Krooninen sairaus

tiivistelmä

Useimmat prekliinisen analgeettinen teho määrityksiin sisältyy edelleen nociceptive testaus jyrsijöillä. Näin on siitä huolimatta huolen vuoksi merkitystä näiden testien arvioimiseksi kipua ehkäiseviä vaikutuksia huumeita. Lisää sopivia menetelmiä kohdistaisi kivun sijaan nosiseptiota, mutta nämä eivät ole tällä hetkellä saatavilla, joten ei tiedetä, eläinten kivun vastaa negatiivisesti affektiivinen ja subjektiivisen /tunnetilaa se aiheuttaa ihmisissä. Hiiren syöpä mallit ovat yhteisiä, vaikka todennäköisyys huomattavaa kipua. Käytimme Ehdollistettu paikanvalintatesti (CPP) testaus, arvioinnit terminen hyperalgesia ja käyttäytyminen määrittää todennäköisyys, että MBT-2 virtsarakon syöpä vaikuttaa kielteisesti hiiren hyvinvointiin, kuten aiheuttamalla kipua. Ei ollut CPP suolaliuos, mutta morfiini etusija kasvaimen kantavien hiirten ylitti nähdään kasvaimettomina valvontaa. Tämä tapahtui jopa 10 päivää ennen tutkimuksen päätepiste rinnalla alentunut ruumiin paino, kehittäminen hyperalgesia ja käyttäytymisen muutokset. Nämä vaikutukset osoitti hiiret kokenut negatiivinen hyvinvointivaltion aiheuttama

huonovointisuus

(jos ei kipua) ennen eutanasiaa. Monimutkaisuuden vuoksi arviointien tarvitaan tämän osoittamiseksi, on epätodennäköistä, että tämä lähestymistapa voitaisiin käyttää rutiini hyvinvoinnin arvioinnin tutkimukseen-by-tutkimuksessa pohjalta. Kuitenkin meidän tulokset osoittavat hiiret riittävän samankaltaisia ​​tutkimuksissa todennäköisesti hyötyvät intensiivisempää vakavuuden arviointi ja uudelleenarviointi päätepisteiden kanssa pannakseen täytäntöön asianmukaisia ​​tarkennuksia. Tässä nimenomaisessa tapauksessa hienosäätö olisi ollut saada tapettiin hiiriä vähintään 7 päivää aikaisemmin tai mahdollisesti järjestämällä loppuvaiheen kivunlievitystä. CPP testaus havaittiin olevan hyödyllinen menetelmä tutkia vasteet hiirten kipulääkkeitä, mahdollisesti subjektiiviseen tasolla. Nämä havainnot ja muiden viimeaikaisten tutkimusten se voisi olla arvokas seulontamenetelmä ehdokas kipulääkkeiden tehoa syöpää kipua ja mahdollisesti muiden kipua tai sairaus malleja.

Citation: Roughan JV, Coulter CA, Flecknell PA, Thomas HD, Sufka KJ (2014) Ehdollistettu paikanvalintatesti arvioineen hyvinvoinnin seuraukset ja mahdolliset Tarkennukset on hiiri virtsarakon syövän Model. PLoS ONE 9 (8): e103362. doi: 10,1371 /journal.pone.0103362

Editor: Bradley Taylor, University of Kentucky Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu 10 syyskuuta 2013 Hyväksytty: 30 Kesäkuu 2014; Julkaistu: 06 elokuu 2014

Copyright: © 2014 Roughan et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tutkimus rahoittivat Britannian kansallinen keskus 3R (NC3Rs): https://www.nc3rs.org.uk/, Grant Number G0900763, PI: JV Roughan. Rahoittaja ei ollut roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

valikoima nosiseptiivisen testejä käytetään määrittämään potentiaalisen tehon uusia kipulääkkeitä, ja laboratorio- rotilla ja hiirillä ovat ylivoimaisesti yleisimmin käytetty koehenkilöitä. Nämä testit ovat yleensä luokitellaan keston ja intensiteetin haitallisten ärsyke ja luonne vasteen. Akuutti tai phasic nociceptive määrityksiä, jotka koskevat lämmön, mekaanisen stimulaation (esim hännänheilautustestissä ja Hargreaves testit, von Frey, vastaavasti) johtuen suurelta refleksiivistä luonteen niihin saadut, pidetään vähemmän sopiva kuin tonic tai subkroonisen testit ( esimerkiksi formaliinilla tai karrageeni), jotka saavat aikaan merkittäviä ja pysyviä tulehdus [1]. Kuitenkin puutteita molemmat ovat hyvin tunnettuja [2]. Kehittämisestä huolimatta eläimen simulaatioita jatkuvan kivun oireyhtymiä (esim. Niveltulehdus tai neuropaattista kipua), koskee etusija niiden kliinistä merkitystä. Nämä lopulta johtuvat jatkuvan puutteen vuoksi ymmärrystä siitä, miten eläinten kivun vastaa ihmisen kokemus; on moniulotteinen ilmiö lukien sekä aisti- ja affektiivisemotionaalisten tila muuttuu (yhteisesti kutsutaan ”elämän laatu” muuttuu). Ainakin teoriassa, eläinten kivun ja kipulääke määrityksiä, jotka ilmoittavat muutoksista näissä valtioissa olisi varaa enemmän translaation pätevyys. Tämä tarve on ajanut viime puhelujen kehittämään enemmän kliinisesti merkitsevää

