Krooninen sairaus

tiivistelmä

Altistuminen solujen ionisoiva säteily (IR) indusoi, paitsi, aktivoitumista useiden signalointireittien että kriittisiä rooleja solun kohtalon määrittämiseen, vaan myös muuttamalla molekyylien reittejä mukana solukuoleman tai eloonjääminen . Viime aikoina DNA: n metylaatio on perustettu kriittiseksi epigeneettiset prosessi osallisena geeniekspression säätelyssä syöpäsoluissa, mikä viittaa siihen, että DNA: n metylaatio esto voi olla tehokas syövän hoitoon strategiaa. Koska muutokset geeniekspression DNA: n metylaatio on katsottu vaikuttavan radioresponsiveness, tutkimme vaikutus DNA-metyylitransferaasi-inhibiittorin, 5-atsa-2′-deoksisytidiini (5-atsa-dC), on radiosensitiivisyyden. Lisäksi olemme tutkineet taustalla solun mekanismeja yhdistelmähoidot ionisoiva säteilytys (IR) ja 5-atsa-dC: ihmisen paksusuolen syöpäsoluissa. Koolonsyöpäsolulinjoissa alun perin testattiin säteilyherkkyydestä IR

in vitro

ja käsiteltiin kahdella eri annoksilla 5-atsa-dC. Survival näistä solulinjoista mitattiin käyttäen MTT (3- (4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -2,5-difenyylitetratsoliumbromidi) ja klonogeenisten määrityksissä. Vaikutukset 5-atsa-dC yhdessä säteilytyksen solun kasvussa, solusyklin jakautuminen, apoptoosin, ja apoptoosiin liittyvien geenien ilmentymistä tutkittiin. Yhdistelmä säteilytys hoito 5-atsa-dC merkittävästi vähentynyt kasvu aktiivisuus verrattuna sädehoitoa yksin tai 5-atsa-dC hoito yksinään. Prosenttiosuus HCT116 solujen osa-G1 vaiheessa ja niiden apoptoottisen nostettiin, kun solut käsiteltiin säteilytys yhdistettynä 5-atsa-dC verrattuna jompikumpi hoito yksinään. Nämä havainnot tukevat voimakkaasti lisääntynyt kaspaasiaktiivisuus, lisääntynyt komeetta hännät käyttämällä komeetta määrityksiä, ja lisääntynyt proteiinin tasot apoptoosin liittyvän molekyylien (kaspaasi 3/9, halkaistut PARP). Tuloksemme osoittivat, että 5-atsa-dC parannettu radioherkkyyttä paksusuolen syöpäsoluissa, ja yhdistelmä vaikutuksia 5-atsa-dC säteilyn osoitti suurempaa solujen vaikutuksia kuin yksi hoitokerta, mikä viittaa siihen, että yhdistelmä-5-atsa-dC ja säteily on potentiaalia tulla kliininen strategia syövän hoitoon.

Citation: Kim JG, Bae JH, Kim jA, Heo K, Yang K, Yi JM (2014) yhdistelmä vaikutus Epigeneettiset asetuksen ja ionisoivaa säteilyä in peräsuolen syövän solut. PLoS ONE 9 (8): e105405. doi: 10,1371 /journal.pone.0105405

Editor: Hiromu Suzuki, Sapporo Medical University, Japani

vastaanotettu: toukokuu 25, 2014; Hyväksytty: 21 heinäkuu 2014; Julkaistu: 19 elokuu 2014

Copyright: © 2014 Kim et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Tällä kirjoittajat vahvistavat, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi- ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat National R Medical Sciences rahoittama Korean opetus-, tiede- ja teknologia. Tätä työtä tukee myös National Research Foundation (NRF) sekä tiede-, ICT ja Future Planning (MSIP), Korean hallituksen kautta kansallisen Nuclear Technology Program (2013M2A2A7043665). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Epigenetiikka on tutkimuksen periytyminen muutoksia geenien ilmentymisen tai solun fenotyypin aiheuttamia muita menetelmiä kuin muutosten taustalla DNA-sekvenssit [1]. Epigeneettisenä geenin ilmentymisen säätelyyn välittävät mekanismit, kuten DNA: n metylaatio, muutokset histonien, ja sijainti nukleosomin pitkin DNA: ta. Tyypillisesti DNA hypermetylaation on keskeisessä asemassa inaktivoinnissa geenien solukierron säätelyssä, DNA korjaus, apoptoosin, solun signalointi, transkriptio, ja muiden solun prosessit [2].

