Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Lääkeaineresistenssi, prosessi välittämä useita mekanismeja, on kriittinen tekijä hoitoon keuhkosyöpään. Tutkimuksen tavoitteena on selvittää, jos oleanolihapon (OA), pentasyklisestä triterpene läsnä useissa tuotantolaitoksissa, pystyy kiertämään mekanismeja lääkeresistenssin läsnä ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) solulinjojen ja aiheuttavan niiden kuoleman .

Keskeiset havainnot

OA vähensi solujen elinkelpoisuuden NSCLC solulinjoista A459 ja H460 läsnäolosta huolimatta aktiivinen, monilääkeresistenteistä (MDR) MRP1 /ABCC1 proteiineja ja anti-apoptoottiset proteiinit Bcl-2 ja surviviiniin. Nämä vaikutukset johtuvat apoptoosin, mistä on osoituksena kapasiteetti OA aiheuttaa pirstoutumista DNA ja aktivoida kaspaasi 3. induktio NSCLC solukuoleman OA ei voida selittää estämällä MDR proteiineista, sillä hoito triterpene oli vähän tai ei lainkaan vaikutusta aktiivisuudesta tai ilmaus MRP1. Lisäksi hoito OA ei ollut vaikutusta ekspression anti-apoptoottisen proteiinin Bcl-2, mutta lisäsi ekspressiota pro-apoptoottisen proteiinin Bax, muuttamalla Bcl-2 /Bax tasapainoa kohti pro-apoptoottisten profiili. OA myös vähentynyt ilmentyminen anti-apoptoottisen proteiinin surviviiniin. Lisäksi OA vähentynyt ilmentyminen angiogeenisten verisuonten endoteelin kasvutekijä (VEGF) ja väheni kehittäminen melanooman aiheuttama keuhkojen etäpesäkkeiden.

Johtopäätös

tiedot antavat merkittävää tietoa kasvaimen kasvua estävä ja antimetastaattista aktiivisuutta OA NSCLC ja viittaavat siihen, että myös OA NSCLC hoito voi auttaa vähentämään relapsien määrä ja vähentää kehittämistä etäpesäkkeitä.

Citation: Lúcio KA, Rocha GDG, Monção-Ribeiro LC, Fernandes J, Takiya CM, Gattass CR (2011) oleanolihapon vihityt apoptoosi ei-pienisoluinen keuhkosyöpä Solulinjat ja Vähentää metastaasin on B16F10 Melanooma Model

in Vivo

. PLoS ONE 6 (12): e28596. doi: 10,1371 /journal.pone.0028596

Editor: Joseph Alan Bauer, Bauer Research Foundation, Yhdysvallat

vastaanotettu: 03 tammikuu 2011; Hyväksytty: 11 marraskuu 2011; Julkaistu: 09 joulukuu 2011

Copyright: © 2011 Lúcio et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustuksia Financiadora de Estudos e Projetos (FINEP /FNDCT /NQTN Conv. 01.06.0390.00), Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ myöntää useita e-26 /110,135 /2009) , Instituto Nacional para Pesquisa Translacional em Saúde e Ambiente na Região amazonica (INCT-INPeTAm /CNPq /MCT Conv. # 57,3695 /2008-3) ja Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Ensino Superior (viitat, PhD apurahan KAL). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Worldwide, keuhkosyöpä on yleisin syy syöpään liittyvän kuoleman [1]. Ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) on yli 80% kaikista diagnosoitu keuhkosyövässä. Korkea kuolleisuus tämän taudin johtuu vaikeuksista varhaisen havaitsemisen. Tuolloin diagnoosin, useimmat potilaat ovat leikkaushoitoon, kehittynyt tauti, johon imusolmukkeiden tai sisäelinten etäpesäkkeitä, tai molempia. Platinapohjaisen kemoterapian, yksi tärkeimmistä hoitoja NSCLC viime vuosikymmeninä, esillä useita ongelmia: sen lisäksi, että erittäin myrkyllinen, kuten kemoterapia vain tuotti vaatimattoman parannusta kokonaiselossaoloaikaa [2]. Senkin jälkeen kehitetään lääkkeitä, jotka kohdistuvat kasvua kasvain, yleinen eloonjäämisaste potilaiden NSCLC edelleen alhainen [3]. Kemoterapeuttisen epäonnistuminen keuhkosyöpä voi edistää etäpesäkkeiden ja korkea sairastuvuus, mikä osoittaa, että tehokas hoitoja tarvitaan.