in vivo

mallit [3], [4] tarjoaa järjestelmälähtöisempää lähestymistapa [5]. Tämä logiikka selittää affektiivinen (subjektiivinen) tila arviointi on yhä pidetään enemmän merkitystä keino luoda hyvinvointia seurauksia malleja, joissa eläimet voivat altistua kivun [6] – [8]. Syöpä mallit ovat yksi tutkimusalue, jossa huomattavasti enemmän tietoa siitä, miten laajasti kivun vaikutuksia hyvinvointiin voi olla myöhässä.

suuri ja tasaisesti kasvava määrä eläimiä (lähinnä hiiriä) käytetään syövän testaus (471000 Britanniassa vuonna 2012; 16% enemmän kuin edellisenä vuonna [9]), jossa on vain vähän tietoa koskien mahdollisesti kielteisiä vaikutuksia hyvinvointiin. Kuitenkin suuntaviivat, jotka on tarkoitus minimoida kärsimyksen Näissä tutkimuksissa [10], [11] eivät sisällä mitään arviointia muutosten taustalla subjektiivinen tilassa, ja todisteiden saamiseksi Syöpäkivulle jyrsijöillä on perustunut paljolti arviointiin taustalla nociceptive muutokset [12 ] – [15], ja se näyttää tämä on yhä edelleen [16] – [19]. Ryhmämme on laajasti arvioitu muutoksia naturalistisia käyttäytymisen keinona arvioida jälkeisen kivun jyrsijöillä ja muiden lajien käyttämällä sekä manuaalinen [20] – [26] ja automatisoitujen menetelmien [27] – [30], tai käyttää molempia tyyppisiä analyysejä [31]. Tällainen käyttäytyminen analyysi on harvoin käytetty vaikutusten arvioimiseksi syövän, ja ne harvat tutkimukset, jotka viittaavat ”kivun käyttäytyminen” oikeastaan ​​tarkoittaa nociceptive tai nocifensive käyttäytymistä (ts peruuttaminen tai vartiointi-) pikemmin kuin tosi spontaani (esim koti-häkki) käyttäytyminen ( katso esimerkiksi [14], [32]). Menetelmästä riippumatta tiedonkeruun käytetään, välisten yhteyksien tuloksista ja syy käyttäytymistutkimuksissa on vaikeaa, koska monet tekijät voivat edistää havaitut muutokset. Muutokset voivat tapahtua välillisenä seurauksena menettelyyn vaikutteita (esimerkiksi anestesian, hypotermia, nestehukka) tai tekijät liittyvät näihin kuten pelkoa ja liittyy ahdistusta. Kuitenkin määrittämiseksi, ja kun kipu syntyy syöpä tutkimukset vaikuttaisi merkittävästi. Ensinnäkin se kannustaa tiukempaa eettisten päätöksentekoa tutkijat voivat hakea tehokkaampaa kustannus-hyöty-analyyseja, kun määritetään, päätepisteet ovat perusteltuja. Parantaminen hyvinvointia koskevat vaatimukset tällä tavalla olisi myös hyödyllistä tutkimuksiin koska unalleviated kipu voi myös vaarantaa mallin pätevyys. Estäminen kipu on osoitettu olevan hyödyllistä pätevyyttä ainakin yhdessä syövän tutkimuksessa [33] ja mahdollisesti muut

in vivo

tutkimussovelluksissa [34]. Syöpä kipu on myös alue, jossa edistystä ihmisen hoitoja tarvitaan pikaisesti. Kipu on yleisin ja pelätty seuraus syövän ja välillä 30-60% Syöpäpotilaille raportoivat edelleen kipua ennen, koko ja hoidon jälkeen [35]. Näyttää nimittäin siltä, ​​näkymät ovat edelleen synkät, vaikka 40 vuotta yritetty ongelman ratkaisemiseksi [36]. On selvää, syöpä kivunhoito on hiottava, ja eläinten syövän malleissa on ihanteellinen alusta rinnakkaisten edistymisen hyvinvoinnista etenemistä ja lääkekehityksen. Tästä huolimatta syöpä malleja ei yleensä käyttää seulomaan mahdollisia kipulääkkeitä, jossa on vain harvoja poikkeuksia lukuun ottamatta [13], [37]. Tämä voi olla, koska useimmat syöpä tutkimukset ovat vaihtoehtoisia tavoitteita, mutta se voi myös olla puutteen vuoksi asianmukaisia ​​arviointimenetelmiä; eli ne, jotka vastaavat subjektiivisia näkökohtia.

