Krooninen sairaus

tiivistelmä

Piilevät ovat tärkeä luokka yksisoluisia leviä, jotka tuottavat bioaktiivisia monityydyttymättömien aldehydejä (PUAS), jotka aiheuttavat keskenmenoja tai epämuodostumia jälkeläisissä selkärangattomien altistuvat niille tiineyden. Tässä vertaamme vaikutukset PUAS 2-

trans

, 4-

trans

-decadienal (DD), 2-

trans

, 4-

trans

-octadienal (OD) ja 2-

trans

, 4-

trans

-heptadienal (HD) on adenokarsinooma solulinjoissa keuhkojen A549 ja paksusuolen COLO 205, ja normaali keuhko /brunssi epiteelin BEAS-2B solulinjassa. Käyttämällä elinkelpoisuuden MTT /trypaanisini määritykset, osoitamme, että PUAS on myrkyllinen vaikutus sekä A549 ja COLO 205 kasvainsoluihin mutta ei BEAS-2B normaalit solut. DD oli vahvin kolmesta PUAS testattu, kaikkina ajan välein harkittu, mutta HD oli yhtä vahva kuin DD 48 tunnin jälkeen. OD oli vähiten aktiivinen kolmen PUAS. Vaikutus kolmen PUAS oli hieman voimakkaampaa A549-soluja. Siksi tutkittiin kuoleman signalointireitin aktivoitu A549 osoittaa, että solut, joita käsiteltiin DD aktivoitu tuumorinekroositekijä-reseptorin 1 (TNFR1) ja Fas Associated Death Domain (FADD), joka johtaa necroptosis kautta kaspaasi-3 aktivoimatta selviytymisreittiin Receptor-vuorovaikutuksessa Protein ( LEPÄÄ RAUHASSA). TNFR1 /FADD /kaspaasi-reitin havaittiin myös OD, mutta vasta 48 tunnin kuluttua. Tämä oli ainoa PUA joka aktivoituu RIP, yhdenmukainen sen havainnon kanssa, että OD aiheuttaa vähemmän vahinkoa solun verrattuna DD ja HD. Sitä vastoin solut, joita käsiteltiin HD aktivoinut Fas /FADD /kaspaasi-reitin. Tämä on ensimmäinen raportti, joka PUAS aktivoida ulkoiset apoptoottisen koneiston toisin kuin muut syöpälääkkeet, jotka edistävät luontainen kuoleman polku, vaikuttamatta elinkelpoisuutta normaalien solujen samasta kudoksesta tyyppiä. Nämä havainnot ovat mielenkiintoisia seurauksia myös ekologiselta kannalta ottaen huomioon, että HD on yksi yleisimmistä PUAS tuottaman piilevät.

Citation: Sansone C, Braca A, Ercolesi E, Romano G, Palumbo A, Casotti R, et ai. (2014) Diatom-johdettujen monityydyttymättömien Aldehydit Aktivoi Cell Death in Human Cancer Cell Lines mutta ei normaaleissa soluissa. PLoS ONE 9 (7): e101220. doi: 10,1371 /journal.pone.0101220

Toimittaja: Srinivasa M. Srinivasula, IISER-TVM, Intia

vastaanotettu: 14 tammikuu 2014; Hyväksytty 4. kesäkuuta 2014; Julkaistu: 3. heinäkuuta 2014

Copyright: © 2014 Sansone et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ rahoittivat Stazione Zoologica Anton Dohrn ja Italian National toimintaohjeiden Project PON01_02093 Study uuden teknologian ja teknologiset alustat tuotannon kehittäminen vaikuttavien lääkeaineiden teollisuuden kiinnostusta ja etsiä uusia bioaktiivisten molekyylien luonnollisista lähteistä. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat vahvistavat, että toinen kirjoittaja Adrianna Ianora on PLoS One akateemisen toimittaja mutta että tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen PLoS One Pääkirjoitus politiikan ja kriteerit.

Johdanto

Piilevät ovat mikroskooppisia, yksisoluisia leviä, jotka edustavat hallitseva fotosynteesin organismien maailman valtamerten. Myönteisistä vaikutuksistaan ​​ruokana ruohonsyöjät haastoi yli kymmenen vuotta sitten, kun havaittiin, että jotkut piilevälajien tuottaa teratogeenisia yhdisteitä, kuten monityydyttymättömiä aldehydejä (PUAS) indusoivat abortteja, synnynnäisiä epämuodostumia, heikko kehitys ja korkea jälkeläisten kuolleisuus saalistushinnoittelu planktonic ja pohjaeläinten [ ,,,0],1] – [3]. PUAS ovat lopputuotteiden lipoksigenaasin /hydroperoksidi lyaasia metaboliareitti [4] vireille vahinkoa levien soluihin, kuten tapahtuu laiduntamalla petojen. Soluvaurioita aktivoi lipaasientsyymit jotka vapauttavat monityydyttymättömiä rasvahappoja (PUFA) alkaen solukalvojen, jotka välittömästi hapetetaan ja lohkaistaan ​​muutamassa sekunnissa muodostamiseksi PUAS ja lukuisia muita yhdisteitä kollektiivisesti kutsutaan oxylipins [4], [5]. Lukuisia toimintoja on ehdotettu PUAS kuten: Grazer puolustuksen [6], [7]; allelopathy [8], [9], solusta soluun signaloinnin [10], antibakteerinen aktiivisuus [11], [12], ja kukintoja [13], [14]. Siten sama sekundäärimetaboliitteja on useita toimintoja laiduntamasta puolustus signaali välittävien molekyylien useita planktonin vuorovaikutusta.

