Krooninen sairaus

tiivistelmä

Anti-HER2 hiiren monoklonaalinen vasta-aine 1E11 on vahva ja yhteisvaikutukset antituumorivaikutus HER2-yli-ilmentävät mahasyövän soluja käytetään yhdessä trastutsumabin. Olemme tällä hetkellä optimoitu tätä vasta-aine ihmisen terapeuttisten. Ensinnäkin, komplementaarisuuden määräävät alueet (CDR: t) hiiren vasta-aineen oksastettuna ihmisen ituradan immunoglobuliinin muuttuja geenejä. Eroa affiniteetti ja biologinen aktiivisuus välillä havaittiin kimeerisen 1E11 (ch1E11) ja humanisoitujen 1E11 (hz1E11). Seuraavaksi affiniteetin kypsyminen hz1E11 suoritettiin satunnaistaminen CDR-L3 ja H3 tähteet seuraa tiukat biopanning valinnan. Milder valinta paine suosi valinta monipuolisempi klooneja, kun taas suurempi valikoima tiukkuus johti lähentyminen panoroinnin lähtö pienempää määrää klooneja parantunut affiniteetti. Klooni 1A12 oli neljä aminohapposubstituutioita CDR-L3, ja osoitti 10-kertainen affiniteetin verrattuna kantaklooni ja lisääntynyt teho käytettäessä

in vitro

antiproliferatiivista aktiivisuustestin HER2-overepxressing mahasyövän solut. Klooni 1A12 esti kasvaimen kasvua NCI-N87 ksenograftimallia kanssa yhtä tehokas trastutsumabille yksin, ja yhdistelmä hoitoon 1A12 ja trastutsumabi kokonaan poistettu vakiintuneita kasvaimia. Nämä tulokset viittaavat siihen, että humanisoitu ja affiniteettimaturoitujen monoklonaalinen vasta-aine 1A12 on hyvin optimoitu molekyyli tulevaa terapeuttista kehitystä vastaan ​​HER2-positiivisia kasvaimia.

Citation: Ko BK, Choi S, Cui LG, Lee YH, Hwang IS, Kim KT, et ai. (2015) affiniteettikypsyminen Monoklonaalisen vasta-aineen 1E11 täsmähankinnoin Satunnaistamismenettelyt CDR3 alueiden optimoi terapeuttinen vasta-Targeting HER2-positiivinen mahalaukun syövän. PLoS ONE 10 (7): e0134600. doi: 10,1371 /journal.pone.0134600

Editor: Mitchell Ho, National Cancer Institute, NIH, Yhdysvallat |

vastaanotettu: 14 huhtikuu 2015; Hyväksytty: 12 heinäkuu 2015; Julkaistu: 30 heinäkuu 2015

Copyright: © 2015 Ko et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot kuuluvat paperin ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat AbClon Inc., ja National Research Foundation of Korea (NRF) myöntää HS lääke- Bioconvergence Research Center (NRF-2013M3A6A4044991) . Kaupallinen rahoittaja (AbClon Inc.) tukenut muodossa palkkojen tekijöille (BKK, SC, LGC, YHL, ISH, KTK, ja JSL), mutta ei ollut mitään ylimääräistä roolia tutkimuksen suunnittelu, tietojen keruu ja analysointi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen. Erityinen roolit nämä kirjoittajat ovat muotoutuneet ”kirjoittaja maksujen osiossa.

Kilpailevat edut: BKK, SC, LGC, YHL, ISH, KTK, ja JSL ovat kaikki työskentelevät AbClon Inc. ja voi omistaa sen varastossa. HS on maksettu konsultoinnista AbClon Inc. omistaa myös sen varastosta. Abclon harjoittaa patentit ja tuotekehitys yhdisteisiin, jotka on mainittu tässä asiakirjassa. BKK, SC, LGC, YHL, ISH, KTK, ja JSL kaikki tällä hetkellä käyttämät kaupalliset rahoittaja Tutkimuksen AbClon Inc. ja voi omistaa sen varastosta. HS on parhaillaan maksetaan konsultoinnista AbClon Inc. omistaa myös sen varastosta. AbClon on rekisteröity patenttia Koreassa (KR10-1453462, Antibodies kykenevät sitoutumaan spesifisesti HER2) ja jätti PCT (PCT /KR2014 /004317, spesifisesti sitoutuva vasta HER2), jossa BKK, YHL, ISH, KTK, ja JSL on lueteltu keksijät. AbClon jatkaa myös tuotekehitys on humanisoitu, affiniteetti-kypsytetty vasta-aineita, jotka on mainittu tässä asiakirjassa. Nämä eivät muuta tekijöiden sitoutumista kaikkiin PLoS One politiikkaa jakaa tietoja ja materiaaleja.

