Krooninen sairaus

tiivistelmä

epidemiologisissa yhdistyksen välillä statiinia käytön ja vähensi riskiä edenneen eturauhassyövän viittaa siihen, että statiinit voivat estää eturauhassyövän kehitykseen ja /tai etenemistä. Tutkimukset suoritettiin vaikutusten määrittämiseksi mallin statiinia, atorvastatiini (ATO), proliferaatioon ja erilaistumiseen eturauhassyöpäsolujen, sekä tunnistaa mahdollisia mekanismeja ATO toimintaa. ATO estivät

in vitro

leviämisen sekä LNCaP ja PC3 ihmisen eturauhasen syöpäsolujen annoksesta ja ajasta riippuvalla tavalla. Suurempi estoaktiivisuus ATO PC3-soluissa liittyi induktioon autophagy kyseisessä solulinjassa, kuten on osoitettu lisääntynyt ilmentyminen LC3-II. miR-182 johdonmukaisesti voimistuvan ATO PC3-soluissa, mutta ei LNCaP-soluissa. ATO ylössäätely miR-182 PC3-soluissa oli p53-riippumatonta ja purettiin geranylgeraniol. Transfektio miR-182 estäjät vähentynyt ilmentyminen miR-182 by 98% ja heikensi antiproliferatiivinen ATO. miR-182 ilmentyminen PC3-soluissa oli myös lisääntynyt vastauksena stressin aiheuttama seerumin peruuttamista, mikä viittaa siihen, että miR-182 säätelyä voi johtua ravitsemuksellisia stressistä. Bcl2 ja p21 tunnistettiin olevan mahdollisia kohdegeenien miR-182 PC3-soluissa. Bcl2 säädeltiin vähentävästi ja p21 yläreguloituja PC3-soluissa altistuvat ATO. Nämä tiedot viittaavat siihen, että miR-182 voi olla stressi reagoiva miRNA joka välittää ATO toimia eturauhasen syöpäsoluja.

Citation: Peng X, Li W, Yuan L, Mehta RG, Kopelovich L, McCormick DL (2013 ) Kasvun inhibitio ja induktio Autophagy Atorvastatiini PC3 eturauhassyöpäsoluissa korreloivat alassäätely Bcl2 ja lisääntymisen merkkejä miR-182 ja p21. PLoS ONE 8 (8): e70442. doi: 10,1371 /journal.pone.0070442

Editor: Natasha Kyprianou, University of Kentucky College of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu: 21 maaliskuu 2013; Hyväksytty: 18 Kesäkuu 2013; Julkaistu: 01 elokuu 2013

Copyright: © 2013 Peng et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat sopimus N01-CN-43303 päässä Division of Cancer Prevention, National Cancer Institute, Department of Health and Human Services. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Statiinit käytetään laajalti ehkäisyyn ja hoitoon hyperkolesterolemia; kolesterolia alentava vaikutus statiinien suoritetaan kautta eston 3-hydroksyyli-3-metyyli-glutaryyli-koentsyymi A: n (HMG-CoA) reduktaasin, joka on keskeinen entsyymi kolesterolin biosynteesissä [1], [2]. Sen lisäksi vaikutuksia kolesterolin biosynteesin, statiinit kuten atorvastatiini (ATO) ovat herättäneet runsaasti kiinnostusta niiden mahdollisia apuohjelma syövän ehkäisyä ja hoitoa [3], [4].

tulokset useita epidemiologisiin tutkimuksiin ja meta -analyses ehdottaa käänteinen suhde statiinin käyttöä ja eturauhassyövän riskiä, ​​erityisesti riskiä edenneen tai metastaattisen eturauhassyövän [5], [6], [7]. Viimeaikaiset tiedot tutkimuksista kokeellisissa eturauhassyövän mallit osoittavat, että samanaikainen statiinien muiden lääkkeiden kanssa voi tuottaa lisäaine tai synergistisiä syöpää ehkäisevistä vaikutuksista [4], [8]. Useita mahdollisia mekanismeja on tunnistettu, jotka statiinit voivat moduloida syövän etenemisen; Näiden mekanismien sisältävät soluproliferaation inhibointi, induktio autophagy ja apoptoosin, ja angiogeneesin estäminen [3], [9], [10]. Statiinit ovat voimakkaita inhibiittoreita mevalonaatin biosynteesin [11], jolloin proteiinikinaasien prenylaatio; antiproliferatiivinen ja syöpää ehkäisevistä vaikutuksista statiinien voisi vaikuttaa läpi tämän reitin. Kuitenkin spesifinen biokemiallinen mekanismi (t), jonka kautta ATO ja muut statiinit aiheuttavat syöpää ehkäisevä ja /tai terapeuttinen vaikutus eturauhasen edelleen pääosin määrittelemätön.