Ensimmäinen kuvattu meren piileviä by Miralto et al. [15], jotka osoittivat, että PUAS 2-

trans,

4-

cis

, 7-

cis

-decatrienal, 2-

trans

, 4-

trans

, 7-

cis

-decatrienal ja 2-

trans

, 4,

trans

-decadienal (DD) pidätettiin alkiokehitystä hankajalkaiset ja merisiilit, ja oli antiproliferatiivisia ja apoptoottista vaikutukset ihmisen adenokarsinooman Caco2 solulinjassa. Peräkkäin, sekä laboratorio- ja kenttätutkimukset ovat osoittaneet haitallinen vaikutus piilevän ruokavalion hankajalkainen Grazer lisääntymiskyvyn [6], [16] – [19]. PUAS voi olla eristetty aikana varhaismunasolun kehitystä ja välitetään emolle alkioon, tai se voi toimia suoraan alkioita. Vuoteen kumpi reitti, ajoitus lisääntymisen suhteen myrkyllisiä piilevien runsaus on merkittäviä seurauksia selkärangaton rekrytointi [6].

Samanlaisia ​​yhdisteitä tuotetaan korkeamman kukkivat kasvit, joiden uskotaan olevan keskeinen rooli kasvin puolustukseen koska ne toimivat kemiallisen attractors (esim feromoneja, pölyttäjien vetovoima) tai hälytys signaaleja vastaan ​​herbivore hyökkäys (esim tritrophic vuorovaikutusta) ja suojaava yhdisteet (antibakteerinen, haavan paranemiseen) [20]. Diatom oxylipins osoittavat myös korkean samankaltaisuutta haihtuvien orgaanisten yhdisteiden vapautettiin ruskolevät joita ehdotetaan olevan osallisena kemiallinen signalointi ja feromonia vetovoima välillä sukusoluja eri sukupuolta [20] ja ne näyttävät olevan välituotteita luontaisen immuniteetin [21].

PUA DD on parhaiten tutkittu metaboliitti tämän ryhmän ja on siten tullut malli aldehydi kokeellisiin tutkimuksiin vaikutuksista oxylipins meren eliöiden (tarkistetaan [1], [3]). Kuitenkin useat meri- piilevät on osoitettu tuottavan PUAS muuta kuin DD, kuten

Skeletonema marinoi

, kosmopoliitti kukinta muodostava piilevien joka tuottaa 2-

trans

, 4-

trans

-heptadienal (HD), 2-

trans

, 4-

trans

-octadienal (OD) ja 2-

trans

, 4-

trans

, 7-octatrienal (octatrienal) [22], [23]. Näistä yleisin on HD [13], [24]. Ceballos ja Ianora [25] kokeita testaamalla vaikutuksia DD, OD ja HD hankajalkainen munan kuoriutumisen onnistuminen osoittaa, että enää ketjun pituus PUAS, sitä voimakkaampi biologinen aktiivisuus näiden molekyylien, kuten myös vahvistanut [26] annetun bakteerit, levät, sienet, piikkinahkaisten, nilviäiset ja äyriäiset, ja [27] käyttäen merisiili munia. Ribalet et ai. [9] todettiin myös pitoisuudesta riippuvaa vähenemistä kasvuvauhti meren kasviplanktonin, jotka kuuluvat eri taksonomiseen ryhmään, altistuvat PUAS kanssa pitkäketjuisten aldehydit voimakkaampia vaikutuksia kasvuun kuin lyhyemmän ketjutettu aldehydejä.

Täällä vertaamme vaikutuksia eri PUAS, kuten DD, OD, ja HD keuhkojen adenokarsinooman A549, koolonadenokarsinooma johdettu metastaattinen askites COLO 205 solulinjaa, ja keuhko /brunssi normaali epiteelisolujen linja BEAS-2B. PUAS tiedetään aiheuttavan apoptoosia [15], [28] – [29], mutta aikaisemmassa tutkimuksessa [6] ne osoitettu saavan aikaan dramaattisia vaikutuksia vain lisääntyvät, erilaistumaton soluja. Siksi käytetään kahta erittäin aggressiivinen tuumorisolulinjat ymmärtämään paremmin reittejä mukana solukuoleman ja kunnolliseen arvioida hypoteettisen erityinen vaikutus proliferating solutyyppejä. Toisena keskeisenä tavoitteena oli verrata vaikutuksia DD, mallin PUA toksikologisissa kokeissa, mutta ei yleisin PUA läsnä meren kasviplanktonin (kyselyssä 51 meressä piilevät, DD oli vähiten havaittu PUA, [24]) kanssa yleisempiä piilevien PUAS HD ja OD. Nämä ovat todennäköisesti aiheuttaa salakavala (sensu [15]) antiproliferatiivisia vaikutuksia planktonic pyytäminen ruohonsyöjät

in situ

aikana luonnolliset piilevien kukinnat kuten raportoinut [3] ja sen viitteet.

