Krooninen sairaus

tiivistelmä

interleukiini-26 (IL-26) on yksi sytokiinejä, joita Th17 soluja, joiden merkitys ihmisen kasvaimissa on tuntematon. Täällä, tutkimme ilmaisun ja mahdollista roolia IL-26 ihmisen mahasyövän (GC). Ilmaisu IL-26 ja niihin liittyviä molekyylejä, kuten IL-20R1, STAT1 ja STAT3 tutkittiin reaaliaikainen PCR ja immunohistochemisty. Vaikutukset IL-26 soluproliferaatioon ja sisplatiinin indusoiman apoptoosin analysoitiin BrdU yhteistyötä määrityksen ja PI-anneksiini V co-värjäystä, vastaavasti. Lentivirusvektorikonstruktit välittämä siRNA käytettiin tutkimaan sen toimintamekanismi, ja IL-26 liittyvä signalointi analysoitiin western-blottauksella. Ihmisen GC kudokset osoitti kohonneeseen IL-26 ja siihen liittyvät molekyylit ja aktivoitumista STAT3 signaloinnin, kun taas STAT1 aktivointi ei eronnut merkitsevästi GC ja normaalin mahan kudoksissa. Lisäksi IL-26 oli pääasiallisesti tuottanut Th17 ja NK-solujen. IL-26 edistää proliferaatiota ja eloonjäämistä MKN45 ja SGC-7901 mahalaukun syövän soluja annoksesta riippuvaisella tavalla. Lisäksi IL-20R2 ja IL-10R1, jotka ovat kaksi olennaista reseptoreita IL-26 signalointia, ilmennettiin molemmissa solulinjoissa. IL-26 aktivoidaan STAT1 ja STAT3 signalointia; kuitenkin, ylössäätelyyn ilmentymisen Bcl-2, Bcl-xl ja c-myc osoittivat, että IL-26 välittää STAT3 aktivointi. Knockdovvn STAT1 ja STAT3 ilmaisun ehdotti, että proliferatiivisen ja anti-apoptoottiset vaikutukset IL-26 välittävät modulaatioon STAT1 /STAT3 aktivointi. Yhteenvetona kohonneet IL-26 ihmisen GC edistää proliferaatiota ja eloonjäämistä säätelemällä STAT1 /STST3 signalointi.

Citation: Sinä W, Tang Q, Zhang C, Wu J, Gu C, Wu Z, et al. (2013) IL-26 Edistää leviämisen ja Survival of Human Mahalaukun Syöpäsolut säätelemällä Balance STAT1 ja STAT3 aktivointi. PLoS ONE 8 (5): e63588. doi: 10,1371 /journal.pone.0063588

Editor: Salvatore V. Pizzo, Duke University Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 11 lokakuu 2012; Hyväksytty: 02 huhtikuu 2013; Julkaistu: toukokuu 21, 2013

Copyright: © 2013 Sinä et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustuksia National Natural Science Foundation (81170415 XC) ja Jiangsun maakunnan Key maakunnan Talents ohjelma (RC2011079 QT ja RC2007056 XC). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Mahasyöpää (GC) on toiseksi yleisin syy syöpään liittyvät kuolemat maailmassa. GC on vaikea parantaa myös länsimaissa, koska se on usein havaitaan vasta myöhemmissä vaiheissa taudin [1]. Vaikka useat tekijät liittyvät kehittymistä ja etenemistä GC, välillä on yhteys krooninen mahalaukun tulehdus kuten atrofinen gastriitti aiheuttama Helicobacter pylori ja riski GC on tullut ilmi viime vuosina [2]. Krooninen tulehdus johtaa GC on pitkä ja monimutkainen prosessi, joka tapahtuu useiden vuosien ajan ja jolle on tunnusomaista inflammatorinen vaurioita mahan limakalvon, sytokiini-indusoidun DNA-synteesin ja solun proliferaatiota, hyperplasia ja syövän synty [3].

assosiaatio krooninen tulehdus ja immuunijärjestelmä on hyvin tutkittu, ja lymfosyytit ovat tärkeimmät tulehduksen välittäjäaineiden-edistänyt syövän synnyn [4]. Th17 solut ovat uudenlainen T-lymfosyyttien, jotka ilmaisevat RORγT ja erittävät erilaisia ​​sytokiinejä, mukaan lukien IL-17A, IL-17F: ksi, IL-21, IL-22 ja IL-26. Erilaistumista Th17 solujen säätelevät useat sytokiinit, mukaan lukien IL-1β, IL-6, IL-23, tuumorinekroositekijä-alfa (TNF-α) ja transformoiva kasvutekijä beeta (TGF-β) [5], [6] . Viimeaikaiset kliiniset tutkimukset osoittivat, että Th17 soluja voidaan läheisesti helikobakteeri liittyvän patologian ja syövän syntymistä GC [7], [8], [9], [10]. Vaikka useita Th17 liittyvät sytokiinien on tutkittu, tiedetään vähän interleukiini-26 (IL-26) suhteen mahalaukun kasvaimet.

