Krooninen sairaus

tiivistelmä

Korkea solupinnan GnRH-reseptorin (GnRH-R) tasojen on osoitettu olevan merkittävä vaikutus laajuudesta GnRH-agonistin välittämä kasvaimen kasvun estäminen. Kyky GnRH-agonistin leuproreliiniasetaatti (LA) indusoimaan transkription jälkeinen ylössäätely GnRH-R-solukalvon androgen-herkkien (LNCaP) ja -insensitive (PC-3) eturauhassyöpä (PCa) solut on aikaisemmin osoitettiin Western blottauksella. Täällä suoritimme yhden molekyylin voima spektroskopialla käyttämällä Atomic Force Microscopy (AFM), joka on osoittautunut tehokas työkalu mahdollistaa tutkinta elävän solun pinnan biologiset ominaisuudet, kuten toistaiseksi epäselvä GnRH-agonisti /reseptorin vuorovaikutus. Siten hormoni-herkkä PC-3-solut, me tunnettu vahvuus LA-reseptoriin sitoutumisen, ja määrä ja jakautuminen toiminnallisen reseptorin molekyylien solun pinnalla. Vaikutus pitkä ja jatkuvaa hoitoa (enintään 30 päivää) kanssa agonistin (10

-11 ja 10

-6 M) on samat parametrit tutkittiin myös. GnRH-R havaittiin kasvua saavuttaen maksimi (-80%) 30 päivän kuluttua hoidon suurimmalla annoksella LA (10

-6 M). Analogisen aiheuttama lisäys GnRH-R osoitettiin myös Western-blottauksella. Lisäksi kaksi eri reseptoria sitovat vahvuuksia havaittiin AFM, mikä viittaa siihen, että on olemassa kaksi GnRH-R luokkiin. Homogeeninen jakautuminen sitoutumattomia tapahtumien on löydetty käsittelemättömien ja käsiteltyjen PC-3 solujen pinnalla. Pysyminen korkeana reseptorin tasoilla kalvon nämä elävät solut voivat oikeuttaa ylläpitoa vastaus LA myös androgeenin penseä PCa. Lisäksi määritettäessä ligandi /reseptori sidoslujuus voisi valottaa huonosti jos LA /GnRH-R vuorovaikutus ja /tai rakenteellisten /kemiallinen agonisti optimointeja.

Citation: Lama G, Papi M, Angelucci C, Maulucci G, Sica G, De Spirito M (2013) leuproreliiniasetaatti pitkäkestoiseen vaikutukset GnRH reseptorit eturauhassyöpäsolujen: Atomic Force Microscopy Study of Agonisti /reseptorivuorovaikutuksesta. PLoS ONE 8 (1): e52530. doi: 10,1371 /journal.pone.0052530

Editor: Antimo Migliaccio, II Università di Napoli, Italia

vastaanotettu: 29 joulukuu 2011; Hyväksytty: 19 marraskuu 2012; Julkaistu: 9. tammikuuta 2013

Copyright: © 2013 Lama et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Takeda Italia Farmaceutici SpA osittain tukenut tätä työtä. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen. Ei ylimääräistä ulkoista rahoitusta saatiin tähän tutkimukseen.

Kilpailevat edut: vuonna 2010, Takeda Italia Farmaceutici SpA antoi kirjoittajat vapaaehtoinen lahjoitus tukea tieteellistä tutkimusta niiden Institute, joka ei suoraan liity tähän työhön. Kirjoittajat osoittivat yrityksen nimi oikeudenmukaisuus. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja. Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, ettei kilpailevia etuja olemassa.

Johdanto

gonadotropiinia vapauttavan hormonin (GnRH), dekapeptidissä erittyy sykkeisesti hypotalamuksen hermosolujen ohjaa gonadotropiinin synteesin ja vapautumisen aktivoimalla reseptorit (tyypin I GnRH-R) ekspressoituu anteriorisen aivolisäkkeen soluista. Säätely alaspäin ja siedätyshoito näiden hypophyseal reseptoreihin jatkuvalla GnRH agonistinen analogeja ovat perustelut kliinisen käytön näiden hormonien terapiassa hormonitoimintaa syöpäsairauksista, koska se johtaa sukurauhasten steroidien tukahduttaminen [1] – [3]. Havainto GnRH /GnRH-R ilmentyminen näissä kasvaimissa, sekä pahanlaatuisissa kudoksissa [4] – [7], esitetään mahdollisuus solujen extrapituitary kudosten vaikuttaa suoraan GnRH-analogit. Eri tutkimukset osoittivat inhiboivaa vaikutusta GnRH-agonistien kasvuun eri kasvaimia, mukaan lukien eturauhassyöpä (PCa) soluihin [6], [8] – [14]. Kuitenkin, jotkut kirjoittajat raportoitu, että GnRH-agonistit ovat tehottomia, kun niitä käytetään yksin, kun vastapainona tai jopa tukahduttaa hormoneja tai kasvutekijä stimuloi soluproliferaatiota [15] – [19]. Lisäksi ne osoittivat, että nämä yhdisteet kykenevät moduloimaan PSA ilmentymisen sekä useiden geenien ekspression /proteiineja säädellään kasvua ja erilaistumista, apoptoosia tai solujen /solun tarttumisen [20] – [23]. Viime aikoina vaikutukset GnRH agonistianalogia leuproreliiniasetaatti (LA) ilmenemistä koskevat GnRH-R tutkittiin Western blottauksella kahdessa ihmisen PCa solulinjoissa: androgeeni-herkkä, hyvin erilaistunut ja alhainen invasiivisia LNCaP ja androgeenin -insensitive, huonosti eriytetty ja erittäin invasiivisia PC-3-solujen [24]. Näissä kaksi mallia, analoginen sekä alhaisissa että korkeissa pitoisuuksissa on tehokas indusoimaan transkription jälkeinen tehostaminen reseptorin ekspression solukalvon tasolla, kun 4, 6 ja 12 päivää jatkuvan hoidon.