Aberrations DNA metylaatio havaitaan usein monissa eri syöpätyypeissä [3], [4]. Erityisesti vaimentaminen tuumorisuppressorigeeneille tai muiden syöpään liittyvien geenien poikkeava DNA hypermetylaation promoottorin tai säätelyalueita myötävaikuttaa kasvaimien syntyyn [5], [6]. Toisin kuin geneettisiä muutoksia, epigeneettiset tapahtumat, kuten DNA: n metylaatio, ovat palautuvia, joten epigeneettiset sääntelyn erittäin mielenkiintoinen näkökulmasta katsottuna uusien lähestymistapojen kehittämistä hoitoa. DNA hypermetylaation voidaan kääntää DNA-demetyloimalla aineita. Lisäksi DNA-metyylitransferaasin (DNMT) estäjät voivat palauttaa geenien ilmentymistä vaiennetaan DNA: n metylaation. Viime vuosina DNMT inhibiittori, 5-atsa-2′-deoksisytidiini (5-atsa-dC), on osoitettu olevan syövän vastaista toimintaa potilailla, joilla on leukemia, myelodysplastinen oireyhtymä, ja useita kiinteitä kasvaimia [7], [8] . Vaikka yksi epigeneettisiä hoito ei ole osoittanut merkittävää reaktioita vastaan ​​eniten kiinteitä kasvaimia [9], prekliiniset tutkimukset viittaavat siihen, että yhdistelmä epigeneettisiä modifiointiaineita, kuten DNMT estäjien tai histonideasetylaasi-inhibiittorit, voivat olla tehokkaita. Lisäksi, näiden yhdistelmä epigeneettiset määritteet tavanomaisten kemoterapeuttisten aineiden voi myös olla tehokas. Siksi nämä tyypit kombinatorisista hoitojen tutkitaan kliinisissä tutkimuksissa [10], [11]. Kuitenkin vain harvat raportit ovat tutkineet radioherkkyyttä liittyy altistusta 5-atsa-dC [12] – [15]. Viime aikoina on ollut kasvavaa kiinnostusta strategioiden aineita, jotka säätelevät solujen radioherkkyyttä kasvattaa kasvain radioherkkyyttä. Siksi tässä tutkimuksessa raportoimme terapeuttista potentiaalia yhdistämällä 5-atsa-dC ionisoivalla säteilyllä (IR) lisätä radioherkkyyttä peräsuolen syöpä solujen ja tutkii solujen mekanismeista näitä vaikutuksia.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely ja 5-atsa-dC hoidon

ihmisen kolorektaalisen karsinooman solulinjoissa: HCT116, SW480, Colo320, ja RKO, jotka on saatu American Type Culture Collection (ATCC, VA, USA), samoin kuin kaksinkertaisen knockout-soluja (DKO) DNA metyylitransferaasi-1 ja DNA-metyylitransferaasi-3b HCT116 solulinjassa [16], joka säilyttää alle 5% genomista DNA: n metylaatio, viljeltiin 37 ° C: ssa 20 % O

2 ja 5% CO

2. HCT116, DKO, ja SW480-solut ylläpidettiin McCoyn 5A-alustassa (WelGENE, Daegu, Korea). Colo320-soluja ylläpidettiin RPMI-alustassa (WelGENE). RKO-soluja ylläpidettiin Dulbeccon Modified Eagle Medium (DMEM) (WelGENE), joka sisälsi 10% naudan sikiön seerumia (Hyclone, Logan, UT, USA) ja 1% antibiootti-antimykoottia (Gibco, Grand Island, NY, USA). Soluja käsiteltiin 5-atsa-dC (0,5 tai 1 uM, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) kerran päivässä 3 päivää (kuvio S1).

Ionisoiva säteilytys (IR) altistumisen

soluja käsiteltiin 5-atsa-DC 3 päivää tai ei-hoidettuun kontrolliryhmään solut altistettiin gammasäteilyä

137Cs-säteilylähde (Eckert Ziegler, Berliini, Saksa) annoksena nopeudella 2,6 Gy /min. Säteilytyksen jälkeen annoksina 2, 5, ja 10 Gy, soluja inkuboitiin 3 päivää 37 ° C: ssa, 20% O

2, ja 5% CO

2.

klonogeeninen määritys

HCT116, SW480, RKO, Colo320, ja DKO-solut ympättiin 6-kuoppaisille levyille (5000 solua /kuoppa), ja sitä käsiteltiin 5-atsa-dC ja IR. Soluja viljeltiin 2 viikkoa. Elatusaine korvattiin tuoreella kasvualustalla, joka 2 päivä. Pesäkkeet kiinnitettiin ja värjättiin 1,25% kristalliviolettia, pestään laajasti liiallisen värin poistamiseksi, ja kuvattiin käyttäen MultiXpress C9250ND skanneri (Samsumg, Seoul, Korea). Pesäkkeitä, joiden 50 solua /pesäke laskettiin käyttäen Image-Pro Plus 7.0 ohjelmisto (Media Cybernetics, Rockville, MD, USA).

Solulisääntyminen ja solujen elinkelpoisuuden määritykset

Solulisääntyminen määritettiin käyttäen 3- (4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -2,5-difenyylitetratsoliumbromidia (MTT). -Soluja (2 x 10

5 solua /kuoppa) ympättiin 6-kuoppaisille levyille ja inkuboitiin 37 ° C: ssa. 48 tunnin kuluttua solut pestiin kahdesti fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS), ja 5 mg /ml MTT: PBS: ssä lisättiin kuhunkin kuoppaan 4 tuntia. Poistamisen jälkeen MTT-liuosta, joka on liukoiseksi liuokseen (dimetyylisulfoksidi /etanoli, 01:01), lisättiin kuhunkin kuoppaan liuottamiseksi formatsaanikiteet. Absorbanssi 570 nm: ssä mitattiin käyttäen Paradigm mikrolevylukijalla (Beckman Coulter, Fullerton, CA, USA). HCT116-solut käsiteltiin 5-atsa-dC ja /tai säteilytyksen ympättiin pitoisuutena 5 x 10

4 solua /kuoppa 6-kuoppaisilla levyillä. 24, 48, 72 ja 96 tuntia, solut kerättiin, laimennettiin trypaanisini työliuoksen, ja laskettiin tuottaa kasvun käyrää.

