Krooninen sairaus

tiivistelmä

akvaporiineja (AQP) ovat vesi kanava proteiineja tärkeä rooli in transsellulaarinen ja epiteelin veden liikkumista. Äskettäin rooli AQPs ihmisen syövän synnyn on tullut alueen suurta kiinnostusta. Täällä immunohistokemian (IHC), olemme löytäneet ilmaus AQP5 proteiinin 35,3% (IHC-pisteet: ≥1, 144/408) on resektoitua NSCLC kudosnäytteitä. Tapaukset, joissa AQP5-positiivisuuden (IHC-pisteet: ≥2) näkyy korkeampi kasvaimen uusiutumisen kuin kielteisiä in NSCLC (54,7% vs. 35,1%, p = 0,005) ja huonompi tautivapaan elinajan (p = 0,033; TAI = 1,52; 95% CI: 1,04-2,23). Edelleen

in vitro

invaasiomääritys käyttäen BEAS-2B ja NIH3T3-solut transfektoitiin stabiilisti yli-ilmentymisen konstrukteja täyspitkää villin tyypin AQP5 (AQP5) ja sen kaksi mutantteja, N185D joka estää kalvokuljetuksessa ja S156A joka estää fosforylaatio Ser156 , osoitti, että AQP5 indusoi solun invasions kun molemmat mutantit eivät. In BEAS-2B soluja, ilmaus AQP5 aiheutti karamaisen ja fibroblastivasteeseen morfologisia muutoksia ja tappiot solu-solu kontakteja ja solun polariteetti. Vain solut AQP5, ei myöskään kahden mutantteja, osoitti menetys epiteelisolujen markkereita ja voitto mesenkyymisolun markkereita. Ihmisen SH3-domeeneja proteiinijärjestelmän, solu-uutteet päässä BEAS-2B AQP5 osoitti vahvan sitoutumisen aktiivisuus SH3-domeeneja c-Src, Lyn, ja Grap2 C-terminaaliin. Lisäksi immuunisaostustesti, aktivoitu c-Src, fosforyloitu Tyr416, osoitti vahvempi sitoutumisaktiivisuutta solu otteita BEAS-2B AQP5 verrattuna N185D tai S156A mutantti. Fluoresenssi in situ -hybridisaatio (FISH) analyysi ei merkkejä genomivahvistuksen, mikä viittaa AQP5 ilmaisu toissijaisena tapahtuma. Perustuen näiden kliinisten ja molekyylitason havainnot, voimme päätellä, että AQP5 kautta fosforylaation Ser156 ja myöhempi vuorovaikutus c-Src, on tärkeä rooli NSCLC hyökkäystä, ja siksi voi tarjota ainutlaatuisen mahdollisuuden kehittää uusia terapeuttisia tavoite samoin ennustetyövälineenä markkerina NSCLC.

Citation: Chae YK, Woo J, Kim MJ, Kang SK, Kim MS, Lee J, et al. (2008) Expression of akvaporiini 5 (AQP5) Edistää Kasvain Invasion Human Non pienisoluinen keuhkosyöpä. PLoS ONE 3 (5): e2162. doi: 10,1371 /journal.pone.0002162

Editor: Joseph Najbauer, City of Hope Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 9. tammikuuta 2008; Hyväksytty: 13 maaliskuu 2008; Julkaistu: toukokuu 14, 2008

Copyright: © 2008 Chae et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tuettiin osittain SPORE avustuksen P50 CA96784-01 (CM), Cancer Research Grant Pyung-Ya Foundation (CM), ja KOSEF tutkimus apurahan R01-2004-000-10670-0 ja Korea Research Foundation apurahan KFR- 2004-041-E00064 (ja SJJ).

Kilpailevat edut: DS on maksettu konsultti Cangen Biotechnology.

Johdanto

akvaporiineja (AQP) edustavat perheen transmembraani- vesi kanava proteiineja laajalti eri kudoksissa kaikkialla kehossa ja niillä on tärkeä rooli transsellulaarinen ja epiteelin veden liikkumista [1], [2]. Toistaiseksi ainakin kymmenen erillistä AQPs on ominaista ihmisillä ja on ollut kasvava ymmärrys niiden roolit ihmisen patofysiologiassa [2]. Kuitenkin vasta viime aikoina tietoja ilmennyt roolista ihmisen AQPs (hAQPs) yhtenä keskeisistä tekijöistä suoraan osallistuvat ihmisten syövän synnyn [3]. Expression of hAQP1 usein liittyy paksusuolen syövän, haimasyövän, aivokasvain, munuaissolukarsinooma, ja mikrosuonten ja (MM), rinnalle angiogeneesi [4] – [8]. Samoin ilmaus AQP5 lisääntyi haimasyöpä ja munasarjasyövän [7], [9]. Lisäksi olemme aiemmin raportoitu induktiota AQP5 ilmentymisen sen viestin alkupuolella paksusuolen syövän kehittymisen [5].

