Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Autophagy on paradoksaalinen ja monimutkaisia ​​toimintoja syövän kehittymisessä ja autophagy liittyvien geenien (ATG) ovat keskeisiä sääntelyviranomaiset autophagy. Tähän asti yli 30 eri ATG-proteiineja on tunnistettu hiivan, ja nisäkkään kollegansa on myös raportoitu. Vaikka roolit muutaman ATG proteiineja syövässä on ominaista, rooli ATG10 on lähes täysin tuntematon.

Menetelmät /Principal Havainnot

tutkimiseksi kliinis roolia ATG10 kolorektaalisyövässä, olemme analysoineet ATG10 ilmentymisen peräsuolen syövän kudoksissa ja solulinjoissa. Proteiinin ilmentyminen analyysi osoitti, että ATG10 lisääntyy suuresti kolorektaalisyövässä (kudos – 18/37 tapauksissa 48%; solulinja -8/12 solulinjat, 66%). Immunohistokemiallista analyysiä kanssa kliinis osoitti vahvaa yhdistys ylös-säätely ATG10 kasvaimen imusolmuke etäpesäke (p = 0,005) ja invaasio (p 0,001). Lisäksi sekä 5-vuoden taudista vapaan eloonjäämisen ja yleistä eloonjäämisluvut potilaiden kasvaimia, jotka eivät esittäneet ATG10 olivat merkittävästi korkeammat kuin potilaiden joissa ATG10 ilmentäviä kasvaimia (p = 0,012).

Päätelmä /Merkitys

Lisääntynyt ilmentyminen ATG10 kolorektaalisyövässä liittyy lymphovascular invaasion ja imusolmuke etäpesäke ilmaisee, että ATG10 voi olla mahdollinen ennustetekijöiden maker kolorektaalisyövässä.

Citation: Jo YK, Kim SC, Park IJ Park SJ, Jin DH, Hong SW, et al. (2012) Lisääntynyt ilmentyminen ATG10 kolorektaalisyövässä liittyy Lymphovascular Invasion ja imusolmukemääritysmenetelmä Metastasis. PLoS ONE 7 (12): e52705. doi: 10,1371 /journal.pone.0052705

Editor: Henrik Einwaechter, Klinikum rechts der Isar der TU München, Saksa

vastaanotettu: 23 maaliskuu 2012; Hyväksytty: 19 marraskuu 2012; Julkaistu: 20 joulukuu 2012

Copyright: © 2012 Jo et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Center for kehittäminen ja kaupallistaminen Anti-Cancer Therapeutics ja Korean Health 21 R Cancer – HCT116, HT29, KM12C, WiDr-, LoVo, SW480, SW48, HCT15, DLD1, RKO, Caco2). ATG10 ilmentyminen kvantifioitiin densitometrialla.

suhde ATG10 Expression ja syövän etenemistä ja Invasion

tutki tarkemmin roolia ATG10 kasvaimen etenemistä ja invaasio. Tutkia kliinis-, immunohistokemiallinen analyysi Kudoksen array 127 kolorektaalisyövän yksilöitä suoritettiin (Fig. 2 ja taulukko 1). Kudokset ilman värjäystä tai heikkoa värjäytymistä (≤10%) luokiteltiin negatiiviseksi (-). Kudokset 10% värjäys luokiteltiin positiivisiksi (+). Kolmekymmentä 127 kasvain näytteet (24%) osoitti ATG10 ilme. Suhde ATG10 ilmaisun ja kliinis on esitetty taulukossa 2. Tulokset osoittivat, että ATG10 ilmentyminen liittyy usein lymphovascular invaasio (

P

0,001), ja imusolmukkeesta etäpesäke (

P

= 0,005). Kuitenkin ATG10 ekspressiota ei merkittävästi yhteydessä ikä, sukupuoli, kasvaimen, seerumin karsinoembryonaalisen antigeenin tai kasvaimen proliferaatiota. Nämä tulokset osoittavat, että ATG10 ilmentyminen liittyy vahvasti lymphovascular hyökkäyksen peräsuolen syövän.