kasvu reseptori saatavuudesta solun pinnalla voisi olla asianmukainen terapeuttinen kysymys, koska se voi olla perusteltua ylläpidosta vastaus -agonistihoidosta [25]. Lisäksi se voi sallia uusien terapeuttisten strategioiden, mikä on erityisen tärkeää niiden kasvainten, jotka joko eivät reagoi tai kehittää resistenssin hormonaalisen hoidon. Itse asiassa, vaikka se on kipeästi vaikea ennustaa PCA solun käyttäytymistä

in vivo

, on oletettavaa, että myös hormoni-penseä PCA agonistin anto voi tarjota hyödyllisen tuloksen johtuu myös suora vaikutus .

Tässä paperi, teimme yksi molekyyli voima spektroskopia avulla Atomic Force Microscopy (AFM), jonka tavoitteena on luonteenomaiset vahvuus LA-reseptoriin sitoutumisen, ja sen määrä ja jakauma toiminnallisen reseptorin molekyylejä androgeenisäädellyn penseä PC-3 solujen pinnalla. Olemme myös osoittaneet vaikutusta pitkän ja jatkuvassa hoidossa, jossa agonisti on samat parametrit. AFM todellakin mahdollistaa havaitsemiseksi dynaamisia muutoksia mekaanisten ominaisuuksien elävän solun pinnan [26], [27], sekä mittauksia ilmassa tai nesteeseen unstained ja päällystämättömän biologisten näytteiden valvotuissa ympäristöissä ja nanomittakaavan päätöslauselmassa [28] – [31], ilman vaatimusta mitään erityistä hoitoa, joka voi johtaa solun tuhoutumiseen tai muuttamista. Lisäksi yksi molekyyli voima spektroskopia tarjoaa ainutlaatuisen mahdollisuuden havaita molekyylien tunnustamista yksittäisten ligandien ja reseptorien. Koska pysyminen korkeana reseptorin tasot solukalvon jälkeen suhteellisen pitkä ja jatkuva hoito GnRH-agonistia voidaan parantaa tehoa LA androgeeni-penseä PCa, tutkimme vaikutus agonistin alhaisissa ja suurina pitoisuuksina PC-3-solujen enintään 30 päivää. Kiehtova tietoa toistaiseksi epäselvä GnRH-agonisti-reseptorin vuorovaikutus voi johtua tutkimuksen voimaa johon tällainen sitoutuminen tapahtuu ja rakenteellisten /kemiallinen optimointeja analogisen.

Materiaalit ja menetelmät

Cell linjat ja viljelyolosuhteet

ihmisen hormoni-herkkä PC-3-solujen [32] oli ystävällisesti lahjoittanut prof F. Labrie (Laval University, Quebec, Kanada). Soluja viljeltiin rutiininomaisesti 25-cm

2 soluviljelypullot Dulbeccon modifioidussa Eaglen väliaineessa (DMEM, Euroclone SpA, Milano, Italia), johon oli lisätty 5% naudan sikiön seerumia (FBS, Euroclone), antibiooteilla (100 IU /ml penisilliini, 100 ug /ml streptomysiiniä, Euroclone), 10 mM Hepes-puskuriliuosta (Euroclone), 1 mM nat- piruvate (Euroclone) ja 2 mM L-glutamiinia (Euroclone).

ihmisen alkion munuaissoluja (HEK293- ) eivät ilmennä mitään endogeenisen GnRH-R oli ystävällisesti professori RP Millar (Medical Research Council Human Reproductive Sciences Unit, kuningattaren Medical Research Institute, Edinburgh, UK), joka on saatu niitä American Type Tissue Culture Collection. HEK293 pysyvästi transfektoitujen solujen GnRH-R (HEK293