Johdanto

monoklonaalisia vasta-aineita ovat valtavirtaa hoitoja onkologian ja autoimmuunisairauksien, ja niiden odotetaan esittävän tärkeitä rooleja tulevaisuudessa taudin hoitoon [1, 2]. Yli 30 rekombinanttivasta-aineita on tällä hetkellä hyväksytty Yhdysvaltain Food and Drug Administration, joista noin puolet on syöpälääkkeen vasta-aineita. Mahalaukun syöpä on yksi yleisimmistä syövistä, ja se on kolmas johtava syöpäkuolemien syy maailmanlaajuisesti [3]. Mahasyövän, yliekspressio epidermaalisen kasvutekijän reseptorin (EGFR), ihmisen epidermaalisen kasvutekijän reseptoria 2 (HER2), ja HER3 korreloi huonon ennusteen [4, 5]. Äskettäin HER2 kohdistaminen monoklonaalinen vasta-aine trastutsumabi hyväksyttiin hoitoon HER2-positiivisten metastasoitunut maha- ja gastroesofageaalinen risteykseen syöpä perustuu tuloksiin Trastutsumabi kemoterapiaan HER2-positiiviset edennyt mahasyöpä (TOGA) kliininen tutkimus [6].

Erityisiä yhdistelmiä keskenään ei-kilpailevia vasta kohdistuvat saman reseptorin lisäys antituumorivaikutuksen

in vitro

ja

in vivo

. Yhdistelmä HER2 kohdistaminen vasta trastutsumabi ja pertuzumab, osoittaa lisääntynyt teho HER2-yliekspressoivassa rintasyöpiä [7]. Edut pertuzumab ja trastutsumabi yhdistelmä on edelleen osoitettu prekliinisissä ja kliinisissä kokeissa [8, 9]. Muut HER2-kohdistaminen vasta osoittaa tehokkaammaksi yhdistelmänä kuin yksittäisinä aineina, ja ovat osoittaneet johdonmukaista alas-säätely HER2 tasoilla ja hyödyllisiä yhdistelmätehosteita hiirimalleissa [10]. Lisääntynyt tehokkuus vasta-aineen yhdistelmien on osoitettu myös EGFR-kohdistaminen vasta-aineet [11, 12] ja verisuonten endoteelin kasvutekijän reseptorin 3 (VEGFR3) -targeting vasta-aineet [13].

terapeuttinen vasta-aineet ovat tyypillisesti laajasti suunniteltu hallussaan toivottavaa biologiset ja fysikaalis-kemialliset ominaisuudet, kuten alhainen immunogeenisyys, suuri affiniteetti ja spesifisyys, optimaalinen efektorifunktioita, ja hyvä liukoisuus ja vakaus [14]. Erityisesti vasta-aine inhimillistäminen affiniteettikypsyminen ovat kaksi eniten käytettyjen tekniikan prosessien kehittämisen aikana terapeuttisten vasta-ehdokkaita. Immunogeenisuutta terapeuttisia vasta-rajoittaa kliinisen hyödyn ja tehon tuotannon huumeiden vastaisen vasta [15], ja inhimillistetään vasta hiiren tai muiden lajien on nyt normaali menettely kehittämiselle terapeuttisten vasta-aineita. Muutama humanization menetelmiä on kehitetty, jotka käyttävät joko rationaalinen tai empiiristä lähestymistapoja [16]. Komplementaarisuuden määrittävän alueen (CDR) varttaminen lähestymistapaa menetelmänä voittamiseksi ihmisen anti-kimeerinen vasta-aine (HACA) -vaste [17] on vakiintunut inhimillistäminen menetelmällä. Kuitenkin suora oksastus hiiren CDR päälle ihmisen runko akseptorisekvenssi johtaa usein affiniteetti, niin back-mutaatioita kehysalueen tähteet (Vernier vyöhyke tähteet) tukemaan rakenteen CDRsilmukoiden on usein tarpeen [18]. Sillä

in vitro

affiniteettikypsyminen, kolme monipuolistaminen lähestymistapoja tyypillisesti käytetään: satunnainen mutageneesi esim virhealtista PCR, satunnaistaminen kohdennetun jäämien käyttäen degeneroituneita oligonukleotideja, ja ketju sekoitus. In kohteena satunnaistaminen lähestymistapaa, CDR: t ovat loogisia tavoite satunnaistamista useimmissa tapauksissa, koska somaattinen hypermutaatio on kehittynyt suosia mutaatioita CDR-vasta-aineiden [19], ja CDR-H3: n ja CDR-L3 yleensä hallitsevat vasta-aine-antigeenin vuorovaikutus [ ,,,0],20]. Yksi tärkeimmistä ongelmista, jotka liittyvät kohteena satunnaistaminen valitaan kantoja, jotka eivät ole välttämättömiä antigeenia sitova, mutta joka voi parantaa affiniteettia, kun optimaalinen vaihdosta aminohappo on tehty. Alaniiniseulontaa voi auttaa määrittämään jäämiä Satunnaista, varsinkin kun CDR ovat pitkiä. Joskus alaniinimutaatio itsessään lisää affiniteettia vasta [21].