Kasvaimen kasvu analyysi

in vivo

arviointiin kasvaimen kasvua, käytimme ihonalainen kasvain SCID hiiren ksenograftimallissa syntyy infektoimalla soluja. Nainen C.B-17 SCID-hiiret ostettiin Keski Lab. Eläimet (Seoul, Korea). Kuuden viikon ikäiset naaras hiiret jaettiin koeryhmään (n = 3 kussakin ryhmässä). Hiiret ihonalaisesti oikealta puolelta selkäpuolen alueella 5 x 10

6 solua laimennettuna 100 ul: aan PBS: ää. Kasvainten tilavuuden mitattiin kerran viikossa. Kasvaimen tilavuus arvioitiin käyttämällä seuraavaa yhtälöä: (lyhyt akseli)

2 x (pitkä akseli) x 0,5.

Virtaussytometrinen analyysi

Solusyklianalyysiä suoritettiin käyttäen propidiumjodidilla (PI ). Solut trypsinoitiin, pestiin PBS: llä ja kiinnitettiin 75% etanolilla 4 ° C: ssa 1 h. Ennen analyysiä varten solut pestiin jälleen PBS: llä, suspendoitiin kylmään PI liuosta 1 mg /ml RNaasi, ja inkuboitiin pimeässä 30 minuuttia huoneenlämpötilassa. Virtaussytometrillä analyysi suoritettiin käyttäen FACScan väline (BD FACSAria, BD Biosciences, San Jose, CA, USA). Apoptoosin käsiteltyjä soluja arvioitiin käyttäen Annexin V /FITC Apoptosis Detection Kit (BD Biosciences). Lyhyesti, kaikki solut ympättiin ja käsiteltiin 100 mm: n annoksia. Tämän jälkeen solut pestiin kahdesti kylmällä PBS: llä. Solut värjättiin fykoerytriiniin (PE) anneksiini V ja 7-amino-aktinomysiini ja inkuboitiin 15 minuuttia pimeässä. Värjäyksen jälkeen, sitovia puskuria lisättiin soluihin, jotka analysoitiin käyttämällä FACScan väline. FACSDiva ohjelmisto (BD Biosciences) käytettiin analyysiin.

kaspaasi 3/7 aktiivisuusanalyysiä

kaspaasi 3/7 aktiivisuuden määrityksessä solut (5 x 10

3-soluissa ) ympättiin 100 ui McCoyn 5A-väliaine 96-kuoppalevylle. 24 tunnin inkubaation, 100 ui kaspaasi-Glu 3/7 iinianalyysikitissä (Promega, Madison, WI, USA) substraatin ja puskurin seos lisättiin kuhunkin kuoppaan. Solut ja liuokset sekoitettiin varovasti 30 minuuttia ja inkuboitiin huoneen lämpötilassa 1 tunnin ajan pimeässä. Fluoresenssi mitattiin käyttämällä luminometriä (ATTO, Tokio, Japani). Kaikki määritykset toistettiin kolme kertaa ja se sisälsi negatiivisia kontrolleja.

DNA-vaurion määritys

DNA-vaurion esiintyminen määritettiin käyttämällä OxiSelect Comet Assay Kit (Cell Biolabs, San Diego, CA, USA). 5-atsa-DC- ja /tai IR-käsiteltyjen HCT116-solut (1 x 10

5) sekoitettiin matalan sulamispisteen agaroosia (1:10 suhde), ja sen jälkeen komeetta dia täytettiin 75 ui seos. Levyjä inkuboitiin 4 ° C: ssa 30 minuuttia ja sitten upotettiin lyysipuskuria 4 ° C: ssa pimeässä 1 tunti. Lyysauspuskuri imettiin sitten peräisin dioja, ja objektilasit upotettiin emäksiseen liuokseen 4 ° C: ssa pimeässä 30 minuutin ajan. Seuraavaksi poistaa alkaalisella liuoksella, levyt säilytettiin Tris-asetaatti-EDTA (TAE) puskurissa 5 min. Objektilasit pantiin vaakasuoraan sähköforeesikammion ja suoritettiin elektroforeesi TAE-puskurissa 25 V: ssa 20 minuuttia. Levyt kuivattiin ja värjättiin DNA väriaineella (CELL Biolabs). Komeetta hännät havaittiin fluoresenssimikroskoopilla (Nikon, Tokio, Japani).

