Krooninen sairaus

tiivistelmä

tarkka virtsan määrityksiä virtsarakon syövän (BCA) havaitseminen hyödyttäisi sekä potilaiden ja terveydenhuollon järjestelmiä. Kautta genomista ja proteomiikka profilointi virtsan komponentteja, olemme aikaisemmin tunnistettu paneeli biomarkkereita, jotka ovat parempia nykyinen virtsa-pohjainen biomarkkereita ei-invasiivisia havaitseminen BCA. Tässä raportoimme diagnostinen käyttökelpoisuus eri monimuuttuja näiden yhdistelmät biomarkkereita. Suoritimme tapauskohtaisesti ohjattu validointitutkimuksessa jossa mitätöity virtsoissa 127 potilasta (64 syöpäkasvaimia sisältävistä aiheista) analysoitiin. Virtsan pitoisuudet 14 biomarkkerit (IL-8, MMP-9, MMP-10, SDC1, CCL18, PAI-1, CD44, VEGF, ANG, CA9, A1AT, OPN, PTX3, ja APOE) arvioitiin entsyymi- (ELISA). Diagnostinen suorituskyky kunkin biomarkkereiden ja monimuuttuja malleja verrattiin käyttämällä vastaanotin toimii ominaiskäyrät ja chi-neliö testi. 8-biomarkkereiden malli saavuttaa tarkin BCA diagnoosi (herkkyys 92%, spesifisyys 97%), mutta yhdistelmä 3 8 biomarkkerit (IL-8, VEGF, ja APOE) oli myös erittäin tarkka (herkkyys 90%, spesifisyys 97%). Vertailun vuoksi kaupallisen BTA-Trak ELISA-testi saavutti herkkyys 79% ja spesifisyys 83%, ja mitätöity virtsan sytologian havaittiin vain 33% BCA tapauksista samassa kohortin. Nämä datashow että Monimuuttuja virtsa-pohjainen määritys voidaan merkittävästi parantaa tarkkuutta ei-invasiivisia BCA tunnistus. Lisävalidointia ovat käynnissä tutkia kliininen hyöty tämän paneelissa biomarkkereita BCA diagnoosiin ja sairauksien seurantaan.

Citation: Goodison S, Chang M, Dai Y, Urquidi V, Rosser CJ (2012) Multi -Analyte määritys Non-invasiivinen havaitseminen virtsarakon syövän. PLoS ONE 7 (10): e47469. doi: 10,1371 /journal.pone.0047469

Editor: Irina Agoulnik, Florida International University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 28 kesäkuu 2012; Hyväksytty: 11 syyskuu 2012; Julkaistu: 19 lokakuu 2012

Copyright: © Goodison et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat tutkimuksen avustuksia lentoemäntä Medical Research Institute (CJR), Florida Department of Health James ja Esther kuningas Team tiedepalkinto 10kt-01 (CJR), ja National Cancer Institute RO1 CA116161 (SG). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: SG, VU ja CJR ovat työntekijöitä /osakkeenomistajien Nonagen Bioscience Corp. Lisäksi ei myönnetyt patentit, tuotteiden kehittämiseen tai kaupan tuotteiden julistaa. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja. MC ja YD ovat ilmoittaneet, että niillä ei ole kilpailevaa etua.

Johdanto

ei-invasiivisia havaitseminen ja seuranta virtsarakon syöpään (BCA) on edelleen haaste. Mitätöidään virtsan sytologia (VUC) edelleen kaikkein vakiintunut virtsan perustuvaa määritystä tähän tarkoitukseen, mutta samalla VUC on spesifisyys 93%, määritys kärsii alhainen herkkyys (25-40%) ja tarkkailija riippuva vaihtelevuus [1] .Commercial mittaavia testejä ydin- matriisin proteiini (NMP-22) ja virtsarakon kasvaimen antigeeni (BTA) ovat nousseet diagnostisia virtsan proteiinin testejä BCA, mutta nämä yhden markkerin määritysten puuttuu spesifisyys VUC [2], [3]. Käsite, että läsnäolo tai puuttuminen yhden molekulaarinen merkkiaine auttavat kliininen arviointi ei ole osoittautunut olevan. Tämä ei ole yllättävää, kun otetaan huomioon vaihtelu yksilöiden välillä, rajat talk välillä molekyyli polkuja, ja heterogeenisyys kiinteiden kasvainten.