Ehdollinen paikanvalintatesti (CPP) testaus on laajalti käytetty arvioitaessa psykoaktiivisia (affektiivinen) ominaisuudet huumeiden eläimillä [38], mutta yleensä tunnistaa alttius väärinkäytölle ihmisten. Eläimet vakioidaan rajoittuu yhteen ”paikka” ja pariksi että lääkehoitoa, kun taas toisessa paikassa heille annetaan vain lumelääkettä. Koska ”paikat” on selvästi erilainen vihjeiden (yleensä väri tai koostumus) eläimet asteittain yhdistää huumeiden vaikuttavat kanssa paikka, jossa he kokivat sen. Jos tämä on palkitseva kokemus, joko johtuen huumeita ”positiivisesti tai negatiivisesti vahvistavia (kipulääke) vaikutukset, eläimet käyttävät tyypillisesti pidempi, tai käydä huumausaineiden pariksi paikka useammin. Tarjoaminen analgesia on positiivinen kokemus kivulias ihmisellä, joten jos sama pätee eläimiin sitten CPP tutkimukset on potentiaalia arvioidaan sekä vastenmielisiä ominaisuuksia kipua ja kipulääke lääkkeiden vaikutuksia. Lähestymistapa on yhä sovellettu tutkimus uhalla jälkeen ensimmäinen osoitus siitä, niveltulehdus syitä tehostettu CPP morfiini ja N-metyyli-D-aspartaatti antagonisti MK-801 [39]. Sen jälkeen osoitettu, että bradykiniinin B

1-reseptorin antagonisti on terapeuttista potentiaalia kroonista tulehduksellista kipua [40]. Huomattava myöhemmin, King et al. osoittivat CPP on myös tehokas menetelmä, jolla arvioidaan kipulääkkeiden vastaan ​​neuropaattista kipua [41]. Qu et ai. kuvitettu merkitystä CPP arviointiin subjektiiviset tekijät neuropaattista kipua rotilla osoittavat, että rostraalisen anterior cingulate aivokuori on olennaista välittävät kipua vaikuttaa [42]. Rutten et ai. pystyivät myös käyttää CPP erottaa välillä positiivisesti ja negatiivisesti palkitseva seuraukset kipulääkkeiden opioidien kaltainen vaikuttaa verrattuna muihin mekanismeihin rotan tulehduksellinen (karrageeni) malli [43]. Davoody et ai. sitten osoittivat lisääntynyttä CPP klonidiini (an α-2-agonisti) rotilla käyttäen selkäydinvamma keskitettynä kipumallista [44]. Okun et ai. käyttivät samankaltaista lähestymistapaa näyttää CPP useisiin eri lääkkeitä käytettäessä osteoartriittisissa malli [45], ja viimeisimpänä, Park et al. osoittivat puuttuminen positiivisen vahvistamisen (palkkio) Gabapentiiniin normaaleilla hiirillä, mutta CPP on polyneuropathic kipumallista aiheuttama antineoplastisten (sisplatiini) käsittely [46]. Yhdessä nämä havainnot osoittavat selvästi, että CPP paradigma pystyy tarjoamaan eläimille keino raportoida tietoisuutta kivun, ja niin voisi tarjota sopivampi arviointimenetelmä sen keskitetyn (affektiivinen /subjektiivinen) vastakohtana nociceptive (tehokas) ominaisuudet.