Western blot-analyysi

Solut lyysattiin lyysipuskurissa, ja kokosoluliuotteista sisälsi yhtä suuret määrät proteiineja ladattiin 4-12%, geelit, natriumdodekyylisulfaatti-polyakryyliamidigeelielektroforeesi ja siirrettiin sitten polyvinylideenidifluoridi kalvoja (GE Healthcare Life Sciences, Piscataway, NJ USA). Membraanit blokattiin 5% maitoa PBS-liuos, joka sisälsi 0,02% Tween-20, ja inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa tietyn ensisijaisen vasta-aineita. Kalvot jälkeen inkuboitiin erityinen piparjuuriperoksidaasiin konjugoituja sekundäärisiä vasta-aineita. Proteiinivyöhykkeet visualisoitiin käyttäen Fusion FX5 järjestelmä (Vilber Lourmat, Eberhardzell, Saksa). Seuraavat ensisijaiset vasta-aineita käytettiin: anti-katkaistuun kaspaasi 3 (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA), anti-katkaistuun kaspaasi-9 (Cell Signaling Technology), anti-katkaistuun PARP1 (Cell Signaling Technology), anti-surviviiniperäistä (Abcam , Cambridge, MA, USA), anti-p53 (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA), ja anti-α-aktiini (Sigma-Aldrich).

tilastollinen

tulokset olivat esitetään keskiarvoina ± keskihajonta. Tilastolliset analyysit suoritettiin käyttäen Studentin

t

-testi.

P

-arvo vähemmän kuin 0,05 katsottiin tilastollinen merkitsevyys.

Eettinen lausunto

Kaikki eläin protokollia käytetään nykyisessä tutkimuksessa tarkistettiin ja hyväksyttiin Institutional Animal Care ja Käytä komitean Dongnam Institute of Radiological Medical Sciences (DIRAMS-IACUC-11-005).

Tulokset

Effects of 5-atsa-DC: ssä radioherkkyyttä paksusuolen syövän solulinjoista

Voit selvittää 5 -aza-dC parantaa solujen herkkyys IR, paksusuolen syövän solulinjat HCT116, SW480, RKO, Colo320, ja DKO altistettiin 5-atsa-dC kahdessa eri annoksilla (0,5 uM ja 1 uM) 72 tuntia, ennen kuin se altistuvat kolme erilaista IR annosta (2 Gy, 5 Gy, ja 10 Gy) (Kuva S1). Seuraavaksi klonogeenisten määritys suoritettiin joka osoittaa, että 5-atsa-dC voisi radiosensitize kaikki koolonsyöpäsolulinjoissa testattu, ja yhdistelmä-5-atsa-dC ja IR oli ylivoimainen kohtelun kuin 5-atsa-dC yksin. DKO soluja, geneettisesti estävät DNMT1 ja 3b, osoitti myös kasvun hidastuminen IR kanssa annosriippuvaisesti (kuva 1A).

(A) klonogeeninen määritys HCT116, SW480, Colo320, ja RKO soluja käsiteltiin 5-atsa -DC (0,5 ja 1 uM) ja /tai IR (2 Gy, 5 Gy ja 10 Gy). Klonogeeniset määritys säteilytettyjä (2 Gy, 5 Gy, ja 10 Gy) DKO soluja. Solut ympättiin 6-kuoppaisille levyille (5000 solua /kuoppa), ja sitä käsiteltiin 5-atsa-dC /IR. 2 viikon kuluttua, viljelmät kiinnitettiin etanolilla ja värjättiin 1,25% kristalliviolettia. Valokuvat yksittäiset pesäkkeet, on myös esitetty. (B-E) Survival osa (SF) ja HCT116 /DKO (B), SW480 (C), Colo320 (D) ja RKO (E) soluja käsiteltiin 5-atsa-dC (0,5 ja 1 uM) ja /tai ionisoiva säteily (IR, 2 Gy, 5 Gy ja 10 Gy). SF laskettiin keskiarvona pesäkettä /kylvetään soluja. Annos lisälaite laskettiin suhteena SF käyrän, joka on saatu käsittelemällä seos 5-atsa-dC ja IR, joka saatiin käsittelemällä IR yksinään. Data ilmaistaan ​​keskiarvona ± keskihajonta kolmesta itsenäisestä kokeesta.

P

-arvot laskettiin Studentin

t

-testi. *

P

0,05; **

P

0,01; ***

P

0,001.

Säteily selviytymisen käyrät luodaan jokaista solulinjaa käsiteltiin 5-atsa-dC ja IR ymmärtää onko säteilytys voidaan herkistää 5 -aza-dC paksusuolen syöpäsolulinjoissa (kuvio 1 B-E). Käyttämällä annos tuottamiseen tarvittavat hengissäsäilymisosuus (SF) 0,5 referenssinä, annosta lisälaite hinnat (ihmeitä) arvioitiin. Soluja käsiteltiin 5-atsa-dC 72 tuntia ennen säteilytystä osoitti kasvua radioherkkyyttä, joiden DER on: 1,19 (0,5 uM 5-atsa-dC) ja 1,41 (1 uM 5-atsa-dC) in HCT116-soluissa, 1,23 (0,5 uM 5-atsa-dC) ja 1,42 (1 uM 5-atsa-dC) in SW480-soluissa, 1,23 (0,5 uM 5-atsa-dC) ja 1,28 (1 uM 5-atsa-dC) in Colo320 soluissa, ja 1,14 (0,5 uM 5-atsa-dC) ja 1,31 (1 uM 5-atsa-dC) in RKO soluissa (kuvio 1 B-E). Meidän tiedot osoittivat, että pienempi annos 5-atsa-dC voisi radiosensitize peräsuolen syövän soluja. Koska 1 uM 5-atsa-dC tai 10 Gy IR ovat sytotoksisia, suhteellisen matalia annoksia 5-atsa-dC (0,5 uM) ja IR (2 Gy ja 5 Gy) valittiin lisätutkimuksiin tutkia vaikutuksia yhdistämällä DNMT estäjä, 5-atsa-dC ja IR.