toiminnallisella tasolla, AQP1 on osoitettu olevan yksi viivästynyt aikainen muuniresponssigeeneinä ja mukana in solujen vaeltamiseen, ja angiogeneesi [10], [11], ja ilmaus AQP1, AQP3 ja AQP5 indusoitiin aikana lymfosyyttiaktivaation [12]. Aikaisemmin olemme antaneet näyttöä uusia onkogeenisten ominaisuuksien AQP1 ja sen ilmentymistä resektoidun kudosnäytteitä ei-pienisoluinen keuhkosyöpä. Lisätodisteita roolin AQP5 ihmisen syövän synnyn saatiin myös ryhmämme [13], [14]. Kohdunulkoinen ilmentyminen AQP5 NIH3T3-soluissa houkuttelivat useita fenotyypin muuttuu ominaisuus muutoksen sekä

in vitro

ja

in vivo

edistämällä signalointipolkujen aktivoidaan Ras, joita aiheuttaa fosforylaatio PKA-konsensus- of AQP5.

tässä tutkimuksessa selvitimme roolia AQP5 keuhkosyövässä. AQP5 valittiin perustuu useisiin tutkimuksiin: Ensinnäkin, alustavien tutkimus osoitti, että muun AQP1, 3, ja 5, AQP5 osoitti vahvin onkogeenisiä NIH3T3 solulinjassa. Toiseksi, vaikka molemmat AQP1 ja AQP5 osoittivat kasvaimia synnyttävän omaisuuden NIH3T3 solulinjan, AQP5 ilmaisu aiheuttama ERK aktivointi [13], kun taas AQP1 ilme ei [15]. Kolmanneksi, ilmaus AQP5, ei AQP1 tai AQP3, havaittiin liittyvän Ras /ERK /Rb-reitti aktivaation koolonsyöpäsolulinjoissa ja sen yhteydessä maksan etäpesäkkeiden paksusuolen syövän potilaille [16]. Olemme aiemmin osoittaneet ilmentymistä AQP1 ihmisen ensisijainen keuhkosyöpä kudoksia; 18 ulos 44 näytteitä ei pienisoluisen keuhkosyövän potilaista havaittiin positiivinen AQP1 proteiinin ilmentymisen. Kuitenkin on osoitettu, että AQP5 osoitti vankempi onkogeeninen potentiaali kuin AQP1 sekä AQP3 pehmeässä agarissa määrityksen, keskittyä muodostumista määrityksessä, ja solujen lisääntyminen (MTT) [13] – [15], joka johtaa meidät valitsemaan AQP5 sen rooli keuhkojen syövän synnyn paitsi kliinisen validointitutkimusta mutta myös tutkimuksia sen taustalla molekyylitason mekanismeja.

Täällä esittelemme sekä molekyyli- ja kliinistä näyttöä, että AQP5 voi olla rooli etenemistä ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC). Ensinnäkin, joka perustuu immunohistokemiallinen analyysi hAQP5 408 NSCLC kudoksia, olemme tutkineet, onko ilmaisun profiilia AQP5 ihmisen keuhkosyöpää korreloi sairauden etenemistä ja eloonjäämistä. Sitten olemme suorittaneet invaasiomääritys ja epiteelin-mesenkymaalitransitioon merkki tutkimus ihmisen keuhkoputken epiteelisoluissa yliekspressoivien AQP5 versus sen mutanttien lisäksi mock valvonta, jota täydennetään muilla molekyylien vuorovaikutus tutkimuksia selvittämään AQP5 välittämän reitin. Lisäksi FISH-analyysi tehdään tunnistaa molekyylitason mekanismit hAQP5 ilmaisua.

Methods

Soluviljely

Kaikki solulinjat saatiin American Type Tissue Collection (Rockville, MD ). Hiiren fibroblastisolulinjaa NIH3T3 viljeltiin DMEM: n läsnä ollessa 10% FBS: ää. Normaali keuhko solulinja BEAS-2B kasvatettiin LHC-9 väliaineessa, kun läsnä on 0,5 ng /ml rekombinanttia epidermaalista kasvutekijää (EGF), 500 ng /ml hydrokortisonia, 0,005 mg /ml insuliinia, 0,035 mg /ml naudan aivolisäkeuutetta , 500 nM etanoliamiinia, 500 nM fosfoetanoliamiini, 0,01 mg /ml transferriiniä, 6,5 ng /ml 3,3 ’, 5-trijodityroniinia, 500 ng /ml epinefriini, 0,1 ng /ml retinoiinihappo (Clonetics Corporation, Walkersville, MD). Kaikki solut viljeltiin 5% CO

2 tasapainoinen ilmassa 37 ° C: ssa.