aiemmin kehittäneet hiiren vasta kohdistaminen HER2 (klooni 1E11), joka osoittaa synergististä antituumorivaikutus yhdistelmänä trastutsumabin HER2 yli-ilmentävät mahasyövän solulinjoissa [22 ]. Tässä raportissa kerrotaan, kuinka me optimoitu 1E11 terapeuttista vasta-CDR: ihmisen ituradan immunoglobuliinin vaihtelevan geenien ja affiniteettikypsymistä kohdennetun satunnaistaminen CDR-H3 ja CDR-L3. Optimoitu 1E11 vasta-aine (klooni 1A12) osoittaa synergististä antituumorivaikutus in HER2-positiivisen mahasyövän ksenograftimalleja yhdistelmänä trastutsumabin. Havaittiin, että klooni 1E11, ihmisen ituradan muuttuja geenit ovat sopivia vastaanottajia humanisointia varten ilman affiniteetin vähentäminen, ja korvaaminen CDR-L3 tähteitä, jotka eivät ole välttämättömiä antigeenia sitovan riitti parantaa affiniteettia enempää kuin 10-kertaisesti.

materiaalit ja menetelmät

Solulinjat ja materiaalien

NCI-N87-solut hankittiin American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA) ja OE-19-solujen saatiin European Collection of Cell Culture (ECACC, Porton Down, Iso-Britannia). Soluviljelyväliaine oli RPMI-1640, johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia (FBS) ja antibiootteja ja soluja viljeltiin 37 ° C: ssa, 5% CO

2. Trastutsumabi ja Palivitsumabin tuotti Genentech (South San Francisco, CA, USA) ja MedImmune, LLC (Gaithersburg, MD, USA), vastaavasti. ChromPure ihmisen lgG: tä (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, USA) käytettiin ihmisen IgG-ohjaus vasta-aineen

in vitro

määrityksissä. IgG-vasta-aineita tuotettiin käyttäen Freestyle 293 järjestelmä (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) ja puhdistettiin käyttämällä proteiini-A-affiniteettikromatografialla (GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA). Endotoksiini poistettiin kanssa endotoksiinin poistaminen Kit (GenScript, Piscataway, NJ, USA), ja endotoksiinin tasot määritettiin käyttäen endotoksiinia Detection Kit (GenScript). Rekombinantti proteiinit tuotetaan erittyviä proteiineja käyttäen Freestyle 293 järjestelmän ja puhdistettiin käyttäen proteiini-A: ta tai Ni-NTA-kromatografialla (Qiagen, Valencia, CA, USA) Fc-merkityn tai His-merkittyjen proteiinien, vastaavasti.

alaniiniseulontamutageneesillä, ja Fab puhdistus

mutageneesi alaniinin skannaus suoritettiin PCR-mutageneesillä käyttämällä QuickChange Site-Directed Mutagenesis Kit (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA). Mutantti Fab-proteiinit ekspressoitiin ja puhdistettiin arvioimaan merkitys kunkin tähteen antigeenia sitova aktiivisuus. Lyhyesti,

Escherichia coli

DH5a-soluja, jotka on transformoitu pComb3X vek- mutantti Fab-geenit, kasvatettiin 28 ° C: ssa SB-liemessä. Indusoitiin 1 mM isopropyyli-β-D-1-tiogalaktopyranosidi, kun optinen tiheys (600 nm), että viljelmä saavutti 0,8. Solupelletit suspendoitiin uudelleen jäähdytetty uuttopuskuria (120 mM Tris, pH 8,0, 0,3 mM EDTA: ta, ja 300 mM sakkaroosi) ja inkuboitiin jäillä 30 minuutin ajan periplasmisten uuttamalla. Magnesiumkloridi (2,5 mM) lisättiin kirkastettu sentrifugoinnin jälkeen sitomiseksi free EDTA ennen immobilisoitu metalli-ioniaffiniteettikromatografia (IMAC) puhdistusta. Puhdistetut Fab-proteiineja käytettiin ELISA sitoutumismääritys ja

k

off analyysin avulla pintaplasmoniresonanssin (SPR).

Affiniteettikypsytys

Humanisoidut 1E11 kloonattu pComb3X vektori Fab-muodossa käytettiin templaattina overlap extension polymeraasiketjureaktio (PCR) mutageneesi, kuten aiemmin on kuvattu [23]. Degeneroitunut oligonukleotidit (Integrated DNA Technologies, Coralville, IA, USA) 5′-CTGCCCGAAGGTCCAGGGMNNMNNMNNMNNCTGCTGGCAGTAATAAGTAGC-3 ’(taaksepäin) ja 5′-GTCTACTATTGTGCTAGA42S43S11S11S24S14S34STTCGACTACTGGGGCCAGGG-3; (Eteenpäin) käytettiin L-NNK ja H-XXS kirjasto, vastaavasti. N merkitsee A, C, G tai T; M on C tai A; ja S on G tai C. numeroitu emäksen kannat osoittavat käsin sekoitettu nukleotidin, joka koostuu 70% yhden emäksen ja 10% kutakin muuta kolmea emäksistä: 70% taajuus emäs on G, A, T, ja C 1, 2, 3, ja 4, vastaavasti. H-2 AA-kirjasto, ekvimolaarinen seos seuraavista eteenpäin mutageenisia oligonukleotideja: 5’-GTCTACTATTGTGCTAGANNKNNKGGTGGGACCGCCTCCTTCGAC-3 ’, 5′-GTCTACTATTGTGCTAGACACNNKNNKGGGACCGCCTCCTTCGACTAC-3′, 5’-GTCTACTATTGTGCTAGACACCTGNNKNNKACCGCCTCCTTCGACTACTGG-3 ’, 5′-GTCTACTATTGTGCTAGACACCTGGGTNNKNNKGCCTCCTTCGACTACTGGGGC-3′ , 5’-GTCTACTATTGTGCTAGACACCTGGGTGGGNNKNNKTCCTTCGACTACTGGGGCCAG-3 ’, ja 5′-GTCTACTATTGTGCTAGACACCTGGGTGGGACCNNKNNKTTCGACTAC TGGGGCCAGGG-3’. K tarkoittaa G tai T. Kun kaksi kierrosta päällekkäisyyttä extension PCR, Fab kirjasto DNA satunnaistettu CDR katkaistiin Sfil, ligoitiin Sfil-pilkottu fagemidivektorissa pComb3X, ja elektroporaatiolla

