Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Monet potilaat, joilla on diagnosoitu munasarjasyöpä kokemusta toistuminen ja etäpesäke, kahta seikkaa, jotka aiheuttavat usein hajosi. Epiteelin-to-mesenkymaalitransitioon (EMT) on keskeinen prosessi osallisina syövän etenemiseen. Yhä todisteita yhdistää sisplatiini ja EMT, halusimme tunnistaa yhdiste kykenee torjumaan EMT etenemistä kun syöpäsolut sisplatiinia.

Menetelmät /Principal Havainnot

Solukuolemaan arvioitiin sytometrialla kanssa anneksiini V /PI-värjäyksen A2780 ja A2780CP soluja. Munasarjasyövän solulinjoissa käsiteltiin Sisplatiini (24 h, 10 uM) ja eri pitoisuuksia Resveratrol arvioida sen vaikutuksia Cisplatin aiheuttamaa EMT käyttäen Western Blot ja RT-PCR-analyysillä. Morfologiset tutkimukset ja haavan määritys arvioimaan soluliikkuvuus suoritettiin käyttäen 72 h Sisplatiini hoidon A2780 ja A2780CP soluja. Densitometria tehtiin Western Blot ja PCR-tuloksiin, ja tilastollinen merkitsevyys määritettiin käyttäen One-Way ANOVA seurasi Tukey post-hoc-testi. Tuloksemme osoittavat, että sisplatiini aiheuttama EMT liittyvät morfologisia muutoksia A2780 munasarjasyövän solulinja ja vähäisemmässä määrin sen Cisplatin kestävä vastine A2780CP. Resveratrol aiheutti solukuolemaa A2780 ja A2780CP solulinjoissa apoptoottisen riippumattomalla tavalla. Resveratroli esti Sisplatiini aiheuttama Snail ilmentymistä vähentämällä Erk reitin aktivointi, palautui morfologiset muutokset aiheuttamien Sisplatiini ja laski migraatiota.

Johtopäätökset

Nämä tulokset osoittavat, että resveratroli on kiinnostavia mahdollisuuksia estää sisplatiiniannoksen aiheuttama EMT in munasarjasyöpäsoluja. Lisäämällä solukuoleman, se edustaa myös houkuttelevan lähestymistavan adjuvanttiterapiana käytettäväksi kemoterapiaa. Käyttämällä Erk reitin inhibiittorit voivat myös osoittautua hyödylliseksi munasarjasyövän hoito vähentää riskiä etäpesäkkeiden.

Citation: Baribeau S, Chaudhry P, Parent S, Asselin É (2014) Resveratrol Estää Cisplatin-aiheuttama epiteelikasvaimet-to mesenkymaalitransitioon munasarjasyövässä Cell Lines. PLoS ONE 9 (1): e86987. doi: 10,1371 /journal.pone.0086987

Editor: Goli samimi, Kinghorn Cancer Centre, Garvan Institute of Medical Research, Australia

vastaanotettu: 04 lokakuu 2013; Hyväksytty: 19 joulukuu 2013; Julkaistu: 22 tammikuu 2014

Copyright: © 2014 Baribeau et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ on tukenut avustusta Kanadan Institutes for Health Research (MOP-66987). EA omistaa kanadalainen Research Chair in Molecular-gynekologiset-Oncology. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Munasarjasyöpä on seitsemänneksi yleisin syöpä ja kolmanneksi yleisin keskuudessa gynekologisia syöpiä Canadian women. Munasarjojen syöpä on myös gynekologinen syöpä, jolla on korkein kuolleisuus ja 5 vuoden pysyvyys arvioidaan vain 15-25% [1]. Tämä voidaan selittää sillä, että potilaat kärsivät munasarjasyöpä on usein jo korkea vaiheessa taudin hetkellä diagnoosi [2], [3]. Tavallinen hoito munasarjasyöpä koostuu kirurgisten cytoreduction seurasi platinapohjaisen kemoterapian [4]. Huolimatta alustavan hoitovasteen, monet potilaat relapsi ja lopulta vaikuttaa etäpesäkkeitä ja lopulta täyttää kuolema.

epiteelikasvaimet-to-mesenkymaalitransitioon (EMT) on fysiologinen prosessi, joka tapahtuu alkionkehityksen aikana ja toisinaan aikuiset, esimerkiksi haavan paranemisen aikana [5]. EMT on ilmiö, jonka aikana solut muuntuvat epiteelin fenotyyppi, jossa on enemmän liikkuvia ja invasiivisia mesenkymaalisten fenotyyppi, mikä tekee ne pystyvät tunkeutumaan kudoksiin ja muodostaa etäpesäkkeitä. Tärkein tunnusmerkki EMT on menetys E-kadheriinin, risteyksen proteiini tyypillisesti ilmaistu epiteelisoluissa. Useimmissa tapauksissa, E-kadheriinin menetys välittyy transkriptiorepresso-, ja mutaatioita geenin tai proteiinin eivät ole yhteisiä tapahtumia [6]. Yleisimmin mukana repressors kuuluvat Snail, Slug, ja ZEB1 suoraan sitoutuvat E-kadheriinipromoottorin tukahduttaa sen transkription [7], [8]. Monet tekijät tiedetään indusoivan EMT, mukaan lukien sytokiinit, kuten TGF-β [9] tai MAPK-Erk-reitin [10]. Äskettäin julkaistun tutkimuksen munasarjasyövän raportoitu Sisplatiini kuin indusoi EMT [11].