käsitys että kipu voi olla niin monimutkainen eläimillä (ainakin nisäkkäillä), koska se on ihmisillä on korostaa se, että mikään yksittäinen mittaus kriteeri voi (toistaiseksi) tehokkaasti arvioida sitä. Bateson et al. alun perin soveltanut useita toimenpiteitä lähestymistapa tieteellisen ongelmanratkaisun (myöhemmin kutsutaan ’kolmiomittauslaitteista ”) [47] vedoten, että vaikka” todisteita saadaan erilaisia ​​lähestymistapoja oli epäselvä ”,” kun koko ruumis todisteita pidettiin, paljon suurempi luottamus voitaisiin sijoittaa on tietty merkitys ”. Ratkaisemisessa eläinten kärsimystä, ja hyväksyttävä, että ”emme voi suoraan tarkkailla eläinten tunteita”, Batesonin suositteli, että ”meidän pitäisi käyttää erilaisia ​​tehtäviä luottaa enemmän johtopäätöksiä” [48]. Niinpä tutkimukset ovat nykyisin yhä soveltavat useita erilaisia ​​toimenpiteitä yritetään luonnehtivat kivun luotettavammin [49], [50]. Tässä tutkimuksessa on valinnut vastaavan lähestymistavan arvioimalla standardin hyvinvoinnin parametri (kehon paino) ohella reuna-yliherkkyys testauksen, seurannan spontaani valmisteleva käyttäytyminen ja suorittaa CPP testaus. Huolimatta useista rajoituksista, hyperalgesia (yliherkkyys) testausta edelleen tarjoaa arvokkaan toissijainen indikaattori kipua eri eri menettelyt kuten syöpää [12], [16], [19]. Käyttäytyminen muutokset ovat myös yhteinen vastaus kipua, mutta tiedonkeruu ja analyysit ovat usein aikaa vievää, varsinkin jos käytetään tutkimuksissa, jotka yleensä kestää useita viikkoja; kuten yleensä tapahtuu syövän tutkimuksiin. Tulkinta näitä tietoja voi myös olla ongelmallista, koska, kuten on jo kuvattu, on aina vaihtoehtoisia selityksiä mistään käyttäytymismuutoksia havaitaan. Yksi usein mainittu mahdollisuus on, että merkkejä työkyvyttömyyden jyrsijöiden voisi olla piilossa niin sopeutumisen vähentää todennäköisyyttä saalistus; vaikka tietääksemme tämä ei ole koskaan osoitettu yksiselitteisesti. Ainakin osittain voittaa aikarajoitus käytimme automatisoitu käyttäytymiseen rekisteröinti ohjelmisto (HomeCageScan; Clever Systems Inc., VA, USA (HCS)). Tämä tunnistaa erilaisia ​​( 20) hiiri käyttäytymistä verrattavissa olevalla tarkkuudella manuaaliseen analyysi koulutettu tarkkailija [27], [28]. Tässä tutkimuksessa vastakkain havaintoja hyperalgesia ja käyttäytymismuutoksia tuloksiin CPP testaus arvioida seurauksia virtsarakon syövän hyvinvointiin hiirillä; käsitteen soveltaminen triangulaation. Sikäli kuin tiedämme, ei ole aikaisempaa on yritetty arvioida CPP lähestymistapa tässä kuvatulla aikana kasvainten kehittymiseen; peräkkäisillä ilmastointi ja testaus sykliä. Pyrimme myös mitata (ainakin hypoteettisesti), onko tämä voisi olla hyödyllinen tapa seulonta ehdokas lääkkeitä syövän kipua ihmisissä. Löysimme kasvain hiirillä saanut vähemmän painoa, kehittyneet hyperalgesia ja osoitti käyttäytymisen muutoksia, jotka ajan sidoksissa tehostetun morfiini etsivät kasvaimia omaavilla hiirillä 7 päivän ajan ennen eutanasiaa. Olemme päätellä, että todennäköisin selitys näille muutoksille oli tuskaa. Jos ei johtuu kipu, ainakin tulokset osoittivat kielteisiä vaikutuksia hyvinvointiin, mahdollisesti myös

huonovointisuus

. Tavallisesti hiiret vain poistettava tutkimuksista tämän jälkeen, mikä osoittaa todennäköisesti tarvitaan loppupiste hienous tässä hiirimallissa virtsarakon syöpään. Meidän soveltamismenetelmä CPP testaus voisi myös olla potentiaalisesti käyttökelpoinen menetelmä tehokkuuden testaamiseksi kipulääkkeiden tarkoitettu syövän ja muita ehtoja, erityisesti ne, joissa kipu voi kärjistyä ajan.

Methods

Ethics Statement

Kaikki työt tehtiin noudattaen Animals (Scientific Procedures) Act 1986 oli asetettu paikallisen eettisen arvioinnin. Kokeet myös kiinni ohjeita laatima tutkimusta ja eettiset kysymykset International Association for Study of Pain (IASP). Kaikki toimenpiteet hyväksynyt UK Home Office (Project Licence PPL 60/4431).

Oppiaineet ja eläinten hoidossa

Kaikki hiiret nainen C3H /kana, punnitaan 25- 30 g toimituksen (Charles River Laboratories Inc., UK) ja oli vapaa pääsy kaupallinen pelleted ruokavalio (R North Kent Plastics, UK) vielä viikon ajan ennen tutkimusta. Puru ja lastuja käytettiin vuodevaatteet ja häkit täydennettiin ”Sizzle Nest”, haapa pureskella-lohko ja pahvi putki (B K Universal). Huoneen lämpötila pidettiin 21 ± 1 ° C: ssa 15-20 ilmanvaihtoa tunnissa alle 12 tunnin valon sykli (valot pois klo 19.00 h). Kaikki testit tehtiin klo 10 ja viisitoista.

