Krooninen sairaus

tiivistelmä

Kasvaimen eteneminen edistetään kasvaimeen liittyvä Makrofageilla (TAM) ja etäpesäkkeiden aiheuttama luun tuhoutumisen osteoklastien. Molemmat myeloidisolun tyyppejä riippuvat CD115-CSF-1 koulutusjakson niiden erilaistumista ja toiminta. Käytimme 3 eri hiiren syövän mallit tutkia vaikutukset kohdistuvat syövän isännän myeloidisoluissa monoklonaalisella vasta-aineella (mAb), jotka kykenevät estämään CSF-1: een sitoutuvien hiiren CD115. Hiirissä, jotka kantoivat ihonalainen EL4 kasvaimia, jotka ovat CD115-negatiivinen, anti-CD115 mAb köyhdytettyä F4 /80

+ CD163

+ M2-tyyppi TAM ja vähentää tuumorin kasvua, mikä johtaa pitkäaikaiseen eloonjäämiseen. Vuonna MMTV-PyMT hiirimallissa, spontaani ulkonäkö kouraantuntuva nisäkasvaimia viivästyi, kun anti-CD115 mAb annettiin ennen pahanlaatuiset siirtymistä ja kasvainten tuli kouriintuntuva vasta päättymisen immunoterapian. Kun hiirille, joissa jo perustettu PyMT kasvaimia, anti-CD115 pidensi niiden selviytymistä ja voimisti kemoterapiaa paklitakselin kanssa. Kuten on esitetty immunohistokemiallisesti, tämä terapeuttinen vaikutus korreloi ehtyminen F4 /80

+ CD163

+ M2-polarisoitunut TAMeja. Vuonna rintasyöpä malli luun etäpesäke, anti-CD115 mAb voimakkaasti esti erilaistumista osteoklastien ja niiden luun tuhoutumisen toimintaa. Tämä johti inhibitio syövän aiheuttama painon menetys. CD115 edustaa siten lupaava kohde syövän immunoterapiaa, koska tietty esto vasta-aine voi paitsi estää kasvun primaarisen kasvaimen läpi TAM ehtyminen, mutta myös mahdolliset metastaasit indusoimaa luun tuhoutumista kautta osteoklastien inhibition.

Citation: Fend L , ACCART N, Kintz J, Kochi S, Reymann C, Le Pogam F, et ai. (2013) terapeuttiset vaikutukset anti-CD115 monoklonaalinen vasta-aine in Mouse Cancer Models kautta Dual inhibitio kasvaimeen liittyvien makrofagien ja Osteoklastit. PLoS ONE 8 (9): e73310. doi: 10,1371 /journal.pone.0073310

Editor: Serge Nataf, University of Lyon, Ranska

vastaanotettu: 02 toukokuu 2013; Hyväksytty: 18 heinäkuu 2013; Julkaistu: 03 syyskuu 2013

Copyright: © 2013 Fend et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Laetitia Fend on vastaanottajan Industrial Training yleissopimusten Recherche (CIFRE) jatko yhteyteen. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat sidoksissa yritykselle Siirtogeeniekspressio ilmoittaa, että tämä ei muuta niiden noudattamista kaikille PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

makrofagien ja osteoklastien ovat myelooinen solutyyppejä tiedetään edistää syövän etenemisen eri vaiheissa taudin [1] – [5]. Niiden erilaistumisen ja toiminta säätelee CD115 (M-CSFR, CSF-1 R, c-FMS), jota koodaa

c-FMS

esikasvaintekijän ja kuuluvat luokkaan III reseptorin tyrosiinikinaasin perhe [6] . CD115 on ainoa solunpintareseptoriin tunnistettu tähän mennessä pesäkkeitä stimuloiva tekijä-1 (CSF-1), on merkittävä sytokiini säännellään erilaistumista, lisääntymistä ja migraatio myeloidista solujen [7]. Interleukiini-34 (IL-34) on viime aikoina todettu toisen CD115-ligandin vertailukelpoisia biologisia vaikutuksia [8]. Vaikka sääntely ja toiminta IL-34 aikana syövän etenemisen edelleen tutkittava, kokeellista ja kliinistä näyttöä ovat pitkälti dokumentoitu keskeistä asemaa CSF-1 in kasvainten kehittymiseen ja etäpesäke.