Etana ja Slug ovat transkriptiotekijät lähinnä tunnettu niiden osallistumisesta EMT missä he tukahduttavat ilmaisua epiteelin markkereita, kuten E-kadheriinin ja Claudin-1, ja lisätä ilmentymistä mesenkymaalisten markkereita, kuten ZEB1 ja MMP-9: [12] – [16]. Ne voivat myös tukahduttaa ilmentymistä ja toimintaa kasvaimen p53 ja edistää chemoresistance [17], [18]. Aikana EMT etenemistä, uskotaan, että Snail on ensimmäinen tekijä aktivoituvat aloittamaan siirtymisen taas Slug ilmaistaisiin myöhemmissä vaiheissa, jotta solut säilyttävät mesenkymaalisten ominaispiirteet [19]. ZEB1 on toinen tärkeä edistäjä EMT by tukahduttamiseen ZO-1 ja E-kadheriinin [20], mutta voi myös olla mukana yhä leviämisen nopeus solujen [21].

resveratrolin (trans-3,4 ’ , 5-trihydroksistilbeeni) on luonnollinen yhdiste tuotetaan monia kasveja kuten punaiset viinirypäleet [22], ja sen jälkeen läsnä viinissä, tunnettu antioksidantti ja sen suojaavia vaikutuksia verenkiertoon ja syöpää vastaan, jossa se voi estää useita vaiheita tauti [23]. Viime vuosina nämä monia vaikutuksia sijoitettu Resveratrol valokeilaan tutkimuksen.

Tässä tutkimuksessa tutkimme vaikutus Resveratrol sisplatiinilla aiheuttama EMT munasarjasyövän. Huomasimme, että solujen yhteistyö käsitelty resveratrolin ja sisplatiinia ei näytä ominaispiirteet EMT, kuten Resveratrol hoito kumottu Cisplatin aiheuttaman Snail-proteiini ja mRNA ilmaisuja annoksesta riippuvaisella tavalla. Tämä mukana Erk polku, joka estyi resveratrolin ja sen osallistuminen varmistettiin myös erityisillä MEK1 /2 eston kanssa U0126. Resveratrol myös estetty morfologisia muutoksia A2780 ja A2780CP solujen ja vähensi muuttoliike kyky A2780 ja A2780CP soluihin haavan paranemista määritystä. Samanlaisia ​​esto muuttoliikkeen havaittiin OVCAR-3 ja SKOV-3-soluissa. Ehdotamme myös β-kateniinin markkerina resistenssi Cisplatin: n indusoiman apoptoosin, kun se pilkottiin vain Cisplatin-herkkiä solulinjoja.

Methods

Reagenssit

Dulbeccon modifioidussa Eagle keskipitkän F12 (DMEM-F12), ja naudan kasvu seerumi (BGS) ostettiin HyClone (South Logan, Utah). Gentamysiini, sisplatiini, ja resveratrolin ostettiin Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). MEK1 /2-estäjän ja Vanheneminen β-galaktosidaasi -värjäyspakkausta ostettiin Cell Signaling Technology (Danvers, MA). Kuolleiden solujen apoptoosin pakki anneksiini V /PI, Trizol reagenssi ja Moloneyn (M-MLV) käänteistranskriptaasia ostettiin Invitrogen (Carlsbad, CA).

Soluviljely ja käsittely

Ihmisen munasarjasyövän solulinjoissa A2780 ja A2780CP (resistentti sisplatiini) soluja ystävällinen lahjoitus tri G. Peter Raaphorst (Ottawa Regional Cancer Center, Ottawa, Kanada) ja alun perin kuvattu [24]. OVCAR-3 ja SKOV-3-solulinjat hankittiin ATCC: ltä. A2780 ja A2780CP soluja viljeltiin DMEM-F12-väliaineessa, jota oli täydennetty 2%: BGS. OVCAR-3-soluja viljeltiin RPMI-1640-elatusaineessa ja SKOV-3-soluja viljeltiin McCoyn elatusainetta sekä täydennetty 10% FBS: ää. Gentamysiiniä (50 ug /ml) lisättiin kaikkiin viljelyväliaineeseen.

Tutkia vaikutus Resveratrol sisplatiinilla aiheuttama EMT, A2780 ja A2780CP solut yhteistyötä käsiteltiin resveratrolin ja 10pM sisplatiinia 24 tunnin ajan. Tutkia vaikutusta Erk reitin on Cisplatin-induced EMT, munasarjasyöpä solulinjoja esikäsiteltiin 20 uM U0126: ssa 1 tunti, sitten Sisplatiini lisättiin elatusaineeseen 24 tunnin ajan lopulliseen konsentraatioon 10 uM. DMSO: ta käytettiin kontrollina U0126 ja Resveratrol.