moniresistenssin (MDR) on keskeisessä asemassa epäonnistumiseen keuhkosyövän kemoterapiaa. Vaikka useat mekanismit voivat välittää MDR tutkijat ovat omistettu paljon huomiota yliekspressio kuljettaja proteiinien adenosiini-5′-trifosfaattia (ATP): aa sitova kasetti (ABC) perheen ja korjauksilla tekijöitä apoptoottisessa prosessissa. Expression of MDR proteiinien pidetään pääsyy potilaan taudin uusiutumisen hoidon jälkeen; kirjallisuus data [4], [5] ovat kuvanneet suhde ilmaus ABC proteiinien ja huono tulos pienisoluista keuhkosyöpää kemoterapiaa. MDR proteiineja, kuten P-glykoproteiinin (P-gp) /ABCB1 ja Multiple lääkkeille vastustuskykyiset Protein 1 (MRP1) työ effluksipumppujen jotka pystyvät poistamaan erilaisia ​​lääkkeitä solusta estäen solukuolemaa [6]. Muutokset mekanismeja, jotka vaimentavat pro-apoptoottisia reittejä ja /tai täydentää anti-apoptoottiset reitit ovat myös tärkeitä tekijöitä kehityksessä kemoterapeuttisen resistenssin kasvaimissa [7], [8]. Useat tutkimukset osoittivat, että estävä anti-apoptoottiset proteiinit, B-solulymfooma 2 (Bcl-2) [9], [10], tai apoptoosi-inhibiittori (IAP) perheet [11], [12] herkistää NSCLC-soluja kemoterapialle.

Toinen tunnusmerkki pahanlaatuisia syöpäsoluja on niiden kyky luoda etäpesäkkeitä. Koska metastaattinen sairaus, sen sijaan paikallista kasvaimen kasvua, määrittää potilaiden kuolleisuutta, tuumorien etäpesäke on korkein prioriteetti syövän hoidossa. Huomattava määrä todisteita, on tullut viittaa siihen, että akselin välinen verisuonten endoteelin kasvutekijä (VEGF) reseptori, ja Flk-1-kinaasi-inserttidomeenin reseptori (KDR) (VEGF-Flk-1 /KDR) on hallitseva signaalinvälitysreitin säätelevä kasvaimen angiogeneesi ja metastaasi [13]. Kuitenkin, koska tärkein vaatimus etäpesäkkeiden kehittymisessä on läsnä elävien kasvainsolujen mekanismeja lääkeresistenssin, kuten ilmaus MDR-proteiinien ja anti-apoptoottisia tekijöitä, on ehdotettu suotuisat olosuhteet etäpesäkkeiden kehittymisessä [14], [15].

Monet yhdisteet luonnollista alkuperää kykenevät moduloimaan lääkeresistenssin. Oleanolihapon (OA), pentasyklisestä triterpenoidi löytyy erilaisia ​​kasvilajeja, esittelee useita biologisia ominaisuuksia, kuten tulehdusta [16], [17], maksa- ja nefrotoxicity suoja [18], [19], elpyminen hematopoieesijärjestelmän säteilytyksen jälkeen [20] ja sytotoksisuutta useita syöpäsolulinjoja [21], [22], [23]. Aikaisemmassa tutkimuksessa osoitimme, että OA tehoaa myös MDR erytroleukeemisesta solut yli-ilmentävät P-gp: n ja sen herkkä vastine [24]. Tässä tutkimuksessa suoritettiin tutkimaan sytotoksisia vaikutuksia OA NSCLC (A549 ja H460), joka ilmaistaan ​​sekä MRP1 [25], [26] ja antiapoptooppinen tekijöitä [7], [8], ja tutkia vaikutukset tämä triterpene kulkeutumisteistä mukana lääkeresistenssin ja etäpesäkkeiden kehittymisessä.

OA indusoi apoptoosia sekä solulinjoissa. Hoito tällä triterpene vähentynyt surviviinin ilmentymiseen ja lisääntynyt ilmentyminen Bax, ilman että se vaikuttaa Bcl-2 tai MRP1. Lisäksi OA vähensi VEGF: n ilmentymistä ja esti kehittäminen melanooman aiheuttama keuhkojen etäpesäkkeiden. Yhdessä nämä tiedot viittaavat siihen, että OA voi olla hyvä ehdokas hoidossa kasvainten luontainen ilmaus resistenssin mekanismeja, kuten keuhko- kasvain.