IL-26 on erittyvä proteiini, joka toimii joko monomeerinä tai homodimeerin. Se oli alun perin kuvattu Knappe et al. [11] nimisenä AK155. IL-26 on heikko mutta merkittävä sekvenssihomologia IL-10, ja sen koodaama proteiini on siis jäsen IL-10 sytokiineihin, jotka enimmäkseen kuuluvat luokan 2 sytokiiniperheen. IL-26 voidaan erittyy ensisijaisesti T-solujen, NK-solujen ja T-solujen klooneja ja se on tavallisesti ilmennetään rinnakkain muiden tärkeiden IL-10-liittyvän sytokiineja, kuten IL-22 [12], [13]. IL-26 sitoutuu erilliseen solun pinnan reseptoriin, joka koostuu IL-20R1 ja IL-10R2 ketjut, ja sen toiminnallista aktiivisuutta, ovat erilaiset kuin välittävät IL-10. IL-20R1 toimii ligandi-sitova ketju IL-26 ja IL-10R2 on olennainen toisen ketjun loppuun kokoonpano aktiivisen reseptorikompleksin. Neutraloivia vasta-aineita joko IL-20R1: n tai IL-10R2 ketjut voivat estää induktio IL-26 signalointia [12]. Kun täysin koottuna, reseptorikompleksissa tapahtuu konformaatiomuutos (t), joka indusoi reseptorin aktivoitumisen liittyvän Janus tyrosiinikinaasit, Jak1 ja Tyk2, ja sen jälkeen ohimeneviä telakointi ja fosforylaatiota STAT-proteiinien, STAT1 ja STAT3 [14], [15 ].

Koska Th17 liittyvä sytokiini, rooli IL-26 kasvaimissa ei ole tutkittu. Täällä, tutkimme mahdolliset osallistumista IL-26 ihmisen GC ensimmäistä kertaa ja tutkitaan sen pro-selviytymisen ja proliferatiiviset vaikutukset

in vitro

.

Materiaalit ja menetelmät

potilaat

Tässä tutkimuksessa mukana 60 potilasta, joilla GC, joille tehtiin leikkaus 2006-2009 First Affiliated sairaala Nanjing Medical University, Nanjing, Jiangsu (taulukko 1). Kaikki kokeet suoritettiin periaatteiden mukaisesti ilmaistu Helsingin julistus. Kirjallinen suostumukset geenien ilmentymisen analyysejä kudoksissa saatiin kaikille potilaille ennen leikkausta tai tähystys. Tutkimussuunnitelman ja lupamenettelyjen hyväksyi eettinen komitea ensimmäisen Affiliated sairaala Nanjing Medical University. Diagnoosi ja lavastus mahasyövän suoritettiin mukaisesti AJCC (TNM) Välivarastointi System.

Quantitative Reaaliaikainen PCR

Käänteistranskriptioreaktiot suoritettiin käyttäen SuperScript First-Strand Synthesis System (Invitrogen, CA) käsittelyn jälkeen RNA malleja DNaasi I välttää genomisen DNA-kontaminaation. Määrittää suhteellinen taso cDNA käänteistranskriboidusta näytteitä, reaaliaikainen PCR suoritettiin Roche LightCycler480 (Roche Diagnostics IN, USA) käyttäen alukkeita IL-26 seuraavasti: eteenpäin, AAGCAACGATTCCAGAAGACC ja kääntää, AAGTCCTCCACAAAGCGTATTTT, jossa monistettu pituus 175 emäsparia. GAPDH: ta käytettiin kontrollina seuraavilla alukkeilla: eteenpäin, AAGGTGAAGGTCGGAGTCAAC; käänteinen, GGGGTCATTGATGGCAACAATA; monistettu pituus, 102 emäsparin. Reaaliaikaisen PCR-reaktio suoritettiin ohjeiden mukaisesti sisältyvät SYBR® Esiseos Ex Taq ™ (Takara, Japani). Data normalisoitiin GAPDH tasot näytteissä.

ELISA

IL-26-pitoisuus seerumissa GC potilaiden ja terveiden kontrollien mitattiin käyttäen kaupallisesti saatavilla olevaa sandwich-ELISA (Biotang Inc., MA).