Detection solukuoleman virtaussytometrialla

A2780 ja A2780CP soluja käsiteltiin resveratrolin ja sisplatiinia 24 tuntia. Sadonkorjuun, soluja sentrifugoitiin 500 rpm: llä 5 minuutin ajan, pestiin PBS: llä ja sitten sentrifugoitiin 300 rpm: llä 5 minuutin ajan. Solukuolemaa arvioitiin anneksiini-V-FITC ja propidiumjodidilla (PI) kaksinkertainen värjäys käyttäen kuolleiden solujen apoptoosin kit mukaan valmistajan protokollaa. Fluoresenssi luettiin käyttäen Cytomics FC 500 MPL virtaussytometrillä (Beckman Coulter). Positiiviset solut anneksiini-V ja /tai PI pidettiin kuolleita soluja.

MTT-määritys

leviämisen A2780 ja A2780CP solut arvioitiin MTT: llä. Solut maljattiin kahtena kappaleena 96-kuoppaisille levyille ja annettiin tarttua yli yön. Seuraavana päivänä solut kasvuvaiheessa hoidettiin 0-60 uM Resveratrol tai ilman 10pM Sisplatiini 24 h 100 ul viljelyalustassa. 4 h ennen hoidon loppuun, 10 ui MTT-liuosta lisättiin kuhunkin kuoppaan ja levyt sijoitettiin inkubaattoriin. 4 tuntia myöhemmin, 100 ui liukoisuuden liuosta (10% SDS: ää 0,01 M HCI) lisättiin kuhunkin kuoppaan ja levyt jätettiin inkubaattoriin yön yli. Seuraavana päivänä absorbanssi luettiin A

595nm kanssa Fluostar Optima -levylukijalla.

Western Blot

Solut kerättiin 24 tunnin kuluttua resveratrolin-Cisplatin tai U0126-sisplatiinihoitoon ja pestiin kahdesti fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS). Sitten solut lyysattiin RIPA-lyysipuskuria, joka sisälsi täydellisen proteaasi-inhibiittoriseosta (Roche Applied Science), ja niille suoritettiin kolme jäädytys /sulatus-syklien -20 ° C: ssa. Sitten solut sentrifugoitiin ja supernatantti otettiin talteen. Proteiinipitoisuus arvioitiin käyttäen BioRad DC Protein Assay. Sama määrä proteiineja (20-40 ug) erotettiin sitten SDS-PAGE: lla ja siirrettiin nitroselluloosamembraaneille (BioRad, Hercules, CA). Membraanit blokattiin 5% rasvatonta kuorittua maitoa PBS-Tween 20: 0,05% (PBS-T), 1 tunnin ajan ennen inkubointia primääristen vasta-ainetta (laimennettu 1:1000 PBS-T /maito) yön yli 4 ° C: ssa (kaikki vasta-aineet ovat peräisin Cell Signaling Technology, Danvers, MA, paitsi GAPDH alkaen Abcam (Cambridge, MA)). Primaarinen vasta-aine suunnattu Snail inkuboitiin 2 h huoneen lämpötilassa ja HRP-konjugoitua-GAPDH inkuboitiin 45 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Inkubaation jälkeen membraanit pestiin neljä kertaa PBS-T ennen inkubaatiota piparjuuriperoksidaasiin konjugoitua sekundaarista vasta-ainetta (BioRad, Hercules, CA) laimennettuna 1:3000 PBS-T /maitoa. Kalvot pestiin neljä kertaa PBS-T: n ja vasta-aineet paljastettiin käyttämällä SuperSignal West Femto alustan (Thermo Scientific, Rockford, IL), kuten valmistaja on kuvannut käyttäen UVP Bio Imaging System. GAPDH: ta käytettiin lastaus ohjaus.

Solumorfologia

Soluja kasvatettiin 6-kuoppaisilla levyillä ja käsiteltiin sitten 2,5 uM Sisplatiini ja /tai 60 uM resveratrolin 72 h A2780 ja A2780CP solujen riittävästi aikaa EMT morfologisia muutoksia tapahdu. Käsittelyn jälkeen solut pestiin tuoreella kasvualustalla, poistaa kuolleita soluja. Lopuksi solut havaittiin alle Carl Zeiss Axio observerZ1 mikroskoopilla määrittää niiden morfologian ja kuva otettiin faasikontrastimikroskopialla käyttäen 20X suurennus. Esitteleville soluille mesenkymaaliset ominaisuuksia, entistä fibroblastien kaltainen morfologia ja solujen protusions, katsottiin läpikäyneet EMT.