Autophagy on soluprosessin jonka kautta makromolekyylien ja soluelimiin heikkenevät kausina solujen stressi liittyy ravinteiden ehtyminen, infektio, tai apoptoosin [9]. Viimeaikaiset

in vitro

tiedot osoittavat, että ATO voivat aiheuttaa autophagy ja autophagy liittyvää solukuolemaa PC3 eturauhassyövän solut [9]. Tämän perusteella, induktio autophagy tarjoaa mahdollisen mekanismin, jonka kautta estämällä eturauhassyövän etenemisen ATO voidaan toteuttaa. Vuonna PC3 eturauhasen syöpäsoluja, ATO indusoi autophagic flux, solusyklin pysähtymiseen ja solukuolemaa [9]. Tässä prosessissa, induktio autophagy näyttää olevan välttämätön vaihe ennen solukuolemaan [9], [12].

miRNA ovat pieniä ei-koodaavat RNA: t, jotka säätelevät geenin ilmentymistä laukaisemalla käännös tukahduttaminen tai mRNA: n hajoaminen [13], [14]. miRNA näyttävät osallistuvan sääntelyn laajan solujen prosesseja, ja muuttunut malleja miRNA ilmaisun nähdään useissa patologisten tilojen. Kertyvät todisteet osoittavat, että miRNA ilmentyminen on muuttunut syöpiä useita sivustoja, kuten eturauhasen [15], [16], [17]; muutoksia ilmaus erityisiä miRNA voisi olla mekanismi, jonka avulla farmakologiset aineet ja ravinnon manipulointia voi estää syövän syntyyn ja /tai etenemistä. Lisäksi, miRNA profilointi voi olla käyttökelpoinen tunnusmerkkiosassa molekyyli allekirjoitukset kasvainten [18], ja tunnistaa mahdolliset tavoitteet kehittämistä syöpälääkkeiden [19]. Esimerkiksi ilmaus miRNA syöpäsoluissa moduloidaan syöpähoitojen kuten doksorubisiinin ja trastutsumabi [20], [21]. Samoin modulaatio miRNA ilmentymisen ravinnon komponentteja kuten folaatin, retinoidit, ja curcumin voivat taustalla niiden syöpää ennaltaehkäisevää toimintaa [18]. Tämän perusteella me arveltu, että muutokset miRNA ilmaisu voisi olla vastuussa, tai liittyy ATO toimia eturauhasen syöpäsoluja, ja että muuttunut spesifisten miRNA liittyy induktion autophagy mukaan ATO.

materiaalit ja menetelmät

reagenssit

Atorvastatiini (ATO) on toimittanut chemopreventive Agent Repository ylläpitämä Division of Cancer Prevention, National Cancer Institute, Rockville, MD. ATO liuotettiin DMSO: hon (50 mM), ja säilytettiin -20 ° C: ssa ennen käyttöä. Geranylgeraniol (GGOH), farnesoli (FOH), Q10, skvaleenia, ja MTT (3- (4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -2,5-difenyylitetratsoliumbromidi) ostettiin Sigma-Aldrich (St. Louis, MO ).

Cell Lines, Cell Culture and Cell Proliferation Assay

Ihmisen syöpäsolujen (PC3-solut ja LNCaP-solut) ostettiin American Type Culture Collection (Manassas, VA). Alalinjoja PC3-solujen (kloonit 7, 19 ja 20), jotka muodostetaan läpi kloonivalinnan [22] ystävällisesti tri Ann R. Kennedy yliopistossa Pennsylvaniassa. Kaikki eturauhassyövän solulinjaa viljeltiin RPMI, joka sisälsi 10% FBS: ää. Solujen proliferaatio määritettiin kvantitatiivisesti käyttämällä MTT-määritystä tai kristalliviolettia (CV) määritys, tai suoraan solujen laskenta käyttämällä Z2 Coulter Particle Counter (Beckman Coulter, Brea, CA). Alustavat tutkimukset suoritetaan laboratoriossamme ovat osoittaneet, että absorbanssi (OD-arvo) sekä MTT ja CV määrityksissä on verrannollinen solujen määrä.

Western Blot analyysi

40-50% konfluenssiin, solut altistettiin ATO: ssa 24 tuntia, 48 tuntia tai 72 tuntia. Altistuksen jälkeen, solulysaatit valmistettiin ja 50 ug kokonaisproteiinia laitettiin western blot -analyysillä. LC3-II polyklonaalinen vasta-aine hankittiin Abgent (San Diego, CA). Bcl2 ja p21 hiiren monoklonaalisia vasta-aineita olivat NeoMarker (Fremont, CA). Aktiini polyklonaalinen vasta-aine ja α-tubuliinin, p53 ja PCNA monoklonaalisia vasta-aineita, ja kaikki sekundaariset vasta-aineet hankittiin Santa Cruz Biotech (Santa Cruz, CA).