Ihmisillä CD115 ja CSF- 1 yli-ilmentyminen ovat yleisiä monenlaisia ​​kasvaimia (rinta-, eturauhas-, kohdun limakalvon, kohdunkaulan, munasarja- syöpiä), ja ovat korreloineet aggressiivisempaa sairauksiin ja huonoon ennusteeseen [9] – [13]. Rinta- kasvaimia, CD115 havaittiin ilmentyvän sekä kasvainsolujen ja tunkeuttamalla makrofagien [14]. Esitettiin S. Scholl

et al

. [15], että CSF-1 ei ehkä toimi vain autokriinikasvutekijänä tuumorisoluille, mutta myös makrofagien kasvainkohtaan edistää syövän etenemiseen. Vuonna MMTV-PyMT (PyMT) hiirimallissa spontaanin rintasyövän, CSF-1 on tuotettu kasvainsolujen todellakin osoitettu olevan tärkeä kemoattraktantti makrofagien ja parantaa niiden tunkeutuminen primaarikasvaimen [16]. Kasvaimeen liittyvä makrofagit (TAM) säädellä angiogeenisen kytkimen kautta induktion angiogeenisten tekijöiden, kuten verisuonten endoteelin kasvutekijän ja tuottaa matriisin metalloproteaasien, joka voi säädellä angiogeneesiä ja helpottaa metastaasin [17], [18]. Metastaattinen solut vaativat CD115-positiiviset makrofagit Ekstravasaation ja kasvamista metastasoituneeseen sivustolla [5].

In vivo

invaasio määrityksiä ovat osoittaneet, että TAM yhteistyössä vaeltavat rintasyöpää kasvainsolujen ja edistävät kasvainsolun invaasiota kautta paracrine silmukan liittyy kasvutekijän tuottama makrofagit, ja CSF-1 tuottama syöpäsoluja [19 ] – [21]. Lisäksi, CSF-1: n on osoitettu polarisoituvan makrofagien kohti vaihtoehtoisesti aktivoitu, troofisen tai M2-tyyppi, jolla on immunosuppressiivista aktiivisuutta ja joille on ominaista erityisesti CD163 ilmentyminen [22] – [28]. Suuren määrän TAM, jotka voivat muodostaa runsain immunosuppressiivinen solupopulaatio kasvaimen mikroympäristössä, ovat korreloineet huonoa ennustetta monissa syövissä kuten rintojen [1], [2], [4], [23]. Koska niiden pleiotrooppista rooleja syövän etenemiseen, TAM ovat merkittävä tavoite syöpäterapialle [29].

CSF-1 yliekspressio luun etäpesäkkeitä voi myös edistää erilaistumista osteoklastien, joka johtaa luuston vaurioita ja kipua syöpäpotilailla. Osteoklastien kuten makrofagit, ovat riippuvaisia ​​CD115 /CSF-1-reitin niiden erilaistumista [30]. CSF-1 etenkin indusoi RANK ilmentymisen osteoklastiesiasteiden [31] – [33]. Viimeaikaiset tulokset osoittavat, että CSF-1 on voimakas stimulaattori kypsän osteoklastin luun resorptioaktiviteettia lisäksi RANK /RANKL [32]. Sekä solun pinnan ja erittyvä CSF-1 tuottama kasvainsolujen metastaattisen luuhun voi osaltaan aiheuttaa osteoklastimuodostusta [3].

Olemme tutkineet vaikutuksia kohdistaminen CD115 3 eri hiiren syöpä malleja ominaista tunkeutuminen M2-polarisoitu TAMeja primäärikasvaimissa tai muodostamalla osteolyyttiset etäpesäkkeitä. Tätä varten käytimme monoklonaalinen vasta-aine (mAb), AFS98, tiedetään estävän CSF-1 sitoutumisen hiiren CD115-ilmentäviä soluja ja estää CSF-1-riippuvainen pesäkemuodostusta hiiren luuytimen esiasteista [34]. Tämä mAb on käyttänyt muiden kirjoittajien heikentävistä myeloidisolun alaryhmiä erilaisissa kokeellisen hiiren malleissa [19], [29], [35], [36].

tulokset korostavat mahdollisuuksia syövän immunoterapia kanssa anti-CD115 mAb, joka voi estää kasvaimen kasvua kuluttamalla TAM, synergoida kemoterapiaa ja estää luun tuhoutumisen osteoklastien.