Haavan paranemista määritys

arvioimiseksi solun liikkuvuus, solut maljattiin 24-kuoppaisille levyt ja kasvatettiin yhtenäiseksi. Steriili kärki käytetään luomaan tyhjästä solussa kerrokseen. Sitten soluja käsiteltiin 2,5 uM sisplatiinia ja 60 uM resveratrolin ja kuvat otettiin sopivina aikoina arvioimaan haavan sulkeutumisen. Haavat arvioitiin käyttäen ImageJ ohjelmiston mitata haava-alueen eri ajankohtina. Prosenttiosuus haavan laskettiin haavan pinta-ala tietyllä hetkellä verrattuna alkuperäiseen haavan pinnan. Kuvat esitetään edustavat kolmen erillisen kokeen suoritettiin kahtena kappaleena.

käänteistranskriptaasia PCR: n (RT-PCR) B

Kokonais-RNA uutettiin käsitellyistä soluista käyttämällä Trizol-reagenssia mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. 500 ng RNA: ta käänteiskopioitiin käyttämällä M-MLV-käänteistranskriptaasia ja oligo (dT) alukkeita. Käännetyn transkriptoitu RNA monistettiin sitten PCR: llä käyttäen spesifisiä alukkeita. GAPDH käytettiin sisäisenä kontrollina. Ihmisen Snail monistettiin käyttämällä sense-aluketta 5′-TCGGAAGCCTAACTACAGCGA-3 ’ja antisense-aluketta 5′-AGATGAGCATTGGCAGCGAG-3′ (fragmentti pituus 140 ep). Ihmisen TCF8-ZEB1 monistettiin käyttämällä sense-aluketta 5’-TTACACCTTTGCATACAGAACCC-3 ’ja antisense-aluketta 5′-TTTACGATTACACCCAGACTGC-3′ (fragmentti pituus 100 ep). Ihmisen vimentiinista monistettiin käyttämällä sense 5’-CGAAAACACCCTGCAATCTT-3 ’ja antisense-aluketta 5′-CTGGATTTCCTCTTCGTGGA-3′ (fragmentti pituus 133 ep). GAPDH: ta monistettiin käyttäen sense 5’-GTCAGTGGTGGACCTGACCT-3 ’ja antisense-aluketta 5′-GACTTGACAAAGTGGTCG-3’ (fragmentti pituus 139 ep). GAPDH käytettiin kontrollina.

Vanheneminen liittyvä β-galaktosidaasi-värjäys

Solut maljattiin 6-kuoppaisille levyille ja annettiin tarttua yli yön. Seuraavana päivänä soluja käsiteltiin 60 uM resveratrolin ja 2,5 uM sisplatiinia 72 tuntia. Käsittelyn jälkeen solut pestiin poistamiseksi tarttumattomat solut ja värjättiin Vanheneminen β-galaktosidaasi -värjäyspakkausta mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Sitten solut laskettiin valomikroskoopilla arvioida prosenttiosuutta senescent soluja, jotka ilmestyi sininen soluja.

Densitometria ja Tilastollinen analyysi

Densitometri analyysi tehtiin Western Blot tulosten ja PCR Kuvien määrä Yksi ohjelmisto (BioRad) määrittää runsaasti proteiineja tai ulkoiset mRNA tutkittu. Molemmissa tapauksissa, GAPDH käytettiin kontrollina. Haavan paranemista määrityksissä, haavan alue mesured käyttäen ImageJ ohjelmistoa. Haavan arvioitiin vertaamalla haava-alueen tietyllä hetkellä alkuperäiseen haava-alueelle. Vertailu hoitojen välillä tehtiin käyttämällä GraphPad PRISM ohjelmistoversio 5.00 (San Diego, CA) käyttäen yksisuuntaista ANOVA-analyysiä ja

jälkikäteen

Tukeyn testi. Tilastollinen merkitsevyys hyväksyttiin, kun p 0,05. Kaikki kokeet suoritettiin tässä tutkimuksessa toistettiin kolme riippumatonta kertaa.

Tulokset

resveratrolin indusoi solukuoleman munasarjasyöpäsoluja

hoito A2780 ja A2780CP munasarjasyöpäsoluja Resveratrol lisääntynyt solukuoleman annoksesta riippuvaisella tavalla, kuten on esitetty osuus PI-positiivisia soluja. Alhainen osuus anneksiini V värjäytymisen resveratrolin-käsiteltyjen näytteiden muttei Cisplatin-käsiteltyjen näytteiden viittaa siihen, että Resveratrol saattaa aiheuttaa solukuoleman kautta eri mekanismilla tai tapahtua nopeammin kuin Cisplatin-solukuolema (kuva 1).

