

CDKN2A

(12%) ja

HRAS

(8%) useimmissa vaikuttaa usein.

mielenkiintoinen ero voidaan havaita, kun verrataan

PIK3CA

jakautuminen kohdunkaulan syöpiä ja muissa elimissä. Endometriumin (ja munasarjasyöpä),

PIK3CA

mutaatiot ovat useimmiten siitä kuormittajat sijaitsevat eksonin 9 ja eksonin 20, jossa on tasainen jakautuminen näiden eksonien (33% ja 45%). Kohdunkaulan syövän kuitenkin mutaatioita lähes yksinomaan esiintyä lokusten eksonin 9 (47 joukosta 50 (94%)

PIK3CA

mutaatioita). Tämä selvä ero (

p

0,0001) voidaan käyttää kliinisessä käytössä, kun erottaa ensisijainen kohdunkaulan syövän ensisijainen kohdun limakalvon syöpä.

Keskustelu

kysyntä yksilöllinen syöpä hoito on lisääntynyt viime vuosina. Uusi genotyypitys menetelmät mahdollistavat kasvaimia ominaista perustuu niiden genomista profiilit, joka on paljastanut uusia tavoitteita kasvain-erityistä hoitoa, jos oivalluksia kasvaimen vaste kemo- ja sädehoidot, ja auttoi ennustaa potilaiden hoitotuloksiin [3] – [6], [ ,,,0],9], [12], [14]. Gynekologinen maligniteetit osuus 15-20% kaikista naisten kasvaimista maailmanlaajuisesti [7]. Kliinisiä seurauksia somaattisten mutaatioiden eri gynekologisen pahanlaatuisia kasvaimia ei ole vielä täysin ymmärretty. Esillä olevassa tutkimuksessa olemme suunnitelleet paneeli, joka on erittäin spesifinen laajan gynekologisten syöpien, jotta tutkittiin kasvaimeen tietyn mutaation spektri 162 mutaatioita 13 geenejä. Käyttämällä tätä paneeli, huomasimme, että tässä sarjassa somaattisista mutaatioista oli läsnä 36% kaikista kohdunkaulan karsinoomien, 78% kohdun limakalvon karsinoomat, 37% munasarjojen karsinoomien ja 20%: ulkosynnyttimien karsinoomien.

somaattinen mutaatio spektrit tutkittiin aiemmin gynekologisten syöpien myös käyttäen MALDI-TOF [17], [18], [22], [31] – [33]. Kuitenkin suurin osa näistä tutkimuksista käytettiin yleisiä syöpään geeni paneelit perustuvat raportoituun taajuudet kaikissa kiinteitä kasvaimia tai käyttää olemassa olevia paneeleja, jotka on suunniteltu yleiskäyttöön onkologian [17], [22], [31] – [33]. Nämä ennestään, kaupallisesti saatavissa paneeleja ei oikaista alaan gynekologisia onkologian, jossa haitta sisältävän geenejä, jotka eivät ole osallisena gynekologisten syöpien, kuten

FLT3

ja

KIT

, tai jättämällä geenejä, jotka ovat osoitettu liittyvän suhteellisen yleisiä gynekologinen syöpä, kuten

PIK3CA

. Näin ollen, olemme luoneet MALDI-TOF-pohjainen mutaatio paneelin erityisesti suunniteltu tunnistamaan erilaisia ​​yleisimmät hotspot mutaatioita, joita on raportoitu eri gynekologiset kasvaimet. Vastaavia mutaatio paneelit on suunniteltu erityisesti melanoomien, paksusuolen karsinoomat ja ei-pienisoluinen keuhkosyöpä [15], [16], [20]. Käyttämällä gynekologinen erityinen paneeli, olemme tutkineet merkitystä vain mutaatioita, kuten esimerkiksi

PIK3CA

ja

PPP2R1A

, joita ei ole sisällytetty yleisesti paneelien kuten OncoCarta (Sequenom, Hampuri, Saksa) ja parempi ja tarkempi kattavuutta (esim

CTNNB1

). Tämän seurauksena on raportoitu taajuudet geenin osallistuminen voi vaihdella huomattavasti. Esimerkiksi meidän sarjassa kohdun limakalvon syöpä,

KRAS

mutaatioaste 17% havaittiin. Tämä on toisin kuin tutkimuksessa Cote et ai [32], että käytetään yleistä onkopsykologista paneeli, raportoi

KRAS

mutaatio oli ainoastaan ​​1% endometriumin syöpää. Muista tutkimuksista käyttäen erilaisia ​​tekniikoita, on tunnettua, että

KRAS

on mutatoitunut 15-20% kaikista kohdun limakalvon syöpien [18], [34]. Tämä esimerkki osoittaa, että luotettavuus tutkimukset käyttäen MALDI-TOF lähestymistapaa vakavasti vaikuttaa valintaan ja laajuus kattavuus geenien sisällytetty paneelissa.