Materiaalit ja menetelmät

Materiaalit

oleanolihapon (OA), moolimassa 456,7, edellyttäen, Sigma Chemical Co. (Saint Louis, MO, USA), liuotettiin 10 mM: aan dimetyylisulfoksidia (DMSO), säilytetään -20 ° C: ssa ja laimennettiin viljelyalustassa käyttää. DMSO, 3- (4,5 dimethylthiozol-2-yyli) -2,5-difenyyli-tetratsolium (MTT), propidiumjodidia (PI) ja rodamiini 123 (Rho123) hankittiin Sigmalta. 5-carboxifluorescein diasetaatti (5-CFDA) saatiin yhtiöstä Calbiochem (San Diego, CA, USA). Dulbeccon modifioitu Eaglen väliaine (DMEM), vasikan sikiön seerumia (FCS), penisilliiniä ja streptomysiiniä oli Life Technologies, Inc. (USA). FACS lyysiliuos oli BD Biosciences (San Jose, CA). Kaspaasit-3 iinianalyysikitissä (CaspGlow) oli peräisin BioVision (Mountain View, CA, USA). Vasta-aineita Bax (klooni P-19), VEGF: n (klooni C-1) ja tubuliinin (klooni b-7) ostettiin Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). Bcl-2-vasta-aine (klooni 124) oli peräisin DAKO (Carpinteria, CA, USA) ja surviviini-vasta-aine (ab24479) hankittiin Abcam (Cambridge, MA, USA). Biotinyloitu anti-hiiri-IgG ja CY3-leimatulla streptavidiinilla olivat yhtiöltä Sigma. Biotinyloitu anti-vuohi-IgG, anti-kani-IgG ja Vectashield® kiinnitysväliaine hankittiin Vector Laboratories (Burlingame, CA, USA). 4 ’, 6-diamino-2-fenyyli (DAPI) ja PE-leimattua anti-MRP1 (QCRL-2) olivat Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). Anti-MRP1 (klooni A23, Axxora, San Diego, CA), Bcl-2: n (klooni bcl2-100, Zymed, San Francisco, CA), anti-hiiri-HPR (Amersham, Arlington, IL) ja anti-kani-HPR (GE Healthcare, Piscataway, NJ) käytettiin western blot.

Solut ja viljelyolosuhteet

ihmisen ei-pienisoluinen keuhkosyöpä solulinjat A549 ja H460- ja jyrsijän melanoomalinja B16F10 kasvatettiin Dulbeccon modifioitu Eaglen väliaine (DMEM), jota oli täydennetty 10% lämmöllä inaktivoitua vasikan sikiön seerumia (FCS), 100 U penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiiniä kertakäyttömuovisia pulloissa 37 ° C: ssa, 5% CO

2. Soluja osa-viljellä käyttäen trypsiini-EDTA: ta joka 3-4 päivä.

solunelinkykyisyysmääritys

Solujen elinkelpoisuus arvioitiin käyttäen MTT-määritystä. Lyhyesti, 180 ui keuhkosyövän solususpensio (10

4 /solua per kuoppa) jaettiin 96-kuoppalevyille ja inkuboitiin 24 h 37 ° C: ssa /5% CO

2, jotta viljelmään vakauttaa. Solut käsiteltiin sitten 20 ui alustaa, eri pitoisuuksia OA (10, 25, 40 tai 50 ug /ml tai 21,9, 54,7, 87,6 tai 109,5 pM, vastaavasti); DMSO pitoisuudet kullekin annokselle käytettiin verrokkeina. 48 tunnin kuluttua inkubaation viljelmää käsiteltiin 20 ul MTT: tä (5 mg /ml) ja pidettiin 4 h 37 ° C: ssa pimeässä ennen sentrifugoitiin ja supernatantti heitettiin pois. Formatsaanisakka tuotettu pelkistämällä MTT elinkykyisten solujen liuotettiin DMSO: hon, ja optinen tiheys mitattiin ELISA-lukijalla (BenchMark, Bio-Rad, CA) aallonpituudella 570 nm (viite suodatin 630 nm). Kokeet toistettiin vähintään kolme kertaa. Tulokset ilmaistaan ​​keskiarvona ± SD inhibitioprosentti solujen elinkelpoisuuden. Voit tarkistaa, onko korkeita pitoisuuksia OA häiritsisivät MTT lukemat, OA inkuboitiin MTT samoissa olosuhteissa käytettiin määritykseen solujen elinkelpoisuuden. Ei häiriöitä havaittu.

DNA: n fragmentoituminen määrityksen

Apoptoosi arvioitiin solusyklin analyysi käyttämällä virtaussytometria. 24 tunnin kuluttua lepää, metalloidun keuhkojen solut (2 x 10

4 /kuoppa) käsiteltiin median tai eri pitoisuuksia OA (10, 25, ja 50 ug /ml) ja inkuboitiin vielä 48 tuntia. Tämän ajan jälkeen solut otettiin talteen, suspendoitiin uudelleen hypotonisella fluoresoivaa liuosta (50 ug /ml PI: n ja 0,1% Triton X-100 0,1% Na-sitraatti-puskuria) ja 1 h, 4 ° C: ssa pimeässä. Solusyklin analysoitiin virtaussytometrialla (FL-2) (FACSCalibur, Becton Dickinson, San Jose, CA) sen määrittämiseksi, osa-G0 /G1 DNA-pitoisuus. Subdiploidisista populaatiot katsottiin olevan apoptoottisia. Tietojen hankinta ja analysointi kontrolloitiin CellQuest- ohjelmiston version 3.1f. Jokainen koe toistettiin vähintään kolme kertaa. Tulokset esitettiin edustavina histogrammit ja keskiarvona ± SD prosenttiosuuden DNA, joka oli hajanaista.