Western blot -analyysi

proteiinit uutettiin MKN45, SGC7901 ja STAT1 ja STAT3 siRNA modifioitu solu linjat, ja kvantitoitiin käyttäen proteiinia määritystä (Bio-Rad Laboratories, CA). Proteiininäytteet (30 ug) fraktioitiin SDS-PAGE: lla ja siirrettiin nitroselluloosakalvolle. Immunoblottaus suoritettiin käyttämällä vasta-aineita IL-26, IL-20R1, IL-10R2, p-STAT3 (S727), STAT3, p-STAT1 (Y701), STAT1, Bcl-2, Bcl-xl, c-Myc, ja α- tubuliinia (kaikki ostettu Abcam, MN). Tulokset visualisoitiin kemiluminesenssiosoitusta järjestelmä (Pierce ECL Alustan Western blot tunnistusjärjestelmä, Thermo Scientific, IL) ja altistuminen -autoradiografiafilmille (Kodak XAR elokuva).

immunohistokemia (IHC) B

kudokset kerättiin ja kiinnitettiin 4% paraformaldehydi yön yli 4 ° C: ssa, käsitellään ja leikataan 5 um: n paksuisia leikkeitä. Immunohistokemiallisella värjäyksellä osien suoritettiin vasta-aineiden IL-26, IL-20R1, p-STAT3 (S727), ja p-STAT1 (Y701) käyttäen tekniikoita, joita kuvataan aiemmin [16].

BrdU Cell Proliferation Assay

Viljellyt solut maljattiin tiheyteen 1 x 10

4 solua /kuoppa 96-kuoppaisille levyille. Soluproliferaatioon 0, 12, 24, 48, 60 ja 72 h arvioitiin käyttämällä BrdU-solujen lisääntymisen määrityksessä kit. BrdU-liuosta (Cell Signaling Technology, MA) lisättiin jokaiseen kuoppaan mukaisesti valmistajan ohjeiden 12 tuntia. Solulisäkasvumäärityk- korko määritettiin mittaamalla absorbanssi 450 nm: ssä käyttäen tietokoneohjattuja mikrotiitterilevypohjainen lukijaa.

eristäminen ja kulttuuri Ihmisen GC soluttautunut Leukosyyttiarvon

tuore kasvainten kudokset pestiin kahdesti RPMI 1640 . Fatty, side- ja nekroottista kudosta poistettiin. Kudokset jauhettiin 1-2 mm: n palasiksi RPMI 1640, siirretään 15 tai 50 ml: n kartiomaisia ​​putkia, ja inkuboitiin kolmen entsyymillä pilkkomalla alustaa, joka sisälsi DNaasia (30 U /ml), hyaluronidaasia (0,1 mg /ml), ja kollagenaasi (1 mg /ml) 2 tunnin ajan huoneenlämpötilassa kevyesti ravistellen. Kudokset suspendoitiin uudelleen 10 ml: aan RPMI 1640 ja suodatetaan 70 um: n solusiivilän (BD Pharmigen). Solut loukkuun siivilä asetettiin yksittäisiin kaivoihin, jotka sisälsivät 1 ml T-solujen kasvualustaa 24-kuoppaisen levyn edelleen havaitsemiseen virtaussytometrialla.

Th17 ja NK Cell Isolation, stimulaatio, ja virtaussytometrinen analyysi

Th17 solut saatiin

in vitro

stimulaation CD4-positiivisten perifeerisen veren mononukleaaristen solujen (PBMC: t), jotka eristettiin virtaussytometrialla olosuhteissa (20 ng /ml IL-1β, 20 ng /ml IL-6, 20 ng /ml IL-23, 5 ng /ml TGF-β, 5 ug /ml anti-IL-12, ja 5 ug /ml anti-IL-4) on kuvattu aiemmin [17]. NK-solut saatiin käyttämällä NK-solujen eristyspakkausta hankittiin Miltenyi Biotec (Cat. 130-092-657). Th17 ja NK-soluja pidettiin

in vitro

ja stimuloida 100 ng /ml LPS ja

H. pylori

lysaatit, vastaavasti, ja analysoitiin solunsisäisen sytokiinin värjäystä.

solunsisäisen sytokiinin värjäystä, soluja stimuloitiin 37 ° C: ssa 5 h ja Leukosyyttien aktivointi Cocktail (BD Pharmingen). Sitten solut värjättiin pinnan markkereita, kiinnitettiin ja tehtiin läpäiseviksi IntraPre Reagent (Beckman Coulter), ja lopuksi värjätään solunsisäisen markkereita. Tiedot hankittiin on FACSVantage SE ja analysoitiin CellQuest ohjelmisto. Fluorikromi-konjugoidulla mAb: t IL-26, CD3, CD4, CD8, CD16, CD56 ja RORγT hankittiin BD Pharmingen.