ATG10 ekspressiota peräsuolen syövän määritettiin immunohistokemiallinen analyysi Kudoksen microarray. (A ja b) Negatiiviset näytteet (-) kanssa ≤10% värjäys (200), (c ja d) näytteeksi, joista 10%: sta 50%: värjäyksen (+, × 200), ja (e ja f) näytteeksi, joista 50 % värjäytymistä (+, × 200).

suhde ATG10 Expression and Patient Survival

tulokset immunohistokemiallinen analyysi osoitti, että ATG10 läheisesti liittyy kasvaimen invaasio, joka on tunnettu riskitekijä uusiutumisen ja eloonjäämisen tuloksiin. Siten arvioimme suhdetta ATG10 ilmaisun ja määrien 5 vuoden tautivapaan elinajan (DFS) ja kokonaiseloonjääminen (OS) kolorektaalisyövän potilaalla. 5 vuoden DFS ja OS hinnat potilaiden kasvaimia, jotka eivät esittäneet ATG10 olivat merkittävästi korkeammat kuin potilaiden joissa ATG10 ilmentäviä kasvaimia (5 vuoden OS [keskiarvo ± SEM], 76,4 ± 0,4%

vs.

57,5 ​​± 0,1%,

P

= 0,012; 5 vuoden DFS, 75,8 ± 0%

vs.

42,8 ± 0,1%,

P

= 0,012) ( Fig. 3). Nämä tulokset viittaavat siihen, ATG10 voi olla mahdollinen ennustetekijöiden maker kolorektaalisyövässä. Monimuuttuja analyysien mahdollisten selviytymisen muuttujia, imusolmuke etäpesäke yksin oli merkitsevästi yhteydessä selviytymisen parametreja, kun taas ATG10 ilme ei ollut (riskisuhde, 4,736

vs.

1.404; 95%: n luottamusväli, +1,763-12,723

vs.

0,676-2,916;

P

= 0.002

vs.

0,363).

suhde ATG10 ilmaisun ja 5-vuoden tautivapaan elinajan ( DFS) ja kokonaiseloonjääminen (OS) hinnat paksusuolisyövän potilaista analysoitiin Kaplan-Meier -käyrät.

Down-regulation of ATG10 Tukahdetut soluproliferaation peräsuolen syövän solut

entisestään tutkittiin, mikä vaikutus alas-säätely ATG10 soluproliferaatioon in HCT116-soluissa. Ehtyminen ATG10 ilmentymisen RNA-interferenssi hieman tukahdutetaan solujen proliferaatiota korko HCT116-soluissa, mikä viittaa siihen, että ATG10 on funktionaalinen rooli solujen lisääntymisen (Fig. 4).

HCT116-soluja transfektoitiin ohimenevästi joko salattu negatiivinen siRNA (Scram) tai ATG10 erityisiä siRNA (siATG10) jälkeen solujen lisääntyminen oli päivittäin määritettiin käyttäen CCK-8 iinianalyysikitissä (a). Alas-säätely ATG10 siRNA varmistettiin Western blot-analyysi (b). Tiedot edustavat keskiarvoa ± SEM (n = 3).

Keskustelu

Autophagy ohjataan ATG proteiinien ja niiden sääntelyviranomaiset [5], [8]. ATG proteiinit aloittaa autophagosome muodostumisen kautta autophagic konjugaation järjestelmän [2]. Rooli ATG6 syövässä on ominaista. Aiemmat tutkimukset ovat raportoineet, että vähentynyt ATG6 ilmentyminen edistää kasvainten synnyssä eläinmalleissa, ja ATG6 säätyy alas erilaisissa ihmisen syövissä [12] – [15]. Kuitenkin myös muiden ATG proteiinien kasvainten synnyssä ei ole oikein ymmärretty.

Tässä tutkimuksessa arvioimme ATG10 ilmentymistä potilailla, joilla on satunnaista peräsuolen syöpä. ATG10 on E2-kaltainen entsyymi, joka osallistuu Ub kaltainen muutos, joka on välttämätön autophagosome muodostumista. Aiemmat tutkimukset ovat raportoineet, että useat yliekspressoidaan Ub-E2 kaltaisia ​​proteiineja edistää kasvainten kehittymistä erilaisten syöpien [16] – [18]. Kuitenkin rooli ATG10 syövän ei ole vielä arvioitu. Toisin ATG6, joka säätyy alas syövän, esillä olevat tulokset osoittavat, että ATG10 lisääntyy peräsuolen syöpä. Lisäksi ATG10 ekspressio liittyy vahvasti tuumorin invaasio ja metastaasi. Tuloksemme viittaavat siihen, että ATG10 voi olla onkogeenisessä proteiinia. Olemme myös arvioineet vaikutusta ATG10 yli-ilmentyminen soluproliferaatioon ja hiiren ksenograftimallia käyttäen RKO masolut ilmensivät stabiilisti ATG10. Solujen lisääntymisen ja kasvaimen kasvu ei vaikuta merkittävästi ektooppinen ilmentyminen ATG10 (tuloksia ei ole esitetty). Kuitenkin knock-alas ATG10 ilmaisun kanssa siRNA tukahdutetaan solujen lisääntymistä kurssi HCT116-soluissa. Niinpä jatkamme vaikutuksen tutkimiseksi sääteli ATG10 on kasvaimien syntyyn.