Caspase aktivaatiomääritys

kaspaasi-3 aktivaatio määritettiin käyttäen kaupallista pakkausta, mukaan ohjeita valmistajan (BioVision, Mountain View, CA). Lyhyesti, solut maljattiin, kuten on kuvattu

solunelinkykyisyysmääritys

(M M) inkuboitiin 48 h elatusaineessa (kontrolli) tai eri pitoisuuksia OA (10, 25 tai 50 ug /ml), ennen kuin se on korjattu , sentrifugoitiin ja suspendoitiin kaspaasi-3: määritys ratkaisu. Tämä määritys liuos sisältää vahvaa kaspaasiestäjä konjugoituna FITC, että on solu läpäisevä, ei-myrkyllisiä ja palautumattomasti aktivoitu kaspaasi. 1 h kuluttua inkuboinnin (37 ° C, 5% CO

2), solut pestiin kahdesti pesupuskurilla ja prosenttiosuus kaspaasi-3-aktivoitujen solujen analysoitiin virtaussytometrialla (FL-1). Tulokset esitettiin histogrammit edustavat kolmea eri kokeissa.

aktiivisuus MDR-proteiinien

aktiivisuus MDR-proteiinien määritettiin kertyminen spesifisiä substraatteja. Rho123 ja 5-karboksifluoreseiini diasetaatti (CFDA), ei-fluoresoiva molekyyli, joka muunnetaan fluoresoiva karboksi-fluoreseiini (CF) solunsisäisten esteraasien, käytettiin aktiivisuuden mittaamiseen P-gp /ABCB1 ja MRP1 /ABCC1, vastaavasti [ ,,,0],27], [28].

kutakin koetta varten solut (1 x 10

5 /kuoppa) siirrostettiin 24-kuoppalevyille ja esi-inkuboitiin 24 tunnin ajan 37 ° C: ssa /5% CO

2, jotta kulttuuriin vakauttamiseksi. Soluja inkuboitiin 30 minuuttia keskipitkän (autofluoresenssia); 400 nM Rho123 tai 5 uM CFDA läsnä ollessa väliaineen, estäjiä P-gp (25 uM Verapamil) tai MRP1 (50 uM MK-571); tai haluttu pitoisuuksia OA. Sitten solut pestiin PBS: llä, kerättiin ja pidettiin jäillä, kunnes virtaussytometria-analyysi (FACSCalibur, Beckton-Dickinson-sytometrillä). Tulokset esitettiin edustavina histogrammit tai keskiarvona ± SD mielivaltaisen yksikköä keskimääräisen fluoresenssi-intensiteetin (MIF).

ilmentäminen MDR-proteiinien

MRP1 ilmentyminen arvioitiin käyttäen virtaussytometriaa ja western blot. Solut maljattiin ja käsiteltiin 24 h media tai OA (joko 25 tai 50 ug /ml). Sillä virtaussytometrillä, solut kerättiin, läpäiseviksi FACS lyysiliuos ja inkuboitiin PE-leimattua anti-MRP1 (klooni QCRL-2) 30 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Kahden PBS pesujen jälkeen solut suspendoitiin uudelleen FACS-liuokseen ja fluoresenssi arvioitiin. Tulokset esitettiin edustavina histogrammit. Western blot, koko-solu-uutteet valmistettiin laimentamalla solupelletit suoraan RIPA (50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 150 mM NaCl, 0,5% Natriumdeoksikolaatti, 0,1% SDS ja 1% proteaasinestäjä Kit (Amersham, Arlington , IL). Yhtä suuret määrät proteiinia, erotettiin SDS-PAGE: lla ja siirrettiin polyvinylideenidifluoridi (PDF) kalvoja. membraanit blokattiin 2 tunnin ajan PBS /0,05% Tween, joka sisälsi 5% rasvatonta kuivamaitoa, tutkittiin spesifisten vasta-aineiden MRP1 ( klooni A23, 1:1000) tai tubuliinin (klooni b-7, 1:500) yön yli ja inkuboitiin HPR-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineita (1:2000 laimennus, Amersham Biosciences, UK) 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Blotit kehitettiin käyttäen tehostetun kemiluminesenssin järjestelmä (ECL, Amersham, Arlington, IL) mukaan valmistajan ohjeiden. Band intensiteetti kvantifioitiin käyttämällä Scion Image Software ja proteiinien ilmentyminen normalisoitui nähden a-tubuliinia.

Immunosytokemia määritykset

A459-soluja (3 x 10

4 /kuoppa) ympättiin peitinlaseja 24-kuoppalevyillä, jätettiin lepäämään 24 h ja sitten käsiteltiin keski- tai 50 ug /ml OA. 24 tunnin inkuboinnin jälkeen solut pestiin kahdesti fosfaatti- suolaliuoksella (PBS), pH 7,4, ja kiinnitetään 4% puskuroidussa paraformaldehydissä, joka sisälsi 4% sakkaroosia 40 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Kolmen pesun jälkeen PBS: llä, peitelasit inkuboitiin 30 min ajan 50 mM NH

4CL liuosta, pH 8,0, ja pestiin sitten jälleen PBS: ssä (3 x). Epäspesifinen sitoutuminen immunoglobuliinien blokattiin 60 min ajan PBS: llä, joka sisälsi 5% BSA: ta, 0,1% Triton X-100, 0,05% Tween 20 ja 0,01% gelatiinia. Seuraava vaihe oli estää endogeenisen biotiinin käyttämällä biotiini estää pakkausta (Vector Lab.), Mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti.