Sisplatiini indusoiman apoptoosin ja virtaussytometrinen analyysi

analysoitiin Soluja viljeltiin täydellisessä väliaineessa 1 ug /ml sisplatiinia 24 tuntia. Solut analysoitiin edelleen virtaussytometrialla (FACSCalibur ™, BD Biosciences, NJ) käyttämällä PI /anneksiini -värjäyspakkausta (BD Biosciences).

siRNA Suunnittelu ja lentivirustartunnat tuotanto ja transduktio

siRNA: illa kohdistaminen STAT1 ja STAT3 suunniteltiin ja syntetisoitiin Genscript Co. (Nanjing, Kiina) seuraavasti: siRNA kohdistaminen STAT1, GGACAAGGTTATGTGTATA; ja siRNA kohdistaminen STAT3, GGACATCAGCGGTAAGACC. Syntetisoidun siRNA: t alikloonattiin lentivirusvektorilla pLL3.7 by

Hapi

ja

XhoI

(New England Biolab, Yhdistynyt Kuningaskunta) yhdessä ohjaus siRNA ja nimettiin pLL3.7-cs, PLL3. 7-STAT1-siRNA ja pLL3.7-STAT3-siRNA. Rekombinantti lentivirukselle tuotettiin 293T [16]. Ihmisen GC solulinjat MKN45 ja SGC7901 ostettiin Kaiji Biotech Co (Nanjing, Kiina) ja kasvatettiin Dulbeccon modifioidussa Eaglen väliaineessa (DMEM), jota oli täydennetty 10% vasikan sikiön seerumia, 100 U /ml penisilliiniä ja 100 U /ml streptomysiiniä (Gibco , CA), ja transdusoidaan lentiviruksen avulla polybreenin (8 ug /ml).

tilastollinen analyysi

tulokset ilmaistaan ​​keskiarvona ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta. Vertailut ryhmien välillä suoritettiin Mann-Whitney U-testi. Korrelaatio IL-26 ilmentyminen ja erilaisia ​​kliinisiä piirteitä analysoitiin käyttämällä Chi-square testi. P-arvot 0,05 pidettiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

1. Lisääntynyt aktivointi IL-26 ja Related STST3 Signaling in Human mahasyövän

IL-26 ilmentyminen ihmisen mahasyövän tutkittiin 60 tuoretta kasvain kudosten ja pariksi viereisen normaali mahan kudoksissa 60 GC potilaista. Reaaliaikainen PCR-analyysi osoitti merkittävää yli-ilmentyminen IL-26-mRNA: n ihmisen GC verrattuna normaaliin mahan kudoksissa (P = 0,004, Mann-Whitneyn U-testi) (kuvio 1A). Seerumin IL-26-tasot olivat myös merkitsevästi suurempi GC potilailla kuin terveillä verrokeilla (P = 0,0064, jonka U-testi) (kuvio 1 B). Lisäksi analyysi IL-26-proteiinin ilmentymistä 60 parafiiniin kudosnäytteitä positiivisesti ilmentymistä 47 GC näytteissä, ja heikosti positiivinen (n = 14) tai negatiivinen (n = 46) lauseke vierekkäisissä normaaleissa kudoksissa. IL-26-positiiviset solut sijaitsevat pääasiassa ei-parenkyymielimen kudoksissa, joka voi koostua immuunisolujen ympärillä ja soluttautuminen syöväksi tai normaali mahan kudoksissa. Lisäksi kvantifiointi IHC värjäyksen tulokset Image-Pro plus (ver 5.0) viidellä satunnaisesti näkökenttään objektilasia kohti osoitti, että IL-26 ilmentyminen oli merkitsevästi korkeampi GC kudoksissa kuin viereisissä normaaleissa kudoksissa (P = 0,0087, Mann-Whitneyn U testata). Havaitseminen ja kvantifiointi IL-20R1, reseptorin IL-26, osoitti, että se ilmentyi merkitsevästi korkeampi ihmisen GC kuin normaaleissa kudoksissa (P = 0,0041, jonka U-testi). Aktivoinnin tila STAT1 ja STAT3, jotka ovat tärkeitä alavirran signalointia tekijöitä IL-26, tutkittiin IHC käyttäen spesifisiä vasta-aineita fosforyloidun jäämiä. Merkittävä lisäys p-STAT3 (S727) havaittiin GC kudoksissa, kun taas tilastollisesti merkitseviä eroja p-STAT1 (Y701) tasot välillä havaittiin ihmisen GC ja normaalit kudokset (P = 0,0094 varten STST3 ja P = 0,392 varten STAT1 , Mann-Whitneyn U-testi) (kuvio 1C, D).