Tiedonkeruu

tulokset 3 -tutkimukset erillistä ryhmää hiiriä kuvataan; (1) Hargreaves (nosiseptiivistä testaus) tutkimus, (2) Behaviour tutkimus ja (3) Loppukäsitelty paikanvalintatesti (CPP) testaus koostuu Pilot annoksena tutkinnan ja sitten tärkein tutkimus. Saadut tutkimuksiin 1 ja 2 olivat valmistelevassa tutkimuksista tekemät kollegojen pohjoisen Institute for Cancer Research (NiCr) käyttäen syngeenisiä MBT-2 (Mouse Virtsarakon kasvainten) peräisin olevia soluja C3H /kana /J-hiiriä (solut lahjoitti professori Michael O’Donnell (University of Iowa, Iowa City, IA, USA) ja Dr. William A. Larchian (EMH /Cleveland Clinic Eturauhasen Centre, Cleveland, OH, USA)). CPP tiedot saatiin hiirillä erityisesti saatiin testausta varten. Kollegamme tavoitteena oli; aluksi luonnehtia kasvun profiilia ortotooppisesti istutettu rakkokasvaimista (tutkimus 1) ja sitten tarkentaa implantin menetelmää (Tutkimus 2). Kuitenkin molemmat tutkimukset tarjosivat mahdollisuuden kerätä täydentäviä tietoja patologisia vaikutuksia (mahdollisesti mukaan lukien kipu), jotka auttaisivat suunnittelussa tärkein (CPP) tutkimus; mikä vähentää eläinten käyttöä niin alhaiseksi kuin mahdollista.

Hargreaves Study

Tämä oli pilottitutkimus sitoutunut ottamaan kasvuominaisuudet ortotooppisesti istutettu MBT-2-solut, jotka tiedottavat mahdollisesta suunnittelu CPP tutkimuksen. Ryhmäkoot määritettiin NiCr työtovereiden perustuu niiden tutkimus vaatimuksiin. Hiiret jaettiin satunnaisesti kolmeen ryhmään 5, joka tehtiin laparotomia varten ortotooppinen implantaatio 100 ui Dulbeccon fosfaattipuskuroitu suolaliuos (DPBS), tai sama tilavuus DPBS, joka sisältää 2 x 10

4 tai 2 x 10

5 MBT -2-soluja. Neljäs ryhmä 5 hiiret olivat anestesian vain valvontaa. Kahdeksan hiirillä, jotka tehtiin leikkaus valittiin satunnaisesti saamaan 5 mg /kg meloksikaamia (ihonalaisesti; t /c) lievittää leikkauksen jälkeisen kivun [27], kun taas loput saivat suolaliuosta (0,3 ml s /c; n = 7). Anestesia indusoitiin 5% isofluraanilla hapessa (5 l /min.) On Perspex kammiossa. Hiiret sitten antaa makaamaan selälleen on Vuoteenlämmitintä ylläpitää kehon lämpötila on 34,5 ja 37,5 ° C ja anestesia ylläpidettiin 1,5-2% isofluraanilla hapessa (500 ml /min.). Syvyys seurattiin tarkkailemalla hengityselinten hinnat ja arvioimalla säännöllisesti toe-hyppysellinen refleksit. Yksinkertainen silmä voidetta (Pliva Pharma Ltd., UK) käytettiin estämään sarveiskalvon kuivumisen. Leikkaus oli 0,5 cm keskiviivan viilto ihon ja lihasten päällä virtsarakon. Kun alttiiksi, 0,1 ml suolaliuosta tai sopivaa kasvainsolun suspensio injektoitiin lihaksensisäisesti virtsarakon seinämän insuliiniruiskul-. Vatsalihasten ja iho suljettiin erikseen käyttäen 5/0 polyglaktiini 910 ( ”Vicryl ’, Ethicon Ltd, Edinburgh, UK) ja kudos liima (” Nexaband ”, Abbott Laboratories, Chicago). Anestesia kesti noin 10 minuuttia.

Terminen poisvetoviiveet saatiin lähtötilanteessa ja 1 tunti ja 1 päivä (24 tuntia) leikkauksen jälkeen, ja sen jälkeen päivinä; 3, 7, 10, 14, 17, 21 ja 24 käyttäen jalkapohjien Test (malli 37370, Ugo Basile, Italia) menetelmällä Hargreaves [51]. Eläimet sijoitettiin akryyli kammioihin lasilattia ja totutetaan 10 minuutin ajan. Infrapuna-lämpölähde vuorotellen sovellettu puoliväliin jalkapohjan alueen kunkin takakäpälän (70% maksimi lämmitysteho, joka vastaa 253 ± 7 mW /cm

2; 30 toinen cut-off). Tämä tarjosi sopiva valikoima vasteen latenssit normaaleilla hiirillä (~between 3 ja 8 sekuntia). Kolme vastauksia saatiin kustakin takakäpälän vähintään välein 1 minuutin välillä ipsilateral tallenteita. Tiedot vasta saatu anestesian ohjaus hiirillä asti päivänä 3, kun he olivat tarpeen muualta. Kehon painot kirjattiin päivittäin kunnes päivän 4, ja sitten nosiseptiivisen testi päivinä. Koska kasvaimet olivat sisäisiä, kasvuvaihe arvioitiin päivittäin tunnustelemalla kokenut teknikko, joka arvostellaan kasvaimia 3 pisteen asteikolla; 1 (tuskin näkyvissä) 3 (havaita ilman käsittelyä). Nämä tarkastukset myös kirjaa toimintaa liittyy vatsakipua jyrsijöillä [21], [31] ja muita merkkejä sairauden kuten verivirtsaisuus, uupumus, nestehukka ja huono turkki ja kehon kunnossa.