Plasmidi rakentaa ja stabiilien solulinjojen

Ihmisen cDNA HEK 293 monistettiin polymeraasiketjureaktiolla-ketju (PCR) käyttäen alukkeita villityypin AQP5 (AQP5) ja insertoidaan sitten EcoRI ja Xhol-pcDNA 3.1 (+). Kloonit vahvistettiin restriktioanalyysillä ja DNA-sekvensoinnilla molempien juosteiden. Seriini 156 tai asparagiini 185 korvattiin alaniinilla tai asparagiinihapon, vastaavasti PCR-pohjainen kohdennetun mutageneesin tuottamiseksi S156A tai N185D AQP5 mutantti, joka perustuu AQP5 pcDNA3.1-konstrukti, kuten aiemmin on kuvattu [13]. AQP5 WT ja kaksi mutantit insertoitiin EcoRI ja BamHI-kohtiin p3XFLAG-CMV-14 (Sigma), ja varmistettiin sekvensoimalla DNA molempien juosteiden mutantit. Expression rakenteet transfektoitiin NIH3T3 ja BEAS2B solujen FuGENE 6 mukaisesti valmistajan suositusten mukaisesti. Kaikki transfektantit valitaan 800 ug /ml G418: aa ja 3 viikkoa ja valitaan kloonit seulottiin Western blot käyttäen AQP5-vasta-ainetta ja /tai RT-PCR: llä. Kun solut olivat konfluentteja, aliviljeltiin trypsinoimalla (0,05% trypsiiniä, 0,53 mM EDTA Hanksin tasapainotettu suolaliuos). Kuvat, jotka osoittavat morfologioita erilaisten stabiileja soluja, jotka ilmentävät erilaisia ​​konstrukteja vietiin läpi faasikontrastimikroskopialla (ECLIPSE TE300, Nikon Co., Tokio, Japani).

invaasiomääritys

Matrigel invaasiomääritys oli suoritetaan NIH3T3 ja BEAS2B soluja. BioCoat Matrigel (BD Biosciences, Bedford, MA), joka liuottaa tyvikalvon hankittiin arvioida soluinvaasiota. 24-kuoppaisella kudosviljelylevyllä insertit päällystetty Matrigelillä oli hydratoidaan uudelleen 2 tuntia 37 ° C: ssa media. Media (0,6 ml), joka sisälsi 5% naudan sikiön seerumia, lisättiin kullekin maljalle ja kemoattraktantti, ja 0,2 ml (2 x 10

4 solua) solususpensiota lisättiin kuhunkin insertin. Kun oli inkuboitu 24 tuntia, ei-tunkeutuvat solut poistettiin ylemmältä puolelta kalvon pesemällä. Jotta minimoida solujen lisääntymistä on invaasiomääritys olemme vahvistaneet, että ensimmäisten 24 tunnin aikana, BEAS-2B solut läpikäyvät minimaalinen solunjakautumisen ja ei ole mitään havaittavaa eroa solujen lisääntymisen välillä soluja, jotka ilmentävät AQP5 ja solut, jotka ilmentävät mock vektori (Fig. S1). Invasion solujen alapintaan Matrigel-päällystetty kalvo havaittiin värjäämällä solut Mayerin hematoksyliinillä liuosta ja visualisointiin soluja mikroskoopilla. Värjäyksen jälkeen solut laskettiin mikroskoopin alla neljän satunnaisesti valitun kentät (suurennos x 100), ja tulokset ilmaistiin muodossa pylväsdiagrammi. Kokeet suoritettiin kolmena rinnakkaisena kullekin tilalle.