[SCL60]) olivat lahja professori R. P. Millar ja syntyi hänen laboratoriossa [33]. HEK293 ja HEK293

[SCL60] soluja käytettiin negatiivisena ja positiivisena kontrollina GnRH-R ilme, vastaavasti. Soluja viljeltiin DMEM: ssä, jota oli täydennetty 10% FBS: ää, antibiootteja (100 IU /ml penisilliiniä, 100 ug /ml streptomysiiniä), 10 mM Hepes-puskuriliuosta, 1 mM natrium- piruvate ja 4 mM L-glutamiinia.

kaikki solulinjat inkuboitiin kostutetussa ilmakehässä, jossa 5% CO

2-95% ilmaa 37 ° C: ssa.

Cell hoitoja

solut siirrostettiin tiheydellä 25000 solua /ml standardin viljelyalustassa 40 mm TPP astiat (Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Sveitsi). Kun he kiinni kulttuuriin levyjen (24 h), väliaine uudistettiin DMEM täydennetty 5% puuhiilikäsitelty FBS (CH-FBS) ja 10

-6 M tai 10

-11 M LA ( ystävällisesti lahjoittanut Takeda Pharmaceutical Company Limited, Osaka, Japani).

elatusaine vaihdettiin joka 48. tunti, kun taas LA lisättiin päivittäin viljelmiin. PC-3-solut altistettiin analogisen 6, 12, 18, 24 ja 30 päivää.

välein kuuden päivän solut trypsinoitiin, ympättiin (25000 solua /ml) suoraan 40-mm TPP ruokia ja , kun ne kiinni viljelymaljoilta, käsiteltiin kuten edellä on kuvattu vielä 6 päivän ajan. Lopussa kunkin hoidon aikana, solut analysoitiin AFM. Kaikissa kokeissa, ohjaus viljelmiä rinnakkain.

Atomic Force Microscopy (AFM) B

Kaikki mittaukset suoritettiin käyttäen atomivoimamikroskooppi

Nanowizard II

( JPK Instruments, Berliini, Saksa) yhdistettynä optisella mikroskoopilla

Axio Tarkkaile

(Zeiss, Oberkochen, Saksa). Kaikki yritysostot täyttyivät PBS-liuosta (pH = 7,4), alle kontrolloidussa lämpötilassa 37 ° C.

AFM Probe valmistelu

Tutkiakseen erityisiä vuorovaikutuksia LA ja GnRH- R pinnalla PC-3-solut, analogisen molekyylit immobilisoitiin AFM vihjeitä. Suorakulmainen pehmeä piinitridin microcantilevers kanssa UltraSharp kartiomainen vihjeitä, jonka säde on ~ 10 nm päällystetty molemmilta puolilta kullalla (CSC16, MicroMash, San Jose, CA) ja kalibroidaan ilmoittamat Papi et al. [34] käytettiin.

Ennen liikkumattomuudesta, microcantilevers pestiin kloroformiin poistamiseksi öljyt ja brutto epäpuhtaudet ja sitten altistettiin 20 min UV-otsoni puhtaampaa poistamiseksi orgaanisten ja muut hapettuvat pinnan epäpuhtaudet.

analoginen molekyyli immobilisointitoimenpide, usein käytetty menetelmä kärki funktionalisoimalla ligandimolekyyli [35], perustuu käyttöön 8 nm pitkä taipuisa ristisitojalla (pyridyyli ditio-Polyetyleeniglykoli-sukkinimidyylipropionaatin, PDP -PEG-NHS, Polypure). Puhdas ulokkeen välittömästi upotettiin PDP-PEG-NHS /kloroformilla, liuos 3 h (linkkeri pitoisuus: 2 mg /ml), ja sitten, sen jälkeen kun kaksi huuhteluvaiheita kloroformiin ja yhdessä PBS: ssä, käsiteltiin pisara LA liuosta ( 2 mg /ml) yön yli.

jälkeen funktionalisointi, ulokkeet pestiin perusteellisesti kolme kertaa puskuriliuoksessa ja säilytettiin sitten 4 ° C: ssa steriileissä olosuhteissa edelleen käytettäväksi kokeissa. Varastointiaika oli aina 1 viikko. Kaikki merkittävät muutokset LA /GnRH-R yhteisvaikutuksia havaittu tänä aikana. Ennen niiden käyttöä, jousivakio kunkin ulokkeen kalibroitiin käyttäen termistä menetelmää [36].