Sen jälkeen, soluja inkuboitiin 1:50 laimennus monoklonaalinen hiiren anti-Bcl -2-vasta-ainetta, 2 ug /ml kanin polyklonaalista anti-Bax-vasta-ainetta, 2 gu /ml hiiren monoklonaalista anti-VEGF-vasta-aineen tai 5 ug /ml surviviini-vasta-aine, kaikki laimennettu PBS: ään, joka sisälsi 3% BSA: ta ja 0,05% Tween ja pidettiin yön yli 4 ° C: ssa kosteassa kammiossa. Seuraavaksi solut pestiin PBS: ssä, joka sisälsi 0,25% Tween 20 ja inkuboitiin 1 h 10 ug /ml toissijaisen vasta-aineen valitut, että tutkimus: biotinyloitu anti-vuohi-IgG, anti-kani-IgG: tä tai anti-hiiri-IgG. Tämän jälkeen vaiheessa peitelasit pestiin (3 kertaa), PBS /0,25% Tween ja inkuboitiin 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa 10 ug /ml streptavidiinia konjugoitu Cy3. Seuraavaksi peitelasit pestiin ja värjättiin sitten 0,5 ug /ml DAPI 5 min. Sen jälkeen kaksi pesua, yksi PBS: llä ja yksi tislattua vettä, Pääliliuskat asentaa Vectashield® kiinnitysväliaine ja noudatettava epi-fluoresenssimikroskopialla (Eclipse E-800, Nikon, Japani). DAPI-värjätään peitelaseihin tarkastettiin sulkea pois mahdollisuutta Mycoplasma saastumista.

kvantitatiivinen analyysi suoritettiin käyttäen kuva-analyysi-järjestelmän (Image-Pro ® Plus 4.5, Media Cybernetics, Inc., Silver Spring, MD, USA), joka koostuu digitaalisen kameran (Evolution, Media Cybernetics, Inc., Silver Spring, MD, USA) kytkettynä fluoresenssimikroskoopilla. Korkealaatuista kuvaa soluja jää (2048 × 1536 kuvapistettä puskuri), käyttäen 40 × objektiivilinssi. Vähintään kaksikymmentä kenttää per peitinlasi laskettiin ja prosenttiosuus immunoreaktiivisten solujen laskettiin DAPI-positiivisia soluja.

ilmentymisen Bax, Bcl-2, VEGF: n ja surviviini arvioitiin myös Western blot käyttäen spesifisiä vasta-aineita . Päällystetty soluja käsiteltiin keski- tai 50 mg /ml OA: ssa 24 tuntia ja kokosolu-uutteet valmistettiin, kuten on kuvattu

ilmentäminen MDR-proteiinien

(M M). Proteiinit erotettiin SDS-Page, siirrettiin PDF kalvoja ja tutkittiin spesifisten vasta-aineiden ja Bax: n (klooni P-19, 1:1000), Bcl-2: n (klooni Bcl2-100, 1:500), VEGF: n (klooni C1, 1 :100), surviviini (klooni ab469, 1: 1000) tai tubuliinin (klooni b-7, 1:500). Blotit kehitettiin käyttäen tehostettua kemiluminesenssia järjestelmän (ECL, Amersham, Arlington, IL) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Band intensiteetti kvantifioitiin käyttämällä Scion Image Software ja proteiinien ilmentyminen normalisoitui nähden a-tubuliinia.

kehittäminen keuhkojen etäpesäkkeiden aiheuttama B16F10 melanoomasoluja

Kaikki eläinkokeiden menetelmät suoritettiin mukaisesti suuntaviivojen kanssa eettisen komitean arviointi Animal käyttö Experimentation päässä IBCCF /CCS /UFRJ (CAUAP-IBCCF) ja hyväksytty nimityksellä, Project # 1005.

päivänä 0, C57BL /6 hiiriä (10-12 viikon ikäisiä) injektoitiin niiden hännän laskimoihin B16F10-melanoomasoluja (1 x 10

6 solua /eläin). Kasvain-cell-kantavia hiiriä jaettiin neljään ryhmään viiden ja 3 päivää inokulaation jälkeen, käsiteltiin päivittäin kahden viikon ajan (maanantaista perjantaihin) ja 20 ui suolaliuosta, ja DMSO tai OA (5 mg kg

-1 tai 10 mg kg

-1). Annos terpeenisten kolmannen ja neljännen ryhmän päätettiin aiemman raportin [29]. Kehon paino kunkin hiiren kirjattiin välein 4 päivää sen määrittämiseksi, onko hoito vaikuttaa eläimen terveydentila. Kahdeksantoista päivää inokulaation jälkeen tuumorisolujen, hiiret tapettiin murtamalla niska anestesiassa CO

2. Keuhkot poistettiin ja kaksi riippumatonta tarkkailijaa määritettiin etäpesäkenystyröiden määrä keuhkoissa kunkin hiiren. Tulokset ilmaistaan ​​keskiarvona ± SD määrän etäpesäkkeitä.