Immunoblottaus ja immunosaostus

Lysaatit viljellyistä soluista ja kudoksista valmistettiin jääkylmässä NP-40 hajotuspuskuria (10 mM Tris-HCl (pH 7,4), 137 mM NaCl, 10% glyserolia ja 0,1% Nonidet P-40), joka sisältää inhibiittoria cocktail 10 mM β-glyserolifosfaattia, 1 mM fenyylimetyylisulfonyylifluoridia, 10 mM NaF, 10 mM Na-ortovanadaatti, 4,5 U /ml aprotiniinia ( Sigma), ja 1 ug /ml leupeptiiniä (Sigma). Raakavalkuaisen lysaatit (30 ug) erotettiin 12% SDS-PAGE: lla (Biorad), siirrettiin nitroselluloosamembraaneille (Biorad), ja blokattiin 1 tunnin ajan 5% rasvatonta kuivamaitoa Tris-puskuroitu suolaliuos, jossa 0,05% Tween 20 seuraavat kaupalliset vasta-aineita käytettiin Western blot-analyysi: anti-AQP5 (1:200, Alpha Diagnostic), anti-α-kateniinin-vasta-ainetta (1:1000, Cell Signaling) anti-γ-kateniini vasta-aineella (1:1000, Cell Signaling) anti-fibronektiini-vasta-aine (1:1000, Cell Signaling), anti-vimentiinin vasta-ainetta (1:1000, Cell Signaling), anti-E-kadheriini-vasta-ainetta (1:1000, Cell Signaling), anti-c-Src-vasta-ainetta (1 :1000, Cell Signaling), anti-fosfo-Src-vasta-ainetta (1:1000, Cell Signaling), anti-Lyn-vasta-ainetta (1:1000, Cell Signaling), anti-grap2-vasta-aine (1:1000, Cell Signaling), ja anti- β-aktiini-vasta-aine (1:5000; Sigma). Fosfo-Src-vasta-ainetta käytettiin ensimmäisen kerran; Sitten blotteja riisuttu ja uudelleen blotattiin anti-src ja beeta-aktiini vasta-aineita. Asianmukaista anti-kani-anti-hiiri piparjuuriperoksidaasi-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineita (1:3000; Amersham) käytettiin. Immunoreaktiivisia vyöhykkeet havaittiin tehostetulla kemiluminesenssin (Pierce).

SH3 domain sitova

TranSignal SH3 domain array III täplikäs peptidejä, jotka edustavat 34 eri ihmisen SH3 domeenit kuten Grb2 ja Src, ostettiin Panomics ja testattiin niiden sitoutumista AQP5 segmentteihin ja AQP5 WT ylläpitää luonnon topologian mukaisesti valmistajan ohjeiden. SH3 domain sisältävät proteiinit array nähtiin kahtena kappaleena. Lyhyesti, kalvosuodattimia inkuboitiin 30 ug /ml proteiinia yön yli. Pesun jälkeen proteiineihin sitoutuminen tehtiin näkyväksi inkuboimalla HRP-konjugoitu His-vasta-ainetta tai aineen kanssa. Tämä määritys suoritettiin vähintään kaksi kertaa kunkin proteiinin.

Protein tunnistaminen ja vuorovaikutuksen

avattavasta määrityksissä, GST-fuusioproteiinit (SH3 domain sisältävät proteiinit) ja GST ostettiin Panomics. Solut hajotettiin NP-40-hajotuspuskuria, ja lysaatit inkuboitiin sitten joko GST tai GST-fuusioproteiinin 4 ° C: ssa 2 tunnin ajan, minkä jälkeen lisättiin 20 ui glutationi-Sepharose 4B. 30 minuutin kuluttua sekoitus, helmet pestiin neljä kertaa. Proteiinit eluoitiin Laemmli-näytepuskurissa ja analysoitiin SDS-PAGE ja sen jälkeen immunoblottauksella mainituilla vasta-aineilla.

Cancer kudos microarray

Tissue mikrosiruja (TMA) konstruoitiin käyttäen formaliinilla kiinnitetyt, paraffiini- upotettu kudoksia 419 NSCLC saatu patologian osaston of Asan Medical Center hyväksynnän nojalla sisäisen Review Board (IRB numero: 2006-0019). Keuhkojen näytteet saatiin vuodesta 1996 vuoteen 1999. Alkuperäinen H DAKO Cytomation, Carpinteria, CA), ja sen jälkeen kromogeenin havaitseminen diaminobentsidiinillä (DAB). Negatiiviset kontrollit tehtiin jättämällä ensisijaisen vasta-inkubaatiovaiheen.

pisteytys Immunohistokemian

immuunivärjäytyminen annetun TMA luokiteltiin puolittain määrällisesti ottaen huomioon sekä värjäyksen intensiteetti ja prosenttiosuus positiivisia kasvainsoluja kahdella tutkimus patologia (SJJ ja MJK) sokaissut ennusteeseen viittaavia muuttujia. Värjäytymisintensiteettiä pisteytettiin asteikolla neljään luokkaan: 0, mitään värjäytymistä syöpäsolujen; 1, heikko värjäytyminen; 2 kohtalainen värjäytyminen; 3, vahva värjäytyminen. Prosenttiosuus värjättyä kasvainsolujen luokiteltiin asteikolla 2 laadut: 0, 10% ja 1, 10%. AQP5 ilmentymistä syöpäkudoksessa määriteltiin positiiviseksi, kun tuote intensiteetin maalitiliään prosenttiluku on 1 tai enemmän. Sekä histologinen tyyppi ja laatu on vahvistettu hematoksyliinillä ja eosiinilla (H 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