Tyydyttävä kattavuus geenien meidän paneelissa saavutettiin varten mutaatiot tutkittiin, ja mutaatio spektrit tässä tutkimuksessa ovat siis luotettava esitys mutaatio taajuuksien gynekologisten pahanlaatuisten geenejä, jotka valitaan tämän paneelin. Kuitenkin joitakin asiaan geenejä, kuten

TP53

ja

ARID1a

, [8], [13], [34] – [39] eivät olleet mukana meidän paneelissa, koska he eivät täyttää kriteeri on ”hotspot geeni”. Molemmat geenit on mutaatioita hajallaan laajalti koko geenin ja tämän vuoksi niitä ei sovellu MALDI-TOF lähestymistapaa. On joitakin lokuksen

TP53

ja

ARID1a

jotka useammin mutatoitunut; mutta nämä kattavat enintään 20% kaikista sen tiedossa mutaatioita. Sisältää joitakin näistä lokusten meidän paneelissa olisi aliarvioi todellisen mutaatiostatuksesta taajuus näiden geenien gynekologisia syöpiä. Heidän mutaatio taajuuksia voitaisiin tutkia paremmin muilla tunnistusmenetelmiä, kuten Sangerin sekvensointia tai seuraavan sukupolven sekvensointi (NGS).

Emme päättää sisällyttää 22 määrityksiä varten tuumorisuppressorigeeniä

PTEN

, jolloin tuloksena on 40% peitto, joita voidaan pitää optimaalisella käyttämällä tätä lähestymistapaa. Mutaatiofrekvenssi raportoitu tässä on siis todennäköisesti aliarvioivat todellinen somaattisen mutaatiostatuksesta taajuus

PTEN

. Lisäksi menetys PTEN voivat aiheuttaa myös muita molekyyli- muutokset, kuten LOH ja promoottorin hypermetylaatio [40]. Näin ollen, käyttämällä lisäksi muita menetelmiä, kuten immunohistokemiallisella on suositeltavaa arvioida todellisen tilan PTEN.

CDKN2A

ei ole todella hotspot mutatoitu geeni myös, mutta se lisättiin paneelin koska sen korkea ennustettu merkitystä ulkosynnytinsyövän, ja koska odotimme saavan kohtuullisen kattavuus geenin. Kasvaimet sisältyvät COSMIC tietokantaan usein näyttää täydellinen menetys, tai suuria deleetioita

CDKN2A

geeni, eräänlainen mutaatio, joka ei ole helposti havaittavissa MALDI-TOF-massaspektrometrialla. Koska

CDKN2A

mutaatioita okasolusyöpä ihon ilmoitetaan olevan useammin pistemutaatioiden kuin (iso) poistot, uskomme, että lisäämällä

CDKN2A

pistemutaatioita paneeliin voi antaa arvokasta tietoa, erityisesti ulkosynnytinsyövän. Vaikka luvut ovat hyvin alhaiset, tulokset tutkimuksen

CDKN2A

imutations vuonna emättimen ja peniksen okasolusyöpä vahvistaa tämän hypoteesin [41].

FBXW7

näyttää olevan pieni kattavuus paneeli, mutta tämä vaikuttaa siihen, että se on tutkittu ja todettu mutatoitunut verrattain pienen määrän gynekologiset kasvaimet. Kun otetaan huomioon suuri määrä saatavilla tietoja tutkimuksesta paksusuolensyöpä, odotettavissa kattavuus on noin 35%.