Kynnyksellä korkean tekniikoiden avulla on mahdollistanut kehityksenä single-merkki tutkimusta entistä kokonaisarviointi strategia, ja olemme käyttäneet näitä tunnistaa lupaavia uusia biomarkkereita BCA. Käyttämällä genomiikka [4] ja proteomiikan [5] lähestyy profiloida liukeneva ja solukomponenttien mitätöidään virtsaa, olemme tunnistaneet paneelin biomarkkereita, jotka osoittavat lupaavia kehityksen tarkkaa määrityksiä ei-invasiivisia BCA tunnistus. Olemme suorittaneet joukon validointitutkimuksissa [6] – [9] on arvioitava mahdollisuudet kliininen hyöty useita näistä biomarkkereita. Tässä tutkimuksessa olemme yhdistetyt tiedot 14 meidän ehdokas biologisten merkkiaineiden kohortin 127 aiheita, jotta voidaan määritellä tarkasti ja vankka monimuuttuja analyysiä ei-invasiivisia havaitseminen BCA.

Potilaat ja menetelmät

näytteen ja Tiedonkeruun

Under Institutional Review Board hyväksyntä ja tietoisen suostumuksen (IRB # 560-2006), mitätöity virtsanäytteitä, ja siihen liittyvät kliiniset tiedot otettiin takautuvasti kootaan genitourinary kudospankille. Ennen tahansa terapeuttisen intervention, -100 ml mitätöidään virtsaa saatiin kultakin kohteelta. Viisikymmentä millilitraa virtsaa käytettiin kliinisen laboratorion analyysit per vakiomenettelyjä. Jäljellä virtsa alikvootti annetaan yksilöllinen tunnistenumero ennen välittömästi laboratorioon käsittelyä. Kukin virtsanäytteen sentrifugoitiin 600 x

g

4 ° C: ssa 5 min. Supernatantti dekantoitiin ja annosteltiin, kun taas virtsan pelletti jäädytettiin. Sekä supernatantti ja pelletti säilytettiin -80 ° C: ssa ennen analyysiä. Proteiinipitoisuus erät mitattiin käyttäen Pierce 660 nm Protein Assay Kit (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA) ja NanoDrop spektrofotometrillä (ND-1000, ThermoScientific, Wilmington, DE, USA). Kudospankin tiedustellessa sopivia yksilöitä analysoitavaksi, joka sisälsi ei-peräkkäisiä näytteitä 127 aiheista. Tutkimus kohortti koostui 63 yksilöiden ei aiemmin urothelia cell carcinoma, brutto hematuria, aktiivinen virtsatieinfektio tai virtsatiekivitapausten (65% kanssa virtsaamisen oireista ja 35% mikroskooppinen hematuria) ja 64 yksilöiden äskettäin diagnosoitu uroteelisyövässä. Näytteitä potilaista, joilla tiedetään munuaissairaus tai dokumentoitu munuaisten vajaatoimintaa ei ollut mukana. Kansainvälisen konsensuksen paneelin Virtsarakon kasvainmerkkiaineet [10], tämä kohortti toimi toisen vaiheen (validointi tutkimus). Raportoidaan käyttäen Stard kriteerien [11]. Kaikki koehenkilöt arvioitiin poliklinikalla urologian klinikan. Virtsa ja VUC tehtiin kaikista aiheista. Kaikki koehenkilöt kävivät toimisto- cystoscopy ja aksiaalinen kuvantaminen vatsan ja pelvis.In syöpä ryhmä, leikkauksen jälkeinen histologista vahvistusta uroteelisyövässä, kuten laatu ja vaihe, kirjattiin. Olennaisia ​​tietoja potilaan kliinisen tilan lavastus, histologista arviointia [12], [13] ja tulos on esitetty taulukossa 1. Seuranta-ajan mediaani meidän hallinnassamme ja syövän kohortteja oli 11,5 ja 12,0 kuukautta.