materiaali ja menetelmät

Soluviljelmät ja hoito

A549 (ATCC CCL185) ihmisen keuhkon adenokarsinooma ja COLO 205 (ATCC CCL-222) koolonadenokarsinooma metastaattinen askites-johtuvat solulinjoja pidettiin DMEM ( Dulbeccon modifioitu Eaglen väliaine), johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia (FBS), 100 yksikköä ml

-1 penisilliiniä ja 100 ug ml:

-1 streptomysiiniä. Soluja inkuboitiin 5% CO

2 kostutetussa kammiossa 37 ° C: ssa kasvun. A549 ja COLO 205 soluja (2 x 10

4 solut hyvin

-1) ympättiin 24-kuoppalevylle ja pidettiin yön yli kiinnitys. Seuraavana päivänä elatusaine korvattiin tuoreella elatusaineella, jossa on kolme pitoisuudet (2, 5 ja 10 uM) kutakin kolmesta PUAS (DD, OD, ja HD, Sigma-Aldrich Inc., Milano, Italia) testattu; Solujen annettiin kasvaa 24, 48 ja 72 tuntia. Inkuboinnin jälkeen supernatantti poistettiin ja kiinnittyneet solut tutkittiin elinkelpoisuuden. A549-soluja käytetään proteiinin /RNA ja solusyklin analyysi 2 x 10

6 ympättiin petrimaljoille (90 mm) ja käsiteltiin yllä kuvatut.

erillisellä kokeella, A549-soluja (2 × 10

3-solujen hyvin 1) ympättiin 96-kuoppalevylle ja pidettiin yön yli kiinnitys. Seuraavana päivänä elatusaine korvattiin tuoreella elatusaineella, jossa on kolme pitoisuudet (2, 5 ja 10 uM) kutakin kolmesta PUAS (DD, OD, ja HD, Sigma-Aldrich Inc., Milano, Italia) testataan ja kaspaasi-3: estäjä (C

30H

41FN

4O

12, sc-3075, Santa Cruz) 9,7 uM; Solujen annettiin kasvaa 24, 48 ja 72 tuntia. Jälkeen aldehydi hoito, elävät solut arvioitiin, kuten on kuvattu alla. Beas-2B (ATCC CRL-9609) keuhko /brunssi normaalin epiteelin solulinjaa ylläpidettiin DMEM: ssä (Dulbeccon modifioitu Eaglen väliaine), johon oli lisätty 50% naudan sikiön seerumia (FBS), 100 yksikköä ml

-1 penisilliiniä ja 100 ug: ml

-1 streptomysiiniä. Soluja inkuboitiin 5% CO

2 kostutetussa kammiossa 37 ° C: ssa kasvun. BEAS-2B (2 x 10

3-solujen hyvin

-1) ympättiin 96-kuoppalevylle ja pidettiin yön yli kiinnitys. Seuraavana päivänä elatusaine korvattiin tuoreella elatusaineella, jossa on kolme pitoisuudet (2, 5 ja 10 uM) kutakin kolmesta PUAS (DD, OD, ja HD, Sigma-Aldrich Inc., Milano, Italia) testattu; Solujen annettiin kasvaa 24, 48 ja 72 tuntia. Inkuboinnin jälkeen supernatantti poistettiin ja kiinnittyneet solut tutkittiin elinkelpoisuuden.

Elinkykymääritykset

suoritettiin kahden tyyppisiä elinkelpoisuuden määritykset: MTT: n ja trypaanisini-määrityksellä. Olemme tässä valita merkittävimpiä saadut tiedot yhden tai muun tyyppinen koe ominaisuuksista riippuen käsiteltyjen solujen. Erityisesti normaalit solut (BEAS-2B), joka ei vaikuttanut PUAS hoito (ja siten ei ollut kuolleita soluja) tutkittiin MTT kolorimetristä taas A549 ja COLO 205 soluja värillinen trypaanisinisellä joka värjää vain kuolleita soluja. Lisäksi A549-soluja käsiteltiin PUAS läsnä kaspaasi-3-estäjällä tutkittiin myös MTT-määrityksellä voidaan arvioida inhibition toksisuutta.

trypaanisini, A549 ja COLO 205-solut (2 x 10

4 /kuoppa) siirrostettiin kuhunkin 24-kuoppaisen levyn ja pidettiin yön yli kiinnitystä varten, kun läsnä on Dulbeccon alustassa. Seuraavana päivänä elatusaine korvattiin tuoreella alustalla, joka sisälsi 0, 2, 5 tai 10 uM DD, OD tai HD. Käsiteltyjä soluja inkuboitiin 24, 48 ja 72 tuntia. Inkuboinnin jälkeen supernatantti kerättiin ja heitetään pois, kun taas kiinnittyneet solut käsiteltiin 0,4% trypan blue-liuoksella (Hyclone, Lot no: JRH27098) mukaan Trypan Blue Dye Exclusion määritys [30]. Sen jälkeen kun värjäys, solut irrotettiin trypsiinillä, sentrifugoitiin, ja pelletti pestiin fosfaattipuskuri suolaliuosta (PBS); 10 ui tätä liuosta pantiin Burker laskee kammioon. Blue-solut (osoittaa kuolleet solut) laskettiin kunkin alueen kontrolleihin verrattuna laskea% solujen elävyyttä.