Atomic Force Spectroscopy

Tutkitaan yhden molekyylivuorovaikutusten, dissosiaatiota prosessi on tip- sitoutuneen ligandi solun pinnan sitoutuneen reseptorin tutkittiin käyttämällä vetovoiman ligandi-reseptori-kompleksin, kunnes välinen sitoutuminen ligandin ja reseptorin hajosi. Vuorovaikutus voimat tip-sitoutuneen ligandit ja pinta immobilisoitu reseptoreihin mitattiin voimassa matkan jaksoissa. Kiinteällä asema, kärki lähestyttiin solun pinnalle ja sitten vedetty pois määrätyn aikavälin (0,5 s) ja taivutuksen ulokkeen havaittiin. Tämän jakson aikana, taipuminen ulokkeen, joka on verrannollinen voima, mitattiin jatkuvasti ja funktiona tip-pinta erottaminen (eli etäisyys). Kaksi edustavaa voima matkan käyrät on esitetty kuvassa. 1, kun ligandi /reseptori yhteisvaikutuksia ei havaittu (musta neliö) ja kun ligandi /reseptori vuorovaikutus havaitaan (punaiset ympyrät). Alussa kärjen pinnan lähestymistapaa, ulokkeen taipuma pysyy nollana. Kun kärki-pinta kosketukseen, ulokkeen taipuu ylöspäin, sopusoinnussa hylkimisvoiman joka kasvaa sisennys. Myöhemmät tip-pinta sulkeutuminen (Fig. 1) ensimmäinen johtaa rentoutumiseen ulokkeen taivutus kunnes vastenmielinen voima laskee nollaan. Tarkemman takaisinveto, jos vuorovaikutus ligandin ja reseptorin tapahtuu, ulokkeen asteittain taipuu alaspäin, mikä houkutteleva voima, joka nousee yhä kärjen pinta erottaminen (Fig. 1, punaiset ympyrät). Jokaisessa kokeessa kunakin ajankohtana, ~1000 voima-etäisyydet käyrät tehtiin.

kaksi tyypillistä voimaa matkan viivoiksi yhteisvaikutuksia ei havaittu (musta neliö) ja kun vuorovaikutukset havaitaan (punainen ympyrä). Sitoutumatonta tapahtuma (tai taitekohta) on korostettu avulla vihreää nuolta.

Western blot-analyysi

Plasmamembraanin fraktiolla valmistettiin 6-päivän viljelty PC-3 , HEK293 ja HEK293

[SCL60] soluja, protokollan mukaisesti raportoimat LIMONTA et al. [37]. Samaa menettelyä on käytetty PC-3-solut käsittelemättömiä tai niitä käsiteltiin LA (10

-6 M tai 10

-11 M) 6, 12, 18, 24 ja 30 päivää. Homogenisoitiin 10 mM Tris-HCl (pH 7,6), joka sisälsi 1 mM ditiotreitolia jäällä. Homogenaatteja sentrifugoitiin kaksi kertaa 10 minuuttia kukin 800

g

soluroskan poistamiseksi ja tuloksena supernatantit sentrifugoitiin 18000

g

pelletoimiseksi alas membraanifraktioiden. Pelletit liuotettiin RIPA-puskurissa [50 mM Tris-HCl (pH 7,7), 150 mM NaCl, 0,8% Triton X-100, 0,8% natriumdeoksikolaatti, 0,08% SDS, 10 mM EDTA, 100 uM Na

3Vo

4, 50 mM NaF, 0,3 mM PMSF, ja 5 mM jodietikkahappo]. Proteiininäytteet (100 ug /kaista) suoritettiin elektroforeesi 10% polyakryyliamidigeelillä pelkistävissä olosuhteissa. Sitten proteiinit elektroblotattiin päälle polyvinylideenidifluoridimembraanille (Immobilon P, Millipore, Bedford, MA, USA), joka oli koetettiin (yli yön, 4 ° C), jossa hiiren monoklonaalisella anti-GnRH-R-vasta-ainetta (Lab Vision Corporation, Fremont, CA, USA) (1:100) TBS, joka sisälsi 0,02% Tween 20: tä (TBS-T) ja 5% rasvatonta kuivamaitoa (estopuskuria). Sitten blotti peitetään HRP-leimattua sekundaarista vasta-ainetta (Vector, Burlingame, CA, USA; 1:5,000) 40 min estopuskurissa huoneenlämpötilassa. Proteiinin vyöhykkeet havaittiin käyttäen vahvistettua kemiluminesenssiä järjestelmä (ECL, Amersham, Buckinghamshire, UK) ja visualisoidaan Hyperfilm ECL (Amersham). Membraanit anti β-aktiini mAb (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA; 1:10,000) sisäisenä kontrollina Proteiinilisäyksen. Signaalit kvantitoitiin densitometrisesti (Chemi Doc Documentation System /Määrä Yksi kvantitoimiseksi ohjelmisto, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA). Densitometristä yksikköä kiinnostavan proteiinin korjattiin sitten densitometrinen yksikköä β-aktiini. Erityinen proteiini /β-aktiini suhde kustakin käsitellystä näytteestä jaettiin saatu arvo kontrolloiduissa olosuhteissa saamiseksi kertainen muutos GnRH-R tasolla.