: IL-26-mRNA: n ilmentymistä ihmisen mahasyövän (GC) (n = 60) ja viereisen normaaleissa kudoksissa (n = 60) havaittiin Real-time PCR. Data A edustavat mRNA: n ekspression suhteen, että GAPDH, ilmoitetaan keskiarvona ± SD. B: Detection of IL-26 ihmisen seerumeissa terveiden verrokkien (n = 30) ja GC potilailla (n = 60) ELISA: lla. C: Havainnollinen kuva ilmaisun ja jakelu IL-26, IL-20R1 p-STAT3 (S727) ja p-STAT1 (Y701) ihmisen GC kudoksissa, normaali mahan kudoksissa ja negatiiviset kontrollit värjättiin isotyypin IgG. Mikrokuvat korkeammalla suurennoksella osoittavat erityisiä lokalisointi eri markkereita. D. Keskimäärin integroitu optinen tiheys (IOD) saatiin analysoimalla viisi kenttää kunkin dian arvioitiin kuva-pro plus ohjelmistot (ver5.0) IHC värjäys IL-26, IL-20R1 p-STAT3 (S727) ja p- STAT1 (Y701) ihmisen GC ja normaali mahan kudoksissa. Tilastolliset analyysit kuvioissa A, B ja D suoritettiin käyttäen U-testi.

analyysi korrelaatio IL-26 ilmentyminen ja kliinis-osoittivat tilastollisesti merkitsevä assosiaatioita IL-26 ilmentyminen ja kasvaimen koon ja

H. pylori

infektio (taulukko 1).

2. Th17 ja NK-solut ovat tärkeimmät solulähteiden IL-26 Human mahasyövän

solulähteet IL-26 on ensisijainen T-solujen, luonnollisten tappajasolujen (NK-solut) ja T-solukloonien stimulaation jälkeen spesifisiä antigeenejä tai mitogeenisiä lektiinejä, [14]. Siksi määritellä lähde IL-26 ihmisen GC, kasvain cross- (TIL) eristettiin 20 tuoretta ihmisen GC kudosnäytteitä ja yhteistyö värjätään eri merkkejä. IL-26 ilmentyminen oli merkitsevästi suurempi CD3-positiivisten solujen (T-solut) ihmisen GC TIL kuin T-soluissa, jotka ovat peräisin perifeerisen veren mono- ydinvoiman solujen (PBMC) (16,52 ± 9,32% T-TIL vs. 3,78 ± 2,91% ja T-PBMC, P 0,0001), joka oli yhdenmukainen tulosten reaaliaikaisen PCR ja IHC (kuvio 2a1, a2). Niistä kokonaismäärä T-solujen, 13,5 ± 3,71% CD4-positiivisten T-solut ekspressoivat IL-26, kun taas vain 3,21 ± 2,61% ja CD8-T-soluista oli positiivisia IL-26 (kuvio 2A3, a4). Lisäksi co-värjäys IL-26, jossa CD4 ja RORγt, markkeri Th17 soluja, havaittiin, jossa 53.21 ± 16,82% of Th17 soluja, jotka ilmentävät IL-26 ihmisen mahasyövän näytteistä (kuvio 2A5, a6). Ilmaisu IL-26 NK-soluissa, toinen usein raportoitu solujen lähteenä IL-26, analysoitiin mittaamalla määrä CD3-, CD16 +, CD56 + solut yhteistyössä värjäys IL-26, joka osoitti, että 43.81 ± 19.44% of yhteensä NK-solut erittävät IL-26 (kuvio 2a7, a8). Yhdessä tuloksemme osoittivat, että tärkein solulähteet IL-26 ihmisen GC olivat Th17 ja NK-solujen ja Kunkin komponentin prosenttiosuuden on yhteenveto ympyrädiagrammina (kuvio 2A9 ja a10).

a1 -a8: edustava tapauksessa IL-26 ilmentyminen ihmisen mahasyövän (GC) ja tuumoria infiltroivien leukosyyttien (n = 20) havaittiin virtaussytometrillä sen jälkeen, co-värjäystä vasta-aineiden CD4, CD8, RORγT, ja CD3 + CD16 +, CD56. a9. Vertailu prosenttiosuus IL-26-positiivisten solujen CD3-positiivisten T-solujen välillä PBMC: itä kontrolleina, CD3, CD4, CD8-positiivisten, Th17 ja NK-solujen, jotka ovat peräisin GC kudoksista. Koe suoritettiin kolmena rinnakkaisena. a10: Piirakkakuviota varten prosenttiosuus eri komponenttien edistää IL-26 tuotantoa. b1-b4: edustaja CD4 + T-soluja,

in vitro

stimuloi Th17 soluja ja eristetyt NK-soluissa tutkittiin virtaussytometrialla. c1-c8: virtaussytometrianalyysin IL-26 ilmentyminen Th17 ja NK-solujen stimuloidaan LPS: n ja

H.pylori

lysaatit. c9: vertailu IL-26 ilmentyminen kussakin ryhmässä. Kokeet suoritettiin kolmena rinnakkaisena. Tilastolliset analyysit kuviossa a9 ja c9 suoritettiin käyttäen Mann-Whitneyn U-testi, ja verrattuna kontrolliryhmään. ** P 0,01.