Entsyymi-immunologiset määritykset 14 Virtsa- Biomarkers ja Hemoglobiini

tasot ihmisen interleukiini 8 (IL-8, Cat # ab46032 Abcam, Cambridge, MA, USA), Matrix metalloproteinase 9 (MMP-9, Cat # DMP900 R 0,05 ja kaikki raportoidut

p

arvot olivat 2-puolinen. Kaikki analyysit suoritettiin käyttäen SAS-ohjelmiston versiota 9.3.

Tulokset

Väestörakenteen, kliiniset ja patologinen ominaisuudet 127 henkilöillä, jotka koostuvat Tutkimuksemme ryhmä on kuvattu taulukossa 1. Viisi koehenkilöä (3 hallinnassa ryhmä, 2 syöpä ryhmässä) puuttuvien biomarkkereiden tietoja jätettiin lopullisen analysis.No aiheita valvontaan kohortissa oli epänormaali kystoskopian tai aksiaalinen kuvantaminen. Lisäksi seurannassa, yksikään verrokeilla havaittiin kehittää BCA tai jopa brutto hematuria. Vuonna syöpä kohortissa, 41%: lla potilaista oli ei-lihas- invasiivista sairautta ja 19% potilaista oli matala-asteinen sairaus. Mediaani tuumorin koko oli 4,5 cm. Linjassa aikaisempaa kokemusta [4], mitätöidään virtsan sytologia (VUC) kohortin saavutettu 98%: n spesifisyys, mutta vain 33% herkkyys.

keskiarvo ja mediaani tasoilla 14 biomarkkereiden virtsassa on esitetty Taulukko 2. tasot 10 biomarkkerit oli merkittävästi kohonnut potilailla, joilla BCA nähden, joiden ilman BCA. CD44 ja OPN olivat huomattavasti, mutta negatiivisesti, liittyy BCA, ja SDC1 ja PTX3 ei merkitsevästi yhteydessä BCA. Koska suurin osa potilaista läsnä urologian klinikan hematuria, yksi on harkittava erityisiä biomarkkereiden määritykset havaitsemaan kasvaimen antigeeni tai seerumin proteiini tuodaan testinäytteen kautta verenvuotoa. Kontrolloida tätä mahdollisuutta, me kvantitatiivisesti hemoglobiiniarvo kaikissa näytteissä ja arvioitiin korrelaatio kaikkien 14 biomarkkerit tämän mitta hematuria. Tämä analyysi paljasti, että tasot CCL18 ja A1AT oli suuri korrelaatio virtsan hemoglobiinin (Spearmanin korrelaatiokertoimen 0,8), ja niin niitä ei ole sisällytetty multivariate mallit on kuvattu alla.

Kuvio 1 esittää diagnostinen suorituskyky erilaisia ​​yhdistelmiä biomarkkereita. Kun kaikki 8 positiivisessa yhteydessä BCA biomarkkereiden yhdistettiin, yleinen diagnostinen tarkkuus oli 94%, joiden herkkyys on 92% ja spesifisyys 97%. Logistinen regressio ja 1000 Bootstrap näyte strategywere määrittämiseksi suoritettiin optimaalisen diagnostisten biologisten merkkiaineiden yhdistelmä, eli korkea tarkkuus niin vähillä biomarkkerit kuin possible.For kunkin Bootstrap näytteestä, ehdokas alaryhmiä rankattiin käyttämällä Bayes tietoa kriteeri [15]. Analyysit havaittu, että yhdistelmä IL-8, VEGF, ja APOE rankattiin ykköseksi 410 kertaa (41%), yhdistelmä VEGF ja APOE ykkönen 379 kertaa (38%), ja kaikki muut yhdistelmät ykkönen alle 100 kertaa ( 10%). Yhdistelmä-IL-8, VEGF, ja APOE saavuttanut suorituskyky lähes yhtä hyvä kuin kaikki 8 biomarkkerit yhdistetty (kuvio 1). 3-biomarkkereiden määritys oli AUC 0,968 (95% luottamusväli [CI], +0,942-+0,992), herkkyys on 90% ja spesifisyys 97% (kokonaistarkkuus 93%). Yhdistelmä VEGF: n ja APOE oli alentunut yleinen tarkkuus (89%). 2-biomarkkereiden määritys oli AUC 0,957 (95% luottamusväli [CI], 0,927-0,987), herkkyys on 81% ja spesifisyys 97%. Vertailun vuoksi BTA-Trak kaupallinen määritys saavuttanut herkkyys 79%, spesifisyys 83%, ja yleinen tarkkuus 81% (kuva 1).