AQP5 yliekspressio liittyy huonompi ennuste NSCLC

Merkittävä ilmentyminen AQP5 proteiinin havaittiin 16,9% (69/408) NSCLC TMA näytteistä (immunovärjäyty- pisteet 2+; määritellään positiivinen) (taulukko 1, kuvio 1A). Kuten on esitetty kuviossa 1A, vain syöpäsolut, ei kasvaimeen tunkeutuvia lymfosyyttejä, osoitti AQP5 ilmentymistä. Mukaan lukien tapaukset, joissa heikko ilme (immnunostaining pisteet 1+), se oli niinkin korkea kuin 35,3% (144/408, taulukko 1). Mielenkiintoista on, AQP5 yli-ilmentyminen havaittiin pääasiassa keuhkojen adenokarsinoomat (p 0,001, taulukko 2). Kuitenkaan mitään muuta tilastollisesti merkitsevä korrelaatio löydettiin NSCLCs välillä AQP5 ilmaisun ja demografiset ja patologisten tekijöiden, kuten iän, sukupuolen, histologiset erilaistuminen, ja kasvaimen vaiheessa (taulukko 2). Johtuen riittämättömän otoskoko metastaattisen tapauksista (n = 4), ei enää tilastollista korrelaatiota tutkimuksen etäpesäkkeitä suoritettiin.

mikrovalokuvia AQP5 immunovärjääminen puettu ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) kudoksiin. Esimerkkejä heikko (+1), kohtalainen (+2), ja vahva (+3) immunoreaktiivisuus NSCLCs (a-c, vastaavasti) Alkuperäinen suurennus × 200. (B) Kaplan Meier käyrä pienisoluista keuhkosyöpää. AQP5-positiivisten tapausten näkyy epäedullisempaan taudista vapaan eloonjäämisaste (log rank p = 0,011) kuin AQP5-negatiivinen tapauksissa.

Yllätykseksemme tapauksia AQP5-positiivinen tila näkyy korkeampi kasvaimen uusiutumisen kuin kielteisiä in NSCLC (54,7% vs. 35,1%, p = 0,005). Vaikka AQP5 yliekspressio ei ollut tilastollisesti merkitsevästi liittyvät yleiseen eloonjäämiseen, hämmästyttävän, joilla NSCLC osoitti huonompi taudista vapaan eloonjäämisaste (log rank -testi, p = 0,011) (Kuva. 1 B). Jopa säätämisen jälkeen histologista luokan ja kasvaimen vaiheessa AQP5 yliekspressio NSCLC oli vielä merkitsevästi yhteydessä aiemmin taudin etenemiseen (p = 0,033; OR = 1,52; 95% CI: 1,04-2,23). Siksi AQP5 asema näyttää olevan riippumaton molekulaarinen merkkiaine liittyy huonompi kliinisiä tuloksia.

Ihmisen AQP5 edistää solujen invaasiota

Meidän kliinisten löydösten, olemme arveltu, että AQP5 voivat aiheuttaa solujen invaasiota, joka on välttämätön askel kasvainmetastaasit. Sen tutkimiseksi, onko AQP5 yliekspressio edistää solujen invaasiota ihmisen keuhkoputken epiteelisoluissa ja, samaan aikaan, määrittää, mitä komponentteja AQP5 proteiini on rooli tässä prosessissa, ensin suoritetaan Matrigel invaasiomääritys in BEAS-2B solulinjat ilmensivät stabiilisti AQP5 ja sen kaksi mutantteja, N185D joka estää kalvokuljetuksessa ja S156A joka estää fosforylaatio S156 paikalle AQP5 molekyylin [13], [14], [17]. Mielenkiintoista, solut AQP5 osoittivat korkeaa soluinvaasiota kesken neljään ryhmään (Fig. 2A, 2C). Vaikka korkeampi kuin mock aste soluinvaasiota soluissa kanssa N185D ja S156A mutantit oli selvästi pienempi kuin solujen AQP5 (Fig. 2A, 2C). Nämä havainnot viittaavat siihen, että molemmat membranous ilmaus AQP5 ja sen fosforylaatio S156, PKA-konsensus-, ovat tärkeitä AQP5 aiheuttama soluinvaasiota in BEAS-2B-soluja. Sulkemaan pois mahdollisuutta, että tämä ilmiö ei ole ainutlaatuinen ihmisen keuhkoputken epiteelisolujen, suoritimme samassa määrityksessä hiirellä fibroblastien NIH3T3 solulinjoja, jotka transfektoitiin sama ekspressiokonstruktien [13] ja on havaittu vastaavia havaintoja (Fig. 2B, 2D) .

Matrigel invaasiomääritys suoritettiin kunkin BEAS-2B soluja (A, C) ja NIH3T3-solut (B, D), jotka ilmentävät AQP5 tai kukin kahden mutantteja. AQP5 aiheuttama solujen vaeltamiseen ja hyökkäyksen BEAS-2B, ikuisti ihmisen keuhkoputken epiteelisolujen sekä NIH3T3-solut. Sen sijaan molemmat N185D mutantti (heikentynyt kalvokuljetuksessa) ja S156A mutantti (heikentynyt fosforylaation Ser 156 PKA) eivät indusoi solujen vaeltamiseen ja invaasiota joko BEAS-2B soluja tai NIH3T3-solut verrattuna Mock.