Microarray Analysis

PC3 ja LNCaP-solut ympättiin viljelymaljoilla niin, että solut saavuttivat -30% konfluenssiin päivänä 2. tuolloin, viljelyalusta vaihdettiin ja solut altistettiin ATO (10 uM) 24 tunnin ajan. Kokonais-RNA voidaan käyttää sekä mRNA: han ja miRNA määrityksissä, eristettiin ja puhdistettiin käyttämällä Ribopure RNA: n eristys-kittiä (Invitrogen, Grand Island, NY). mRNA microarray ja miRNA array profilointi suoritettiin suvun Biosystemin (Northbrook, IL) käyttäen Agilent Human v2 GE 4x44K paneelit ja Agilent Human miRNA V14 Rev.2 taulukot, vastaavasti; rinnakkaisia ​​microarray ja miRNA profilointi tehtiin käyttäen samoja koko RNA-näytteet. Tiedot analysoitiin käyttämällä Agilent Feature Extraction ja GeneSpring GX v7.3.1 ohjelmistopaketteja. Microarray-tiedostot 4 analysoidut näytteet tässä raportissa löytyvät GEO liittymistasausmaksut GSE46376.

kvantitatiivinen RT-PCR

Yhteensä-RNA uutettiin Trizol reagenssia (Invitrogen), ja mRNA analyysit tehtiin kuten aiemmin on kuvattu [23]. Kaksi RT reaktiot jokaiselle näytteelle yhdistettiin ja laimennettiin yhtä suurella määrällä DNaasia /RNaasi vapaata vettä. Reaaliaikainen PCR suoritettiin 2 ui laimennettua RT tuote on MyiQ Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad, Hercules, CA) käyttäen iQ ™ SYBR Green PCR Supermixiä (Bio-Rad) mukaan valmistajan ohjeiden [24] . Gene alukkeet suunniteltiin Primer 3 (https://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi). Aktiini käytettiin viite-geenin normalisointia tietoja. Kertainen Indusoinnit lasketaan kaavalla 2

– (ΔΔCt), jossa ΔΔCt on ACt

(käsittely) – ACt

(kontrolli), ACt on Ct

(kohdegeenin) – Ct

(aktiini) ja Ct on sykli, jossa kynnys on ylitetty.

miRNA analyysiä, 20 ng kokonais-RNA: ta käytettiin cDNA-synteesin Taqman MicroRNA Reverse Transcription kit (Invitrogen); miRNA ilmentyminen kvantitoitiin käyttäen Taqman MicroRNA määritys (Invitrogen) seuraten valmistajan ohjeita. Suhteellinen ekspressiotasot miRNA normalisoitiin U6 snRNA ja laskettiin kuten aiemmin on raportoitu [25].

miRNA transfektio

miRNA transfektiot toteutettiin PC3-soluissa käyttämällä lipofectomine 2000 (Invitrogen) seuraten valmistajan protokollaa . PC3-soluja viljeltiin yön yli normaalissa kasvualustassa, sitten transfektoidaan miR-182 matkivat (Sigma) tai miR-182 estäjän tai negatiivisena kontrollina OPTI-MEM (Invitrogen), joka sisältää 3% FBS 18-28 tuntia. Mirna matkivat, inhibiittoria miR-182, ja negatiivinen kontrolli (Invitrogen) on kussakin käytettiin lopulliseen konsentraatioon 20 nM. Sitten transfektoituja soluja viljeltiin normaalissa kasvualustaan ​​tai ilman ATO hoitoa eri ajanjaksoina.

Tilastollinen analyysi

Normaalisti jakautunut parametritietoja esitetään keskiarvona ± SD, ja analysoitiin Studentin t -testi tai yksisuuntainen ANOVA;

post-hoc

analyysit suoritettiin käyttäen Tukeyn monivertailukoetta. Tilastolliset analyysit tehtiin käyttäen GraphPad Software (San Diego, CA) ja Microsoft Office Excel. Erot keinot katsottiin merkitsevä p 0,05.

Tulokset

Differential atorvastatiinin vaikutukset LNCaP ja PC3 Eturauhassyöpä Cells

Kun annetaan pitoisuuksina 0 -20 uM, ATO esti solujen lisääntymistä sekä LNCaP ja PC3-solujen annoksesta ja ajasta riippuvaisella tavalla; pienin tehokas annos molemmissa solulinjoissa oli 2,5 uM (tuloksia ei ole esitetty). Edustavia kasvukäyrät LNCaP ja PC3 soluja viljeltiin ilman ja läsnäolo ATO (10 uM) on esitetty. 1A. Pitoisuutena 10 uM, ATO indusoi jatkuvaa, ajasta riippuva inhibitio LNCaP-solujen lisääntymisen yli 6 päivän altistuksen aikana; mitään todisteita solukuoleman nähtiin LNCaP altistuneet ATO 10 uM tältä ajalta. PC3-soluja, ATO soluproliferaation inhibointi havaittiin päivänä 2; merkittäviä solukuoleman PC3-soluissa nähtiin vuorokausina 4 ja 6, kuten solumäärää ATO-käsiteltyjen ryhmien näinä aikoina olivat alle solujen lukumäärä alunperin kylvetään. Nämä tiedot viittaavat siihen, että (a) PC3-solut ovat herkempiä ATO kuin ovat LNCaP-soluja, ja (b) toimintamekanismit ATO kahden eturauhassyövän solulinjoissa voi olla erilainen.