Materiaalit ja menetelmät

Vasta

hybridooma AFS98 erittävä rotan anti-hiiri-CD115 IgG

2a oli ystävällisesti Pr S. Nishikawa (RIKEN Center for Developmental Biology, Japani). MAb oli tuotettu viljelemällä hybridoomaa täydellistä RPMI-väliainetta, joka sisälsi 5% FCS: ää ja puhdistettiin proteiini G (Millipore) ja diasuodatus on Pellicon 3 30 kDa (Millipore). LgG käytettiin negatiivisena kontrollina oli Rockland /Tebu-bio. Joissakin tapauksissa, mAb AFS98 ja isotyyppikontrolli rotan IgG:

2a hankittiin eBiosciences.

Cell Lines

EL4 hiiren lymfoomasolulinja (ATCC TIB-39) viljeltiin täydellisessä DMEM-elatusainetta (Sigma-Aldrich), jossa oli 10% FCS: ää (PAA Laboratories) ja 40 ug /ml gentamysiiniä (Schering-Plough) ja 2 mM glutamiinia (Sigma). MDA-MB231SA-GFP6 ihmisen rinta- syöpäsolujen käytetään metastaasin luukadossa malli saatiin Pharmatest (Turku, Suomi) Dr. Theresa Guise (Indiana University, Indianapolis, USA) [37], [38] ja transfektoitiin pTurboGFP- N-vektoriin (Evrogen).

Immunofluoresenssi

Mouse formaliinilla kiinnitetyt, parafiiniin upotettuja kudosleikkeiden poistettiin parafiini ja rehydratoitiin, ja epitoopit haettiin keittämällä 10 mM sitraattipuskuria, pH 6. EL- 4 kryoleikkeet rehydratoitiin ja kiinnitettiin asetonissa. Kohdat kyllästettiin 3% H2O2: ta ja 10% vuohen seerumia poistaa endogeenisen peroksidaasin aktiivisuuden ja ei-spesifistä värjäytymistä, vastaavasti, ennen inkubaatiota 90 min huoneen lämpötilassa vasta-aineiden F4 /80 (BM8, ref. MF48000, Caltag) tai CD163 (M-96, viite. sc-33560, Santa Cruz). Kuvitella järjestelmä (HRP-konjugoidun polymeerin kytketty sekundaarisia vasta-aineita, ref. K4003, Dako) ja TSA-Cy3 (ref. SAT704A, Perkin Elmer) käytettiin signaalin vahvistus. Lopuksi leikkeet vastavärjättiin 0,5 ug /ml DAPI (Hoechst 33258, B-2883, Sigma) ja asennettu MowiolR (Calbiochem). Isotyyppi-sovitettua kontrolli vasta-aineita käytettiin negatiivisina kontrolleina. Kuvat otettiin optisella mikroskoopilla 90i (Nikon) varustettu 40x tavoitteen ja epifluoresenssilla (asteikko bar = 50 pm). Signaali kvantifioitiin § skannaa (Nanozoomer, Hamamatsu) käyttäen ImageJ (https://rsb.info.nih.gov/ij) ilmainen ohjelmisto. Tätä varten kuvat jaettiin 3 kanavaa (punainen, vihreä ja sininen). Sininen kanava mahdollistaa määrällisesti sininen pikseliä määritellään kasvain osassa pintaa, kun taas punainen kanava mittaa punaista pikseliä vastaavan immuno- pintaan. Prosenttiosuudet positiivisten solujen lasketaan (punainen pikseliä /sininen pikseliä) x100.

Prekliiniset Mouse Models

Kokeet suoritetaan EL-4 ja PyMT syövän mallien tehtiin täysin noudattaen CEE direktiivi 2010/63 22. syyskuuta

d 2010 suojeluun liittyviä käytettävien eläinten kokeisiin tai muihin tieteellisiin tarkoituksiin ja noudattaen Ranskan lakia (décret n ° 2013-118 1. helmikuuta

st, 2013 ) ja hyväksynyt Comité National de pohdiskelu Ethique sur l’Experimentation animale (CNREEA, eettinen komitea TG numero 93). Kokeet on rintasyöpä luumetastaasipotilailla -mallin hyväksynyt Suomen kansallisen komitean eläinkokeet (ajokortin numero STH667A).