Uudet tekniikat, kuten seuraavan sukupolven sekvensointi kykenevät havaitsemaan mutaatioita useita geenejä ilman esikarsinnan ja voi näin ollen voittaa rajoituksiin liittyviä massaspektrometrialla lähestymistapaa. Jossa NGS, täydellinen kiinnostavia geenejä voidaan analysoida ja siksi kaikki mutaatiot löytyvät. Kuitenkin bioinformatiikan analyysi tuottama data NGS voi olla haastavaa ja on tällä hetkellä vielä kehitysvaiheessa. Lisäksi erotetaan toisistaan ​​ei-patogeeninen somaattisten variantteja ja patogeenisten mutaatiot voivat olla aikaa vievää ja monimutkaista [42]. Vertailun vuoksi MALDI-TOF data-analyysi on paljon yksinkertaisempaa, varsinkin kun analysoidaan mutaatioita, joiden tiedetään olevan kliinistä merkitystä. Paneeli esittelemme tässä kattaa yleisimmät mutaatiot gynekologisia syöpiä, muutamaa poikkeusta lukuun ottamatta. Mutaatio spektrit olemme havainneet ovat verrattavissa spektrit raportoitu NGS ja exome sekvensointi tutkimukset, jotka keskittyvät gynekologisiin syöpiin [8], [43], [44]. Näin ollen MALDI-TOF massaspektrometria on potentiaalia käytettäväksi kliinisessä ympäristössä, tunnistaa mutaation aseman asiaan geenien nopea ja luotettava tapa. Toinen selvä etu massaspektrometria perustuva mutaatio analyysi on joustavasti lisätä ja poistaa määritykset paneelista, kuten myös on esitetty tässä raportissa, joten uusia oivalluksia tai kliinisten vaatimuksia voidaan hyväksyä helposti.

somaattinen mutaatio maisema gynekologisia syöpiä tuottamat tutkimuksessa (kuva 2) ja julkisesti saatavilla mutaatio kirjastot osoittavat päällekkäisiä ja erottava mutaatio profiilien välillä gynekologisia kasvaimia. Mutaatiot PI3K /Akt-reitin ovat yleisiä ja päällekkäisyyttä, mutta jotkut erottaa mutaatiota tunnistettiin. Esimerkkinä on havainto, että

PIK3CA

eksoni 20 mutaatioita vain harvoin esiintyy kohdunkaulan syövän, kun taas ne ovat usein löydös kohdun limakalvon syöpiä. Tämä havainto saattaa olla hyötyä hoitopaikassa, kun on epävarmuutta kasvaimet ensisijainen alkuperä, erityisesti kohdunkaulan adenokarsinooman, jotka ovat HPV negatiivisia ja sijaitsee matalan kohdun segmentti kohtuun. Se osoittaa, että somaattisia mutaatiostatuksesta tiedot voivat olla hyödyllisiä luokituksessa kasvaimia [45].

Somaattiset mutaatiot profilointi voi myös paljastaa uusia oivalluksia kasvaintyypeille jotka eivät ole hyvin tunnettu vielä, kuten ulkosynnyttimien syöpä. Emättimen syöpä on harvinainen sairaus, joka voi syntyä HPV-riippuvaisen tai HPV-riippumaton polku. Karsinogeneesi HPV-riippumaton vulvan karsinoomien ei juuri tunneta. Esillä olevassa tutkimuksessa 25 vulvar karsinoomat (joista 19 HPV-syöpäkasvain) analysoitiin, ja yksi

PIK3CA

, 3

CDKN2A

, ja 2

HRAS

mutaatiot olivat havaittu HPV-negatiivinen karsinoomia. Mutaatioita havaittu missään 13 tutkitaan geenien 6 HPV-positiivisia kasvaimia. Mutaatio kirjo ulkosynnytinsyövän näyttää eri spektristä muiden gynekologisten syöpien, mutta näyttää yhtäläisyyksiä mutaatio kirjo okasolusyöpä n Pään ja kaulan [46], kasvain tyyppi, joka jakaa morfologisia ja etiologinen ominaisuuksien kanssa emättimen okasolusyöpä . Se, että ulkosynnytinsyövän ei ilmene Mullarian alkunsa rakenteissa, koska muut kolme kasvaintyypeissä tässä tutkimuksessa tehdä, voisi myös olla selitys erot spektrin, että olemme havainneet. Tulokset Tutkimuksemme nopea lisätutkimuksia roolien

HRAS

ja

CDKN2A

in ulkosynnytinsyövän.

Yhteenvetona suunnittelimme, validoitu ja käyttää uutta massaspektrometria -pohjainen mutaatio paneeli tunnistaa somaattisia mutaatioita suuren ikäluokan gynekologisten syöpäsairauksia. Olemme osoittaneet, että tämä uusi paneeli on toistettavissa, suurikapasiteettisten, ja sopii matalan laatu ja määrä DNA FFPE näytteistä. Tuloksemme tukevat mahdollisuudet somaattisen mutaation profiilien välineenä luokitella kasvaintyypeille sisällä gynekologinen ärsytystä. Lisäksi meidän tulokset osoittivat, että PI3K-Akt signalointireitin on näkyvimmin vaikuttaa gynekologisia maligniteetteja oikeuttaa lisätutkimukset

PI3K

/AKT /mTOR kohdistaminen hoitomuotojen gynekologisen onkologian.