(A) LNCaP ja PC3-soluja siirrostettiin 6-kuoppaisille levyille (36000 solua /kuoppa) ja inkuboitiin yön yli, ja käsiteltiin sitten DMSO: ta (kontrolli) tai 10 uM ATO 2, 4 ja 6 päivää. Solujen määrä ilmaistaan ​​keskiarvona ± SD, n = 3 (B) mikroskopia LNCaP ja PC3-solujen käsittelyn jälkeen with10 uM ATO 2 ja 4 päivää. C: LNCaP ja PC3-soluja käsiteltiin 5 uM ATO 24 ja 48 h, solulysaatit kerättiin LC3-II ilmentymisen analyysi käyttäen western blot. ATO aiheuttama LC3-II ilmentymisen vain PC3-soluissa.

The effects of ATO (10 uM) solutiheydestä ja solujen morfologia LNCaP ja PC3-solujen kahden ja neljän päivän altistumisen on esitetty kuvassa 1B. Morfologiset muutokset olivat läsnä sekä LNCaP ja PC3-solut altistettiin ATO; solutiheys muutokset olivat yhdenmukaisia ​​muutoksia solujen määrä on raportoitu edellä. Tässä prosessissa autophagosome muodostumista, soluliman mikrotubuluksiin liittyvä proteiini kevytketjun 3 (LC3) on konjugoitu fosfatidyylietanoliamiini (PE), sen karboksyylipäässä [26], [27]. Konjugoidut LC3 (tunnistettu LC3-II) asetetaan sitten autophagic vesikkelikalvoon. LC3-II voidaan havaita immunoblot tai immunovärjäyksellä, ja on laajalti käytetty biokemiallinen markkeri solun autophagy [28], [29]. Käyttäen LC3-II biomarkkeri autophagy, western blot-analyysit osoittivat, että ATO indusoi autophagy PC3-soluissa, mutta ei LNCaP-soluissa (kuvio. 1C). Nämä tulokset viittaavat induktion autophagy mukaan ATO PC3 eturauhassyövän solut solukuolemaan näissä soluissa; ei autophagy eikä solukuolema indusoitiin ATO LNCaP-soluissa.

atorvastatiinin vaikutukset soluproliferaatioon ja LC3-II Expression PC3 Solut

Vahvista yhdistyksen välillä autophagy ja solukuoleman PC3 eturauhasen syöpäsoluja altistetaan ATO, ensin tunnettu vaikutuksia ATO on solumäärää vanhempien PC3-soluissa ja useat PC3 alilinjat [22]. Altistuminen vanhempien PC3 solujen ATO (5 uM) esti solujen lisääntymistä 38% Päivä 2 (p 0,01) ja 85% (p 0,001) päivänä 4 (Fig. 2A). Kaikki alalinjoja (klooni 19, 7, ja 20) (Fig. 2B-D) olivat herkkiä ATO hoitoon, mutta PC3 klooni 19 oli herkin ATO kolmesta testattiin kloonien: kahden ja neljän päivän altistumisen, ATO ( 5 uM) inhiboivat PC3-kloonin 19 soluihin 70% ja 95%, vastaavasti (p 0,001 sekä vertailuja, Fig. 2B); kun taas muut kaksi kloonia (klooni 7 ja 20) vastasi ATO samalla tavalla kuin vanhempien soluissa joidenkin vaihtelua. Lisäksi merkittävä solukuolemaa havaittiin kaikissa solulinjoissa päivänä 4. Tämän vuoksi vanhempien ja herkin klooni valittiin lisäkarakterisointiin LC3-II ilmentymistä. Sekä PC3 vanhempien ja PC3-kloonin 19 soluihin, ATO aiheuttama LC3-II ilmentymistä ajasta riippuva tavalla (Kuva. 2E); kuitenkin, herkällä PC3-kloonin 19 soluihin, LC3-II osoitti nopeampaa ja määrällisesti suurempi indusointia ATO. Nämä tiedot viittaavat siihen, että ATO indusoi autophagy aktiivisuus korreloi solujen herkkyys vastauksena ATO, ja että autophagy voivat olla mukana solukuoleman aiheuttama ATO PC3-soluissa.