ROC käyrät piirrettiin verrata suoritusarvot koko 8 -biomarker yhdistelmä, 3-biomarkkereiden yhdistelmä (IL-8, VEGF, APOE), 2-biomarkkereiden yhdistelmä (VEGF, APOE) ja BTA-Trak testi. Perustuen alla oleva pinta-ROC-käyrän (AUROC), Youdenin Indeksi raja-arvot, joka maksimoi summa herkkyys ja spesifisyys määritettiin kullekin biomarker (ristissä neliö käyrällä). Taulukko tarjoaa suorituskyvyn arvot kullekin yhdistelmä. PPV, positiivinen ennustearvo. NPV, negatiivinen ennustearvo.

Keskustelu

Syöpä virtsarakon kuuluu viisi yleisintä syöpäsairauksia maailmanlaajuisesti. Esittelystä, yli 80% rakkokasvaimista ovat ei-lihas- invasiivisia papillaarinen kasvaimia, joilla on 5-vuoden eloonjäämisaste 90%, mutta noin 70%: lla näistä leesioista kehittyy uusiutunut kahden vuoden kuluessa alustavan diagnoosin . Toistuvuustaso ilmiö kuin lihas invasiivisia BCA tekee siitä yhden yleisimmistä syövistä maailmanlaajuisesti. Kun BCA havaitaan ja käsitellään, potilaat rutiininomaisesti saavat usein valvonnasta kystoskopian seurata kasvaimen uusiutumisen. Jos jätetään hoitamatta, aluksi ei-invasiivisia kasvaimia voi edetä lihas-invasiivisia kasvaimet, joilla on merkittävästi vähentynyt 5 vuoden pysyvyys. Siten tarkka havaitseminen BCA, mieluiten kautta ei-invasiivisia virtsa-analyysi, edelleen kiireellinen tavoite.

Voidakseen vahvistaa paneelin lupaava biomarkkereiden löydetty käyttäen genomiikan ja proteomiikan lähestymistavat [4], [5] olemme suorittaneet useita tutkimuksia käyttämällä ELISA perustuvissa määrityksissä [6] – [9]. Tässä tutkimuksessa selvitettiin lisäksi tavoite ja yhdistetty kaikki tiedot -14 biomarkkerit kohortin 127 subjects- johtamiseksi tarkin diagnostinen usean analyytin määrityksissä. Olemme myös seurata suorituskykyä kaupallisen BTA-Trak määritys samassa tapauksissa vertailun, ja me kvantitoitiin hemoglobiini kulloinkin selvittääkseen mahdollisia korrelaatioita biomarkkereiden ja hematuria. Kaksi biomarkkereita, CCL18 ja A1AT, havaittiin olevan suhteellisen korkea korrelaatio virtsan hemoglobiini, nostaa sitä mahdollisuutta, että lähde näiden proteiinien on, ainakin osittain, seerumin ujutetaan verenvuotoa. Jatkamme tutkia näitä kahta biomarkkereita itsenäisissä ikäluokat, mutta ne eivät sisälly logistinen regressio analyyseissä tunnistaa optimaalisen diagnostisten biomarkkereiden yhdistelmiä. 8-biomarkkerit paneeli (IL-8, MMP-9, PAI-1, VEGF, ANG, CA-9, APOE, MMP-10), osoittautui tarkin (yleinen tarkkuus 94%) multi-analyytin määritys havaitseminen BCA on 127-aihe kohortti. Multiplex molekyyli allekirjoitusta, on tavallista, että muutama komponenteista tarjoaa paljon ennusteita, mutta ylimääräisiä markkereita tekee mallin vakaampi virheitä [4]. Testaamalla kaikkia mahdollisia yhdistelmiä kautta bootstrap Strategiamme paljasti, että kolme 8 biomarkkereiden paneeli (IL-8, VEGF ja APOE) vaikutti eniten tietoa. Kuin stand-alone analyysillä 3-biomarkkereiden paneeli saavutti yleinen tarkkuus 93% ja säilyy niin korkea herkkyys (90%) ja spesifisyys (97%). Saavuttaa korkea tarkkuus niin vähillä biomarkkerit mahdollisimman on optimaalinen käytännön syistä, mutta on tärkeää, että me seurata kaikkia lupaavia biomarkkereita edelleen laajemman ja monipuolisemman ikäluokat, koska eri yhdistelmät voivat olla vakaampi tietyissä olosuhteissa, kuten infektion läsnäolon, tai se voi olla tarkempi uusiutumisen verrattuna alkuperäisen diagnoosin.