Solukuolema tasot arvioitiin virtaussytometrialla anneksiini-V: n ja PI-värjäyksellä A2780 ja A2780CP soluja. Edustaja virtaussytometrillä tulokset on esitetty A2780 (A) ja A2780CP solut (B), käsiteltiin 10 uM sisplatiinia ja 40 uM Resveratrol. Vuonna oikeassa yläkulmassa, solukuoleman prosenttiosuutta näytetään, vastaten apoptoottisten ja nekroottisen solukuoleman. Anneksiini V ja PI negatiiviset solut (B3) ovat ei-apoptoottisia. Anneksiini V positiivisia ja PI negatiiviset solut (B4) ovat alkuvaiheessa apoptoosin. Anneksiini V positiivisia ja PI-positiivisten solujen (B2) ovat myöhässä apoptoosin. Anneksiini V negatiivinen ja PI-positiivisia soluja (B1) ovat nekroottinen soluja. Solukuoleman prosenttiosuus on esitetty (C) sekä solulinjoja käsiteltiin kasvavilla annoksilla resveratrolin jopa 60 uM kanssa tai ilman sisplatiinia 10 uM. Esitetyt tulokset edustavat kolmen erillisen kokeen. Graafeissa, sarakkeita tunnistetaan eri kirjaimia ovat merkittävästi erilaisia ​​(p 0,05). Graafeissa, mock: käsittelemättömät solut, R20: Resveratrol 20 uM, R40: Resveratrol 40 uM, R60: Resveratrol 60 uM, CP: sisplatiini, R20CP: Resv. 20 uM + sisplatiini, R40CP: Resv. 40 uM + sisplatiini, R60CP: Resv. 60 uM + sisplatiini.

Tutkimme apoptoosin ja autophagy mahdollisina solukuoleman mekanismeja. A2780-soluja, sisplatiini indusoi kasvua kaspaasi-3 ja PARP pilkkominen, mikä osoittaa, solukuoleman induktio apoptoosin kautta. Sitä vastoin hoito A2780 tai A2780CP solujen resveratrolin ei vaikuttanut tasoa pilkottiin kaspaasi-3 läsnäolosta huolimatta kuolleita soluja, vahvistaa mahdollisuutta, että mekanismi muu kuin apoptoosi (kuvio 2). Päätimme sitten tutkia autophagy induktion arvioimalla ekspressiotasot LC3B-II ja Beclin-1, kaksi proteiinia tunnetaan osallistumisesta autophagy etenemistä. Resveratroli aiheutti lisääntymisen LC3B-II tasot molemmissa solulinjoissa, tukevat tulokset Opipari

et ai

. esittää autophagy mahdollisena mekanismi vastaa resveratrolin solukuolema [25]. Mallissa, emme tarkkailla kasvua Beclin-1 tasot, joka on jo ilmaissut suhteellisen korkeilla A2780 ja A2780CP solulinjoissa.

mekanismi solukuoleman tutkittiin A2780 ja A2780CP solujen vastauksena Sisplatiini ja Resveratrol. Puuttuminen nousu pilkotun PARP tasoilla ja kaspaasi-3 pilkkominen kun suurempia annoksia Resveratrol käytetään viittaa resveratrolin aiheuttaisivat solukuoleman mekanismin kautta riippumattoman apoptoosin. Merkittävä kasvu LC3BII viittaa Resveratrol saattaa aiheuttaa solukuoleman kautta autophagy. Densitometria analyysi esitetään alla Western Blot kunkin solulinjan. Esitetyt tulokset edustavat kolmen erillisen kokeen. Graafeissa, sarakkeita tunnistetaan eri kirjaimia ovat merkittävästi erilaisia ​​(p 0,05). Graafeissa, mock: käsittelemättömät solut, R40: Resveratrol 40 uM, CP: sisplatiini, R20CP: Resv. 20 uM + sisplatiini, R40CP: Resv. 40 uM + sisplatiini, R60CP: Resv. 60 uM + sisplatiini.

resveratrolin potentiates Cisplatin aiheuttama lasku solujen lisääntymisen

vieressä pyrki vaikutuksen arvioimiseksi Resveratrol proliferaatioon A2780 ja A2780CP solulinjoissa. Kuten on esitetty kuviossa 3, pieniä annoksia resveratrolin (20-40 uM) nostaa hieman lisääntymistä molemmissa solulinjoissa huolimatta solukuolemaa liittyvät tähän hoitoon. Korkeimmalla tutkitulla annoksella (60 uM) Resveratrol indusoi lievää laskua proliferaatiota A2780 soluissa ja melkein mitään muutosta A2780CP soluissa. In Sisplatiini herkkien A2780 soluissa, Resveratrol voimistaa vähentää solujen lisääntymistä havaittiin, kun Sisplatiini käytetään hoito viittaa synergistinen vaikutus näiden kahden yhdisteet. Tätä ei havaittu Cisplatin kestävä A2780CP soluissa, mutta korkein Resveratrol annos ei lisännyt proliferaatiota, kun sitä käytetään yhdessä Cisplatin.