Tilastollinen

Data analysoitiin yksisuuntainen ANOVA seurasi Tukeyn monivertailutestillä. Arvoa p 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

GnRH-R kvantifiointi ja sitomiskyky käsittelemättömissä PC-3-solujen

Kuvassa. 2A edustaja jakelu sitoutumatonta tapahtumien (~1000 voima matkan jaksoa nopeudella 2 um /s) saatu käsittelemätön PC-3-solujen 6 päivän jälkeen näytetään. Bimodaalinen jakauma on ominaista läsnäolo kaksi hyvin selvää piikkiä, kukin talteen Gaussin sopivaksi. Ensimmäinen huippu (violetti viiva) havaittiin alhaisemmalla voima (f~37 PN), kun taas toinen (vihreä linja) suuremmalla voimalla (f~65 PN). Läsnäolo Näiden kahden piikin pinta viittaa siihen, että on olemassa kaksi erillistä vuorovaikutusta. Vuodesta bimodaalis-, yleinen sitoutumatonta todennäköisyys (eli todennäköisyys äänittää sitoutumatonta tapahtuma yhdestä voima-etäisyys käyrä) on noin 13% saatiin (Fig. 2A, sininen viiva). Bimodaalisen jakelu yhdessä sitoutumatonta todennäköisyydellä ei muuttunut jopa 30 päivää (tuloksia ei ole esitetty).

Distribution sitoutumatonta tapahtumista saadaan lastausnopeudeksi 2 um /s käsittelemättömissä (A) ja LA ( 10

-6 M) hoidetun (B) PC-3-solujen 30 päivän viljelyn ja HEK293

[SCL60] soluja (C). Taajuus vastaa tapahtumien määrä. Sekä käsittelemätöntä ja LA-käsitelty PC-3-solujen bimodaalinen jakauma (sininen viiva) on selvästi havaitsemisen ja määrän kahdella Gaussin käyrät (violetti ja vihreä katkoviivat). Ensimmäinen huippu havaittiin alhaisemmalla voimalla (f~37 PN), kun taas toinen on suurempi voima (f~65 pN). HEK293

[SCL60] soluja sitoutumatonta tapahtumia korkeammalla voimat ovat harvinaisempia.

arvioimiseksi määrän mahdollisten ei-spesifisten sitoutumatonta tapahtumia johtuen erityinen kärki funktionalisointiin menettely ja herkkyyttä lähestymistapamme teimme sama voima spektroskopia kokeita HEK293 ja HEK293

[SCL60] soluja. Kuten odotettua, villityypin HEK293-soluissa hyvin harvat kärki /näyte vuorovaikutukset havaittiin (~ 3%). Päinvastoin, että GnRH-R-ilmentäviä HEK293

[SCL60] solua useita kärki /näyte vuorovaikutukset havaittiin (~59%). Mielenkiintoista on, että nämä solut bimodaalinen jakauma sitoutumatonta voimien ei ollut ilmeinen, koska sitoutumatonta tapahtumien suuremmilla voimat (~65 PN) ovat selvästi vähemmän todennäköistä verrattuna useammin sitoutumatonta tapahtumia alemmilla voimia ~37 pN (Fig. 2C).

GnRH-R kvantifiointi ja sitomiskyky käsitellyissä PC-3-solujen

Nostamalla agonisti /GnRH-R sitoutumatonta tapahtumia havaittiin PC-3-solujen 30 päivän aikana altistuksen LA (10

-6 M tai 10

-11 M) (Fig. 3A). Lisälaitteen oli havaittavissa koko ajan välein tarkastelujaksolla (6

nnestä 30

päivänä; p 0,001) ja se saavutti enimmäisarvo -80% verrattuna kontrolliin 30 päivän kuluttua hoidon suurimman annoksen analogisten. Tilastollisesti merkittävä ero oli aina löydy vaikutus laukaisee kaksi lääkeainepitoisuudet, korkein annos on enemmän tehokkaita edistämään kasvua.

(A) histogrammit LA /GnRH-R sitoutumatonta tapahtumia LA- käsitelty PC-3-soluja. Kussakin mittauksessa suoritetaan joka 6 päivää, laskenta on normalisoitu saatu käsittelemättömillä soluilla (kontrolli) asetetaan 1. Sarakkeet, tarkoittaa; baareja, SD. * P 0,001

vs

ohjaus,

• p 0,001

vs

10

-6 M LA (yksisuuntainen ANOVA ja Tukeyn monivertailu testeissä). (B) Modelling of GnRH-R korko ilme. Määrä sitoutumatonta tapahtumien havaittu PC-3-solut käsiteltiin 10

-6 M LA (sininen ruutu) tai 10

-11 M LA (punaiset neliöt) normalisoitiin määrä sitoutumatonta tapahtumista käsittelemättömien solujen ( ohjaus) on 1. Gompertz käyrä sovitettiin sekä kokeelliset tiedot (sininen tai punainen katkoviivat). GnRH-R nousu hinnat olivat selvästi erilaiset [(9,3 ± 0,1) päivä

-1 10

-6 M LA ja (6,1 ± 0,1) päivä

-1 10

-11 M LA], mutta yleensä samaan arvoon (1,9 ± 0,1) ja pitkät ajat (yli 30

päivänä). Tiedot annetaan keskiarvona ± SD kahdesta toisistaan ​​riippumattomasta kokeesta.