geneettisiä muutoksia ovat vastuussa lisääntyneen ilmentymisen monien onkogeenisten proteiineja. Kromosomaalisen alueen ATG10 (5q14) on usein menetetty munasarjasyövän, mahasyövän ja rintasyövän [19], [20]. Kuitenkin viime aikoina genomin laajuinen DNA-siru tutkimukset ovat osoittaneet, että 5q14 alue monistetaan neurofibrosarcoma ja haimasyövän [21], [22]. Kopioi numero vaihteluiden 5q14 kolorektaalisyövässä ei ymmärretä hyvin. Niinpä tulevaisuudessa tutkimuksia tarvitaan määrittämään alleeliset muutoksiin tässä lokuksessa kolorektaalisyövässä.

Autophagy näyttää kaksi toimintoa syövän. Erityisesti, ajoitus autophagy voivat olla tärkeitä kasvainten kehittymiseen. Varhaisessa vaiheessa kasvaimen, autophagy näyttää toimivan tuumorisuppressorina. Tämän seurauksena, estämällä autophagy lisää DNA-vaurioita, kromosomaalisia muutoksia, kuten alleelinen menetys ja vahvistuksen, ja oksidatiivisen stressin, mikä voisi johtaa kasvaimia tapahtumat [23], [24]. Kuitenkin autophagy edistää myös kasvaimien syntyyn. Autophagy induktio irrottautuminen soluväliaineen syöttöä kasvainsolun eloonjäämistä aikana anoikis, joka osaltaan levittämiseen ja etäpesäkkeiden [25], [26]. Yhdenmukaisesti näiden aiempien tutkimusten, tuloksemme osoittivat, että ATG10 ilmentyminen liittyy läheisesti lymphovascular invaasion ja imusolmuke etäpesäke kolorektaalisyövässä. Nämä havainnot voidaan selittää yhteyden kasvaimeen korvattu solmut tai suonensisäinen kasvain aggregaatteja, joilla on systeeminen imusolmukkeiden kautta lymphovascular kanavien [27], [28]. Kasvaimen invaasio ja etäpesäkkeiden ovat tunnettuja riskitekijöitä uusiutumisen ja eloonjäämisen lopputulokseen. Tämän käsitteen, huomasimme, että ATG10 ilmentyminen kasvaimissa oli heikompi eloonjäämisaste. Kuitenkin suhde ATG10 ilmaisun ja kliinisiin tuloksiin, olisi vahvistettava suurempi kohortti ymmärtämään paremmin roolin ATG10 syövässä.

Johtopäätöksenä ATG10 ylössäätöä kolorektaalisyövässä liittyy läheisesti lymphovascular hyökkäyksen ja imusolmuke- etäpesäke, mikä osoittaa, että ATG10 voivat olla hyödyllisiä ennustetyövälineenä merkki ja terapeuttisena kohteena kolorektaalisyövässä.

Materiaalit ja menetelmät

Potilaille ja kasvain näytteet

arvioimiseksi ATG10 ilme, 37 kolorektaalisyöpä kudosnäytteet olivat satunnaisesti valittu arkistointia yksilöitä asemointia tehdään kesäkuun 1999 toukokuuta 2003 Asan Medical Center (Seoul, Korea). Seuraaville kliininen validointi ero proteiinin ilmentymisen malleja, arvioimme kasvain näytteet yhteensä 124 potilasta, joilla satunnaista peräsuolen syöpä, mukaan lukien peräkkäistä potilasta, joille tehtiin resektoimalla parantava tahallisuus (R0 resektio, n = 119; R1 resektio, n = 5) (Pöytä 1). Potilaat, joilla on perinnöllinen polypoottinen peräsuolen syövän tai familiaalinen adenomatoottisen polypoosin suljettiin, samoin kuin ne, jotka tehtiin ennen leikkausta chemoradiation hoito. Toistuminen, mukaan lukien alueelliset ja etäispesäkkeitä, esiintyi 22 124 potilasta (17,7%), joille parantava resektio seurannan aikana (keskiarvo 58 kuukautta alue, 3-123kuukausi). Kaikki potilaat toimitti kirjallisen tietoon perustuvan suostumuksen, ja tutkimussuunnitelman hyväksyi IRB (Institutional Review Board) mukaisesti Helsingin julistuksen.