AQP5 ilmaisu johtaa fibroblastin kaltaisen morfologisten muutos keuhkoputken epiteelisoluissa

siis päättänyt arvioida mitään morfologisia muutoksia mukana AQP5 yli-ilmentymisen. Morfologiat Beas-2B ihmisen keuhkoputken epiteelisolujen kuljettavat joko mock vektorin FLAG tai FLAG /AQP5 tutkittiin faasikontrastimikroskopiassa. Kuten odotettua, valetransfektoidut BEAS-2B-solut osoittivat erittäin järjestäytyneen solu-soluadheesion ja ylläpidetään solun polariteetti, joka on tyypillinen morfologia normaalien epiteelisolujen (Fig. 3). Kuitenkin ilmaus AQP5 aiheutti selvästi tappimaista ja fibroblastinen muutos solujen morfologia ja menetys solu-solu kosketukseen ja solun polariteetti (Fig. 3). Nämä morfologiset muutokset voivat merkitä sitä, että AQP5 on rooli epiteelin-mesenkymaalitransitioon (EMT).

morfologiat Beas-2B ihmisen keuhkoputken epiteelisolujen ilmentävät mock vektorin FLAG tai FLAG /AQP5 paljastuivat faasikontrastimikro- mikroskopia. BEAS-2B-soluja ylläpidetään hyvin järjestetty solu-soluadheesion ja solun polariteetti kuin tyypillinen epiteelin morfologia. Ilmaus AQP5 aiheutti tappimaista ja fibroblasti- morfologia ja menetys solu-solu-kontaktien ja solujen napaisuus. Mittaviivat 50 pm.

AQP5 ilmentyminen liittyy molekyylimarkkereita epiteelin-mesenkymaalitransitioon

Jotta voitaisiin varmistaa, onko AQP5 todella indusoi EMT ihmisen keuhkoputken epiteelisoluissa, suoritimme western blot-analyysi tarkistaa proteiinimarkkereita varten EMT. Huomattavaa on, että joukossa BEAS-2B soluista, jotka ilmentävät stabiilisti AQP5 (klooni # 1 ja # 2), N185D, S156A mutantit ja mock vektori, vain solut, jotka ilmentävät AQP5 näytteillä menetys epiteelisolujen markkereita, kuten E-kadheriinin, α kateniinin ja γ kateniinin, ja voitto mesenkyymisolun markkereita kuten fibronektiiniä ja vimentiinista (Fig. 4). Molemmat muutokset morfologiassa ja molekyylitason profiilia AQP5 yli-ilmentävät solut antaa täsmällisiä todisteita siitä, että AQP5 stimuloi keuhkoputken epiteelisolujen käymään EMT.

Expression of epiteelin proteiinien kuten E-kadheriinin, α-kateniinin ja γ-kateniinin, ja mesenkymaaliset proteiineja, mukaan lukien fibronektiinin ja vimentiinin tutkittiin immunoblottauksella on neljä erillistä BEAS-2B-soluja, joista kukin kuljettaa yli-ilmentymisen konstruktin AQP5 (klooni # 1 ja # 2), N185D, S156A ja Mock. Vain solut AQP5 näytteillä menetys epiteelin markkereita ja voitto mesenkyymisolun markkereita. 1, AQP5 klooni # 1; 2, AQP5 klooni # 2; 3, N185D; 4, S156A; 5, Mock perustuu BEAS-2B solulinjoissa.

AQP5 vuorovaikutuksessa c-Src, joka on voimakas EMT laukaista

Sitten tutkimme mahdolliset molekyylimekanismin takana EMT edistämällä omaisuutta AQP5. Ihmisen AQP5 kantaa diproline peptidisekvenssi (RTSPVGSP) silmukan D [18], [19], joka kantaa sekvenssin samankaltaisuus SH3 sitova yksimielisyys päällä. Näin ollen, on mahdollista, että tämä segmentti AQP5 voi sitoa kanssa SH3-domeenin sovittimen molekyylin [18]. Siksi teimme ihmisen SH3 verkkotunnuksia proteiinijärjestelmäksi tutkia mahdollisuuksia usean SH3 verkkotunnuksen sisältävien proteiinien sitoutua ihmisen AQP5. Huomattavaa on, että puhdistettu AQP5 vakaista BEAS-2B-solut osoittivat sitoutumisen aktiivisuus SH3-domeenin c-Src, Lyn, ja Grap2 C-terminaalinen (kuvio 5A). AQP5-segmentti, joka sisältää fosforyloidun Loop D (88 aa kautta 182 aa) oli myös mahdollisuus sitoa SH3-domeenin c-Src, Lyn, ja Grap2 C-terminaalista (Fig. 5A). AQP5-segmentti, joka sisältää fosforyloitumaton Loop D, kuitenkin, ei kyennyt sitoutumaan mihinkään SH3 domains kolmesta proteiineja (Fig. 5A). Fosforylaation tilan kunkin proteiinin varmistettiin edelleen.