MTT-määritys suoritettiin arvioimaan A2780 ja A2780 solulinjojen jakautumista vasteena 10gM Sisplatiini ja suurenevina annoksina enimmillään 60 uM Resveratrol. A2780 soluissa proliferaatio korotettiin resveratrolin 20 uM ja laski 60 uM, kun kaikki annokset viittaavat lisääntyminen proliferaation A2780CP soluissa. Resveratrol voimistaa myös Sisplatiini lasku leviämisen A2780 soluissa. Kaavio baareja eri kirjaimet ovat tilastollisesti erilaisia ​​(p 0,05). Graafeissa, mock: käsittelemättömät solut, R20: Resveratrol 20 uM, R40: Resveratrol 40 uM, R60: Resveratrol 60 uM, CP: sisplatiini, R20CP: Resv. 20 uM + sisplatiini, R40CP: Resv. 40 uM + sisplatiini, R60CP: Resv. 60 uM + sisplatiini.

resveratrolin inhiboi Cisplatin välittämää EMT induktio munasarjasyövän solulinjoissa

arvioida Resveratrol sisplatiinilla aiheuttama EMT, A2780 ja A2780CP solut ko hoidetun Resveratrol ja sisplatiinia. Kuten odotettua, käsittelemällä soluja Cisplatin lisääntynyt proteiinin tasot Snail, vimentiinin ja ZEB1, kolmen tärkeimmän merkkiaineiden EMT. Solujen käsitteleminen Sisplatiini ja Resveratrol vähensi ekspressiotasot Snail, mutta ei näytä tätä vaikutusta vimentiinista ja ZEB1 ilme. Sitä vastoin nämä kaksi proteiinia ovat hieman lisääntynyt, kun solut altistettiin resveratrolin yksin (kuvio 4A). Lasku Snail tasoilla A2780 käsitelty resveratrolin ja sisplatiinia korreloi lasku Snail mRNA levels.However, tämä ei ollut asianlaita A2780CP soluissa, joissa ei ole merkittävää muutosta ei havaittu Snail mRNA-tasojen välillä näytteiden sisplatiinia rinnastettavalle sekä Sisplatiini ja Resveratrol, mikä viittaa jotkut kääntämisen jälkeiset mekanismit voisivat myös olla mukana Snail downregulation näissä soluissa (kuvio 4B). ZEB1 ja vimentiinista mRNA-tasot pysyivät pääosin muuttumattomina soluissa käsitelty joko resveratrolin, sisplatiini tai molempia aineita. Meidän solumallin, emme voineet arvioida EMT eteneminen perustuu downregulation E-kadheriinin koska A2780 ja A2780CP solut eivät ilmennä tätä proteiinia.

Western Blot analyysi EMT markers Snail, vimentiinistä ja ZEB1 A2780 ja A2780CP (A) solujen vastauksena 10 um Sisplatiini tai ilman kasvavia annoksia Resveratrol. Densitometri-analyysi on esitetty alla solulinjan Western blotit. Resveratroli inhiboi Cisplatin-induced Snail ilmentymisen annoksesta riippuvaisella tavalla, mutta nostaa hieman ZEB1 ja vimentiinin tasolla. Resveratrol annosriippuvaisen laskun P-Erk2 tasot ehdottaa osallistumista Erk väylän resveratrolin aiheuttama Snail downregulation. EMT-markkereita Snail, vimentiinistä ja ZEB1 ilmentyminen analysoitiin RT-PCR: llä A2780 ja A2780CP (B-solut), käsiteltiin 10 um sisplatiinia tai ilman kasvavia annoksia resveratrol. Resveratroli tai sisplatiinihoitoon ollut vaikutusta ZEB1 ja vimentiinista mRNA-tasoja. Vimentiinista ja ZEB1 tiheysmittaus esitetään kunkin solulinjan. Snail mRNA ilmentyminen väheni vain A2780 soluissa, mikä viittaa toinen mekanismi voisi osallistua A2780CP soluissa. Kuvissa edustavat kolmen erillisen kokeen. Graafeissa, sarakkeita tunnistetaan eri kirjaimia ovat merkittävästi erilaisia ​​(p 0,05). Graafeissa, mock: käsittelemättömät solut, R40: Resveratrol 40 uM, CP: sisplatiini, R20CP: Resv. 20 uM + sisplatiini, R40CP: Resv. 40 uM + sisplatiini, R60CP: Resv. 60 uM + sisplatiini.