yhdistelmä 5-atsa-dC ja IR aiheuttama kasvun hidastuminen vuonna koolonkarsinoomasoluissa

Analysoimme soluproliferaatiota HCT116-soluissa käsiteltiin 5 -aza-dC tai IR yksin tai yhdistelmä 5-atsa-dC ja IR. Kasvukäyrät osoitti, että hoito yhdistelmällä 5-atsa-dC ja IR (2 Gy ja 5 Gy) sai aikaan tilastollisesti merkitsevän kasvun eston HCT116 ja SW480-soluissa kunakin ajankohtana tutkittiin (24, 48, 72, ja 96 h ) verrattuna hallinnassa soluissa, käsitellyissä soluissa vain 5-atsa-dC, tai soluissa käsiteltiin vain IR (2 Gy ja 5 Gy) (kuvio 2A;

P

0,05). Lisäksi olemme suorittaa MTT-määritystä sekä HCT116 ja SW480-soluja, jotka oli käsitelty tai ei 5-atsa-dC (0,5 uM) ja säteilytetään sitten ne 2, 5, ja 10 Gy, vastaavasti. Absorbanssi määrityksestä suoritettiin soluissa, joita käsiteltiin yhdistämällä 5-atsa-dC ja IR oli merkitsevästi pienempi (

P

0,05) kuin soluista, käsiteltiin 5-atsa-dC tai IR yksinään ( Kuvio 2B). Olemme myös suorittaa kasvukäyrä analyysi ja MTT-määritystä in DKO soluissa, mikä myös osoitti laskua kasvun hidastuminen sekä leviämisen riippuen säteilyannos (kuvio 2A ja B). Näin ollen, nämä tulokset osoittavat, että vaikutukset 5-atsa-dC ja IR kasvun estäminen ovat additiivisia. Perustuu

in vitro

datan merkittävän kasvun esto soluissa on käsitelty yhdistelmä 5-atsa-dC ja IR, olimme kiinnostuneita onko nämä vaikutukset voitiin havaita

in vivo

. Tätä varten, HCT116-solut altistettiin 5-atsa-dC (0,5 uM) 72 tunnin ajan ennen altistusta IR (2 Gy ja 5 Gy), ja sen jälkeen injektoitiin subkutaanisti SCID-hiirissä. Kuva 2C osoitti merkittävästi viivästynyt kasvaimen kasvua yhdistelmällä hoitoa 5-atsa-dC ja IR (2 Gy ja 5 Gy) verrattuna yhden hoidon joko 5-atsa-dC tai IR. Lisäksi, tilavuus ksenograftien soluista käsiteltiin sekä 5-atsa-dC ja IR vähenivät verrattuna solujen käsiteltiin joko 5-atsa-dC tai IR yksinään.

(A) Cell kasvu käyrät saatiin käyttäen 0,5 uM 5-atsa-dC ja kaksi eri säteilyannosten (2 Gy ja 5 Gy) paksusuolen syöpäsoluissa (HCT116, DKO ja SW480) ja (B) MTT määrityksissä paksusuolen syövän soluissa, joita käsiteltiin 5-atsa-dC (0,5 uM) ja /tai säteilytys (2 Gy ja 5 Gy). Data ilmaistaan ​​keskiarvona ± keskihajonta rinnakkaisessa kokeessa. (C) Kasvaimen kasvu seuraavat 5-atsa-dC (0,5 uM) hoitoon ja /tai säteilytys (2 Gy ja 5 Gy) SCID-hiirissä. HCT116-solut (5 x 10

6 solua), jotka oli käsitelty 5-atsa-dC (0,5 uM) ja säteilytettiin (2 Gy ja 5 Gy) injektoitiin subkutaanisti SCID-hiirten (n = 4), ja keskimääräinen kasvaimen koko mitattiin kerran viikossa 7 viikon ajan.