(A-D) PC3 vanhempien (A) ja PC3-kloonin 19 (B), 7 (C) ja 20 (D) soluja viljeltiin 6-kuoppalevyille ja käsiteltiin 5 uM ATO 2 tai 4 päivää. Solujen määrä ilmaistaan ​​keskiarvona ± SD, n = 3 (C) PC3 vanhempien ja PC3-kloonin 19 soluja käsiteltiin 5 uM ATO rinnakkain leviämisen määrityksessä (A B) 24 h, 48 h tai 72 h. Solulysaatit kerättiin western blot-analyysi LC3-II ilmentymisen.

atorvastatiinin vaikutukset Gene Expression LNCaP ja PC3 Cells (Microarray tutkimukset ja Pathway Analysis) B

Microarray analyysit olivat määrittämiseksi suoritettiin vaikutusten ATO geenien ilmentymisen ja miRNA ilmaisun LNCaP ja PC3-solut; rinnakkain vertailuja suoritettiin käyttäen kokonais-RNA-näytteet eristettiin soluista käsiteltiin ATO (10 μ M) 24 tuntia. ATO indusoi tilastollisesti merkittäviä muutoksia ilmaisua 1427 geenien LNCaP ja 3755 geenejä PC3 vanhempien soluissa (Kuva. S1). Kegg sellaisia ​​keinoja analyysi 1427 ilmentyvät eri geenien LNCaP tunnistettu 7 toiminnallisia polkuja, joille ero ilmentymistä komponentin geenien oli tilastollisesti merkitsevä

p

≤0.01 (taulukko S1). Jotkut reitit (

esim

., Kolesterolin biosynteesin, steroidi biosynteesi) olivat ennustettavissa perusteella tunnetun aktiivisuuden ATO kuin HMG Co-A -reduktaasin; toiset voivat nimenomaan liittyvät antiproliferatiivinen ATO LNCaP-soluissa. Kuten voidaan olettaa, joka on paljon suurempi määrä muuttaa toiminnallisia väyliä (46 väyliä) tunnistettiin Kegg analyysi differentiaalisesti ilmentyvien geenien PC3-soluissa altistetaan ATO (taulukko S2). Sen lisäksi polkuja, jotka päällekkäisiä mainittuja LNCaP, ATO moduloitu useita reittejä selkeitä yhteyksiä solujen lisääntymisen ja solukuoleman; nämä toiminnalliset reittejä mukana DNA: n kahdentuminen, solusyklin ja MAPK signalointi.

Microarray Tutkimukset atorvastatiinin ja Mirna Expression LNCaP ja Pc3 Cells

ATO aiheuttama ero ilmentymistä lukuisia miRNA LNCaP ja PC3-solut . Käyttäen raja-arvot 1,5 kertamuutosta eroja ilmaisun ja p 0,05 tilastollista merkittävyyttä, 131 miRNA oli differentiaalisesti ilmaistut LNCaP altistuvat ATO, ja 111 miRNA oli differentiaalisesti ilmaistut PC3-soluissa altistuneet ATO (Fig. S1).

tunnistamiseksi miRNA, jonka erilainen ekspressio voisi taustalla ATO sytotoksisuuden PC3-soluissa, kertamuutos cutoff ≥2.00 levitettiin PC3 tietoja, ja poistamalla sen jälkeen miRNA joiden suunta ilmentymisen muutosten olivat samat PC3 ja LNCaP solut. Tämä strategia tunnistaa yhteensä 42 miRNA jotka differentiaalisesti säännellään ATO erityisesti PC3-soluissa (taulukko S3).

Mir-182 Is Up valvoman Ato PC3 Cells

Vahvista miRNA array tiedot PC3-soluissa, qRT-PCR (Taqman tekniikka) käytettiin vahvistamaan ero ilmaus kolme miRNA (miR-555, miR-654 ja miR-182) tunnistettu up-säännellään ATO ja kolme miRNA (asennuspalveli- 494, miR-1255a ja miR-550a), jotka alas-säädellä ATO. Nämä erityiset miRNA valittiin lisätutkimuksia perusteella kertamuutosta eroja ilmaisua nähdään microarray tutkimuksissa. miR-182 (joka oli ajan säännelty nelinkertaiseksi PC3-soluissa alttiina ATO) valittiin myös johtuen sen tunnettujen suhdetta solujen stressiä [29].

ATO säätely ylöspäin miR-182 PC3-soluissa varmistettiin qRT-PCR (Kuva. 3A); muut miRNA havaittiin ilmaista vain hyvin pieninä määrinä, ja ekspressiotasot näiden miRNA osoittivat huomattavaa vaihtelua näytteiden välillä. miR-182-ekspressio kasvoi 56% (p 0,01), 24 tunnin ja 66% (p 0,01), 48 tuntia PC3 altistuneiden solujen ATO (Fig. 3A). Sen sijaan, ATO alassäädetty miR-182 LNCaP-soluissa 24% (p 0,01) 48 tuntia (Fig. 3B). Nämä tiedot viittaavat siihen, että miR-182 sääntelyn ATO eturauhassyöpäsoluissa on soluspesifisestä, ja että säätely ylöspäin miR-182 voi olla mukana ATO toimia PC3-soluissa.