komponentit 3-biomarkkereiden paneeli (VEGF, IL-8, APOE) on liitetty useita syöpiä, mukaan lukien virtsarakon syöpä, eriasteisesti. Eräässä tutkimuksessa 26 koehenkilöillä, Crews

et al.

Osoitti, että kohonnut virtsan VEGF korreloivat tasoilla poistetun kudoksen [17]. Tutkimuksessa, 219 Lähi-idän aiheista, virtsan VEGF olivat merkittävästi suurempi potilailla, joilla BCA. Heidän kohortti mitattaessa VEGF päihitti VUC, saavuttaa diagnostisen herkkyyden 76% [18]. Vastaavasti, Bian osoitti parannettu herkkyys virtsan VEGF verrattuna VUC, saavuttaa 69% vs. 38%, vastaavasti [19]. Toisessa tutkimuksessa potilaat, joilla on kohonnut virtsan VEGF tasoilla oli suurempi riski taudin uusiutumisen [20]. Aiemmat raportit ovat sekaantuneet IL-8 virtsarakon kasvain biologian ja sen käyttöä mahdollisena biomarkkeri BCA on tutkittu muutamissa tutkimuksissa. IL-8 on osoitettu olevan mitogeenisesta ja angiogeenisen ominaisuuksia, ja korkea johtaa lisääntyneeseen tuumorigeenisyyteen, etenemisen ja etäpesäkkeiden hiirimalleissa, kuulemma säätelemällä tumatekijä kappa-B [21]. Kliiniset tutkimukset ovat osoittaneet, että kohonnut virtsan tasoja IL-8 voidaan liittää läsnä virtsarakon syöpä. Eräässä tutkimuksessa 140 aiheiden, IL-8 määrityksen saavutti herkkyys 59%, ja spesifisyys 90% [22] ja tutkimus 79 aiheita, herkkyys on 50% ja spesifisyys 90% raportoitiin [23]. Nämä tulokset ovat hyvin linjassa havaintojen arvioitaessa IL-8 yksilönä biomarkkerina [7]. Tiedot on niukasti roolista APOE syövissä. Toiminnot ovat tehostaminen lipidikuljetukseen soluihin ja sovittelu signaalitransduktion sitoutuessaan lipoproteiinireseptoreita [24], [25]. APOE on osoitettu olevan vuorovaikutuksessa siirtymäkauden epiteelin vaste-geeni (TERE1), kasvainsuppressorigeenin, virtsarakon tuumorisoluissa, mikä lisää solujen uusiutumista ja kestävyys apoptoosin [26], [27]. Äskettäin Lindén

et al.

Raportoitu että APOE oli osa paneelin biomarkkereiden havaita massaspektrometrialla, ja voi liittyä ei-lihas- invasiivisia BCA [28].