P

-arvot laskettiin Studentin

t

-testi. *

P

0,05; **

P

0,01.

valaista kasvun inhibition 5-atsa-dC, IR, ja yhdistelmä hoidon käytimme virtaussytometria analyysi määrittää onko kasvun esto liittyi solukierron muutoksia. Solusyklin jakautuminen-analyysi osoitti, että osuus käsiteltyjen solujen G1, S ja G2-M-vaiheisiin ei ollut erilainen kuin kontrollisolut, paitsi että siellä oli osuuden kasvu solujen osa-G1 vaiheeseen, mikä viittaa siihen lisäys apoptoosin (kuvio 3). Osuus HCT116-soluja käsiteltiin 5-atsa-dC tai IR (2 Gy) yksin sub-G1-vaiheen solut oli kahdeksan kertainen (5-atsa-dC), kaksinkertaiseksi (IR, 2 Gy), ja nelinkertaiseksi (5 Gy) on suurempi kuin kontrolli-solujen ja yli kahdeksan kertaa suurempi soluissa, käsiteltiin 5-atsa-dC ja IR kuin kontrollisoluissa. Mielenkiintoista, toisin kuin HCT116-solut, SW480-solut osoittivat G2 /M pidätyksen jälkeen IR yksinään (2 Gy ja 5 Gy) verrattuna kontrolleihin [2-Gy G2 /M osa: 46.77% (vs. 28,03% kontrollisoluissa); 5 Gy G2 /M osa: 58.88% (vs. 22,03% kontrollisoluissa)]. Kuitenkin osa-G1-vaiheen soluissa, joita käsiteltiin 5-atsa-dC tai IR (2 Gy) yksinään oli kuusinkertaiseksi (5-atsa-dC), kaksinkertaiseksi (2 Gy), ja seitsemän kertainen (5 Gy) on suurempi kuin kontrollisoluja ja yli 19-kertaiseen kasvuun soluissa, joita käsiteltiin 5-atsa-dC ja IR kuin kontrollisoluissa. Olemme myös vahvistaneet, että osa-G1 vaiheessa soluja säteilytettiin 2 Gy tai 5 Gy verrattuna kontrolli-solujen lisääntynyt DKO soluissa. Sen vuoksi päättelemme, että kasvua estäviä vaikutuksia 5-atsa-dC tai IR-johtuvat apoptoosin lisääntyminen.

Colon syöpäsoluja (HCT116, DKO ja SW480), käsiteltiin 5-atsa-dC (0,5 uM) ja /tai säteilytys (2 Gy ja 5 Gy) värjättiin propidiumjodidilla ja analysoitiin käyttäen FACS virtaussytometrillä. Sarakkeet osoittavat solujen osuus kussakin solusyklin vaiheessa. Musta pylväs, sub-G1 vaiheeseen; kirkas harmaa pylväs, G1 vaihe; tummanharmaa pylväs, S-vaiheessa; valkoinen sarake, G2-M-vaiheessa.

yhdistelmä 5-atsa-dC ja IR edistää apoptoosin induktio koolonkarsinoomasoluissa

selkeyttämiseksi apoptoosin induktio 5-atsa-dC yhdistettynä IR in HCT116 ja SW480-solut, solut kaksinkertainen värjättiin fluoreseiini-leimattu anneksiini V ja PI. Taso indusoiman apoptoosin 5-atsa-dC yhdistettynä IR oli suurempi kuin IR (1,7-kertainen 2 Gy tai 1,8-kertainen 5 Gy) tai 5-atsa-dC yksinään ( 2,4-kertainen) in HCT116 solut. Mielenkiintoista on, havaitsimme samanlaisia ​​tuloksia kohonnut apoptoosin tasoa, joka on indusoitu käsittelemällä 5-atsa-dC ja IR verrattuna IR (3,4-kertainen 2 Gy tai 2,4-kertainen 5 Gy) tai 5-atsa-dC ( 1,5-kertainen) yksin SW480-soluissa (kuvio 4A). Lisäksi olemme tutkineet solujen mekanismeista apoptoottisen vaikutusten yhdistelmän 5-atsa-dC ja IR. Yksi yleisimmistä signalointikaskadien mukana apoptoosin on aktivointi erittäin apoptoosin tietyn perheen kaspaasien, joka kerran aktivoitu, aloittaa solukuoleman pilkkomalla ja aktivoimalla efektori kaspaasien ajo apoptoosin [17]. Sen määrittämiseksi, ovatko caspases välittämien vaikutusten 5-atsa-dC ja IR, mittasimme toimintaa caspases 3 ja 7, jotka ovat keskeisiä efektoreita varten nisäkässolujen apoptoosin [18]. Molemmissa solu-uutteita käsiteltiin 5-atsa-dC ja IR, joko yksin tai yhdistelmänä, toimintaan caspases 3 ja 7 olivat huomattavasti lisääntynyt soluissa käsiteltiin 5-atsa-dC ja IR (2 Gy ja 5 Gy) verrattuna nämä käsitellyissä soluissa IR tai 5-atsa-dC yksinään (kuvio 4B). Nämä tulokset vastaavat kasvoi aiheuttamaa apoptoosia yhdistelmähoitoa 5-atsa-dC ja IR, ja on esitetty kuviossa 4A. Molemmissa analyyseissä, DKO solut myös osoittaneet kasvavaa apoptoosin taso IR. Nämä tulokset tukevat voimakkaasti enää komeetta hännät havaittu komeetta määrityksessä, joka ilmaisee suurempi määrä solun DNA-vaurioita soluissa käsitelty yhdistelmällä 5-atsa-dC ja IR verrattiin kontrolli soluja tai käsitelty 5-atsa-dC tai IR yksinään (kuvio 4C ja D).