Sama bimodaalis- (yksi pick at f~37 pN ja toinen f~65 PN) havaittiin käsittelemättömissä PC-3-solut oli havaittu LA-käsitellyissä soluissa ajan (alkaen 6

nnestä 30

päivänä), riippumatta niiden hoitotoimet soluihin. Kuviossa. 2B, edustaja jakauma sitoutumattomia tapahtumista saadaan nopeudella 2 um /s PC-3-solut käsiteltiin 30 päivän ajan 10

-6 M LA on kuvitettu. Sininen käyrä osoittaa bimodaalinen jakauma sitoutumattomia tapahtumien ja yleisen sitoutumatonta todennäköisyys noin 22%.

Modelling of GnRH-R korko ilme PC-3-solujen

valaista erityisen dynaamisen kuvataan kasvu alttiina reseptorit, vertasimme eri määrä reseptorien saatu hoidon aikana on kaksi analogista käytetyt pitoisuudet (Fig. 3B). Kasvu hinnat olivat selvästi erilaisia, mutta yleensä samaan arvoon pitkiä aikoja (yli 30

päivänä). Tämä ongelma voidaan kytkeä rinnan luokkaa kuin kasvainsoluissa, joissa niiden kasvua rajoittaa rajallinen tila, jossa solut rajoittuvat ja ravinteiden saatavuuden, kuten mallinnetaan Gompertz käyrä [38]: missä X (t) edustaa numero GnRH-R, X (0) reseptorin numero aloituskohdassa havainnon aikaa (tässä normalisoitu yksi), K enimmäismäärä reseptoreita, jotka voivat ilmentyä solun pinnalla ja ai jatkuvasti kuvaavat kasvu määrä GnRH-R .

kuviossa 3B parhaiten sopivan kaartaa kokeellisia saadut PC-3-solut altistettiin 10

-6 M (punainen viiva) tai 10

-11 M (sininen viiva) LA. Molemmissa tapauksissa merkittävä laatu sovi mahdollistaa elpyminen reseptorin lisäys korko ja tasanne arvoja. Ylätasanko arvo (K = 1,9 ± 0,1) oli sama molemmissa LA käytetyillä pitoisuuksilla. Koska K oli asetettu 1 käsittelemättömän näytteen, tasanne saatu arvo ilmoittaa, että LA-käsitelty PC-3-solujen reseptorin määrä voi nousta jopa 90% verrattuna käsittelemättömiin soluihin, riippumatta agonistipitoisuuden käytetty. Toisaalta kasvu korko vaikutti voimakkaasti LA keskittyminen [α = (9,3 ± 0,1) päivä

-1 10

-6 M LA ja α = (6,1 ± 0,1) päivä

– 1 10

-11 M LA], jolloin suurempi pitoisuus, sitä nopeammin GnRH-R-ekspressioon.

Topographic jakautuminen sitoutumiskohtien

kaksiulotteisesta kartta sitoutumatonta tapahtumista suoritetaan yli solun pinnalla toimittaa selkeä visualisointi GnRH-R alueellinen jakautuminen (Fig. 4). Unbinding tapahtumista minä voiman 50 pN (vastaa ensimmäistä huippu bimodaalis- kuvassa. 2A) ovat edustettuina sininen, kun taas välillä 50-100 pN (joka vastaa toista huippu Fig. 2A) , punaisella. Maantieteellinen jakautuminen GnRH-R yli PC-3 solujen pinnalla näyttää homogeeninen. Hoidot kanssa agonisti ei vaikuttanut reseptorin alueellisen jakautumisen (Fig. 5) sekä aikavälein mutta nousi reseptorin tasolla. Harvoin oli joitakin klustereita havaittu (tuloksia ei ole esitetty).

(A) Edustava korkean resoluution kuva PC-3 solun pinta harkita reseptorin kartoitus. (B) Edustava LA /GnRH-R sitoutumatonta voima kartta saatu PC-3-solut käsiteltiin 30 päivän ajan 10

-6 M LA. Sininen edustaa sitoutumattomia tapahtumista minä voiman 50 pN kun taas punainen niille, jotka ovat voimassa alueella 50-100 pN.

homogeeninen jakautuminen reseptorimolekyylejä ei vaikuttanut hoitoon analogisella (10

-6 M) eikä se muutu kautta aikavälein. Sininen edustaa sitoutumattomia tapahtumista minä voiman 50 pN kun taas punainen niille, jotka ovat voimassa alueella 50-100 pN.