Tilastollinen

Tulokset esitetään keskiarvo ± SD. Studentin t-testi suoritettiin käyttäen Instat ohjelmistoa. Arvo

p

0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

A549 ja H460 solulinjat ilmentävät aktiivista MRP1 pumppu

A549 ja H460 solulinjat ilmentävät merkittäviä määriä MDR transporter proteiinien [25], [26]. Tutkia läsnäolon aktiivisen pumppujen näitä rivejä, soluja inkuboitiin fluoresenssin substraatteja P-gp (Rho123) tai MRP1 (CFDA) läsnä ollessa tai poissa ollessa inhibiittorien näiden proteiinien ja sitten solunsisäinen fluoresenssi mitattiin. Puute muutos fluoresenssissa havaitaan, kun läsnä on verapamiili, erityisen P-gp-salpaaja [30], ja korkean fluoresenssin kasvu saadaan, kun A549 ja H460 käsiteltiin MK571, tietyn MRP1 inhibiittori [31], osoitti, että nämä linjat ovat hyvin vähän tai ei lainkaan P-gp: n aktiivisuuden, mutta näyttää vahvasti MRP1 aktiivisuus (kuvio 1).

P-gp: n /ABCB1 aktiivisuutta, A549 tai H460-soluja inkuboitiin 30 minuuttia keskipitkän (AF) tai 400 nM rodamiini 123 puuttuessa (Rho) tai läsnä oli 50 uM verapamiilia (VP), For MRP1 /ABCC1, soluja inkuboitiin 5 uM CFDA puuttuessa (CF) tai läsnä oli 50 uM MK-571 (MK) . Pesun jälkeen solujen fluoresenssi mitattiin virtaussytometrialla. Histogrammit edustavat kolmen erillisen kokeen suoritettiin kaksinkertaisina.

oleanolihapon estää elinkelpoisuutta ja aiheuttaa kaspaasiriippuvaisen DNA pirstoutuminen NSCLC linjat

arvioimiseksi sytotoksista vaikutusta OA A549 ja H460, soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla OA tai sisplatiinin (perinteinen kemoterapeuttinen lääke NSCLC) ja sitten 48 tuntia myöhemmin; Solujen elinkelpoisuus mitattiin MTT-määrityksellä. Oleanolihapon laski elinkelpoisuus solulinjojen annoksesta riippuvalla tavalla (kuvio 2A). Mikroskooppinen havainnointi solujen ehdotti, että vaikutus OA johtui apoptoosin. Tutustua havainnon lisäksi, käsiteltiin soluja inkuboitiin hypotonisella liuoksella, joka sisälsi PI: n ja sitten solusyklin analyysi suoritettiin virtaussytometrialla (FCM). Subdiploidisista populaatiot pidettiin apoptoottisia. Lisääntynyt prosenttiosuus fragmentoitunutta DNA: ta soluihin ja kaspaasi-3-aktiivisuus indusoitiin OA hoito (kuviot 2B ja 2C), vahvistettu apoptoottisen luonne OA sytotoksisuuden. Tämä havainto vahvistettiin anneksiiniV /PI-data (data ei ole esitetty).

A549 tai H460-soluja inkuboitiin eri OA-pitoisuuksilla (10, 25, 40 tai 50 ug /ml tai 21,9, 54,7, 87,6 tai 109,5 uM) tai sisplatiinin 48 tuntia. (A) Solujen elinkelpoisuus arvioitiin MTT: n ja piirrettiin prosentteina solujen elinkelpoisuuden inhibition. Tulokset ovat keskiarvoja ± SD 4 kokeet suoritettiin kolmena rinnakkaisena. (B) Samalla, soluja käsiteltiin hypotonisella liuoksella, joka sisältää propidiumjodidia (PI) ja DNA-pitoisuus analysoitiin virtaussytometrialla. Ylempi paneeli: edustaja histogrammi solusyklin. Alempi paneeli: Prosentuaalinen apoptoottisten sub-G1 soluihin. Arvot edustavat keskiarvoa ± SD 3 kokeesta, jotka suoritettiin kolmena kappaleena. (C) kaspaasi-3 aktivoitujen solujen määritettiin virtaussytometrialla käyttämällä CaspGlow kit, kuten on kuvattu M M. Histogrammit edustavat kaksi erillistä koetta suoritettiin kaksinkertaisina.