aktivointi MAPK Erk liittyy sisplatiinin aiheuttama EMT

vieressä tutkittiin mekanismia, jolla resveratrolin laskurit Cisplatin-induced Snail ilmentymistä. MAPK /Erk reitti on yksi mahdollisista mekanismeja, jotka voivat olla mukana EMT induktioon soluissa. A2780 ja A2780CP soluja, Erk2 fosforylaatio lisättiin vastauksena Cisplatin. Aktivointi tämän reitin merkittävästi inhiboi resveratrolin, joka vastaa laskua Snail tasoilla A2780 ja A2780CP solulinjoissa (kuvio 4). Edelleen vahvistaa osallistumista Erk lisääntymisenä Snail tasot vastauksena sisplatiini, käytimme U0126, joka on MEK1 /2 spesifinen inhibiittori (kuvio 5). Solujen esikäsittely Tämän estäjä vähensi merkittävästi aktivoinnin tasoja Erk2 A2780 ja A2780CP soluja, mikä on myös korreloivat merkittävä lasku Snail-proteiinin molemmissa solulinjoissa. Lievää proteiinin tasot vimentiinista ja ZEB1 havaittiin myös (kuvio 5A). Snail mRNA-tasot laskivat, kun sekä solujen linjat käsiteltiin sisplatiini ja U0126, mikä viittaa siihen, sisplatiini aiheuttama Snail ilmaisun kautta Erk reitin edellyttää transkriptio Snail-geeniä. ZEB1 ja vimentiinin mRNA-tasot eivät osoittaneet merkittäviä muutoksia, kun A2780 ja A2780CP soluja käsiteltiin Sisplatiini ja U0126 yksin tai yhdistelmänä (kuvio 5B). Nämä tulokset tukevat resveratrolin aiheuttama EMT inhibition kautta Erk-reitin.

A2780 ja A2780CP solulinjoja esikäsiteltiin U0126 estää Erk aktiivisuutta ja käsiteltiin sisplatiinin kanssa 24 tuntia. Western Blot on esitetty (A). Vastaava densitometrian esitetään kunkin solulinjan. Erk esto vähensi Cisplatin aiheuttama Snail ilmaus mutta hieman lisääntynyt ZEB1 ja vimentiinista ilmaisun molemmissa solulinjoissa. Vastaavat PCR tulokset on esitetty (B). Snail mRNA lasku U0126 + sisplatiini käsiteltyjen näytteiden ehdottaa Snail sääntelyä Sisplatiini liittyy geenin transkription. Esitetyt tulokset edustavat kolmen erillisen kokeen. Graafeissa, sarakkeita tunnistetaan eri kirjaimia ovat merkittävästi erilaisia ​​(p 0,05). Graafeissa, mock: käsittelemättömät solut, CP: sisplatiini, U + CP: U0126 + sisplatiini.

resveratrolin lohkot Cisplatin aiheuttamaa morfologisia muutoksia

Jotta vältetään liiallinen Cisplatin aiheuttama sytotoksisuuden A2780 soluissa, päätimme käyttää 2,5 uM Sisplatiini arvioida morfologisia muutoksia A2780 ja A2780CP soluja 72 tuntia hoitoa. Munasarjasyövän hoito solujen Sisplatiini indusoi morfologiset muutokset muistuttavat EMT kuin solut menettivät epiteelin mukulakivikadut kaltaisia ​​morfologia hankkia enemmän pitkänomainen fibroblastien kaltainen muoto. Cellular protusions esiintyi myös Cisplatin-käsitellyissä soluissa verrattuna kontrolliin näytteitä. Sekä A2780 ja A2780CP solut osoittivat nämä muutokset osoittavat niiden etenemistä läpi EMT. Vaikutuksen testaamiseksi Resveratrolin tähän ilmiöön, käytimme 60 uM, pitoisuus, jossa Snail downregulation oli ilmeisintä. Lisäämällä Resveratrol sisplatiinihoitoon estetty näitä morfologisia muutoksia, koska solut eivät saa mitään luonteenomaisen mesenkymaaliset morfologiset ominaisuudet (kuva 6). On myös mielenkiintoista huomata, että Resveratrol käsiteltyjä soluja laajentuneet ja näkyvät epäsäännöllinen ulkonäkö viittaa toiseen solutransformaatioon, kuten Vanheneminen ohjelma voitiin esiintyvät [26].

A2780 (A) ja A2780CP (B ) solulinjoja käsiteltiin 72 h 2,5 uM Sisplatiini kanssa tai ilman 60 pm Resveratrol jotta EMT morfologisia muutoksia ilmenee. Sisplatiini indusoi solun morfologiset muutokset muistuttavat EMT A2780 soluissa ilmeinen jälkeen 72 h, joka oli peruutettava, kun Resveratrol lisättiin hoitoon. Resveratrol kohdistama sama vaikutus A2780CP soluihin vaikka morfologisia muutoksia aiheuttama Sisplatiini oli vähäisempi. Soluja tarkasteltiin 20X suurennus, Mittakaavapalkki vuonna vasemmassa yläkulmassa kuvista edustaa 20 um. Nuolet osoittavat esimerkkejä soluista läpikäyneet EMT. Kuvissa edustavat kolmen erillisen kokeen.

resveratrolin indusoi vanhenemista

Kartoitimme vanhenemista induktio meidän solulinjoissa jälkeen sisplatiini ja Resveratrol hoitoa ja havaittiin merkittävä kasvu resveratrolin aiheuttama vanhenemista molemmissa solulinjoissa jälkeen 72 h, voimakkaampi vaikutus A2780-soluja (kuvio 7). Havaitsimme myös korkeampia vanhenemista tasoilla A2780 soluissa sisplatiinia ja viittaavat siihen, että jatkuva altistuminen Sisplatiini saattaa aiheuttaa oksidatiivisen stressin johtaa vanhenemista näissä Cisplatin-herkkien solujen. Vanheneminen induktion A2780 ja A2780CP soluja voisi olla toinen mekanismi, joka osallistuu eston sisplatiinin aiheuttaman EMT by Resveratrol.