tutkimiseksi edelleen eritystä IL-26 Th17 ja NK-soluissa, PBMC kerättiin 20 terveillä vapaaehtoisilla ja stimuloidaan alle Th17 polarisoivan olosuhteissa. Toinen pääasiallinen lähde IL-26, NK-solut, saatiin PBMC käyttäen kaupallista ihmisen NK eristyspakkausta. Ominaisuudet indusoimia tai eristetty Th17 ja NK-soluissa varmistettiin solunsisäisen sytokiinin värjäystä ja edelleen analysoitiin virtaussytometrialla (kuvio 2B1, b2). Stimulaatio Th17 ja NK-solujen LPS: n kanssa, ja

H.pylori

lysaatit johti merkittävään kasvuun eritystä IL-26, joka osoittaa, että IL-26 on tärkeä sytokiini vasteen mahasyövässä (kuvio 2C).

3.

In vitro

Proliferative ja Anti-apoptoottista vaikutukset IL-26

IL-26 tutkittiin tarkemmin joukon

in vitro

tehdyissä tutkimuksissa kaksi ihmisen GC solulinjat, MKN45 ja SGC-7901. Vaikutus IL-26 proliferaatiota arvioitiin kanssa BrdU incooperation määritys soluissa, joita käsiteltiin eri pitoisuuksilla IL-26 (1, 10 ja 50 ng /ml). Mitään merkittäviä eroja solujen lisääntymisen välillä havaittiin käsittelemättömät solut ja niitä käsiteltiin 1 ng /ml IL-26. Osuus kuitenkin soluproliferaation lisääntynyt voimakkaasti 10 ja 50 ng /ml IL-26 verrattuna käsittelemättömissä soluissa (kuvio 3A). Lisäksi arviointi antiapoptoottinen vaikutus IL-26 PI-anneksiiniV co-värjäys soluissa käsitelty kemoterapiaa huumeiden sisplatiinin eri aikaan kohdetta osoittivat, että IL-26 oli merkittävä anti-apoptoottinen vaikutus jopa annoksella 1 ng /ml. Anti-apoptoottinen vaikutus kasvoi kasvavien pitoisuuksien kanssa IL-26-10 ja 50 ng /ml (kuvio 3B1, B2). Nämä tulokset osoittivat, että IL-26 on proliferatiivisia ja antiapoptooppinen vaikutukset ihmisten GC solulinjoissa, mikä osittain selittää yhdistyksen välillä IL-26 ilmentyminen ja eri kliinisiä piirteitä kliinisissä tutkimuksissa. Kuitenkin taustalla molekyylitason mekanismia on analysoitava tarkemmin.

: n kasvu- käyrä mahalaukun syövän (GC) solulinjat MKN45 ja SGC7901 läsnä ollessa tai ilman IL-26 ilmoitettuina pitoisuuksina määritettynä BrdU yhteistyö määrityksessä. Koe suoritettiin kolmena rinnakkaisena. B1: Analyysi sisplatiinin (1 ug /ml) indusoi apoptoosin MKN45 ja SGC7901 soluissa ja soluissa, joita käsiteltiin osoitetuilla pitoisuuksilla IL-26: ssa 24 tuntia. Solut analysoitiin PI-anneksiini V co-värjäystä. Hoitamaton MKN45 ja SGC7901 soluja käytettiin kontrolleina. B2: vertailu prosenttiosuus apoptoottisten solujen eri aikaan paikalla kussakin ryhmässä (kokeet suoritettiin kolmena kappaleena). Tilastolliset analyysit kuvioissa A ja B2 suoritettiin Kaksisuuntainen ANOVA ja verrattuna kontrolliryhmään. ** P 0,01.

4. Proliferatiivinen ja Anti-apoptoottista vaikutukset IL-26 liittyy STST3 Activation

Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että IL-26 sen reseptorikompleksin voivat aiheuttaa nopeaa käyttöönottoa STAT3 ja vähemmässä määrin, STAT1 [ ,,,0],12]. Näin ollen, ensin määritetään ekspression IL-26-reseptorikompleksin (IL-20R1 ja IL-10R2) in MKN45 ja SGC7901 solujen ja varmistanut, että molemmat reseptorit olivat läsnä GC solulinjoissa vahvistaa, että transduktion IL-26-signaalit oli mahdollista (kuvio 4A). Sitten tutkittiin aktivointi STAT1 ja STAT3 signalointia ja se osoitti, että fosforylaatio S727 jäännös STAT3 ja Y701 ja STAT1 kasvoi vasteena 10 ng /ml IL-26. IFN-γ (10 ng /ml) ja IL-6 (30 ng /ml) käytettiin aktivoinnin säätimet STAT1 ja STAT3, vastaavasti (kuvio 4B). Perustuu aiempiin tutkimuksiin, jotka osoittavat, että STAT1 ja STAT3 signalointireitteihin on päinvastainen vaikutuksia kasvainten synnyssä [18], tutkimme alavirtaan tavoitteet STAT1 ja STAT3 edelleen valaista niitä taustalla proliferatiivisia ja pro-selviytymisen vaikutukset IL-26 välittävät STAT1 ja STAT3 signalointia GC solulinjoissa. Tulokset osoittavat, että IL-26 stimulaation voimistunut ilmentyminen Bcl-2, Bcl-xl ja c-myc, viittaa siihen, että IL-26 on voimakkaampi vaikutus STAT3 aktivoinnin kuin STAT1 signalointi suoraan tai välillisesti (kuvio 4B). Tämä tulos tukee myös ymmärrystämme pro-eloonjäämisen ja proliferatiivista vaikutusta IL-26 ihmisen GC solulinjoissa.