(A) PC3-soluja altistetaan 5 uM ATO 24 h ja 48 h. Kokonais-RNA eristettiin ja altistettiin Taqman qRT-PCR-analyysi käyttäen alukesarjoja Mir-182. (B) LNCaP-solut altistettiin 5 uM ATO 48 tuntia, minkä jälkeen analyysi miR-182 ilmentymistä. Data on esitetty yhteenvetona 3 itsenäisestä kokeesta ja ne ilmaistaan ​​keskiarvona ± SD. ** P 0,01.

Mir-182 lisääntymisen merkkejä By Ato PC3 Solut korjaantuu Geranylgeraniol Co-hoito ja riippumaton P53 Expression

aiemmin raportoitu että miR-182 on stressi reagoivan miRNA rintojen epiteelisolujen [29]. Koska miR-182 voimistuvan ATO, ja ATO voi aiheuttaa solujen stressiä estämällä mevalonaatin biosynteesiä [3], [9], me arveltu, että miR-182 säätelyä by ATO saattaa johtua ATO aiheuttama solujen stressiä. Jos tämä hypoteesi on oikea, poistaminen ATO stressin päinvastaiseksi miR-182 säätelyä ylöspäin. Arvioida tämän hypoteesin, miR-182-ekspressio kvantitoitiin PC3-soluissa käsiteltiin ATO ± useita mevalonaatin metaboliitteja, joiden synteesi estyy seurauksena ATO tukahduttaminen mevalonaatin biosynteesin. Agents tutkittu Mukana geranylgeraniol (GGOH), farnesolin (FOH), koentsyymi Q10 (Q10), ja skvaleenia. Alustavassa tutkimuksessa vain GGOH käänteinen vaikutukset ATO Mir-182 ilmentymistä PC3-soluissa. Tämän perusteella lopullinen sarja kokeita suoritettiin käyttämällä GGOH ja FOH. Yhdenmukainen tulokset Esiselvityksen GGOH käänteinen vaikutus ATO Mir-182 ilmaisu; FOH ei ollut vaikutusta (kuva. 4A). Olemme myös arvioineet vaikutusta GGOH ja FOH on ATO estoa solujen lisääntymisen ja induktio autophagy PC3-soluissa. Kuten on esitetty kuviossa. 4B, GGOH myös käänteinen vaikutus ATO soluproliferaatioon ja LC3-II ilmaisu; FOH ei ollut vaikutusta. Nämä tiedot osoittavat selvästi, että ATO-välitteinen inhibitio biosynteesin geranylgeraniol, mutta ei farnesoli, tuloksia säätelyä miR-182, tukahduttaminen leviämisen ja induktion autophagy.

(A) PC3-soluja käsiteltiin 5 uM ATO 48 h: n läsnä ja poissa ollessa metaboliiteiksi mukaanlukien geranylgeraniol (10 uM) ja farnesolin (10 uM), miR182 ekspressiota havaittiin sitten qRT-PCR: llä. (B) PC3-soluja käsiteltiin 5 uM ATO 2 tai 4 päivää läsnä ollessa ja poissa ollessa geranylgeraniol (10 uM) ja farnesolin (10 uM), solujen lisääntyminen (4 päivää hoidon) arvioitiin MTT-määrityksellä ja LC3-II lauseke (2 päivää hoito) tutkittiin western blot. (C) PC3-soluja viljeltiin normaalin kasvun väliaineessa (10% FBS) yön yli, ja sitten korosti viljelemällä matalan seerumin elatusaineessa (1% FBS) 48 h, jonka jälkeen kvantitoimalla miR-182 ilmentyminen qRT-PCR: llä. (D) p53 ekspressiota tutkittiin Western blot -analyysillä PC3-soluissa, MDA-MB-231-rintasyöpäsolujen toimi positiivisena kontrollina p53 ilmentymistä. Kaikkien pylväskaaviot, tiedot ilmaistaan ​​keskiarvona ± SD; for qRT-PCR-analyysit, n = 3; MTT-määritys, n = 8; * P 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001.

Käytimme toinen stressi malli – seerumideprivaation – määrittää spesifisyys miR-182 vastauksia ATO ja onko miR-182 ilmentyminen on myös tehostaa muun tyyppisiä stressiä PC3-soluissa. PC3-soluja viljeltiin kasvualustassa, joka sisälsi 10% FBS: ää, jonka jälkeen viljellään kaksi päivää kasvatusliuoksessa, joka sisälsi vain 1% FBS: ää. Seerumideprivaation 2 päivää lisätä miR-182 ilmentyminen 26% (p 0,001; Fig. 4C), mikä viittaa siihen, että miR-182 ylössäätöä PC3-soluissa indusoi erilaisia ​​stressitekijöitä.

p53 on katsotaan tiiviisti liittyvän solun stressiin [30]. Koska sääntely miR-182 on viime aikoina raportoitu olevan p53-riippuvaista [20], tutkimme tasoja p53 ilmentymisen PC3-soluissa tai ilman altistumista ATO. p53-proteiini ei ole ilmaistu PC3-soluissa joko tilassa (kuvio. 4D), mikä osoittaa, että miR-182 sääntelyn ATO PC3-soluissa on p53-riippumatonta.