E

.

coli

-kanta ER2537 (New England Biolabs, Beverly, MA, USA).

Korkea affiniteetti sideaineita valittiin käyttäen liukoista biotinyloitua HER2-ECD-proteiini. Helmet sideaineita esi-köyhdytettyä inkuboimalla vasta-faagikirjastoa 100 ui esitukittiin Dynabeads M-280 Streptavidin (Invitrogen) 1 tunnin hitaan pyörimisliikkeen huoneenlämpötilassa. Biotinyloitu HER2-ECD-proteiini (100 nM- 12:01) lisättiin esi-köyhdytettyä-vasta-aine-kirjasto ja inkuboitiin 1 tunnin ajan samalla pyörittäen huoneenlämpötilassa. Sitten 50 ui estetty streptavidiini-magneettisia helmiä lisättiin ja inkuboitiin rotaattorin 15 minuuttia. Helmet pestiin 10 kertaa 1 ml: lla Tris-puskuroitua suolaliuosta-Tween 20 (TBST) ja kaksi kertaa 1 ml: lla PBS: ää. Sitoutuneet faagit eluoitiin inkuboimalla helmiä 1 ml: lla 100 mM trietyyliamiinia, 8 minuuttia, minkä jälkeen neutraloitiin 0,5 ml: lla 1 M Tris, pH 7,4.

ELISA sitova aktiivisuus test

Vasta-aineita lisättiin ja Costar 96-puoli alueella levyt (Corning, Corning, NY, USA Tuote nro 3690) päällystettiin 1 ug /ml antigeenin. Kun oli inkuboitu huoneen lämpötilassa 1 tunnin ajan, levyt pestiin kolme kertaa TBST: llä ja inkuboitiin kanin anti-humaani-vasta-aine-piparjuuriperoksidaasi (HRP) (Pierce, Rockford, IL, USA) ja IgG-vasta-aineiden ja rotan anti-HA-HRP (klooni F10, Roche Life Science, Basel, Sveitsi) Fab-vasta-aineita, tässä järjestyksessä. Levyt pestiin kolme kertaa, tetrametyylibentsidiini (TMB) (Surmodics, Eden Prairie, MN, USA) lisättiin ja reaktiot pysäytettiin lisäämällä 1 N rikkihappoa (Duksan, Ansan, Korea). Absorbanssi 450 nm: ssä mitattiin käyttäen Victor X3 väline (PerkinElmer, Waltham, MA, USA).

Pintaplasmoniresonanssianalyysi

k

off analyysi Fab-proteiinien, HER2-ECD-His-proteiini immobilisoitiin pinnalle CM5-anturisirun (GE Healthcare) käyttäen amiinikytkentää menetelmää noin 2000 vaste yksikköä (RU). Puhdistettu Fab-proteiinit injektoitiin 2 ug /ml pitoisuuden ja virtausnopeudella 50 ul /minuutti. Sillä

k

pois analyysi IgG, vuohen anti-ihmisen IgG (γ) (Invitrogen, Cat. No. H10500) immobilisoitiin CM5 anturi sirun avulla amiinikytkentää, ja vasta-aineet tallennettiin 1 ug /ml: ssa 4 minuutin ajan ja pysyi 5 minuutin ajan virtausnopeudella 50 ul /minuutti. HER2-ECD-His-proteiinia injektoitiin konsentraationa 160 nM. Affiniteetin mittauksia, vasta-aineita jää noin 50 RU vuohen anti-ihmis-IgG (γ) immobilisoituna CM5-siru. HER2-ECD-His-proteiinia injektoitiin pitoisuuksina 0-640 nM. Sensorigrammit saatiin kussakin pitoisuudessa ja arvioitiin käyttämällä BIAevaluation ohjelmistoa. Sillä epitooppi binning, IgG muodossa hz1E11 immobilisoitiin erilliseen CM5 Tunnistinsirussa pinnat noin 1000 vasteyksiköllä. HER2-ECD-His (320 nM) ja vasta-aineet (1 ug /ml), lisättiin peräkkäin 4 minuuttia ja stabiloitiin 5 minuutin ajan virtausnopeudella 50 ul /minuutti.