EL4 Kasvainmalli

Viisi viikkoa vanhoja C57BL /6-hiiriä (Charles River Laboratories) pidettiin tietyssä-taudinaiheuttajista vapaa eläin laitos ja totutettu viikkoa ennen kokeita. Päivinä 0, 10

4 EL-4-soluja injektoitiin subkutaanisesti oikeaan kylkiin hiirillä. Kymmenen päivää tuumorin implantaation jälkeen, mAb: t laimennettiin PBS annosteltiin IP 10, 25 tai 50 mg /kg ryhmille 21 hiirillä. Injektiot suoritettiin 3 kertaa viikossa 3 viikon ajan. Kasvaintilavuudet tarkkailtiin kahdesti viikossa mittaharppimittauksilla kunkin dimension ja lasketaan käyttäen seuraavaa kaavaa: V = 4/3 π (pituus /2) (leveys /2) (syvyys /2). Kolme hiirtä ryhmässä pitäen EL4 kasvaimia tapettiin päivinä 20 ja 27, kun kasvaimet otettiin näytteet makrofagien havaitsemiseen immunofluoresenssilla. Hiiret lopetettiin kaulan sijoiltaan, kun kasvain ylsi 3000 mm

3 tai kun eläimet osoittivat hädässä, tarpeettoman kärsimyksen välttämiseksi. Tilastot kasvainten tilavuudet (n = 15 hiirtä /ryhmä) suoritettiin käyttäen Kruskal-Wallisin testi seurasi Mann-Whitneyn testi pareittain vertailuissa. Log-rank testi käytettiin tilastolliseen analyysiin Hiiren eloonjäämisen (n = 15).

PyMT Kasvainmalli

MMTV-PyMT (PyMT) siirtogeenisiä hiiriä saatiin Mayo Foundation for Medical koulutus ja tutkimus (Rochester, Minnesota) ja sijaitsee tietyllä-taudinaiheuttajista vapaa eläin laitokseen. Kantaa ylläpitämä takaisinristeyttämäl- on C57BL /6 taustalla. Kun PyMT hiirillä oli 10 viikon iässä (varhainen hoito), 10 hiirtä ryhmää kohden annettiin mAbrllä kautta IP reittiä, 3 kertaa viikossa 4 viikon ajan opiskeluun kasvaimen kasvua ja hiiri selviytymistä. Myöhäinen käsittely suoritettiin samalla tavalla, mutta lähtien viikolla 16. MAb: tä annettiin annoksena 50 mg /kg, laimennettuna PBS: ssä. Kasvaintilavuudet seurattiin joka 7. päivä mittaharppimittauksilla 3 mitat ja lasketaan käyttäen seuraavaa kaavaa: V = 4/3 π (pituus /2) (leveys /2) (syvyys /2). Tarpeettoman kärsimyksen välttämiseksi, hiiret lopetettiin katkaisemalla kaula, kun yhteensä kasvainten, eli summa kaikkien mitattavissa kasvaimia, oli yli 2000 mm

3. Tilastoja kasvainten tilavuudet tehtiin käyttäen Kruskal-Wallisin testi seurasi Mann-Whitneyn testi pareittain vertailuissa. Tilastot eloonjäämiseen suoritettiin käyttäen Log-rank-testiä. Vuonna toistetuista kokeista suoritettiin 3 hiirtä ryhmässä, eläimet tapettiin katkaisemalla kaula viikon kuluttua hoidon lopettamisen. Kolme 5 kasvaimia kohti hiiriä otettiin näytteet immunofluoresenssimenetelmällä ja histopatologia.

histopatologia

etenemistä primaarikasvainten analysoitiin tuumorisektioiden 4-25 viikkoa vanha PyMT hiirillä. Lyhyesti, maitorauhaset kiinnitettiin 10% formaliinilla 4 ° C: ssa ja sen jälkeen kuivattu. Kudokset upotettiin parafiiniin, leikattiin leikkeiksi, ja värjättiin hematoksyliinillä ja eosiinilla (H 0,05 verrattuna kasvaimen tilavuuteen PBS-käsiteltyihin hiiriin (n = 15). B. Prosenttiosuudet elossa hiirtä kussakin ryhmässä. * Log-rank testi, p 0,05 verrattuna PBS-käsitellyn hiiren ryhmässä (n = 15).

EL-4 kasvainten näytteet vuorokautena 20 hiirille on joko PBS (A, C, E) tai 50 mg /kg mAb AFS98 (B, D, F) analysoitiin IF anti-F4 /80-mAbin (A, B), anti-CD163-mAb (C, D) tai merkityksetöntä isotyyppikontrolli (E, F ). Sininen: DNA; Punainen: F4 /80

+ makrofageja (A, B) tai CD163

+ M2-tyypin makrofagit (C, D). Osiot osoittaneet saatiin yhdeltä kasvain edustaja 3 analysoitiin ryhmää kohti. F4 /80 (G) ja CD163 (H) värjäys kvantitoitiin kasvaimissa esitetty AD.