Solulinjat ja reagenssit

CCD841 soluja ystävällisesti Dr. SY Rha (Yonsei University, Seoul, Korea) [29]. AMC5 solulinja saatiin, kuten aikaisemmin on kuvattu [30]. Ja muut syöpäsolulinjat kuten HCT116, HT29, KM12C, WiDr-, LoVo, SW480, SW48, HCT15, DLD1, RKO ja Caco2 ostettiin ATCC (Manassas, VA). Kaikki solut viljeltiin 37 ° C: ssa, 5% CO

2-inkubaattorissa ja ylläpidetään RPMI1640-elatusaineessa, joka sisälsi 10% naudan sikiön seerumia ja 1% penisilliini /streptomysiiniä (Invitrogen, Carlsbad, CA).

Western blot-analyysi

proteiinit kudokset ja solut on valmistettu käyttäen proteiini-näytepuskuria (62,5 mM Tris-HCl: a, 25% glyserolia, 2% SDS, 5% 2-merkaptoetanolia, 0,01% bromifenolisinistä) (BioRad, Hercules, CA). Proteiinit (noin 50 ug) kvantifioitiin käyttäen Bradford liuosta (BioRad) mukaisesti valmistajan ohjeen ja sen jälkeen, erotettiin SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesilla ja siirrettiin polyvinylideenifluoridi kalvoja (BioRad). Membraanit inkuboitiin ensisijaisen vasta-aineita ATG10 (1:3000; MBL, Nagoya, Japani) ja aktiinin (1:10,000; Chemicon International, Temecula, CA). Kalvoja inkuboitiin sitten piparjuuriperoksidaasikonjugoiduilla toissijainen vasta (1:5000, Pierce, Rockford, IL).

immunohistokemiallinen värjäys

Tissue joukko lohkot valmistettiin käyttämällä tarkkuusinstrumentti (Beecher Instruments Sun Prairie, WI). Immunohistokemiallinen värjäys perustuu leimatun streptavidiinin biotiini menetelmä suoritettiin käyttämällä Dako LSAB kit (Dako, Carpinteria, CA) monoklonaalisten ATG10 vasta-aineita (MBL). Heikko värjäytyminen (≤10%) ja ei värjäytymistä pisteytettiin negatiivisiksi (-), ja 10% värjäytyminen pisteytettiin positiiviseksi (+). Näytteet negatiiviset immunokemiallinen värjäys tutkittiin kahdesti todentaa tulokset.

proliferaatiomääritystä

Sirna varten ATG10 (siATG10, siGENOME SMART-allas) ja salattu kontrolli ei-kohdistettu siRNA (Scramble) syntetisoitiin Dharmacon, Inc. (Thermo Scientific, Chicago, IL). HCT116-solut transfektoitiin 0,5 umol /l siATG10 tai salattu siRNA Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA). Sitten leviämisen nopeus mitattiin käyttämällä soluproleferaatiomäärityksessä Kit (CCK-8) mukaisesti valmistajan protokollan (Dojindo Corporation, Japani). Lyhyesti, solut 96-kuoppalevyllä sekoitettiin 10 ui CCK-8-liuoksella ja inkuboitiin tämän jälkeen yhden tunnin ajan CO

2-inkubaattorissa. Myöhempi kolorimetrinen muutos mitattiin Victor mikrotitrauslevylukulaitetta (PerkinElmer) asettaa valvomaan muutoksia absorbanssi 450 nm: ssä.

Tilastollinen analyysi

Cross-pöydän analyysi käyttämällä Fisherin testiä kaksi- puolinen tarkastus käytettiin vertaamaan immunohistokemiallisia havaintoja mukaan kliinis ja uusiutumisen esiintyvyys potilailla. Päätetapahtuma oli toistuminen, 5-vuoden DFS, ja 5 vuoden OS. Survival suhteita verrattiin Kaplan-Meier-menetelmää ja log-rank-testi, ja voimakas eloonjäämistekijät varmennettiin käyttämällä Coxin regressiomallin. Merkitsevyystasolla 5% valittiin jokaista analyysia. Tilastolliset analyysit tehtiin SPSS (versio 19, SPSS Inc., Chicago, IL).