solunelinkykyisyysmääritys

Solut ympättiin 96-kuoppaisille levyille (Corning) on ​​10% FBS: ää sisältävässä väliaineessa ja esiviljellään 24 tunnin ajan. Soluja käsiteltiin vasta-aineilla, ilmoitettuina pitoisuuksina ja kulttuurin 4 päivää. WST-1-reagenssia (Dogen EZ-Cytox; Daeil Laboratoriopalvelu, Seoul, Korea) käytettiin mittaamaan solujen elinkykyä. Suhteellinen solujen elinkyky laskettiin jakamalla kunkin kuopan absorbanssi, jonka keskimääräinen absorbanssi PBS-käsitellyn kuoppiin kullekin levylle.

Vieraslajisiirteen tutkimuksen

Kateenkorvattomia nude-naarashiiret (Daehan Biolink, Chungbuk, Korea ) injektoitiin subkutaanisesti vasemman kyljen alueelle 5 x 10

6 NCI-N87 solujen Matrigel (BD Biosciences, San Jose, CA, USA). Kasvainten annettiin kasvaa noin 200 mm

3 koko, ja hiiret satunnaistettiin sitten ryhmiin. Eläimet saivat intraperitoneaalisesti vasta osoitetussa annoksina kahdesti viikossa. Kasvaintilavuudet laskettiin käyttäen kaavaa (L x W x W) /2, jossa L on suurin tuumorin halkaisija ja W edustaa pienintä kasvaimen halkaisija. Kaksisuuntainen toistettujen mittausten ANOVA seurasi Bonferroni kokeen suoritettiin tilastollinen analyysi kasvaimen growth.All eläinkokeet tehtiin suuntaviivojen mukaisesti ja NIH: n ”Guide for Care ja käyttö Animals” ja hyväksytyn protokollan saamat yhtiön Institution Animal Care ja käyttö komitea.

tulokset

humanisaatio 1E11 suoritti CDR-oksastamalla ihmisen ituradan geeneistä

kehittää humanisoidun vasta, VH ja VL sekvenssit hiiren 1E11 verrattiin ihmisen ituradan V- ja J-geeni repertories käyttäen IMGT /V-QUEST analyysityökalujen [24]. Raskaan ketjun, IGHV3-48 * 03 ja IGHJ4 * 01, osoitti suurinta homologiaa 1E11 kollegansa, jakaa 85% ja 87% identtisyys, vastaavasti. Kevytketjun, ihmisen IGKV1-39 * 01 ja IGKJ1 * 01 geenien näytetään identiteetti 80% ja 81%, vastaavasti. Nämä ihmisen geenit valittiin akseptorisekvenssien varten oksastus hiiren CDR: t. Niistä Vernier-alueen, joka koostuu tähteistä puitteissa alueella, jotka ovat mukana esittämiseen CDR rakenteiden tukemalla CDRsilmukoiden [18, 25], vain yksi tähde 49

H raskaan ketjun vaihteli hiiren ja ihmisen sekvensseillä. Näin ollen, humanisoidut 1E11, hz1E11, on vain yksi hiiren tähde puitteissa alueiden (kuvio 1).

Raskas ketju (A) ja kevyen ketjun (B) aminohapposekvenssi rinnastus hiiren, ihmisen ituradan, ja humanisoitujen 1E11. CDR-tähteet mukaan määriteltyä Kabat määritelmään, on lihavoitu. Aminohapot on numeroitu Kabat numerointijärjestelmän. Kaksoispisteet edustavat yhteiset tähteet hiiren ja ihmisen välillä ituradan sekvenssit.

Sitovat aktiivisuus hz1E11 ekstrasellulaariseen alueeseen (ECD) HER2 oli vastaava kuin ch1E11 (kuvio 2A), ja affiniteetti trastutsumabi, ch1E11 ja hz1E11 oli 3 nM, 23 nM, ja 23 nM, vastaavasti. Olemme myös vahvistaneet, että hz1E11 sidottu aliverkkotunnus IV kuten vanhempien ch1E11. Trastutsumabi sitoutuu myös aliverkkotunnus IV [26].

in vitro

antiproliferatiivista toimintaa hz1E11 ainoana lääkkeenä ja yhdessä trastutsumabin olivat myös samat kuin ch1E11 (kuvio 2C). Edellisessä tutkimuksessa [22] todettiin, että ch1E11 oli

in vivo

antituumorivaikutuksen verrattavissa trastutsumabi ainoana lääkkeenä, ja yhdistelmä ch1E11 ja trastutsumabi johti kasvaimen taantumiseen indeksi (TGI) ja 95,1%. Samoin hz1E11 ainoana lääkkeenä oli samanlaisia ​​

in vivo

antituumorivaikutuksen trastutsumabille (S1 kuvio) ja yhdistelmä hz1E11 trastutsumabin osoitti myös annoksesta riippuvaa antituumorivaikutuksen NCI-N87 ksenografti hiirimallissa ( kuvio 2D). Vasta-aine yhdistelmä hoito 1 mg /kg kutakin hz1E11 ja trastutsumabi johti samanlainen antituumorivaikutuksen trastutsumabilla kertahoitona 10 mg /kg, ja 2,5 mg /kg yhdistelmä ja yläpuolelle muodostuneen kasvaimen vakiintunut tai alkoi taantuu (Tilastollisesti merkittävää eroa [