(A) tasot apoptoosin mitattiin anneksiini V: n ja 7-amino-aktinomysiini ja analysoitiin käyttäen FACS virtaussytometria. Tasot apoptoosin HCT116, DKO ja SW480-solut käsiteltiin 5-atsa-dC (0,5 uM) ja /tai säteilytys (2 Gy ja 5 Gy) ilmaistiin prosentteina koko solupopulaation sekä varhaisen ja loppuvaiheen apoptoosin. (B) toiminta caspases 3 ja 7 määritettiin käyttämällä kaspaasi-Glo määritys ja edustivat prosentteina HCT116, DKO ja SW480-solut käsiteltiin 5-atsa-dC (0,5 uM) ja /tai säteilytys (2 Gy ja 5 Gy) verrattuna käsittelemättömiin soluihin. Kaavion tiedot (keskiarvo ± keskihajonta) kolmesta itsenäisestä kokeesta. (C) edustaja micrographs loisteputki DNA tahra käyttäen komeetta määritystä. DNA pirstoutumista komeetta määritys HCT116, SW480 ja DKO soluja käsiteltiin 0,5 uM 5-atsa-dC ja /tai säteilytys (2 Gy ja 5 Gy). (D) kvantifiointi DNA vaurioituneita soluja edustaa keskiarvoa kolmesta satunnaisesti mikroskooppikentäs- näytettä kohti, ja virhepylväät edustavat ± keskihajonnat. NS osoittaa ole merkittävä.

P

-arvot laskettiin Studentin

t

-testi. *

P

0,05; **

P

0,01.

Kaspaasit 3 ja 9 ovat myös tiedetään olevan osallisena säteilyn aiheuttaman apoptoosin [19]. Niinpä käytetään western blotting vahvistaa aktivoinnin tasoja kaspaasien 3 ja 9 soluissa, joita käsiteltiin 5-atsa-dC ja /tai IR. Kuvio 5 esittää korkeamman tason aktivoitu kaspaasien 3 ja 9 HCT116, DKO, ja SW480-soluja käsiteltiin 5-atsa-dC tai IR yksinään verrattuna kontrollisoluissa. Mielenkiintoista on, että Western blotting, kolmen, testattu koolonsyöpäsolulinjoissa, paljasti, että proteiini tasot kaspaasien 3 ja 9 lisääntyivät myös soluissa, joita käsiteltiin yhdistämällä 5-atsa-dC ja IR verrattuna soluihin käsitelty kummallakaan aineella yksinään tai kontrolleissa soluissa. Taso katkaistun PARP1, joka on toinen avainefektori apoptoosin induktion [20], [21], kohosi myös soluissa, joita käsiteltiin 5-atsa-dC tai IR yksinään verrattuna ohjaus soluihin, ja vielä enemmän lisääntyi soluissa käsitelty yhdistelmä 5-atsa-dC ja IR. Sitä vastoin proteiini ekspressiotasot surviviinin määrä väheni soluissa, joita käsiteltiin 5-atsa-dC ja IR yksinään ja yhdistelmänä verrattuna kontrollisoluissa. Lisäksi testasimme taso p53 samoin. Mielenkiintoista on, että p53-ilmentymisen taso nousi käsitellyissä soluissa yhdistelmä-5-atsa-dC ja IR kuin soluissa, joita käsiteltiin 5-atsa-dC yksin. Tämä data on samaa mieltä edellisessä raportissa, joka on solut, jotka ilmentävät villityyppistä p53 ovat parempia herkkiä IR kuin mutantin tyyppi p53 [14]. Nämä proteiinin ilmentyminen kuvioita vahvistettiin säteilytettyjen DKO soluissa. Yhdessä meidän tiedot viittaavat siihen, että yhdistelmä 5-atsa-dC ja IR synergistisesti indusoi korkeamman apoptoosin verrattuna kertahoitona käyttäen 5-atsa-dC tai IR useassa koolonkarsinoomasoluissa.

Western blot analyysi ekspression apoptoosin liittyvien proteiinien (pilkottiin kaspaasi 3, pilkottiin kaspaasi 9, pilkottiin PARP1, surviviini, ja p53), in HCT116 ja SW480-soluja käsiteltiin 5-atsa-dC (0,5 uM) ja /tai säteilytys (2 Gy ja 5 Gy), sekä säteilytettyjä DKO soluissa, käyttäen pilkotaan kaspaasi 3, pilkotaan kaspaasi 9, halkaistut PARP1 surviviiniperäiset, ja p53-vasta-aineita.