hoito A2780 ja A2780CP solujen Resveratrol merkittävästi kasvattanut senescent soluja. Sisplatiini indusoi merkittävää kasvua vanhenemisen A2780 soluissa. Solut värjättiin β-galaktosidaasin aktiivisuus ja laskettiin valomikroskoopilla arvioida prosentteina senescent (sininen) soluja. Graafeissa, sarakkeita tunnistetaan eri kirjaimia ovat merkittävästi erilaisia ​​(p 0,05). Analyysi suoritettiin kolmen itsenäisen kokeen.

resveratrolin inhiboi solumigraatiota

Koska morfologinen muutos esiintyy A2780 ja A2780CP soluja, seuraavan kerran arvioitiin migraation kyky näiden solujen kanssa haavojen määritys. Soluja käsiteltiin 2,5 pM sisplatiini, jotta vältetään liiallinen sytotoksisuutta A2780 soluissa, ja 60 uM Resveratrol. Molemmissa solulinjoissa, 72 h tarvittiin haavan täysin sulkea käsittelemättömissä soluissa, mikä viittaa siihen, että nämä solulinjat eivät ole hyvin liikkuvaa fenotyyppi. Resveratrol hoito selvästi inhiboi solumigraatiota joka kerta kohdassa, jossa haavan arvioitiin, vähentää haavan sulkeminen vain 20-25% 72 tunnin jälkeen sekä solulinjoja kun taas kontrolli solut olivat lähes täysin suljettu haavat (kuvio 8A ja 8B). Resveratrol toiminta ei vaikuta sisplatiinin A2780CP soluissa, joissa tämä aine kohdistuu sama vaikutus solujen kanssa tai ilman Cisplatin.

vaeltavia kyky A2780 (A), A2780CP (B), OVCAR-3 ( C), ja SKOV-3 (D) solujen arvioitiin haavan paranemista määrityksessä. Naarmu tehtiin steriili kärki konfluentin kerros soluja ja haavan jälkeen havaittiin 24, 48, ja 72 h sisplatiinin ja Resveratrol hoito A2780, A2780CP ja OVCAR-3 soluja, ja 12 ja 24 h SKOV -3, joka vastaa hetkeä, jolloin haava oli lähes täysin suljettu. Molemmissa solulinjoissa, Resveratroli vähentynyt siirtyminen solujen haavan, estetään sen sulkeminen sen jälkeen, kun 72 tuntia. Edustavia kuvia näkyvät t = 48 tuntia. Graafinen esitys haavan jälkeen eri ajankohtina tutkittu näytetään (E). Esitetyt tulokset edustavat kolmen erillisen kokeen suoritettiin kahtena kappaleena. Graafeissa, hoidot verrataan kussakin aikapisteessä tutkittu ja sarakkeita tunnistetaan eri kirjaimia ovat merkittävästi erilaisia ​​(p 0,05).

Lisäksi olemme tutkineet mahdollisuuksia Resveratrol estää migraation kykyä OVCAR -3-solut, epiteelin, joka ilmentää E-kadheriinin ja ilman perusilmennystä ZEB1 tai vimentiinin, joka osoittaa vähäistä muuttopotentiaalia, ja SKOV-3-soluja, mesenkymaaliset solulinja, joka esittää perusilmennystä vimentiinista ja ZEB1 sekä mesenkymaaliset morfologia ja korkea muuttopotentiaalia huolimatta pohjapinta E-kadheriinin ilmentymisen (kuva S1). Samanlaisia ​​A2780 ja A2780CP soluja, OVCAR-3 soluja tarvitaan vähintään 72 tuntia sulkea haavan. Tässä solulinjassa, Resveratrol vähensi sulkeminen haavan jälkeen 72 tuntia ja joka kerta vaiheessa tutkitaan, kun sitä käytetään yhdessä sisplatiini. In SKOV-3-soluissa, vain 24 tuntia oli noudatettava 80-85% haavansulkemiseen ja Resveratrol vähensi näiden solujen vaeltaminen käytettynä yksinään tai yhdistelmänä sisplatiinin kanssa tänä ajankohtana, mikä osoittaa, että tämä fytoaleksiinin hallussaan kyky alentaa muuttoa soluja, jotka omistavat suuren pohjapinta muuttopotentiaalia sekä solujen alhaisen muuttopotentiaalia (kuvio 8C ja 8D). Havaitut tulokset OVCAR-3 ja Skov-3-solut korreloivat havaittuun A2780 ja A2780CP vastaavasti jossa herkkyys Sisplatiinin on myös samanlainen.

käsitellä mahdollisuutta lisääntyminen hyökkäyksen mahdollisuudet solujen,