P

0,05] välillä havaittiin 2,5, 5 ja 10 mg /kg yhdistelmät). Nämä tulokset osoittavat, että hz1E11 on affiniteetti ja biologinen aktiivisuus, joka vastaa ch1E11, ja että hz1E11 parantaa kasvaimen vastainen aktiivisuus trastutsumabi, kun niitä käytetään yhdistelmänä.

A, sitoutumisaktiivisuus toimintaa hz1E11 ja ch1E11 HER2-ECD proteiini analysoitiin ELISA: lla. Trastutsumabi (TRA), käytettiin positiivisena kontrollina vasta-aineen HER2-proteiinia. B, sitoutumisaktiivisuus vasta-aineiden analysoitiin ELISA: lla käyttämällä yhdistelmä-HER2 sub-domain-proteiineja. C, NCI-N87-soluja käsiteltiin vasta-aineiden 4päivä täydelliseen kasvatusliuokseen ja solujen elinkyky mitattiin kahtena rinnakkaisena (keskiarvo ± SD) käyttämällä WST-1-reagenssia. 100% elinkelpoisuuden määriteltiin elinkelpoisuutta vasta-käsittelemättömän kuoppiin. D, Hiiret, NCI-N87 ksenograftikasvaimissa hoidettiin osoitetun annoksen kontrollivasta-aineen, trastutsumabi, hz1E11 tai trastutsumabin plus hz1E11. Palivitsumabi käytettiin isotyypin kontrollivasta-ainetta. Kasvaimen tilavuus (mm

3) ilmaistiin keskiarvona ± SD (

n

= 6 hiirtä /ryhmä). Selvyyden vuoksi vain positiiviset virhepalkkeja näkyvät. **,

P

0,01; ns, ei merkittäviä määritettynä kaksisuuntainen toistettujen mittausten ANOVA seurasi Bonferroni kokeen.

alaniiniseulontaa CDR-H3 ja CDR-L3

tunnistettava kriittiset tähteet varten antigeeni-vasta-vuorovaikutusta, alaniiniskandeerausmutageneesiä suoritettiin CDR3-alueet ja raskas- ja kevytketjujen (CDR-H3: n ja CDR-L3). Vaikutukset mutaatioiden arvioitiin analysoimalla sitovaa aktiivisuutta puhdistettiin Fab-proteiinien epäsuoralla ELISA: lla. CDR-H3 alaniinisubstituutiolla asemassa Gly98

H poisti sitovan Fab HER2, ja G97

HA ja T99

HA mutanttien oli vähentynyt sitoutumisaktiivisuus (kuvio 3A). CDR-L3, alaniinisubstituutiot oli paljon pienempi vaikutus (kuvio 3B).

k

off-arvot alaniiniluotaus- mutanttien analysoitiin SPR vastaan ​​immbolized HER2-ECD-proteiini. Olemme vahvistaneet, että raskaan ketjun G98A mutantti täysin menetetty sitovia toimia, ja naapurimaiden T99

HA ja G97

HA mutanttien johti 32-kertaiseksi ja 17-kertainen

k

off-arvojen , vastaavasti (kuvio 3C). Nämä tulokset osoittavat, että raskaan ketjun Gly98

H on toiminnallisesti kriittinen ja sen vieressä tähteet ovat myös toiminnallisesti tärkeä antigeeni-vasta-vuorovaikutusta.

sitovaa toimintaa alaniiniluotaus- mutantteja CDR-H3 (A) ja CDR L3 (B) analysoitiin ELISA. C, Quantitative dissosiaatiokinetiikalla indikoitu mutanttien analysoitiin pintaplasmoniresonanssilla. HER2-ECD-proteiini immobilisoitiin CM5 sensorisirulla seurasi altistus osoitti mutantti Fab-vasta-aineita. 100% yhdistys määriteltiin vaste yksikkö (RU) 200 sekuntia alusta Fab injektion.

k

off-arvot laskettiin käyttäen BIAevaluation ohjelmistoa.

Affinity kypsymistä hz1E11

Affinity kypsymistä hz1E11 suoritettiin rakentaminen raskas tai kevyen ketjun CDR3 variantti kirjastot, sen jälkeen tasapainon valinta vasta-aineiden faagikirjastoista. Kevytketjun, glutamiini asemissa 89

L ja 90

L ei hajautettu koska glutamiini on yleisesti todettu näissä asemissa yhdeksän aminohapon-longCDR-L3-jaksot 59% ja 73% taajuuksilla, tässä järjestyksessä [ ,,,0],27]. Positiot 91

L-94

L satunnaistettiin käyttäen NNK degeneroitunut kodoni (L-NNK). Raskaan ketjun asemissa 95

H -100a

H satunnaistettiin käyttäen XXS kodoni (H-XXS), on suunniteltu siten, että ensimmäinen ja toinen nukleotidiasemia monipuolinen kodonin villityyppisen pohja tapahtui 70 % mahdollisuus, kutakin muuta kolmea emästä esiintyi 10% taajuudella, ja kolmas kirjaimet kodonien syntetisoitiin käyttäen ekvimolaarinen seos G ja C (kuvio 4A). Korkean affiniteetin sideaineita valittiin korkean ankaruuden tai alhaisen ankaruuden panning (taulukko 1).