Effects of oleanolihapon MDR toimintaa ja ilmaisun

tutkia, sytotoksista vaikutusta OA A549 ja H460 välitti modulaatio MDR-pumpulle, olemme analysoineet vaikutuksia OA MRP1 toimintaa ja ilme. Soluja inkuboitiin 30 min CFDA läsnä eri OA-pitoisuuksilla (6,25, 12,5, 25 tai 50 ug /ml) ja kertymistä CF mitattiin fluoresenssi. Kuten kuviossa 3A on esitetty, hoito OA ei muuttanut kertymistä CF A549. Pieni mutta merkittävää kasvua fluoresenssin havaittiin H460 viittaa siihen, että OA saattaa pystyä moduloimaan MRP1 aktiivisuutta. Toisaalta se oli myös mahdollista, sen sijaan, että OA muuttaa ilmaus MRP1. Tämä mahdollisuus analysoitiin FCM ja western blot soluissa inkuboitiin väliaineessa tai OA (25 tai 50 ug /ml, kukin 24 tunnin ajan ja sitten se käsiteltiin anti-MRP1. Kuten on esitetty kuvioissa 3B ja 3C, muuttaminen ei MRP1 ekspressio oli havaittua.

(A) määrittämiseksi MRP1 aktiivisuuden, A549 tai H460-soluja inkuboitiin 30 minuuttia keskipitkän (AF), 5 uM CFDA puuttuessa (CF) tai läsnä 50 uM MK-571 (MK -571), tai CFDA läsnä ollessa eri pitoisuuksina OA (6,25, 12,5, 25 tai 50 ug /ml). Cellular fluoresenssi mitattiin virtaussytometrialla. tulokset ilmaistaan ​​keskiarvona ± SD, että fluoresenssin voimakkuuden keskiarvo on saatu 3 eri kokeissa suoritettiin kolmena rinnakkaisena. * ja ** osoittavat

p

0,05 ja

p

0,01 vastaavasti suhteessa kontrolli (CF). (B) määrittämiseksi MRP1 ilmaisu, soluja käsiteltiin keski- tai OA (25 tai 50 ug /ml) 24 tunnin ajan ennen kuin talteen, läpäiseviksi ja inkuboitiin PE-leimattua anti-MRP1 30 minuutin ajan 4 ° C: ssa. kahden PBS pesujen jälkeen solut suspendoitiin uudelleen FACS-liuokseen ja fluoresenssi arvioitiin. Histogrammit edustavat kolmen erillisen kokeen. (C) määrittämiseksi MRP1 Western blot, koko-solu-uutteet saatiin soluissa, joita käsiteltiin, kuten on kuvattu B. Proteiinit erotettiin natriumdodekyylisulfaatti (SDS) -gels, siirrettiin PDF kalvoja ja tutkittiin vasta-aineen MRP1, kuten on kuvattu että M M osassa. Numerot edustavat kaistan intensiteetin suhteen a-tubuliinia.

oleanolihapon estää proteiinien ilmentymisen mukana vastustavat apoptoosin ja angiogeneesin on A549-solulinja

Sen tutkimiseksi, jos sytotoksista aktiivisuus OA voi johtua modulaatio reittejä mukana apoptoosin resistenssin, A549-soluja käsiteltiin 24 h 50 ng /ml tämän triterpene ja sitten Bcl-2, Bax ja surviviini analysoitiin käyttäen immunosytokemiallista tekniikoita. Emme löytäneet mycoplasma in peitinlaseja valmistautunut immunosolukemiallinen. Havaitsimme, että Bcl-2 ei muutu sen jälkeen, kun hoidon OA (kuviot 4A-B); oli merkittävä (

p

0,005) kasvaa Bax (kuviot 4C-D) ja merkittävä lasku (

p

0,0001) ilmentymiseen Surviviiniproteiini (kuviot 4E- F). Nämä tulokset viittaavat siihen, hoito OA muuttunut matkapuhelinverkon miljöö kohti apoptoottista profiilin ja että tämä prosessi voi myös vähentää määrää metastaasipesäkkeiden. Tämän mahdollisuuden tutkimiseksi tarkemmin, vaikutus OA VEGF: n ilmentymistä [13], tekijä osallistuu solujen proliferaation ja angiogeneesin, arvioitiin immunosytokemialla. Tiedot esitetään kuvioissa 4 (G-H) osoitti, että hoito OA johti huomattavaan vähenemiseen (

p

0,05) VEGF-positiivisten solujen. Samanlaisia ​​tuloksia havaittiin, kun vaikutukset OA näiden proteiinien ilmentymisen analysoitiin Western blot (kuvio 5). Kaiken kaikkiaan nämä tiedot vahvistavat mahdollisen inhiboivan vaikutuksen OA lääkeresistenssin reittejä ja etäpesäkkeiden kehittymisessä.