Käyttäytyminen Tutkimus

käyttäytyminen tiedot kerättiin osana seurantatutkimuksen (taas ilman ylimääräistä eläintä käyttö) arvioimaan mahdollisesti tarkemman (ei-kirurgiset) menetelmä soluistutusryhmä [52]. Kollegamme tarkoituksena oli vahvistaa, jos kasvain siirteen voitaisiin parantaa tällä menetelmällä, kun taas me halusi arvioida pidemmällä aikavälillä vaikutuksia syövän kasvua käyttäytymiseen. Kuten aiemminkin, ryhmäkoot olivat ennalta määrätty; 20 hiirtä jaettiin DPBS ryhmään ja 20 kasvaimen ryhmään. Anestesia indusoitiin aikaisemmin kuvatulla vaan erissä 5 hiirillä käyttäen mittatilaustyönä avoimen maski kaasun jakelujärjestelmä. Implantti menettely on jo kuvattu, mutta lyhyesti, virtsarakon kunkin hiiri käsiksi 27 G lapsipotilailla kanyyli asetettiin virtsaputkeen. Virtsaa mitätöityy kevyesti supra-häpyluun paine ja imu, ja virtsarakon limakalvon ilmastoiduissa miedolla hapolla huuhtelu (50 ui 0,1 M HCI) 20 sekunnin ajan. Tämä oli myös imettiin pois ja neutraloitiin sitten 50 ui 0,1 M KOH, ja kolme DPBS pesua. Virtsarakko tyhjennettiin ennen herättää 50 ui 5 x 10

6 MBT-2-solut tai sama tilavuus DPBS ruiskun kautta sidottu häntää. Suurempi solujen pitoisuus oli ennakoiden tuntemattoman solun osa mitätöidään virtsaan elpymistä. Solut jätettiin

in-situ

30 minuuttia, minkä jälkeen hiiret laitettiin inkubaattoriin 37 ° C: ssa 20 minuutin ajan. Päivittäinen kasvaimen kehitystä seurattiin kuten edellä ja kehon painot olivat myös kirjataan päivittäin. Hiiriä kuvattiin erikseen 10 minuutin ajan käyttämällä videokameraa (Sony DCR-HC96, Sony, Japani) on sijoitettu jalustalle 30 cm edestä selvä ”1284’cages (35 × 20 × 14 cm; Techniplast, UK Ltd), joka sisälsi vain vuodevaatteet (Aspen sahanpuru). Menettely käyttäytymistä tiedonkeruuta aikaisemmin kuvatulla [28], paitsi että se oli toinen päivä ennen kasvaimen havaitsemiseen, ja sitten päivittäin. Kuvaaminen oli aina valoisan vaiheen aikana, mutta kellonaika kunkin hiiren kuvattiin satunnaistettiin sisällä kasvain ja kontrolliryhmiin.