Koska CSF-1 normaalisti poistuu verenkierrosta CD115 endosytoosin [40] ja sen jälkeen AFS98 estää CSF-1 /CD115 sitova, me titrattu tasot verenkierrossa CSF-1, kun vain yksi mAb injektio. Heti kuin yksi päivä annon, AFS98 at kaikilla tutkituilla annoksilla kasvanut dramaattisesti CSF-1 pitoisuus seerumissa (kuva S2). Vaikka seerumin CSF-1 oli tuskin havaittavissa ELISA puskuriin saaneilla hiirillä, sen pitoisuus saavutti 2000 pg /ml yhden päivän kuluttua AFS98 injektion. Tärkeyden ja kesto CSF-1 kertymistä seerumissa korreloi annokset AFS98 annettuna. 25 tai 50 mg /kg, AFS98 oli vielä vaikuttaa voimakkaasti CSF-1 seerumissa, joka oli edelleen lisääntyi 19 päivää injektion jälkeen 50 mg /kg. Tämä tulos saattaa selittää suuren annoksen AFS98 (50 mg /kg), joka tarvitaan saavuttamaan terapeuttinen vaikutus, koska mAb on kilpailtava CSF-1 CD115 sitoutumisen.

Anti-hiiri-CD115 mAb-hoito Viivyttää Ulkonäkö maitorauhasen kasvaimia PyMT hiiret

siirtogeenisiä MMTV-PyMT hiiriä, jotka ekspressoivat polyooma keskellä T-onkogeenin ohjauksessa hiiren nisätuumoriviruksen promoottori, kehittävät spontaanisti nisäkasvaimia vaiheiden verrattavissa ihmisen tilannetta [16], [ ,,,0],39]. Perustuu neliportaisen luokituksen kuvattu PyMT hiirillä jalosteta C3H /B6 tausta Lin et al [39], olemme histologisesti etenemistä rintarauhaskasvainten PyMT hiiriä C57BL /6 geneettinen tausta (kuva 3). 4 viikon iässä, muutama maitorauhaset olivat hyperplasic kanssa epiteelisolujen lisääntyvissä sisällä acini ja muodostaa keskeisten tai multifokaalinen ryppäitä terminaali kanavat. Lisäksi hyperplasia, adenoomien (maitorauhasen intraepiteliaalinen neoplasia MIN) havaittiin 6 viikon iässä, tunnettu siitä, että kiinteä arkkia lisääntyvien epiteelisolujen täysin täyttämällä acini mutta rajoittuu tyvikalvon. Pesäkkeitä leukocytic tunkeutumisen liittyvän kohonneeseen vascularization. Alkuvaiheessa pahanlaatuisia siirtymävaiheessa, kutsutaan varhainen karsinooma (EY), todettiin ensimmäisen kerran alkaen 10 viikon iässä. EY leimasi muutos ydin- morfologian häviämiseen tyvikalvoissa ja korkea tiheys valkosolujen suodattuu ympäröivään acini. Nisäkasvaimia tuli kouraantuntuva välillä 13 ja 14 viikon iässä ja viikolla 16, kaikki hiiret oli käsin kosketeltava kasvaimia. Advanced invasiivisia (myöhäinen) karsinoomat (LC) näytti noin 18 viikon iässä, jolle on ominaista kiinteä arkkia epiteelisolujen ja menetys asinussolujen rakenteiden häviämisen tyvikalvoissa ja läsnäolo nekroottisen alueilla. LC olivat aina liittynyt keuhkometastaasitestissä.

Prosenttipiste jakautuminen kasvaimen vaiheissa ominaista histopatologisesti. Neljästä kuuteen maitorauhasista poistettiin 2-6 PyMT hiirissä osoitti aikojen.