MTT, A549 ja BEAS2B solut ympättiin 96-kuoppalevylle (2 x 10

3 solua /kuoppa), hoidon jälkeen kertaa, ja inkuboitiin 10 ui (10 mg /ml) MTT (3- [4,5-metyylitiatsol-2-yyli] -2,5-difenyyli-tetrazoliumbromide, Applichem A2231). Määrä elinkelpoisia soluja, kun aldehydin (DD, OD, HD) hoitoon arvioitiin spektrofotometrisesti MTT-määrityksellä mukaan valmistajan protokollan ja lasketaan suhde keskimääräisen absorbanssin (λ = 570 nm) näytteen ja keskimääräinen absorbanssi valvonta- ja ilmaistuna prosentuaalinen elinkelpoisuus.

akridiiniorans- /etidiumbromidilla kaksinkertainen värjäys testi morfologinen analyysi

Ohjaus ja käsitelty kiinnittyneet A549-solut trypsinoitiin ja kerättiin sentrifugoimalla 500 g: llä 5 minuutin ajan. Solut pestiin 3 x PBS: llä ja solujen morfologian muutoksiin ei havaittu akridiini oranssi /etidiumbromidivärjäyksellä testi. Solut suspendoitiin uudelleen 25 ul: aan väriainetta (100 ug ml

-1 akridiinioranssilla ja 100 ug ml:

-1 etidiumbromidia valmistettu PBS: ään ja sekoitettiin varovasti). 10 ui värjättyä solua asetettiin mikroskoopin objektilasille, peitetään peitelasi ja tutkitaan -konfokaalimikroskoopilla (Zeiss LSM510, laser 488 kanssa LP505 suodatin vihreän fluoresenssin; laser 543 LP 560 suodatin punainen fluoresenssi) 25 x tavoite. Akridiinioranssin tunkeutuu sekä elävät ja kuolleet solut emittoivat vihreää fluoresenssia kun interkaloituina normaaliin kaksijuosteista nukleiinihapot (DNA) ja punaisen fluoresenssin sitoutuessaan rikkinäistä yksijuosteisia nukleiinihappoja. Etidiumbromidi tunkeutuu ainoastaan ​​kuolleiden solujen vaurioitunut kalvot säteilevät punaista fluoresenssia. Neljä solutyyppejä tunnistettiin mukaan [31] perusteella Fluoresenssiemission morfologiset näkökohta kromatiinin tiivistyminen värjätään ytimet: (1) elinkelpoisten solujen tasaisen kirkkaan vihreä ytimet ja järjestäytynyt rakenne (valvonta); (2) varhainen apoptoottisten solujen epäsäännöllisten vihreä ytimet tiivistyneen kromatiinin ja apoptoottisten elinten värjätään punaisella, (3) myöhäinen apoptoottisten solujen kanssa oranssista punaiseen ytimiä erittäin hajanainen chromatin; (4) tasaisesti oranssista punaiseen ytimet järjestäytynyt rakenne syyksi nekroottista soluihin.

RNA: n eristys ja RT

2 Profiler PCR Arrays

Käsittelyn jälkeen A549 solut pestiin kudosviljelmässä astia lisäämällä kylmää PBS ja rokkaavaa varovasti. Solut pestiin suoraan viljelyastia lisäämällä 1 ml Trizol reagenssia (Life Technologies, kissa. 10296-010) kohti halkaisijaltaan 10 cm malja ja raaputtamalla solukaapimella. RNA eristettiin valmistajan protokollaa. RNA-pitoisuus ja puhtaus arvioitiin käyttäen nanophotomer NanodroP (Euroclone). RNA: ta (400 ng) suoritettiin käänteistranskriptio-reaktiossa käyttäen RT

2 ensimmäisen juosteen (Qiagen, cat.330401) mukaan valmistajan protokollan.

arvioimiseksi ilmentymisen apoptoottisten geenien reaa- kvantitatiivinen käänteistranskriptio-PCR (qRT-PCR) suoritettiin käyttäen RT

2 Profiler PCR Arrays (Qiagen, cat.330231). Kokeet suoritettiin kolmena rinnakkaisena A549- solulinjan käsitelty PUAS 5 uM 2 tunnin valotusaikaa.

Levyt ajettiin VIIA 7 (Applied Biosystems 384 hyvin lohkot), Standard Fast PCR Cycling protokollan kanssa 10 ul reaktio määriä. Sykliolosuhteet käytettiin – 1 sykli aloittamisesta 95,0 ° C: ssa 10 minuutin ajan ja tämän jälkeen vahvistus 40 sykliä, jotka olivat 95,0 ° C: ssa 15 s ja 60,0 ° C: ssa 1 min. Monistaminen kerättiin kautta VIIa 7 RUO Software (Applied Biosystems). CT-arvot analysoitiin PCR array data-analyysi online-ohjelmisto (https://pcrdataanalysis.sabiosciences.com/pcr/arrayanalysis.php, Qiagen).