keskustelu

IR altistuminen johtaa samanaikaista aktivointia tai alisäätely useita signalointireittien että kriittisiä rooleja solutyyppispesifiselle valvonta säilymisen tai kuolema. IR on tunnettu genotoksinen ja ihmisille syöpää, joka aiheuttaa soluvaurioita suoraan ja välillisesti mekanismien [22]. Viime aikoina monet tutkimukset ovat keskittyneet molekyylien ja prosesseja, jotka vaikuttavat solujen vaste IR-. Monia erilaisia ​​molekyylejä, tiedetään lisäävän radioherkkyyttä vaikuttamalla solusyklin tarkastuspisteiden, DNA: n korjautumiseen, geenin transkription, ja apoptoosin. Viimeisimmät tutkimukset ovat osoittaneet, että epigeneettisten mekanismeja, kuten histonimodifikaation ja DNA: n metylaatio liittyy geenien ja voi olla mukana säätelyssä radioherkkyyttä syöpäsoluissa. Useat aiemmat tutkimukset ovat raportoineet, että useat histonideasetylaasi inhibiittorit ovat sytotoksisia ja voi herkistää kasvainsolut sädehoitoa. Kuitenkin juurikaan tietoa myöskään vaikutuksista DNMT estäjien säteilylle herkäksi [13], [23]. Lisäksi 5-atsa-dC on osoitettu olevan vain vähän aktiivisuutta kiinteitä kasvaimia monoterapiana [24], [25], ja tiedetään vähän koskevat molekyyli- tai solumekanismeja taustalla radioherkkyyttä aiheuttama epigenetic estäjiä. Yhdistämällä epigeneettisellä lääkkeet sädehoitoon on erityisen kiinnostava tässä yhteydessä, ja on osoittanut parantunut tehokkuus sekä

in vitro

ja

in vivo

useita kiinteitä kasvaimia [13] – [15], [26 ]. Esillä olevassa tutkimuksessa olemme tutkineet solujen vaikutuksia DNMT inhibiittoria, 5-atsa-dC, ja IR, sekä yksinään että yhdistelmänä, paksusuolen syöpäsoluissa. Huomasimme, että 5-atsa-dC osoittivat lisäaineen vaikutuksia kasvun esto yhdistettynä IR, mikä viittaa siihen, että 5-atsa-dC voisi olla hyödyllinen säteilyn herkistävä paksusuolen syövän hoidossa. Yksi asia, että meidän täytyy harkita vielä perustuvat tuloksiin, DKO solujen geneettinen malli järjestelmä estämällä DNA metyylitransferaasi, ei näytä olevan enemmän voimakas kasvu estävä vaikutus IR kuin käyttämällä farmakologinen mallijärjestelmä käsittelimme 5-atsa-dC IR.

koska meidän tulokset osoittavat, että tämä vaikutus välittyy apoptoosin induktion, apoptoosin on aiemmin pidetty mahdollisena mekanismi säteilylle herkäksi. Useita erilaisia ​​tuloksia on raportoitu koskien sädeherkistävä vaikutuksia DNMT estäjiä. Jumaloida et ai. aiemmin raportoitu, että yhdistelmä IR- ja zebularine ei lisännyt merkittävästi apoptoosin [13]. Sitä vastoin, Qiu et ai. osoittivat, että 5-atsa-dC indusoi säteilylle herkäksi tietyissä mahasyövän solulinjojen ja aiheutti apoptoosin lisääntyminen, joka oli liitetty lisääntynyt ilmentyminen on

p53

,

RASSF1

, ja

DAPK

geeniperheiden [14]. Tutkimuksessamme 5-atsa-dC noussut yli apoptoosin HCT116 ja SW480-soluissa, päätelmä oli sopusoinnussa tulosten Qiu et al. Erittäin kiinnostavaa, Qiu et al. ehdottivat myös, että mahalaukun syövän solulinjat ekspressoivat villityypin p53 ovat herkempiä yhdistelmähoitoa IR ja 5-atsa-dC verrattuna ilmentävät mutantti p53. HCT116 solulinja käytettiin tässä tutkimuksessa ilmaisee villityyppisen p53, ja havaitsimme, että p53-taso nousi vastauksena 5-atsa-dC käsittely sekä ilman IR. Lisäksi p53-ilmentymisen taso nousi käsitellyissä soluissa yhdistelmä-5-atsa-dC ja IR kuin soluissa, joita käsiteltiin 5-atsa-dC yksin. Kuitenkin, toisin kuin HCT116-soluissa, mitään vaikutusta ei näy p53 tasolla SW480-soluissa, mikä ilmaisee mutantti p53 (kuvio 5). p53 on klassisesti kuvattu välittäjänä IR sytotoksisuuden ja toimii edistämällä joko solusyklin pysähtymisen tai apoptoosin [27], [28]. Aiemmat tutkimukset ovat raportoineet, että 5-atsa-dC indusoi p53 ilmentymistä, joka liittyy soluproliferaation inhibointi villityypin p53-soluja, mutta ei mutantti-p53-solujen eturauhassyövän [29], [30]. Koska vain muutama solulinjojen ja p53 liittyvät molekyylit tutkittiin näissä tutkimuksissa, lisätutkimuksia mahdollista yhteyttä 5-atsa-DC p53 on tarpeen. Lisätutkimuksia tarvitaan myös varata lisää epigeneettiset muutokset liittyvät radioherkkyyttä. On rajoitetusti tutkimuksia roolista DNA: n metylaation vastustuskyky IR. Eräs edellinen tutkimus osoitti, että hoito 5-atsa-dC aiheuttaa maapallon hypometylaatio, joka on sädeherkistävä vaikutus [23]. Siksi lopullinen tutkimuksia olisi tehtävä, onko IR vaikuttaa sivusto- tai geenispesifiseen DNA: n metylaation syövän (käsikirjoitus valmisteilla).

Tässä tutkimuksessa Solusyklianalyysiä ei muuttunut merkittävästi single