GnRH-R kvantifiointiin Western blot analyysi

Western blot-analyysi GnRH-R-ilmentäviä soluja (HEK293

[SCL60]) osoittivat, että vyöhyke noin 60 kDa: n, molekyylimassan tyypin I aivolisäkkeen reseptorin raportoitu kirjallisuudessa [39]. PC-3-solut osoittivat vähemmän vahva viiva samassa asemassa. Vain mitätön signaalia ei havaittu ei-transfek- HEK293-soluissa (kuvio. 6A).

(A) Western blot-analyysi GnRH-R: PC-3-solut, HEK293-solut (ei ilmentävät GnRH-R) ja HEK293

[SCL60]-soluja (transfektoitu stabiilisti GnRH-R) sen jälkeen, kun 6 päivää viljelyn. (B) Western-blotit osoittavat LA laukaisema tehostaminen GnRH-R PC-3-solujen käsitelty 6-30 päivää kanssa analogisen (10

-11 tai 10

-6 M). Edustavia blots kahdesta erillisestä kokeesta saatiin samanlaiset tulokset on esitetty. (C) Ryhmiteltyjä densitometrisellä data Western blot-analyysi GnRH-R. Intensiteetti signaalit kvantitoitiin densitometrinen skannaus ja normalisoitiin että β-aktiinin (jota käytetään latauskontrollina). Tiedot ovat arvojen välisen suhteen käsitellyn ja käsittelemättömän näytteen (kontrolli, asetetaan 1), ja ne esitetään keskiarvona ± SD 2 riippumattomassa kokeessa. * P 0,001

vs

ohjaus,

• p 0,001

vs

10

-6 M LA (yksisuuntainen ANOVA ja Tukeyn monivertailu testeissä).

PC-3-soluja, 6-30 päivää hoidon sekä LA pitoisuudet (10

-11 ja 10

-6 M) indusoi tilastollisesti merkittävää kasvua (70%: sta 110 %, p 0,001) reseptorin tasot (Fig. 6B ja 6C), joka tukee datan atomivoima spektroskopia. Vaikka korkeimman LA annos näytti olevan tehokkaita edistämään GnRH-R kasvu, tilastollista merkitsevyyttä ei aina saavutettu (Fig. 6C).

Keskustelu

suora extrapituitary vaikutukset GnRH-analogit voidaan pitää seurauksena monimutkainen mosaiikki molekyyli tapahtumia, jotka ovat välttämättä riippuvainen määrä GnRH-R-molekyylien saatavilla solun pinnalla ja aktivoitu signalointireitin, jotka molemmat eroavat eri kudoksissa [4], [40].

Scarce tietoa on saatavilla vaikutuksista GnRH-analogit on GnRH-R. Useimmat julkaistut tutkimukset vaikutuksista GnRH agonistien GnRH-R ilmaisu on suoritettu

in vitro

ja

in vivo

aivolisäkkeen malleja. Näissä tutkimuksissa havaitut vaikutukset näyttivät olevan tiukasti riippuvainen hallinnon komodaalisuudessa jossa lyhyen tai sykkivää altistuminen agonisti johti säätelyä reseptorin tasoilla taas jatkuva ja pitkäaikainen hoitoja määritettiin vähennys tai jättää ne ennallaan [41] – [43]. PCA, hyvin heterogeeninen tuloksia on raportoitu. Immunohistokemiallinen tutkimus kuvataan GnRH-R väheneminen PCa näytteissä potilailta, joille tehtiin 3 kuukauden pitkä neoadjuvant hormonihoidon leuprolidia ja antiandrogeeni bikalutamidi, verrattuna immunoreaktiivisuus havaittiin näytteissä hoitamattomista potilaista [44]. Tämä havainto johtui kirjoittajien sitoutumis- analogisen PCA soluihin. Myös DU-145 ksenosiirrettyjä kumppanuus-, agonisti-indusoidun lievää laskua GnRH-R tasot kuvattiin, kun taas mitään merkittäviä eroja havaittu reseptorin mRNA-tasojen [45]. Samanlaisia ​​tuloksia saatiin, kun PCa-solut ja fibroblastit, jotka on eristetty potilaiden näytteistä, viljeltiin yhdessä ja altistettiin leuprolidin [46]. Toisaalta, voimakas kasvu GnRH-R mRNA kuvattu rotan eturauhasen 28 päivän kuluttua hoidon goserelin [43]. Tässä yhteydessä havaitsimme Western-blottauksella että LA kykeni indusoimaan transkription jälkeinen ylössäätely kalvo GnRH-R jälkeen 4, 6 ja 12 päivää hoidon androgeenin erottelua, erittäin invasiivisia ja huonosti eriytetty PC-3-solujen [24 ].