Proteiinin uutto

A549 solulysaattina hoidon jälkeen valmistettiin raaputtamalla solut kunkin petrimaljan 1 ml: aan RIPA-lyysipuskuria (150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCI, pH 7,6, 5 mM EDTA, 0,5% NP-40, 0,5% natriumdeoksikolaatti, 0,1 % SDS) täydennettynä proteaasinestäjät (1 uM PMSF ja Complete proteaasiestäjäseostabletit Tabletit, Roche, Monza, Italia) ja fosfataasi estäjät (PhosSTOP Cocktailpöydät, Roche). Lysaattia inkuboitiin jään päällä 15 minuuttia ja sitten kirkastettiin sentrifugoimalla 14000 g: llä 20 minuutin ajan. Kokonaisproteiinipitoisuus määritettiin käyttämällä Bio-Rad Protein Assay Reagent (Bio-Rad, Milano, Italia), naudan seerumin albumiinia (BSA) standardina. Proteiini uute säilytettiin – 80 ° C: ssa käyttöön asti.

Elektroforeesi

Ennen elektroforeesia, proteiini näytteitä inkuboitiin 100 ° C: ssa 5 min. Seuraavat 10% SDS-PAGE-geelit värjättiin Coomassie tai blotattiin nitroselluloosalle (Hybond, GE Healthcare) kalvo. Membraanit blokattiin 1 tunnin ajan 1X Tris puskuroidulla suolaliuoksella (TBS), jossa oli 0,1% Tween-20: 5% w /v rasvatonta kuivamaitoa, ja inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa primaaristen vasta-aineiden laimennettu 1 x TBS, 0,1% Tween -20 5% BSA. Ensisijainen vasta-aineet olivat peräisin Death reseptorin vasta-aineen Sampler Kit (Cell Signaling Technology, 8356S), mukaan lukien anti-TNFR1: n (1:1000), anti-TNFR2 (1:1000), anti-FADD (1:1000), anti-RIP (1 :1000), anti-Fas /FasL (1:1000). Anti-aktiiviset Cas-3 (1:1000) hankittiin BioVision. Positiivinen kontrolli saatiin käyttäen anti-aktiini-vasta-aine (1:500) (Sigma). Aktiini käytettiin kontrollina kullekin proteiinille analysoitiin. Tässä näytämme vain edustaja geeli aktiini. Inkuboinnin jälkeen kalvot pestiin kolme kertaa 5 minuutin ajan kutakin 15 ml: lla TBS /Tween ja sitten inkuboitiin HRP-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineen anti-kani (1:2000, Cell Signaling Technology) samalla varovasti sekoittaen 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Inkuboinnin jälkeen kalvot pestiin kolme kertaa 5 minuutin ajan kutakin 15 ml: lla TBS /Tween. Pyyhittäisiin kalvoja immunodetektoitiin käyttäen ECL Prime western blotting detektointireagenssia (GE Healthcare). Proteiinit tehtiin näkyviksi Amersham Hyperfilm (GE Healthcare). Densitomet- analyysi immunopositiivista bändejä suoritettiin käyttäen Image J ohjelmisto.

Solusyklianalyysiä

A549-solut kerättiin levyillä käyttäen 1 ml trypsiini-EDTA (Lonza, Italia), kiinnitettiin 70% etanolia ja säilytettiin -20 ° C: ssa. Sitten solut pestiin kahdesti PBS: llä, suspendoitiin uudelleen PBS: ään, joka sisälsi 1 mg ml

-1 RNaasi A: ta (Qiagen, Cat.19101), inkuboitiin 37 ° C: ssa 45 min ja värjätään propidiumjodidilla (PI, 10 ug ml

-1) 15 min. DNA jakelu solujen sisällä arvioitiin sitten käyttämällä FACScalibur-virtaussytometriä (BD Biosciences Immunocytometry Systems, San Jose, CA, USA). Solujen prosenttiosuus eri vaiheissa solusyklin laskettiin käyttämällä ModFit LT (Verity Software House, Topsham, ME, USA).

Tilastollinen analyysi

väliset tilastolliset erot käsiteltyjen ja kontrollisolujen solun elinkelpoisuus lukumäärät selvitettiin Yksisuuntainen ANOVA ja Dunnin monivertailutesti merkittäviä p-arvot ≤0.05 käyttäen GraphPad Prism (GraphPad Software, San Diego Kalifornia USA).

Geenien ilmentyminen analysoitiin PCR array data analyysi online-ohjelmisto (https://pcrdataanalysis.sabiosciences.com/pcr/arrayanalysis.php, Qiagen). Histogrammit osoittavat suhteellinen ekspressio suhteet analysoitiin geenien suhteen kontrolleihin ilman PUAS. Vain ilmaus arvo on suurempi kuin 1,55-kertainen ero suhteessa verrokkeihin pidetään merkittävinä.

Immunoblottausmääritys proteiinin ilmentymistä laskettiin prosenttiosuutena kiinteä alueen jokaisen geelivyöhykkeestä suhteessa koko geelikaistan ala, jota edustaa pikseleinä. Tilastolliset erot käsitellään ja valvonta määritettiin T-opiskelija analyysi merkittävä p-arvot ≤0.05. Tiedot poikkeavat huomattavasti valvontaa, jossa p-arvot 0,001 on merkitty 2 tähdillä lukuihin.