Ymmärrämme että tutkimus on useita limitations.First kuin tertiaarisen hoitolaitoksessa, meillä on taipumus nähdä enemmän korkea-asteen, korkea-vaiheessa tauti, mikä näkyy tutkimuksessamme kohortissa. Vahvista luotettavuutta meidän allekirjoitus, myöhemmät tutkimukset on arvioitava suurempi ikäluokkien jotka sisältävät potilailla, joilla on matala-asteista, matala-vaiheen tauti. Toiseksi, jalostettu, kallisteta virtsoissa analysoitiin. Virtsassa sentrifugoitiin ja erotettiin solupelletti ja supernatantti ennen varastointia -80 ° C: ssa. On mahdollista, että juuri mitätöity virtsanäytteistä voi antaa erilaisia ​​tuloksia, ja se on raikas virtsa että olisi käytetty materiaali point-of-care määrityksissä. Tutkimme parhaillaan suorituskykyä valittujen biomarkkereiden virtsoissa käsitellään kautta useita eri protokollia, kuten tuoretta mitätöidään virtsoissa. Seuraavaksi herkkyys VUC meidän kohortin pääasiassa korkealaatuisesta (aste 3) sairaus (33%) oli pienempi kuin olisi odotettavissa. Tämä asettaa kyseenalaiseksi tunnetut välinen tarkkailija vaihtelu tulkinnassa VUC. Seuraavina tutkimuksissa, me käyttää kahta cytopathologists tulkita näitä tuloksia. Lisäksi on epävarmaa, kuinka proteiinin koostumus virtsan supernatantin voi muuttua jäädytetty varastoinnin. Määrä jäädytys-sulatus-syklien pidettiin 1-2 jakamalla virtsan supernatantti useita pieniä eriä. Lopuksi meidän otoskoko 127 on pieni ja kaksi ryhmää, jotka kuuluivat 127 aiheita olivat suhteellisen homogeenisia, eli joko aktiivisia syöpä, tai ohjaus tapauksissa ole aktiivisia syöpää, ei ollut syöpää, ei virtsatieinfektio, ei virtsakivitauti, eikä brutto hematuria. Näin emme voineet arvioida herkkyys /spesifisyys meidän biomarkkereiden eri vaiheissa /grades.The spesifisyys lupaavia biomarkkereiden tarvitse testata in ikäluokat, joiden tiedetään olevan ongelmallisia muiden virtsa perustuvissa määrityksissä (esim hematuria, virtsatieinfektio , kiviä ja virtsaamisen toimintahäiriö).

tunnistaminen vankka BCA liittyvien biomarkkereiden ja perustamalla multiplex virtsan perustuvissa määrityksissä on useita lyhyen aikavälin ja pitkän aikavälin vaikutuksia. Monet validoitu biomarkkereita tässä tutkimuksessa ei ole yhdistetty syöpään aiemmin. Analyysi näiden proteiinien osuutta tuumorisolun biologiassa voi valaista mekanismeja kasvaimen aloittamisen tai etenemisen, ja voivat paljastaa uusia terapeuttisia kohteita. Kliinisesti tarkka BCA määritykset on selkeä vaikutus alkuperäisen diagnostinen suorituskyky, sekä potilaiden kliinisessä hoidossa jälkikäsittelyä. Jos luotettava virtsan diagnostisia biomarkkereiden määrityksissä voi vähentää tarvittavien invasiivisia ja epämiellyttävä cystoscopies parannuksia potilaiden hoitomyöntyvyyttä ja tyytyväisyys seuraa, ja lisääntynyt tehokkuus ja kustannussäästöt hyötyvät terveydenhuoltojärjestelmää. Perimmäisenä tavoitteena on pystyä havaitsemaan BCA ajoissa siten, että potilas voi odottaa parempaa elämänlaatua ja tulokseen.

Johtopäätökset

kautta tietojenkeruuvaiheessa tutkimuksissa että sovellettu kehittynyttä profilointi tekniikoita todellinen, edullinen kliininen koeanalyytin, tässä tapauksessa mitätöity virtsa, olemme tunnistaneet molekyyli allekirjoituksia joka havaitsee BCA poikkeuksellisen tarkkuudella. Validointi näiden yhdistelmät virtsan biomarkkereiden avulla immunokemiallinen määrityksiä vahvistaa, että monen analyytin testejä voisi merkittävästi parantaa ei-invasiivisia havaitseminen BCA, ja antaa perustelut suurempi, mahdollisille selvityksiä, jotka.

Kiitokset

kirjoittajat ovat kiitollisia 127 henkilöitä, jotka osallistuivat tähän kliinisessä tutkimuksessa.