Pakattu paikanvalintatesti Studies

CPP työ tehtiin 2 vaiheessa. Ensimmäinen oli pilottitutkimus tutkia kehittämiseen CPP morfiinin alle toistuvia ilmastointi ja testaus syklit, ja tunnistaa morfiiniannos tärkeimpien CPP tutkimus. Valittu annos olisi sellainen, joka tukee vain vaatimattoman parempana mutta säilytti riittävä kipua lievittäviä ominaisuuksia herättämään negatiivinen vahvistaminen kasvaimen hiirille. Numbers määritettiin käyttäen retrospektiivinen teho analyysi edellisestä morfiini CPP tuloksia monilla annosmäärät normaaleilla hiirillä (1 ja 5 mg /kg s /c) [53], että olisi myös herättämään merkittäviä analgeettiset vaikutukset [54], [55] . Otoskoot 8 tai 10 havaittiin jälkeenpäin saavuttaa 79%: n tai 91%: n teholla havaitsemaan merkittäviä CPP lääkkeeseen (3 tai 5 mg /kg morfiinia) ja lumelääkkeen-pariksi lokero. CPP laitteisto koostui musta (teräs sauva marmorilattiaisesta) ja valkoinen (teräsverkko marmorilattiaisesta) osastot on erotettu harmaa (kiinteä floored) alkavat kammiosta. Käytimme 4 samanlaista testaus- yksikköä (Med Associates, St Albans, VT, USA; Malli CPP-3013AT) varustettu automaattisesti ohjattu giljotiini ovet ja valot. Osastot sijoitetaan infrapuna-paneelit automaattisesti tallentaa osastoon viipymisajat ja liikkeet ja niiden välillä 3 lokeroa. Ensimmäinen oikeudenkäynti käytettiin määrittämään perustason osaston mieltymys kunkin eläimen. Tästä ne pantiin Keski (harmaa) alkaa kammiossa 1 minuutti ennen kääntämällä valot ja avaamalla giljotiini ovia. Etusijalle testaus aina suoritettiin välillä 10 am ja neljätoista. Suhteellinen aika vietettyyn mustavalkoinen osastojen yli myöhemmin 15 minuutin oikeudenkäyntiä laskettiin osuus koko testin ajan (ks CPP tietojen analysointi jakso). Hiiret jaettiin S + (suolaliuos tai morfiini) ilmastointi osastossa, jossa he viettivät suhteellisesti vähiten aikaa (eli niiden ei-ensisijainen kammio), mutta ei hiirillä osoittivat oikeassa suhteessa alkuperäiseen osastoon mieltymykset ylittää 0,6 (CPP analyysi osa yksityiskohdista etusija laskentamenetelmä). Suunnittelu sitten vastapainona niin, että alkuperäinen suhteellinen ryhmä etusija arviolta mahdollisimman lähellä 0,5 (eli yhtä monta jaettiin ryhmää kohti mustiin (B) tai valkoinen (W) S + kammiot). Tämän perusteella kahdeksan hiiret jaettiin kullekin 2 morfiini ryhmien ulottuu todennäköisen tehokas analgeettinen annos hinnat (1 tai 5 mg /kg s /c) ja edustava joukko 4 hiiret olivat suolaliuosta valvontaa. Kun olemme saavuttaneet vaiheessa syöpätestausluvut tiesimme perinteinen CPP lähestymistapa toistuvia ilmastointi kokeiden jälkeen yksi yksittäinen preferenssitestiarvioinnilla ei olisi asianmukaista. Tämä johtui siitä, jos kipu on tapahtunut; myös halusi kaapata sen puhkeamista. Ilmoitti tämän, kaikki CPP testaus (myös pilottitutkimus) koostui toistuvia 3 päivää lohkoja, jokaisen lohkon, jossa 2 päivää ilmastointi ennen huumeettomasta preferenssitestiarvioinnilla kukin seuraava päivä (kuvassa 1). Sillä pilottitutkimus 4 tarkastukset sai vain suolaliuosta (0,03 ml S /C) alla sekä S- ja S + olosuhteissa. Koska mahdollisia morfiini ”carry-over” iltapäivään S + tutkimuksissa oli välttämätöntä, että ajoneuvo (S-) injektiot annettiin aina aamulla ja S + (morfiini tai suolaliuosta) iltapäivällä. Morfiini saatiin morfiinisulfaattia liuosta (30 mg /ml; NHS Supplies, UK) ja laimennettiin sopivasti vedellä injektiota varten (WFI) annettavaksi ihon alle tilavuudessa 0,03 ml. Kaikki injektiot annettiin välittömästi ennen sijoittamista jaetuille B tai W lokero 45 minuutin Vakioimisajan kanssa giljotiini ovet kiinni. Hiiret palautettiin kotiin-häkeissä välittömästi kunkin ilmastointi istunnossa. Neljä peräkkäistä etusija testit tehtiin varten pilottitutkimus (4 koekappaleiden, kuva 1) tarkasti seuraavaa menetelmää käytetään määrittämään alkuperäisen osaston etusija.

Peräkkäiset lohkot olivat kukin kaksi ehdollistamispäivinä jossa hiiret koki aamulla S- (suolaliuos) ja sitten iltapäivällä S + (morfiini tai suolaliuosta) hoitoja ja rajattiin 45 minuutin mustan tai valkoisen kammioon. Kolmantena päivänä kunkin lohkon oli lääkkeettömän preferenssitestiarvioinnilla, ja 3 päivän toistettiin kunnes eutanasiaa.

Tärkein CPP Tutkimus alkoi toistaa alkuperäisen etusija testaus. Kukin hiiri osoitettiin B tai W osastoon myöhemmin S- /S + ilmastointi aikaisemmin kuvatulla tavalla (tasapainottamisen numerot aluksi mieluummin B tai W osastoon poikki ohjaus ja kasvain ryhmiä). Kuten aiemmin, hiiret jaettiin niiden alun perin ei-ensisijainen osastoon niin pitkälle kuin mahdollista. Kasvaimen hiiriin jälleen istutettiin virtsaputken kautta 50 ul DPBS: llä, joka sisälsi 5 x 10

6 MBT-2-solut. Kolmekymmentä hiiriin ortotooppisesti istutettiin kasvainsoluista ja kymmenestä oli suolaliuosta valvontaa. Nämä luvut ilmoitettiin meidän aikaisemmat havainnot lukumäärästä siirteen häiriöitä, virtsaputken istutusta. Suunnittelimme tasapainottaa suunnittelun (ja edelleen conserve eläinten käyttö) luovuttamalla tällaisia ​​vikoja hallita ryhmiä, mutta vain jos ei olisi kosketeltavissa olevat tai muita merkkejä kasvaimen kehittymisen jälkeen 21 päivää. Kasvainten puuttuminen vahvistettiin myös

post mortem.