(ylempi paneeli) Immunofluoresenssi ja A549-solut värjättiin Bcl2 (A-B), Bax (C-D), surviviiniperäistä (E-F) ja VEGF (G-H). A549-soluja käsiteltiin viljelyalustaan ​​(A, C, E, G) tai 50 ug /ml OA (B, D, F, H) 24 tunnin ajan, kiinteä, värjättiin primaaristen vasta-aineiden, paljastuu biotinyloidun lgG seurasi streptavidiini -CY3 ja laskuri värjättiin DAPI, kuten on kuvattu M M. Edustavia immunofluoresenssimenetelmällä micrographs kolmesta kokeesta. Bar: 100 pm. (Alempi paneeli) Graafinen esitys histomorphometrical tuloksista immunosytokemiallisia määrityksen. Prosenttiosuus immunoreaktiivisten solujen laskettiin DAPI-positiivisia soluja. Bcl-2 ei moduloi OA (p 0,05), mutta Bax lisääntyi merkitsevästi (*

p

0,005), kun taas surviviini ja VEGF merkittävästi vähentynyt hoidon jälkeen (**

p

0,0001 ja ***

p

0,05, vastaavasti).

A549-soluja käsiteltiin keski- tai 50 ug /ml oleanolihapon 24 tuntia ja koko solu-uutteet saatiin, kuten on kuvattu M M. Proteiinit erotettiin SDS-PAGE: lla, siirrettiin PDF kalvoja, tutkittiin vasta-aineiden Bcl-2, Bax, surviviinia, VEGF tai α-tubuliinin ja kehitettiin ECL, kuten on kuvattu M M. Numerot edustavat kaistan intensiteetin suhteen a-tubuliinia.

oleanolihapon inhiboi melanooma-indusoidun keuhkojen etäpesäkkeiden

Metastasis pidetään yleisesti kasvaimen kasvun peräisin soluista, jotka menettivät noudattaminen , tuli liikkeeseen, ja sitten siirtynyt erityisiä metastaattisen markkinaraon; siinä tapauksessa, keuhkosyövän, nämä kapeampiin ovat aivojen, maksan ja luut. Koska malli metastaasin spesifisiä tämäntyyppisen keuhkosyövän, käytimme melanooma mallia, käytetään usein kirjallisuudessa vaikutuksen tutkimiseksi lääkeaineiden etäpesäkkeitä, käyttää vaikutukset OA etäpesäkkeiden kehittymisessä

in vivo

. Tätä tarkoitusta varten keuhkometastaaseja indusoitiin

i.v..

Ymppäyksen B16F10-melanoomasoluja, kuten aiemmin on kuvattu [29]. Samalla tavalla kuin A549 ja H460, nämä solut myös näyttää aktiivisen MRP1 pumpun (tuloksia ei esitetty). Alkaen 3 päivää tuumorin istuttamisen jälkeen, ryhmää hiiriä käsiteltiin sisäistä nenän ja 2 viikkoa 10 annosta PBS: ää (kontrolli) tai eri pitoisuuksia OA (5 tai 10 mg kg

-1 päivä

-1). Hiiret tapettiin päivänä 17 ja useissa keuhkojen etäpesäkkeiden laskettiin. Mitä suurempi pitoisuus hoito OA merkitsevästi (

p

0,05) vähensi etäpesäkkeiden verrattuna ei-käsiteltyihin kontrolleihin (kuvio 6).

ryhmät hiiriä, injektoidaan hännän suonet B16F10-melanoomasoluja, käsiteltiin suolaliuoksella, DMSO, OA (5 mg kg

-1 päivä

-1) tai OA (10 mg kg

-1 päivä

-1), kuten kuvattu M M osan ja ylemmän paneelin; lukumäärää keuhkometastaasitestissä laskettiin päivänä 18 (alempi kuva). Tulokset ilmaistaan ​​keskiarvona ± SD määrän etäpesäke. * Tarkoittaa

p

0,001 suhteessa kontrolli (DMSO).

Keskustelu

Läsnäolo luontainen tai hankittu resistenssi kemoterapeuttisia aineita on suuri este tehokas hoito NSCLC. Todellakin, havainto, että noin puolet potilaista kuolee kasvain leviää kaukaisiin elimiin on annettu kehittämiseen MDR. Tässä esitetyt tulokset osoittivat, että, sen lisäksi, että aktiivinen NSCLC linjat, jotka ekspressoivat luonnostaan ​​MRP1 /ABCC1 aktiivisuus, OA moduloidaan tekijöitä apoptoosin resistenssin ja esti kehittäminen melanooman aiheuttama keuhkojen etäpesäkkeiden.

Koska MDR-proteiinit ovat löytyy normaalin keuhkojen epiteelin kasvaimissa, jotka ovat peräisin tässä kudoksessa nostaa tasoa näiden proteiinien kemoterapian tai sädehoidon [32], [33] ja ne ovat usein herkkiä sytotoksisia aineita. Tiedot esitetään tässä asiakirjassa osoitti, että OA on sytotoksinen ja indusoi apoptoosin kahden NSCLC solua ja joka ilmentää MRP1 [25], [26] ja läsnä korkea MRP1 aktiivisuus (kuvio 1). Oleanolihapon välittämä solukuolema johtuu apoptoosin, mistä on osoituksena OA: n kyvyn aiheuttaa pirstoutumista DNA ja aktivoimaan kaspaasi 3 (kuva 2).