Tulokset

elinkelpoisuus A549 ja COLO 205 syöpäsolun linjat, ja normaali BEAS-2B cell line käsittelyn jälkeen PUA dekadienaalin (DD) B

Kuten kuviossa. 1A-1B, hoito A549 ja COLO 205 soluja 2, 5 tai 10 uM DD johti merkittävään ja ajasta riippuva vähennys solujen elinkelpoisuuden kontrolleihin verrattuna (p 0,05). 24 tunnin kuluttua, lasku prosentteina elävien A549-soluja havaittiin kaikilla tutkituilla annoksilla (70%, 50% ja 18% eläviä soluja 2, 5 ja 10 uM DD pitoisuuksia, vastaavasti). Samanlaisia ​​tuloksia saatiin COLO 205-solut (80%, 44% ja 26% eläviä soluja 2, 5 ja 10 uM DD pitoisuuksia, vastaavasti). 48 tunnin kuluttua hoidon lisävähennys havaittiin, erityisesti suuremmilla DD pitoisuuksina 5 ja 10 uM A549-soluja; COLO 205 elinkelpoisuus väheni hitaammin (67%, 43% ja 23% eläviä soluja 2, 5 ja 10 uM DD pitoisuuksia, vastaavasti). Klo 10 uM A549-solut osoittivat selvää morfologisia muutoksia, kuten menetys kosketuksiin sitoutuminen muihin soluihin sekä levyn alustaan. 72 tunnin jälkeen, A549 solujen elinkykyisyys laski 0% 5 ja 10 uM DD ja 26%: lla 2 uM DD; COLO-205 solujen elinkelpoisuus oli 30%, 21% ja 13%, 2, 5 ja 10 uM DD, vastaavasti.

(D) vaikutus DD A549-solulinja, kun läsnä on kaspaasi-3-estäjällä ( 9,7 uM). Elinkelpoisten solujen prosentuaalinen A549- ja COLO 205 lasketaan trypaanisinisen elinkelpoisuuden määritys ja BEAS-2B MTT elinkelpoisuuden määrityksessä. Arvot ilmoitetaan keskiarvona ± S.D kontrolleihin verrattuna (100% elinkelpoisuus); ▴ 2 uM; ▪ 5 uM, ♦ 10 uM.

hoito BEAS-2B-soluja, jossa on 2, 5 tai 10 uM DD ei merkittävästi vähentänyt solujen elinkykyä verrattuna kontrolleihin (Fig. 1 C). 24 h kuluttua DD hoidon BEAS-2B solujen elinkelpoisuus väheni hieman (74%, 65% ja 85% eläviä soluja 2, 5 ja 10 uM DD pitoisuuksia, vastaavasti), mutta sen jälkeen, kun 48 ja 72 h solujen elinkelpoisuuden talteen ja oli verrattavissa valvontaa , mikä osoittaa lieviä toksisia vaikutuksia 24 tunnin kuluttua vain. Lopuksi, arvioida spesifisten sytotoksisten vaikutus kirjattiin A549-solulinja, MTT-määritystä koe suoritettiin, kun läsnä on kaspaasi-3-estäjällä kaikkien aldehydin hoitoja. Kuviossa 1D on esitetty, että solujen prosentuaalinen määrä elinkelpoisuus on verrattavissa käsiteltyjen solujen PUAS ilman estäjää 2 uM; 5 ja 10 uM on hitaampi lasku solujen elinkelpoisuuden verrattuna hoitoon ilman kaspaasi-3-estäjällä jälkeen 48 h (1A), mutta 72 tunnin kuluttua sama pitoisuudet indusoi lisäys solujen kuolemaan.

elinkelpoisuus A549 ja COLO 205 syöpäsolulinjoilla ja normaali BEAS-2B solulinjan käsittelyn jälkeen PUA octadienal (OD) B

hoito A549-solujen 2, 5 tai 10 uM OD estivät solujen proliferaatiota ajan, erityisesti suurilla pitoisuuksilla (10 uM), kun solujen elävyys laski 35% 72 tunnin jälkeen (kuvio. 2A). 2 uM pitoisuuksilla vaikutus solujen elinkykyä 24 tunnin jälkeen ei ollut merkitsevästi erilainen verrattuna kontrolleihin, mutta tuli niin sen jälkeen 72 h (p 0,05). Kun taas COLO 205 solujen elinkelpoisuuden 24 tunnin jälkeen ei laskenut merkittävästi (Fig. 2B), sytotoksisia vaikutuksia voimistui 72 tunnin jälkeen kaikki kolme OD pitoisuudet (60%, 60% ja 41% eläviä soluja 2, 5 ja 10 uM OD pitoisuuksien vastaavasti, p 0,05).