pyrittiin tutkimaan vaikutusta anti-CD115-mAb-hoidon kehittämiseen näiden nisäkasvaimia. Kasvaimen leikettä n vaiheessa kaikki F4 /80-positiivisia tunkeutumisatmosfäärin makrofagien värjättiin anti-CD115-vasta-ainetta (kuvio S3). Sen sijaan PyMT kasvainsolut eivät ilmennä CD115 [16] ja siksi ei voida suoraan kohdistaa AFS98 hoitoa. MAb annettiin (50 mg /kg, IP 3 kertaa viikossa), ja PyMT hiiriä viikolla 10-13, aikaan MIN EY siirtymistä (kuvio 3). Palpoitavissa nisäkasvaimia ilmestyi merkittävästi myöhemmin (15,8 +/- 0,9 viikko, n = 10) kuin hiirissä, joita hoidettiin isotyyppikontrollilla (13,8 +/- 1,4 viikkoa, p = 0,0112, n = 10) tai PBS: llä (14,4 +/- 1,1 viikkoa, p = 0,020, n = 10) (kuvio 4A). Kasvaimen koot olivat merkittävästi pienempi AFS98 viikolla 13 (p = 0,0149 vs PBS ja p = 0,0098 vs rotan IgG) ja viikolla 14, päättymisen jälkeen hoidon (p = 0,0183 vs rotan IgG- ja p = 0,0212 vs PBS-käsiteltyjen hiiret) (kuvio 4B). AFS98 hoito pidensi merkittävästi kun sitä verrattiin rotan IgG (p = 0,018) (kuvio 4C). Huomattavaa on, että hoito lgG oli vahingollinen vaikutus eloonjäämiseen verrattuna PBS-hoidetussa ryhmässä (p = 0,0283). Terapeuttinen vaikutus anti-CD115 -mAb hävisi kahden viikon kuluttua lopettamisesta hoidon. Tämä voidaan selittää dramaattinen upregulation verenkierrossa CSF-1, esiintyy C57BL /6 (kuvio S2) ja PyMT hiirissä (tuloksia ei ole esitetty) sen jälkeen, useiden mAb annon.

10 viikkoa iässä, MMTV -PyMT hiiriä hoidettiin 50 mg /kg mAb AFS98, ohjaus rotan IgG- tai PBS, injektoitiin IP 3 kertaa viikossa viikosta 10 viikkoon 13 A. ulkonäkö palpoitavissa kasvainten viivästyi AFS98-käsitellyissä hiirissä. Keski-ikä (viikkoina ± SEM) palpoitavissa kasvainten havaitseminen on esitetty kunkin 3 hiiren ryhmään. * Mann-Whitneyn testi p 0,05 verrattuna Rat IgG ja PBS-käsitellyn hiiren ryhmässä (n = 10). B. Tuumoritilavuudet on esitetty keskiarvoina ± SEM. * Merkitsevää eroa kasvaimen tilavuuden käyttämällä Mann-Whitneyn testi, p 0,05 ryhmien välillä hoidettiin Rat IgG ja PBS (n = 15). C. Prosenttiosuudet elossa hiirtä kussakin ryhmässä. * Log-rank testi, p 0,05 verrattuna ilmoitetun hiiren ryhmää (n = 10).

Kuten todettu EL4 SC kasvain mallissa makrofagimarkkeri F4 /80 oli vahvasti vähentynyt ensisijainen maitorauhasen kasvainten PyMT hiirissä, joita hoidettiin 50 mg /kg AFS98 näyte viikon kuluttua lopettamisesta hoidon, verrattuna PBS-käsiteltyihin hiiriin (kuvio 5A, B, G). Lukumäärä M2-polarisoitunut makrofagit tunnistettiin CD163 värjäys pienensi myös kasvaimissa anti-CD115-hoidetut hiiret (kuvio 5C, D, H). Kuitenkin, angiogeneesiä ei ollut havaittavasti inhiboi kuin saapuvat CD31-värjäys näistä kasvaimista, näyte viikon kuluttua lopettamisesta hoidon (tuloksia ei ole esitetty).

F4 /80 (A, B) tai CD163 (C, D ) ilmentyminen nisäkasvaimia näytteitä viikolla 14 hiirille on joko PBS (A, C) tai mAb AFS98 (B, D). Värjäys merkityksetön isotyyppikontrollilla näkyy E, F pääluokat esitetään saatiin yhdellä hiiren edustaja 3 analysoitiin ryhmää kohti. Sininen: DNA; Punainen: F4 /80

+ (A, B) tai CD163

+ (C, D) makrofageja. F4 /80 (G) ja CD163 (H) värjäys määrä määritettiin kasvaimia hiirille on joko PBS, ohjaus rotan IgG- tai mAb AFS98.