, suunnittelu CDR-L3: n ja CDR-H3 kirjastoja affiniteetin kypsymistä. Katso teksti yksityiskohtainen selvitys. B, Sequence logo luotiin käyttäen WebLogo ohjelmaa noin ainutlaatuinen CDR-L3-sekvenssit 4

nnen kierroksen vieritys-2 (low-tiukkuus panorointi) lähtö CDR-L3 kirjasto (

n

= 39). C, The hz1E11 immobilisoitiin CM5 sensorisirulla seuraa peräkkäinen altistuminen HER2-ECD-His ja merkitty vasta-aineita käyttäen BIAcore®2000. D, Trastutsumabi immobilisoitiin CM5 sensorisirulla jälkeen lisättiin peräkkäin exposeure HER2-ECD-His ja merkitty vasta-aineita käyttäen BIAcore 3000 E, sitoutumisaffiniteetti toiminta vasta-aineet analysoitiin ELISA: lla käyttämällä yhdistelmä-DNA-HER2 sub-domain-proteiineja.

verrattuna matalan tiukkuuden panoroinnin L-NNK kirjasto, jossa 100%: n toisen, kolmannen ja neljännen kierroksen lähtö kloonit seulotaan olivat ELISA positiivisia, korkean ankaruuden panoroinnin neljännen kierroksen lähtö ei tuottanut sideaine lainkaan, ja vain kolmasosa kolmannen kierroksen lähtö kloonit ELISA positiivisia (taulukko 1). Valitun kloonit CDR-L3-kirjasto sisälsi useita sekvenssejä, jotka olivat kaikki neljä satunnaistettua CDR-L3 kantoja mutatoitu, toisin kuin CDR-H3-kirjastoja, jotka useimpien valittujen kloonien säilytti villityypin sekvenssin asemissa 97

H -100

H (katso alla). Eri panning strategiat tuottivat eri sekvenssi rikastamiseen kuvioita. Esimerkiksi kevytketjun variantti klooni 1A12 (Q

89LQNAYAPWT

97L) eristettiin korkean tiukkuuden panorointi mutta ei alhaisen tiukkuuden panoroinnin, ja raskaan ketjun variantti klooni 1B12 (N

95HYGGTASFDY

102H) oli myös valittu vain korkean tiukkuuden panoroinnin. Mielenkiintoista, 59% ainutlaatuisia vasta 4

th lähtö matalan tiukkuuden panoroinnin L-NNK kirjasto oli alaniinia asemassa 92

L mukaisesti alaniinipyyhkäisyksi analyysi (kuvio 4B).

Lähes kaikki kloonit, jotka eristettiin H-XXS kirjasto oli samassa järjestyksessä 97

H -100

H kuin vanhempien klooni, ja osoitti selvästi rikastuminen Asn-Tyr-sekvenssin 95-96. Lisäarvioimiseksi osuus CDR-H3 jäämiä antigeeni-vasta-sitovia, ylimääräinen CDR-H3-kirjasto rakennettiin erillisillä NNK satunnainen kodonin skannausta CDR-H3 (H-2AA, kuvio 4A). Matalan tiukkuuden panoroinnin, mutantit asemissa 95

H, 96

H, 99

H, 100

H, ja 100 a

H valittiin ensimmäisellä kierroksella panorointi, mutta vain mutantit asemissa 95

H ja 96

H rikastuneet neljännen kierroksen ulostulo (taulukko 1). Emme havainneet mutantit asemissa Gly97

H ja Gly98

H millään vieritys strategioihin ja lähdöt.

Affinity ja sitoutumisaktiivisuus valikoitujen kloonien

arvioimiseksi yhdistelmän vaikutus affiniteetin avulla kypsytettyjen raskaan ja kevyen ketjun variantteja, IgG yhdistelmillä affiniteetin avulla kypsytettyjen raskaita ja kevyitä ketjuja tuotettiin ja niiden

k

off-arvot olivat määrittää käyttämällä SPR analyysi (taulukko 2). Niistä kaksi kevyttä ketjua muunnelmia ja kaksi raskasta ketjua variantteja, 1A12 johdettu L-NNK osoittivat eniten parannusta (16-kertainen). Yhdistelmä kevytketjun 1A12 kanssa optimoitu raskaan ketjun kloonin 1B12 johti 24-kertainen parannus

k

pois yli vanhempien hz1E11, kun taas muut yhdistelmät

k

off-arvot olivat samankaltaisia ​​tai suurempia kuin 1A12. Koska 1,5-kertainen lisäparannuksia, että L-1A12 + H-1B12 yhdistelmä ei ole huomattavan suuri, kloonit 1A12 ja 1F11 (kevytketju vaihtoehtoja) valittiin lisäkarakterisointia minimoimiseksi sekvenssi ero affiniteetin-kypsytetty vasta-aineet vanhempien klooni. Dissosiaatiovakiot varten affiniteetin kloonit, määritettiin myös SPR-analyysi, olivat yli 10 kertaa alhaisempi kuin kantaklooni hz1E11 ja verrattavissa trastutsumabi (taulukko 3).