(D) vaikutus OD A549-solulinja, kun läsnä on kaspaasi-3-estäjällä (9,7 uM). Elinkelpoisten solujen prosentuaalinen A549- ja COLO 205 lasketaan trypaanisinisen elinkelpoisuuden määritys ja BEAS-2B MTT elinkelpoisuuden määrityksessä. Arvot ilmoitetaan keskiarvona ± S.D kontrolleihin verrattuna (100% elinkelpoisuus); ▴ 2 uM; ▪ 5 uM, ♦ 10 uM.

hoito BEAS-2B-soluja 2 ja 5 uM OD ei merkittävästi vähentänyt solujen elinkykyä kontrolleihin verrattuna 24, 48 ja 72 h (Fig. 2C ), kun taas 10 uM OD, BEAS-2B solujen elinkelpoisuus heikkeni hieman jälkeen 72 h (75% elinkelpoisia soluja). Hoito A549-solujen OD läsnäollessa kaspaasi-3-estäjällä ei aiheuttanut merkittäviä eroja prosentuaalinen solujen elävyys (Fig. 2D).

elinkelpoisuus A549 ja COLO 205 syöpäsolulinjoilla ja normaali BEAS-2B solulinja käsittelyn jälkeen PUA heptadienal (HD) B

Kuten kuviossa. 3A, hoito 2, 5 ja 10 uM HD A549-solut hieman esti solujen lisääntymistä 24 tunnin kuluttua, mutta vaikutus oli vielä merkittävästi erilainen suhteessa kontrolleihin (p 0,05). Vaikutus oli ilmeinen ajan. Erityisesti, 10 uM vain 10% soluista oli elinkelpoinen 48 tunnin jälkeen ja 0% 72 tunnin jälkeen. HD kohtelu COLO 205 soluja myös alensi solun elinkelpoisuutta, mutta vaikutus ei ollut yhtä voimakas kuin A549-soluja. Sen jälkeen kun 48 ja 72 h (Fig. 3B), joka on merkittävästi toksinen vaikutus havaittiin suurilla HD pitoisuuksina (40% ja 28% solujen elävyyttä 10 uM HD).

(D) vaikutus HD A549 rivi läsnä kaspaasi-3-estäjällä (9,7 uM). Elinkelpoisten solujen prosentuaalinen A549- ja COLO 205 lasketaan trypaanisinisen elinkelpoisuuden määritys ja BEAS-2B MTT elinkelpoisuuden määrityksessä. Arvot ilmoitetaan keskiarvona ± S.D kontrolleihin verrattuna (100% elinkelpoisuus); ▴ 2 uM; ▪ 5 uM, ♦ 10 uM.

Kuten DD ja OD, hoito BEAS-2B-soluja HD ei aiheuttanut myrkyllisyys (Fig. 3C). Hoito A549-soluja HD: n läsnä ollessa kaspaasi-3-estäjällä ei johtaa eroihin elinkelpoisten solujen prosentuaalinen korkeammissa HD-pitoisuudet (5 ja 10 uM) (Fig. 3d). 2 uM, oli merkittävä kasvu solussa kuolleisuuden läsnäollessa kaspaasi-3 Inhibitor kuluttua 72 h (Fig.3D).

morfologiset vaikutukset piilevä PUAS DD, OD ja HD A549-solulinja

tarkkailla morfologisia muutoksia soluissa käsitelty DD, OD ja HD sekä tarkistaa jos laski elinkelpoisuuden käsittelyn jälkeen korreloi apoptoosin induktio, tuplaamme värjätään solut fluoresoivat väriaineet nukleiinihappojen akridiinioranssia (AO) ja etidiumbromidia (EO) 48 tunnin jälkeen hoidon. Elävät solut tunnistettiin kirkkaan vihreä ytimien ehjien solujen (AO). Varhainen apoptoottisia soluja tunnistettiin epäsäännöllisesti rakenteeltaan vihreä ytimet tiivistyneen chromatin ja oranssi tai vaaleanpunainen laikkuja. Late apoptoottiset solut sisälsivät positiivisesti värjätään ytimet sekä väriaineet (EB ja AO), esiintyvät oranssi tai vaaleanpunainen yhdessä apoptoottisia kappaleita. Ytimien nekroottisia soluja oli ehjä chromatin ja näytti punaista. Kaikki ohjaus ytimet näytti vihreää tavallisella pallomainen rakenne ja chromatin organisaatio lukuun ottamatta muutamia senescent solujen nekroottista vaiheessa, joka osoitti punaisia ​​fluoresoivia ytimiä (Fig. 4A). Klo 10 uM DD, kaikki solut olivat myöhään apoptoosin vaiheessa ja leimasi keltainen-oranssi kaksinkertainen värjäys (AO /EB) johtuen kromatiinin tiivistymistä ja menetys kalvon eheyden (Fig. 4B). Klo 10 uM OD, soluvaurioita oli vähemmän ilmeinen erillisiä muutoksia morfologiassa ja läsnäolo punaisen värjäytymisen joissakin soluissa, mikä osoittaa etenemisen apoptoosia (nuolet kuvassa. 4C). Klo 10 uM HD, solumorfologiaan oli olennaisesti muuteta erillään olevat chromatin tumissa joka ilmestyi laajentunut. Tunnusmerkkejä myöhään apoptoosin kuten ydin- hajanaisuus oli myös näkyvä (nuolet kuvassa. 4D).