Late Anti-hiiri CD115 mAb Hoito pidentää Survival of PyMT Hiiret ja Voimistaa vaikutus Kemoterapia

sitten tutkittiin vaikutusta anti-CD115 mAb hoitotoimet myöhemmin syövän etenemiseen. AFS98 annosteltiin (50 mg /kg, IP 3 kertaa viikossa, 3 viikkoa), alkaen viikolla 16, jolloin kaikki kasvaimet olivat käsin kosketeltava, enimmäkseen EY vaiheessa ilman vielä saavuttaa LC vaiheessa (kuva 3). Viikon kuluttua hoidon lopettamisen (viikko 20), koot primaaristen kasvainten merkittävästi pienentynyt AFS98 hoidetussa ryhmässä verrattuna PBS: llä (p = 0,0101, n = 10), mutta ei IgG-käsiteltyjen hiirten (s = 0,1457, n = 10) (kuvio 6A). Eloonjääminen merkittävästi pidentynyt AFS98 verrattuna joko PBS: ää (p = 0,0031) tai IgG: tä (p = 0,0474) (kuvio 6B). Kuten nähdään, kun hoito aloitettiin aikaisemmin (kuvio 5), ehtyminen CD163

+ makrofagien havaittiin kasvaimia käsiteltyjen hiirien AFS98 (kuva S4).

16 viikkoa ikäisiä transgeenisiä PyMT hiiret annettiin 50 mg /kg mAb AFS98 tai isotyyppikontrollilla tai PBS, IP, 3 kertaa viikossa 4 viikkoa, yksinään (A, B) tai yhdistettynä (C, D), jossa paklitakseli 5 mg /kg, IP, kerran viikossa ja 3 viikkoa. A. Tuumoritilavuudet edustettuina tarkoittaa ± SEM. * Mann-Whitneyn testi p 0,05 AFS98- verrattuna PBS-käsitellyistä hiiristä. Viikolla 20, * p 0,05 AFS98- ja rotan IgG- vs PBS-käsiteltyihin hiiriin. B. prosenttiosuus elossa hiirten oli merkittävästi lisääntynyt AFS98 hoidetussa ryhmässä. * Log-rank testi, p 0,05 välillä AFS98- ja Rat IgG-käsiteltyjen ryhmien ja ** p 0,005 välillä AFS98- ja PBS-käsiteltyihin hiiriin (n = 10). C. Tuumoritilavuudet edustettuina tarkoittaa ± SEM. * Mann-Whitneyn testi p 0,05 yhdistelmälle Paklitakseli + AFS98 verrattuna Paklitakseli + PBS, ja p 0,01 verrattuna Paklitakseli + Rat IgG. ** P 0,01 ja *** p 0,001 Paklitakseli + AFS98 verrattuna paklitakseli + Rat IgG tai PBS: ää (n = 10). D. prosenttiosuus elossa hiirillä lisäsi merkitsevästi AFS98 yhdistettynä Paklitakseli. ** Log-rank testi, p 0,01 hiiriä hoidettiin Paklitakseli + AFS98 verrattuna paklitakseli + Rat IgG- tai PBS.

vaikutuksen tutkimiseksi anti-CD115 mAb yhdessä kemoterapia, me Yhdistetyt jälkimmäinen AFS98 hoito paklitakselin (5 mg /kg, IP 1 kerran viikossa). Paklitakselia tällä annoksella ei havaittu merkittäviä terapeuttisia vaikutuksia, mutta suuntauksena väheneminen kasvaimen kasvua. Vuonna PyMT hiirissä, joita hoidettiin paklitakselia yhdistettynä AFS98, koot primaaristen kasvainten väheni merkitsevästi verrattuna PBS: llä (p = 0,0155, p = 0,0039 ja p = 0,0009 viikolla 17, 18 ja 19, vastaavasti, n = 10) tai rotan IgG: tä (p = 0,0077, p = 0,0022 ja p = 0,0005 viikolla 17, 18 ja 19, vastaavasti, n = 10) (kuvio 6C). Eloonjääminen merkittävästi pidentynyt, kun Paklitakseli yhdistettiin AFS98, verrattuna joko PBS: ää (p = 0,0014) tai IgG: tä (p = 0,00072) (kuvio 6D), joka osoittaa, että anti-CD115-mAb hoito voisi voimistaa kemoterapiaa.