Ato säätelee Bcl2 Ja P21, joita mahdollisia kohteita Mir-182 PC3 Cells

vaikutuksia ATO mahdollisia kohdegeenien miR-182 tutkittiin, jotta voidaan arvioida oletusta, että ATO modulaatio miR-182 ilmentyminen saa aikaan muutoksia sääntelytehtävä. Ongelman hypoteesin, TargetScan (https://www.targetscan.org/) ja PicTar (https://pictar.mdc-berlin.de/) käytettiin tunnistamaan mahdolliset kohdegeenien miR-182; geenejä tunnistaa käyttämällä näitä tietokonesimulaatio ohjelmat olivat sitten seuloa käyttämällä microarray data. Tämän toistuvan prosessin, 41 potentiaali kohdegeenien miR-182 tunnistettiin; 24 geenejä voimistunut ja 17 geenit vaimentua mukaan ATO (taulukko S4).

Koska miR-182 oli voimistuvan ATO, suora tavoitteet miR-182 todennäköisimmin vaimentua. Käyttämällä ero geenien ilmentyminen raja-arvot ≥2.0 kanssa tilastollista merkittävyyttä asetettu p≤0.05 tunnistimme viisi miR-182 kohdegeenien jotka alas-säädellä ATO PC3-soluissa; geenejä tällä menettelyllä olivat Bcl2, BNC2, FRMD4A, ELL ja AMOTL2. qRT-PCR-analyysit vahvistivat, että Bcl2 ja FRMD4A kukin vaimentua 65% PC3-soluissa altistetaan ATO (p 0,001 molemmat geenit, tiedot Bcl2 on esitetty kuviossa. 5A). Down-regulation Bcl2 mukaan ATO vahvistettiin myös proteiinitasolla (Kuva. 5A).

(A) (B) PC3-soluja käsiteltiin 5 uM ATO 48 h, jonka jälkeen qRT-PCR: llä ja western blot-analyysi Bcl2 (A) ja p21 (B). Tiedot ilmaistaan ​​keskiarvona ± SD. n = 3. ATO laski sekä mRNA ja proteiini ilmentymä Bcl2 taas kasvoi sekä mRNA ja proteiini ilmentymistä p21. (C) (D) PC3-solut transfektoitiin negatiivisen kontrollin (NegCon), miR-182 matkivat (miR182-mi), tai miR-182-estäjän (miR182-in) 24 ja /tai 48 h, jonka jälkeen analyysi ilmentymisen miR -182 (C), Bcl2 ja p21 (D). C vahvistaa onnistuneen transfektion miR182-mi ja miR182-in osoittamalla lisääntynyt tai vähentynyt ilmentyminen miR-182. D osoittaa Bcl2 ja p21 ilmentymistilanne mRNA (ylhäällä) ja proteiini tasoilla (alhaalla) 48 h transfektion jälkeen. miR-182 yliekspressio laski Bcl2 mRNA ilmaisun, mutta oli vain vähäinen vaikutus sen proteiinin ilmentymiseen; kun taas miR-182 knock-down ollut vaikutusta Bcl2 mRNA ilmaisun, mutta lisäsi proteiinin ilmentymisen. p21 korreloi positiivisesti Mir-182 ilmentymistä sekä mRNA ja proteiini tasoilla. Actin tai α-tubuliinin toimi lastaus säätimet proteiinin ilmentymisen.

Olemme myös havainneet, että p21 CDK-estäjä, tärkeä negatiivinen säätelijä solusyklin, on johdonmukaisesti säädellään ylöspäin PC3-soluissa altistuvat ATO , ylössäätöä p21 mukaan ATO osoitettiin sekä mRNA ja proteiini tasoilla (kuvio. 5B).