Ohjaus ja käsitellyt solut kaksinkertainen värjättiin akridiinioranssilla ja etidiumbromidilla jälkeen 48 uM DD, OD ja HD havaittiin konfokaalimikroskoopilla . Numerot osoittavat (1) normaalit solut; (2) varhainen apoptoottisia soluja; (3) myöhään apoptoottisia soluja; (4) nekroottinen soluja (ks materiaali ja menetelmät lisätietoja). Nuolet osoittavat solujen hajanaista ytimeksi.

immuunianalyyseilla kuoleman reseptorien (TNFR1, TNFR2, RIP, FADD) sekä -efektiboksejamme (kaspaasi-3) A549-solulinja käsiteltiin PUAS (DD, OD ja HD ) B

24 tunnin kuluttua hoidon, DD indusoi annoksesta riippuvaisen ekspression lisääntymisen Tuumorinekroositekijän Receptor 2 (TNFR2), erityisesti 5 ja 10 uM, verrattuna kontrolleihin, joka käy ilmi densitometrinen analyysi valokuvaus arkki (Fig. 5A), immunoblottaus-kalvo. Päinvastoin, TNF-reseptori liittyy tekijät (TRAF1 ja TRAF2), ei ole aktivoitu osoittaa puuttuminen selviytymisen kautta. Lisäksi DD indusoi aktivaation TNFR1 käsitellyissä soluissa 5 ja 10 uM pitoisuuksina (Fig. 5A). Loppupään Fas-Associated proteiinin Death Domain (FADD) on myös voimakkaasti aktivoitu 10 uM pitoisuuksina, kun taas tasojen Receptor-vuorovaikutuksessa proteiini (RIP) väheni huomattavasti kaikissa kolmessa DD pitoisuudet (Fig. 5A). Ilmentyminen vähenee RIP edustaa ennenaikaiseen kuolemaan signalointireittiä kuten puuttuminen sovittimen proteiinien, kuten tuumorinekroositekijä-reseptorin tyypin 1-Associated Death Domain-proteiinia (TRADD) tai TNF-reseptoriin assosioituneen tekijät TRAF1 ja TRAF2 (tietoja ei ole esitetty). DD on aktivoitu kaspaasi-3 vahvistaa solukuolemaa apoptoosin välityksellä 24 tunnin jälkeen (kuvio. 5A). Muut kuolemareseptorien osallisena ulkoista apoptoottisen reitin (Fas, DR3, DR4, DR5) sekä joitakin tekijöitä aktivoidaan luontainen apoptoottista reittiä (Akt1, Akt2, PARP, Apaf1) ei mukana soluvasteen DD (tietoja ei esitetty ).

immunoblottianalyysi osoittaa, että PUAS aiheuttaa TNF signalointi 24 (DD ja HD) ja 48 h (OD) hoidon aktiini. Tähdellä merkitsee merkittävää kasvua proteiinin tasot mitattiin. ** P≤0.05 vs. kontrolli; virhepalkit edustavat ± SD.

samaa reittiä jälkeen havaittiin OD hoidon mutta vasta 48 tunnin jälkeen. TNFR2 ilme hieman lisääntynyt verrattuna kontrolleihin, mutta ero ei ollut merkittävä. TNFR1 ja FADD osoitti merkittävää vastetta korkeimmat pitoisuudet (5 ja 10 uM) (kuvio. 5B). Toisin DD, OD-käsitellyt solut osoittivat voimakasta ja jatkuvaa ilmaisua RIP, mikä osoittaa rinnakkaiseloa selviytymisen ja kuoleman signalointi vaste (kuvio. 5B). Kaspaasi 3 oli myös aktivoida kanssa DD (Fig. 5B).

HD ei lisännyt merkittävästi ilmentymistä TNFR2 (Fig. 5C) ja ei käynnistänyt mitään vastausta TNFR1: ssä jälkeen 24 tunnin ja 48 tunnin. 24 h kuluttua HD voimakkaasti lisääntynyt ilmentyminen Fas-reseptorin (Fas /FasL-ligandin System) annoksesta riippuvalla tavalla. Suurin vaikutus HD Fas havaittiin 5 ja 10 uM pitoisuuksina (Fig. 5C). HD kasvoi myös FADD ilmaisun ja aktivoitu kaspaasi-3 (Kuva. 5C). Sen sijaan tasot RIP väheni dramaattisesti 24 tunnin jälkeen (Kuva. 5C). Lisäksi Apaf1 ei ole paljastettu, kun HD hoitoa 24 ja 48 tuntia (dataa ei esitetty).

Expression analyysin koodaavien geenien kuolemareseptorien (TNFR1, TNFR2, RIP, FADD) sekä -efektiboksejamme (Caspase-3, AIFM1) A549-solulinja käsiteltiin PUAS (DD, OD ja HD) B

Ymmärtääksemme paremmin myrkyllisiä vaikutuksia molekyylitasolla, A549-solut analysoitiin kuluttua 2 h PUAS hoitoa, koska kaikki proteiinit DD ja HD olivat jo ilmaisseet ja aktivoidaan 24 tunnin kuluttua. Päätimme käyttää 5 uM koska suuremmilla pitoisuuksilla vaikutukset olivat liian vaikeita.

Ohjaus geenit reaaliaikaisen qPCR oli Actin-beeta (ACTB), beeta-2-mikroglobuliini (B2M), hypoksantiinifosforibosyylitransferaasin (HPRT1