Kun tavoitteena on saada käsityksen toiminnallisia ominaisuuksia GnRH-R alttiina solun pinnalla, ja siksi aktiivisesti agonisti-reseptorin signalointi, AFM lähestymistapa elävään PC-3-solut oli hyväksyttiin ensimmäistä kertaa tässä tutkimuksessa. Vaikutukset pitkä ja jatkuva hoito LA avainkysymyksiä kalvon GnRH-R (eli määrä sitoutumattomia tapahtumia, vahvuus analogisten-reseptoriin sitoutumisen ja reseptorin jakelu) tutkittiin.

Ilmaisemalla määrä ja vuorovaikutuksen voimakkuus, olemme osoittaneet kykyä hormonin ekspressoitumisen lisäämiseksi /saatavuus GnRH-R-PC-3-solujen pinnalla, kun sitä pidetään jatkuvasti annetaan soluihin, joiden suurin lisäys -80% 30 hoitopäivän korkeimmalla annoksella LA.

tässä yhteydessä olemme myös tutkineet kinetiikka GnRH-R altistuminen PC-3-solujen käsitelty korkean ja matalan agonistin pitoisuuksia. Kinetics analysoitiin sovittamalla Gompertz käyrä logistinen käyrä laajasti kuvata väestönkasvu useissa biologisessa järjestelmissä. Gompertz käyrä hyvin palauttaa ajasta riippuva lisäys GnRH-R-proteiiniin solun pinnalla. Tämän mallin mukaan, määrä ilmentymisen GnRH-R LA käsiteltyjä soluja riippuu agonistipitoisuuden käytetty, kun taas asymptoottinen arvo on riippumaton LA keskittymistä ja siihen liittyvien erityisten solun ominaisuudet ja kokeellinen kunnossa käyttää. Nämä todisteet, kun taas selvästi perustamisesta esiintyminen LA-laukaisi pitkäkestoisen säätelyä oman reseptorin solun pinnalla, mahdollistaa havaitsemisen enimmäismäärän reseptoreja että solu voi ilmaista. Tämä jälkimmäinen havainto mahdollistaa hienosäätöä annos /vaikutus-suhde muuttamalla LA keskittyminen. Mukaisesti edellä tulokset ovat tietoja immunoblot-analyysi kalvo GnRH-R suoritettiin PC-3-solujen käsitelty 6-30 päivää kanssa analoginen, joka selvästi osoitti LA teho asiakkuutta merkittävä säätelyä reseptorin, kuten aiemmin osoitettiin samaa tekniikkaa kunnes 12 päivää hoidon [24]. Western blot havainnot yhtyä AFM tiedot kuin korkein LA annos näytti olevan tehokkaampia edistämisessä GnRH-R kasvaa, vaikka tilastollista merkitsevyyttä ei aina saavutettu. Tämä saattaa johtua siitä, että olennaiset erot kahden menetelmän.

Mitä mekanismeja vastuussa analogisten aiheuttama reseptorin lisälaite, erilaisia ​​toiminnallisia parametreja voivat olla mukana määrää määrittäessään reseptorien saatavilla solukalvon. Aikaisemmat tutkimus koskien LA aiheuttama ylössäätely GnRH-R on PC-3 solujen pinnalla osoittaneet, että tällainen vaikutus esiintyi transkription jälkeisellä tasolla [24]. Näin ollen on ajateltavissa, että agonisti voi toimia lisäämällä käännös nopeudella reseptorin transkriptin ja /tai hidastamaan proteiinien hajoaminen. Perusteella kirjallisuudessa, on myös mahdollista spekuloida, että yksi mukana mekanismit voivat edustaa agonistin kyky edistää GnRH-R poistumisen Endoplasmakalvosto (ER) näin ollen suositaan reseptorin anterogradista kaupan sisällä solunsisäinen kuljetus rakkulat, solukalvoon. Tämä olisi yhdenmukainen sen havainnon kanssa, että muut seitsemän transmembraani- (7TM) reseptorit, kuten δ-opioidi- peptidi reseptoreita, jotka ovat laajasti tallennettu ER, lähetetään solun pinnalla vasteena aktivointi pieni alapopulaation membraanireseptorit [47 ]. Koska 7TM-reseptoreihin läpikäydä myös taaksepäin kuljetuksen solun pinnalta kautta endosomeihin, vaihtoehtoinen mahdollinen selitys on se, että GnRH-R-aktivaation voi estää reseptorin sisäistämisen, että tyypin I nisäkkään GnRH-R tiedetään esiintyvän hyvin hitaasti [48].