Anti-hiiri CD115 mAb Estää Osteoklastit ja Bone Destruction on Breast Cancer luumetastaasipotilailla Model

tutkineet vaikutusta CD115 saarron etäpesäkkeitä aiheuttama osteoklastien aikaansaamaa luun hajoamista. Tätä varten olemme käyttäneet mallia, jossa ihmisen rintasyövän solut injektoidaan vasemman sydämen kammiot on kateenkorvattomissa hiirissä aiheuttaa osteolyyttiset etäpesäke [37], [41]. MDA-MB231-solujen tiedetään erittävän ihmisen CSF-1 [42], joka voi aktivoida hiiren CD115 [7]. MDA-MB231-soluissa on raportoitu myös ilmaista ihmisen CD115 [42], mutta mAb AFS98 on spesifinen hiiren CD115 [34]; siksi tässä mallissa, anti-CD115 mAb hoitoon kohdistuvat vain hiiren myeloidisolun lokero. Hiirten käsittely 50 mg /kg mAb AFS98 voimakkaasti inhiboi kehitystä osteolyyttisiä leesioita visualisoitiin X-ray radiografian (kuvio 7A). AFS98 näkyy samanlainen aktiivisuus kuin tsoledronihapolle, Standart-of-care estäjän osteolyysiä, jota käytettiin positiivisena kontrollina. Molemmat yhdisteet vähentynyt alueella sekä lukumäärän osteoklastien leesioita verrattuna PBS: ää tai lgG valvontaa. AFS98 ja tsoledronihapon olivat yhtä tehokkaita vähentämään osteoklastien lukumäärä, kuten on esitetty osteoklastien markkeri tartraatti-resistentti hapan fosfataasi 5b (TRACP 5b), joka väheni seerumissa hiirten päivinä 17 (tuloksia ei ole esitetty) ja 24 (kuvio 7B) . Mitattuna histomorfometriassa, osteoklastien numerot kasvain luun rajapinnan voimakkaasti väheni AFS98 tai tsoledronihappoa. Molemmat yhdisteet lisääntynyt koko ja trabekkeliluuta alueilla, joissa voimakkaampi vaikutus tsoledronihapon on trabekkeliluulla alueilla (kuvio 7C). Syöpään liittyvä laihtuminen estyi niinikään tsoledronihappoa tai AFS98. MDA-MB231-solulinjasta käytettiin tässä tutkimuksessa ilmentää stabiilisti GFP [37]. Koko kehon kasvaintaakkaa analysoitiin fluoresenssikuvantamisella ei muutettu joko anti-CD115 mAb tai tsoledronihappo hoito, verrattuna verrokkieläimiin (tuloksia ei ole esitetty). Kaiken kaikkiaan nämä tulokset osoittavat, että anti-CD115-mAb inhiboi etäpesäkkeiden aiheuttamaa luun tuhoutumista kohdistamalla osteoklastien.

Kateenkorvattomia nude-hiiriin istutettiin MDA-MB231 kasvainsoluja käsiteltiin mAb AFS98, ohjaus rotan IgG: tä (molemmat IP at 50 mg /kg, IP 3 kertaa viikossa), tsoledronihappo (0,1 mg /kg) tai PBS: ää (molemmat SC, päivinä 0 ja 14). 7.A. Bone-suojaava vaikutus anti-CD115 mAb. Osteolyyttisiä leesioita mitattiin kokeen lopussa.

Vasen

: Total osteolyytti- vaurioalueet (mm

2, keskiarvo + SD) esitetään summat aloilla luun vaurioiden oikea ja vasen sääriluu ja reisiluu.

Oikea

: lukumäärä osteolyyttisiä leesioita (keskiarvo + SD). Tulokset on esitetty, koska laskee yksittäisten luuleesioita sisään oikean ja vasemman säären ja reisiluu. 7.B Osteoklastien estävä vaikutus anti-CD115-mAb.

Vasen

: osteoklastien markkeri TRACP 5b titrattiin seerumissa näytteet vuorokautena 24. Tulokset ilmaistaan ​​suhteellinen muutos (%) seerumin TRACP 5b päivästä 0 päivään 24 (keskiarvo + SD).

Oikea

: Palasia takajalkojen kunkin eläimen värjättiin TRACP 5b ja osteoklastien numeroitu kasvain luun rajapinnan (keskiarvo + SD). Osteoklastien jakaantui pituutta tämän käyttöliittymän. 7.C Effects of anti-CD115 mAb trabekulaarisilla luuhun ja estämällä syövän aiheuttama laihtuminen.

Vasen

: Trabekulaariluun ala (mm

2, keskiarvo + SD) kunkin eläimen määritettiin histomorfometrialla. * P 0,05; Lin et ai.