Kun kliiniset tarkastukset vahvistivat kasvaimen kasvua, kukin hiiri alkoi CPP ilmastointi ja hoito sovitetun ei ollut kasvainta ohjaus osallistui tutkimukseen samanaikaisesti. 3 päivää sarjaa ilmastointi ja koejaksot sitten jatketaan, kunnes hiiret tapettiin (katso osio päätepisteen määritys). Koeryhmät siis muodostivat 2 (Drug) x 2 (hoito) faktorianalyysimallin että yhdistetyt conditioning morfiinia tai 0,9% Saline kasvainten tai ei-kasvain hiirillä. Valitsimme välissä annos morfiinia (2 mg /kg s /c) Päätutkimuksen perustuu havaintoihin pilottitutkimus. Pääasiassa CPP tutkimuksessa etusija testit olivat myös 45 sijasta 15 minuuttia, mutta metodologia oli muuten sama kuin käytetyn pilottitutkimus. Aikarajoitusten vuoksi ja mahdolliset ymmälle sijoitus muihin uusiin olosuhteisiin (käytännössä muut ”paikoissa”), käyttäytyminen ja hyperalgesia arviointeja ei tehtäisi, koska CPP tutkimuksen edetessä. Kuitenkin vaikutus myöhäisen vaiheen kipulääkitystä käyttäytymiseen arvioitiin mahdollisena hienostuneisuus vaihtoehto. Tämä tarkoitti, että eutanasiaa päivinä hiiriä kuvattiin 20 minuuttia ennen ja jälkeen injektion ilmastointi annos morfiinia (2 mg /kg s /c) ja samanlaiset tallennukset suoritettiin yhtä monta valvonnan viimeisenä päivänä tutkimuksessa.

End-pisteen määritys

kliiniset tarkastukset tehtiin kaikissa tutkimuksissa sen määrittämiseksi, jolla on kasvain tarvitaan peruutetaan. Nämä olivat mukaisesti julkaistujen ohjeiden [10], [11] sekä neuvoja erittäin kokenut eläinten hoitohenkilökunnan. Eutanasia oli väistämätön kerran eläimillä oli suuri palpoitavissa kasvain tai yli 15% kehon painon, ja jos jompikumpi näistä samaan aikaan merkittäviä hematuria (merkitty veren värjätään turkista ja /tai vuodevaatteet). Kaikki hiiret mukaan lukien tarkastukset tehtiin tunnustelu. Ne hillitty tavalla, joka on tavallista intraperitoneaalisesti. Rakko alue oli sitten varovasti tunnustellaan peukalon ja etusormen, mutta riittävällä paineella määrittämään varhaisin aika puhkeamista kasvaimen kehitystä mahdollisimman luotettavasti.

Data Analysis

Hargreaves tutkimus.

vastauksena latenssit oli aluksi samanlainen vasemman ja oikean takajalan-tassut, kaikki arvot laskettiin keskiarvot laskemiseksi yleinen keskimääräinen vaste latenssi kullakin tallennusaika. Tiedot täyttäneet vaatimuksia muuttujien analyysi niin tutkittiin käyttämällä toistuvia ANOVA kanssa ”Time” (10 tasoa) ja ”Group” (4 tasoa; 2 x kasvaimen; 1 × lumelääkettä ja anestesia ainoastaan) sisällä ja välillä-koehenkilön kertoimilla .

Post-hoc

yksilön aikaa ja ryhmä vertailut tehtiin ja todennäköisyys tasolla mukautettava (

Bonferronin

). Kehon painon muutokset olivat myös laskettiin muutos lähtötasosta ja samalla tilastollisia menetelmiä sovelletaan. Selkeyden, paino muutokset kuvataan absoluuttisina arvoina kussakin ajankohdassa. Puuttumisen vuoksi nosiseptiivisten dataa ei-leikkauksen ohjaus hiirillä päivä 3 ja ruumiinpaino jälkeen päivä 4 analyysien seuraavat nämä ajat olivat leikkauksen vain ryhmille. Lopuksi vaikutukset ennen leikkausta meloksikaamin tutkittiin vertaamalla perusvasteeseen latenssit 1 tunnin kohdalla, että ANOVA; mutta ”esikäsittelyn” (meloksikaami tai suolaliuosta) kuin välissä kohteen kerroin (n = 7 (suolaliuos) versus n = 8 (meloksikaami)).

Käyttäytyminen tutkimus.

Käyttäytyminen data prosessoitiin käyttäen HCS automatisoitua analyysin ohjelmisto. Toimenpiteet käytettiin kulkema kokonaismatka ja viisi käyttäytymisen luokkaa, joissa eri elementtejä 20 yksilön käyttäytymistä järjestelmän tunnustettu. Nämä olivat: 1) kasvatus (käsittäen ”Rear Up” (sekä osittainen ja täysi bipedal laajennus) vastavuoroinen toiminta ”Come Down”); 2) Aktiivinen käyttäytymistä (kuten kävely, juoksu, hyppääminen ja kiipeily); 3) Vatsan trimmaus, ja 5) Lepo (aktiivinen aikoja). Me tiivistää esiintymät käyttäytymistä kussakin luokassa suhteellinen suuruus luokan elementtejä oli riittävän yhtenäinen. esim.