(A) ihmisen SH3 domains proteiinijärjestelmän käytettiin tutkimaan mahdollisia sitovaa toimintaa useita SH3 domain sisältäviä proteiineja AQP5. Ei vain AQP5, mutta myös AQP5-segmentin, joka sisältää fosforyloidun Loop D (88 aa kautta 182 aa) havaittiin sitoutuvan SH3-domeenin c-Src, Lyn, ja Grap2 proteiinia. AQP5-segmentti, joka sisältää fosforyloitumaton Loop D, kuitenkin, ei kyennyt sitoutumaan SH3 domain tahansa näistä proteiineista. (B) GST pull-down koe suoritettiin kolmella eri GST-fuusioproteiinit: c-Src SH3 domeenin, Lyn SH3 domain, ja C-terminaalinen Grap2 SH3 domeenin proteiinia. Solut, jotka ekspressoivat stabiilisti AQP5 ihmisen keuhkoputken epiteelisoluissa, BEAS-2B, paljasti vahvan vuorovaikutuksen c-Src SH3 domain proteiinia, Lyn SH3 domain-proteiini ja C-terminaalinen Grap2 SH3 domeenin proteiinia. (C) AQP5 on co-immunosaostettiin c-Src, että BEAS-2B, jotka on vakaasti transfektoitu AQP5 ekspressiorakenne. Lisäksi vain n aktivoitu muoto, c-Src, fosforyloitiin Tyr 416, on co-immunosaostettiin AQP5. 1, Mock; 2, N185D; 3, S156A; 4, AQP5; M, molekyylipainomarkkeria.

Lisäksi teimme GST avattavasta määritys tarkistaa suoraa vuorovaikutusta AQP5 ja Src-molekyylejä. Tässä määrityksessä käytettiin kolmea eri GST-fuusioproteiinit: c-Src SH3 domeenin, Lyn SH3 domain, ja C-terminaalinen Grap2 SH3 domain-proteiinia, joka havaittiin olevan vuorovaikutuksessa AQP5 in SH3 domain proteiinijärjestelmiä. Yhdenmukainen tulos SH3 domain proteiinijärjestelmien, AQP5 ekspressoida pysyvästi BEAS-2B ihmisen keuhkoputken epiteelisolujen osoitti voimakasta vuorovaikutusta c-Src, Lyn ja C-terminaalinen Grap2 SH3 domain-proteiineja (Fig. 5B).

Lopuksi vahvista meidän havainto

in vivo

, teimme immuunisaostustesti ihmisen keuhkoputken epiteelisolulinja BEAS-2B. Tällä kertaa keskityimme c-Src, molekyylin tunnettu EMT edistävä aktiivisuus [20]. Kuten odotettua, AQP5 yhteistyössä immunosaostettiin c-Src soluissa stabiilisti ilmentävät AQP5 (Fig. 5C). Kiinnostavaa, c-Src co-immunprecipitated kanssa AQP5 osoittautui n aktivoitu muoto, c-Src, joka on fosforyloitu Tyr416 (Fig. 5C). Toteamme myös, että solut ilmentävät AQP5 ovat enemmän aktivoitu c-Src kuin kantavien solujen N185D tai S156A mutantti (kuvio. 5C), mikä viittaa siihen, että vuorovaikutus AQP5 voi olla tärkeä askel aktivoimisessa c-Src.

AQP5 yliekspressio ei saa liittyä genomivahvistuksen

Valaistaan ​​molekyylitason mekanismeista AQP5 yliekspressio, olemme tutkineet läsnäollessa genomivahvistuksen kautta FISH-analyysillä. 69: tulkittavia tapauksissa NSCLC TMA, ei yksittäinen selkeä kuvio genomin monistamisen havaittiin (Fig. S2), mikä viittaa siihen, että ektooppinen ekspressio AQP5 voi olla toissijainen molekyyli tapahtuma.