V: n ilmentyminen IL-20R1 ja IL-10R2 in MKN45, SGC7901, mahasyövän ja normaali mahalaukun kudoksesta havaitaan western-blottauksella. B: MKN45 ja SGC7901 soluja stimuloitiin on tai ei ole IL-26 (10 ng /ml), IL-6 (30 ng /ml), ja IFN-γ (10 ng /ml), proteiinit uutettiin ja analysoitiin western-blottauksella for STAT3 ja STAT1 aktivointi (fosforyloituu S727 varten STST3 ja Y701 varten STAT1) ja loppupään proteiinin ilmentymistä Bcl-2, Bcl-xl ja c-myc.

5. Kasvain edistävää vaikutusta IL-26 on riippuvainen STAT1 /STAT3 Balance

IL-26 tasapainoon STAT1 ja STAT3 aktivaatio tutkittiin käyttämällä lentiviraalinen välittämää siRNA vaiennettu STAT1 ja STAT3 vuonna MKN45 ja SGC-7901-soluja. Vastaava siRNA tehokkaasti alassäädetty ilmaus STAT1 ja STAT3 molemmissa solulinjoissa (kuvio 5A). Solujen lisääntyminen määritettiin BrdU yhteistyötä määritys ohjaus siRNA transfektoiduissa soluissa ja STAT1 ja STAT3 siRNA käsiteltiin GC solulinjoja kasvatetaan väliaineessa, joka sisälsi 10 ng /ml IL-26. Knockdovvn STAT3 ilmentymisen merkittävästi inhiboi kasvua MKN45 ja SGC-7901-soluissa, kun taas STAT1 pudotus ei ollut vaikutusta solujen lisääntymistä (kuvio 5B1, B2). Sisplatiini indusoi apoptoosin arvioitiin PI-anneksiini V co-värjäys samoissa soluissa ylläpidetään median kanssa 10 ng /ml IL-26, ja tulokset osoittivat merkittävää laskua pro-eloonjäämisen vaikutusta IL-26 STAT3 pudotus soluissa , kun taas tilastollisesti merkittäviä muutoksia apoptoosin havaittiin vastauksena STAT1 hiljentäminen (kuva 5C1, C2). Nämä tulokset osoittivat, että IL-26 on pro-selviytymisen ja proliferatiiviset vaikutukset ihmisten GC solulinjoissa välittämän ainakin osittain STAT1 /STST3 signalointi.

V: Expression of STAT1 ja STAT3 vuonna MKN45 ja SGC7901 solut transfektoitu ohjaus siRNA (merkitty MKN45cs ja SGC7901cs) tai erityiset siRNA kohdistaminen STAT1 ja STAT3 määritettynä western blottauksella. B: Solujen kasvu MKN45cs ja SGC7901cs ja STAT1 ja STAT3 siRNA käsitellyissä soluissa määritettynä BrdU yhteistyötä määrityksessä. Kokeet suoritettiin kolmena rinnakkaisena. C1: Sisplatiini (1 ug /ml) indusoi apoptoosin MKN45cs, SGC7901cs ja STAT1 ja STAT3 siRNA käsiteltyjen solujen määritettynä PI-anneksiini V co-värjäystä. B2: vertailu apoptoosiprosentti kussakin ryhmässä (kokeet suoritettiin kolmena kappaleena). Tilastolliset analyysit kuvioissa B ja c2 suoritettiin Mann-Whitney U-testi, ja verrattuna kontrolliryhmään. ** P 0,01.

Keskustelu

Aiemmat tutkimukset osoittivat, että IL-26 on koekspressoitiin toinen tärkeä IL-10-liittyvän sytokiini, IL-22, joka on myös erittyy Th17 soluihin [19], [20]. Ilmaisulla ja rooli IL-26 ihmisen syövässä ei ole tutkittu yksityiskohtaisesti. Täällä me tutkittiin ensimmäistä kertaa IL-26 ihmisen GC kudosten ja osoittivat, että IL-26 ja liittyvien molekyylien kuten IL-20R1 ovat yli-ilmentyy ihmisen GC kudoksissa.