sen määrittämiseksi, affiniteetti-erääntyi hz1E11 kloonit sitoutuvat samaan epitooppiin kuin vanhempien hz1E11, sitoutuminen 1A12 ja 1F11, että HER2-ECD, joka oli ennalta sidottu hz1E11 analysoitiin SPR. Molemmat kloonit eivät pystyneet sitoutumaan monomeerisen HER2-ECD-His-proteiinin jää immobilisoidulla 1E11 taas trastutsumabi voisi (kuvio 4C). Lisäksi vahvistettiin, että 1A12 epitooppi ei mene päällekkäin, että trastutsumabi (kuvio 4D). Kloonit 1A12 ja 1F11 myös sitoutua aliverkkotunnus IV kuin niiden vanhempien klooni hz1E11 (kuvio 4E). Nämä tiedot osoittavat, että epitooppeja, 1A12 ja 1F11 eivät muuttuneet affiniteetin kypsymiseen.

tehoa affiniteetin hz1E11 kloonien

Sekä 1A12 ja 1F11-vasta-aineita, osoittivat hieman kasvanut antiproliferatiivinen toimintaa kuin ainoana lääkkeenä verrattuna hz1E11 on NCI-N87 ja OE-19 mahasyövän solulinjoissa yli-ilmentää HER2 (kuvio 5A ja 5B), kun taas yhdistelmänä trastutsumabin niiden antiproliferatiivinen toiminta oli parempi kuin trastutsumabille yksin ja vastaa hz1E11 trastutsumabi . Antiproliferatiivista aktiivisuutta 1A12 ja 1F11 vahvistettiin

in vivo

NCI-N87 ksenograftimallissa. Superior antituumorivaikutus oli ilmeistä yhdessä trastutsumabin kuin kunkin aineen yksinään molemmissa ksenograftimalleissa (kuvio 5C).

NCI-N87-solut (A) ja OE-19-solut (B) käsiteltiin vasta-aineiden 4 päivää täydellistä kasvualustaa. Solun elinkelpoisuus mitattiin kaksoiskappaleita (keskiarvo ± SD) käyttäen WST-1-reagenssia. 100% elinkelpoisuuden määriteltiin elinkelpoisuutta vasta-käsittelemättömän kuoppiin. C, NCI-N87 (

n

= 5 hiirtä /ryhmä) inokuloitiin hiiret ja vasta-hoidot aloitettiin, kun kasvainten oli noin 200 mm

3. Hiiret saivat 20 mg /kg yhden aineella ja 10 mg /kg kutakin vasta-aineen yhdistelmän hoidossa. Antoa päivää on osoitettu nuolilla. Kasvaimen tilavuus (mm

3) ilmaistiin keskiarvona ± SD. Selvyyden vuoksi vain positiiviset virhepalkkeja näkyvät.

Keskustelu

Vaikka rohkaisevaa kliinisiä tuloksia, jotka saatiin HER2 kohdistaminen aine, trastutsumabi hoidossa mahasyövän, on edelleen olemassa tarve lisää voimakas HER2 kohdennettuja hoitomuotojen [6]. Yhdistelmä ei-kilpailevan vasta kohdistaminen reseptoreihin, kuten HER2, EGFR, ja VEGFR3, voi lisätä antituumorivaikutuksen kokeellisissa malleissa [11-13, 28]. Pertuzumab, toinen HER2-kohdistaminen vasta-aine, on hyväksytty käytettäväksi yhdistelmänä trastutsumabin hoidossa metastaattisen rintasyövän [29]. Aikaisemmassa tutkimuksessa, olemme kehittäneet uuden HER2 kohdistaminen vasta-1E11, joka osoitettiin merkittäviä antituumorivaikutuksen monoterapiana ja synergistinen vaikutus yhdistelmänä trastutsumabin

in vitro

ja

in vivo

[22]. Anti-kasvain aktiivisuus 1E11 ja trastutsumabi yhdistelmä on parempi ei vain trastutsumabille yhden hoitoa, mutta myös yhdistelmä pertuzumab ja trastutsumabi. Tässä raportissa inhimillistämisen ja myöhemmin affiniteettikypsyminen hiiren hybridoomasta johdetun 1E11 monoklonaalinen vasta-aine on kuvattu.

Ensimmäinen lähestymistapoja vähennetään mahdollisia immunogeenisuutta nonhuman vaihtelevien alueiden CDR-oksastamalla osaksi ihmisen runko merkittävästi pienentää immunogeenisyyttä terapeuttisten vasta [15, 17].