Keskustelu

Olemme aiemmin osoittaneet, että yli-ilmentyminen AQP5 hiiren fibroblasteissa, NIH3T3-solut, indusoi solujen lisääntymisen toissijainen aktivointi Ras, joka välittää fosforylaatiota AQP5 sen PKA-konsensus-(S156), ja tässä tutkimuksessa selvästi edellyttäen yhdistys välillä AQP5 ja Ras signaalinvälitysreitin [13], [14]. Lisäksi olemme hiljattain raportoitu tutkimus, jossa kuvataan indusoima AQP5 proteiinin aikana peräsuolen syövän synnyn ja molekyylitason reitit miten AQP5 proteiinin ilmentyminen voi vaikuttaa paksusuolen syövän kehitystä sen vuorovaikutus Ras /ERK /Rb signalointireitin [16].

vastakohtana näille Aiempien raporttien täällä, olemme pyrkineet roolin AQP5 annetun etenemistä NSCLC. Tämä perustuu osittain meidän ensin kertomusta, joka ei ainoastaan ​​osoittivat kasvaimia synnyttävän omaisuutta AQP1 NIH3T3-soluissa, mutta myös kuvattu ilmaus profiilia AQP1 NSCLC [15]. Tämä raportti, vaikkakin jos tietyt käsityksen asemaa koskevien AQPs NSCLC, ei osoittanut myöskään sen kliinisiä vaikutuksia tai liittyvän molekyylitason reittejä. Meidän -esitutkimukseen AQP5 NSCLC, huomasimme useita AQP5 ilmentymisen useissa NSCLC solulinjojen H1975, H1838, H1650, H1437, ja H838. Lisäksi, samanlainen havaintojemme kanssa NIH3T3-hiiren fibroblastisoluissa [13], [14], on viime aikoina havaittu, että AQP5 yli-ilmentyminen in BEAS-2B-soluja indusoi aktivoitumisen ERK-reitin, joka johtaa solun lisäkasvun stimulaatiota (Kang et al., käsikirjoitus valmisteilla); ihmisen keuhkoputken epiteelisolut stabiilisti transfektoitu AQP5 oli merkittävästi korkeampi lisääntymistä nopeudella kuin soluja, jotka on stabiilisti transfektoitu mock (Fig. S1). Perustuen näiden alustavien havaintojen ja aikaisempien havaintojen meillä oli AQP1 NSCLC ja AQP5 kolorektaalisyövässä tutkimuksessa olemme tutkineet ilmaisun profiilia AQP5 suuressa paneelissa kliinisissä näytteissä.

Vaikka ilmaus AQP5 sen sanoma taso on raportoitu joissakin osissa normaalin ihmisen keuhkoputken ja keuhkorakkuloiden kudoksissa [21], toistaiseksi, AQP5 ilmaisun profiileja NSCLC kudosnäytteitä, sen proteiinin taso, ei ole raportoitu. Jotta voitaisiin löytää kliinistä merkitystä AQP5 yli-ilmentymisen NSCLC, olemme keränneet resektoitiin ihmisen NSCLC kudoksia keskimäärin viisi vuoden seurantatutkimuksessa, johon teimme immunokemian tutkia proteiinin ilmentymistason AQP5. Vaikka löysimme AQP5 ilmentymistä syöpäsoluissa, emme nähneet mitään todisteita AQP5 immunoreaktiivisuus keskuudessa kasvaimeen tunkeutuvia lymfosyyttejä, mikä on vastoin meidän aiempia havaintoja esittää indusoima AQP5 sanomien lymfosyyttien aktivaation [12]. Vaikka tämä ero voi olla seurausta useista syistä, on mahdollista, että AQP5 ilmaisun aikana lymfosyyttien aktivaation voi olla tilapäinen tapahtuma ja että, kun lymfosyytit aktivoidaan, ne voivat downregulate AQP5 ilmaisua.

Olemme tunnistaneet kolme kiinnostavaa ilmaisun profiilit AQP5 proteiinin NSCLC kliinisten korrelaatio. Ensinnäkin ilmaus AQP5 proteiinin huomannut 35,3% (144/408, taulukko 1.) on resektoitua NSCLC kudosnäytteitä. Toiseksi NSCLC tapauksissa AQP5-positiivisuuden näkyy korkeampi kasvaimen uusiutumisen kuin negatiivisiin (54,7% vs. 35,1%, p = 0,005). Kolmanneksi AQP5 yliekspressio NSCLC oli merkitsevästi yhteydessä aiemmin taudin etenemiseen (p = 0,033; OR = 1,52; 95% CI 1,04-2,23) ja huonompi tautivapaan elinajan. Uskomme, että tämä on ensimmäinen kliininen näyttöä vahva korrelaatio AQP5 ilmaisun ja tulos syöpäpotilasta, jotka tehtiin leikkaus, ja lisäksi mukaan hAQP5 on potentiaalinen riippumaton prognostinen markkeri. Lisäksi se, että tämä tutkimus perustuu huomattavan koon potilaiden näytteistä (yli neljäsataa tapausta) ja keskimäärin 5 vuoden seuranta vahvistavat havaintomme.

ennustetekijöitä merkkiaine keuhkosyöpään on ratkaisevaa Yang et ai.