IL-26 on co -expressed IFN-γ: n ja IL-22 ihmisen Th1-kloonit, mutta ei Th2-klooneja. Lisäksi IL-26 on koekspressoitiin IL-17 ja IL-22 Th17 solujen tärkeä osajoukko CD4 + T-auttajasolujen, joka on erillään Th1- ja Th2-solujen [12], [21]. Esillä olevassa tutkimuksessa IL-26: n havaittiin tuotetaan pääasiassa CD4-positiivisten auttaja-T-solut ihmisen GC, joiden joukossa lähes puolet Th17 solujen eritetyn IL-26. Tutkimme toinen mahdollinen solulähteestä, NK-solut, jotka on raportoitu liittyvän kasvaimen tilavuuden ja levittää ihmisen GC [22], [23] ja osoittivat, että NK-solut olivat myös tärkeitä lähteitä IL-26 tuotantoa. Tuloksemme tukevat tuoreessa tutkimuksessa, jossa uusi osajoukko CD56 + NKp44 + NK-soluissa havaittiin yhteistyöhön ilmentää IL-22 ja IL-26, erityisesti hoitovasteen IL-23 [24]. Hughes

et al

. kuvataan eri osajoukon kypsymättömiä NK-solujen, jotka eivät ilmennä CD56 tai NKp44 mutta ilmaista CD117 ja CD161 ja joka ilmentää IL-22 ja IL-26 [25]. Lisäksi tuloksemme osoittivat ensimmäistä kertaa, että IL-26 edistää proliferaatiota ihmisen GC-solujen tasapainoon vaikuttavan STAT1 ja STAT3 aktivaation, jolloin saadaan uusia todisteita suhde NK-solujen ja kasvaimen tilavuus ihmisen GC.

IL-26 on raportoitu signaloida heterodimeerisen reseptorin kompleksin, joka koostuu IL-20R1 ja IL-10R2 ketjut. IL-20R1 toimii ligandi-sitova ketju IL-26 ja IL-10R2 toimii olennaisen toisen ketjun loppuun kokoonpanon aktiivisen reseptorikompleksin. Neutraloivia vasta-aineita joko IL-20R1: n tai IL-10R2 ketjut kykenevät salpaamaan IL-26 signalointia. Kun täysin koottuna, reseptorikompleksissa tapahtuu konformaatiomuutos (t), joka indusoi reseptorin aktivoitumisen liittyvän Janus tyrosiinikinaasit, Jak1 ja Tyk2, ja sen jälkeen ohimeneviä telakointi ja fosforylaatiota STAT-proteiinien, STAT1 ja STAT3, [26] [27]. Yhtenä alavirran signalointia tekijät IL-26, STAT3 on useimmiten liittyy kasvaimen kehittymisen ja se pidetään myös onkogeeni. STAT3, jota pidetään yhtymispiste lukuisia onkogeeniset signalointireittejä, konstitutiivisesti aktivoitu sekä tuumorisoluissa ja immuunijärjestelmän solujen kasvaimen mikroympäristössä [28], [29], [30]. Erityisesti, STAT3 aktivointi on raportoitu lähes 70% kiinteää ja hematologiset kasvaimet, mukaan lukien multippeli myelooma, useita lymfoomat ja leukemia, rintasyöpä, pään ja kaulan syöpä, eturauhassyöpä, munasarjasyöpä, melanooma, munuaissyöpä, paksusuolen karsinooma ja kateenkorvan kasvaimia [31]. STAT3 tiedetään edistävät solujen proliferaatiota ja angiogeneesiä ja rooli kasvaimen immuuni-paeta, mutta se myös heikentää invasiivisuus ja metastaattisen potentiaalin kasvaimia. Tuloksemme osoittivat, että STAT3 on aktivoitu ihmisen GC kudoksissa ja sen aktivaatio voi liittyä liialliseen IL-26 eritystä. Toisaalta, mitään merkittäviä eroja ei havaittu muissa alavirtaan tavoite IL-26, STAT1 välillä kasvaimen ja viereisten normaaleissa kudoksissa. STAT1 ja STAT3 arvellaan päinvastainen rooleja kasvainten synnyssä [18]. STAT1 on monimutkainen joukko toimintoja sekä kasvainsoluissa ja immuunijärjestelmää ja pidetään yleensä tuumorisuppressorina koska sen rooli kasvun eston ja apoptoosin edistämiseen [32].

Yhteenvetona osoitimme, että IL -26 edistää solujen kasvua ja estää apoptoosin ihmisen mahalaukun syöpäsolujen moduloimalla tasapainoa STAT1 /STAT3 signalointia, mikä osoittaa, että IL-26 voi olla arvokas prognostinen indikaattori ja terapeuttinen kohde mahalaukun syöpäpotilailla.