sarja transfektiotutkimuksissa suoritettiin selvittämään suhdetta ATO altistumisen, miR-182 ilmaisua, ja Bcl2 ja p21 mRNA ja proteiini ilmentymistä PC3-soluissa. Kuten on esitetty kuviossa. 5C, transfektio miR-182 jäljittelevät kasvoi miR-182 ilmentyminen 400-500-kertaisesti sekä 24 h ja 48 h transfektion jälkeen; sitä vastoin transfektoimalla miR-182 estäjä tukahdutetaan miR-182 ilmentyminen 98%. Yli-ilmentymisen miR-182 laski Bcl2 mRNA-tasoja 26% (p 0,05), mutta ei ollut merkittävää vaikutusta Bcl2 proteiinin ilmentymiseen 48 tuntia. Transfektio miR-182-estäjän ei ollut vaikutusta Bcl2 mRNA: n ekspression, mutta ei merkittävästi Bcl2-proteiinin ilmentymistä (Fig. 5D). Nämä tiedot viittaavat siihen, että Bcl2 on välittömänä kohteena miR-182 PC3-soluissa; koska pohjapinta proteiinin taso Bcl2 oli jo alhainen, oli vähän proteiinin ilmentymisen osoittamiseksi saatavilla edelleen alassäätö kautta miR-182 yli-ilmentymisen. Nämä tulokset viittaavat myös siihen, että miR-182 eivät lisäisi Bcl2 alassäätöä vastauksena ATO PC3-soluissa.

Sitä vastoin p21 ei ollut tunnistettu välittömänä kohteena miR-182 joko TargetScan tai PicTar . Mielenkiintoista on, että p21-ilmentyminen korreloi positiivisesti miR-182-ilmentymisen sekä mRNA: ta ja proteiinia tasoja (kuvio. 5D). Yli-ilmentymisen miR-182 lisääntynyt p21 mRNA: n ilmentymisen 57% (p 0,05), kun taas knock-down of miR-182 transfektoimalla miR-182 estäjä laski p21 mRNA: n ilmentymisen 36% (p 0,05). Nämä tiedot viittaavat siihen, että p21 on epäsuora kohteena miR-182, ja että miR-182 voidaan edistää jollakin tavalla p21 ylössäätöä by ATO PC3-soluissa.

Vaikutusta Mir-182 Expression soluproliferaatioon vastauksena Ato in Pc 3 Cells

Jotta voidaan tutkia toiminnallista roolia miR-182 välittäjänä ATO vastausten miR-182 ilmentyminen oli manipuloitavissa transfektoimalla miR-182 matkivat tai miR-182 inhibiittori PC3 soluihin . Transfektoidut solut altistettiin alhainen pitoisuus ATO (2,5 uM) ja 4 päivää, minkä jälkeen kvantitoimalla solujen lisääntymisen MTT (Fig. 6A) tai CV-määritys (Fig. 6B). 2,5 uM pitoisuuden ATO käytettiin Jotta tutkimuksessa ero jotka johtuvat manipulointi miR-182 ilme. Kuten on esitetty kuviossa. 6A, yli-ilmentyminen miR-182 käsittelemättömissä soluissa esti lisääntymistä 36% (p 0,001); knock-down Mir-182 muuten käsittelemättömien solujen lisääntyvän leviämisen 43% (p 0,001). miR-182 yliekspressio ei muuttanut PC3 soluvasteita ATO; kuitenkin, knock-alas miR-182 vähensi aktiivisuutta ATO estäjänä soluproliferaation (kuvio. 6A). Läsnä ollessa ATO, absorbanssi syntyy miR-182-inhibiittori-transfektoitujen solujen määrä lisääntyi 89% (p 0,001, n = 8) verrattuna negatiivisen kontrollin-transfektoiduissa soluissa. Kuva. 6B esittää kuvia CV värjäystä 4 päivää transfektion miR-182 matkivat ja miR-182 estäjää PC3-soluissa. CV-määritys osoitti samanlaisia ​​tuloksia (tuloksia ei ole esitetty), kuten MTT-määritys. Nämä tulokset osoittavat, että miR-182 suoraan estää proliferaatiota PC3-solujen, ja se voi myös välittää solujen proliferaatio indusoimaa ATO.

(A) PC3-solut transfektoitiin miR-182 matkivat (miR182-mi , 20 nM) ja miR-182-estäjän (miR182-in, 20 nM) 48-kuoppalevyillä vastaavasti kanssa miRNA matkivat, että vahvistettu olevan minimaalisen sekvenssin identiteetti miRNA ihmisen negatiivisena kontrollina (NegCon, 20 nM), ja sitten käsiteltiin 2,5 uM ATO ja 4 päivää, soluproliferaatiota arvioitiin MTT-määrityksellä. Absorbanssi-arvot ilmaistaan ​​keskiarvona ± SD, *** p 0,001, n = 8. (B) PC3-soluja transfektoitiin, kuten on kuvattu kohdassa A, ja viljeltiin vielä 4 päivää transfektion jälkeen, solut värjättiin kristallivioletilla käyttäen standardia CV koemenetelmää; kuvia soluproliferaatiota aseman tallennettiin mikroskoopilla. (C) PC3-solut transfektoitiin negatiivisen kontrollin tai miR-182-estäjän, käsiteltiin sitten 2,5 uM ATO 48 tuntia, solut kerättiin western blot-analyysi LC3-II ilmentymistä. Aktiini toimi latauskontrollina. Edustava Western blot on esitetty. Alla olevat arvot kunkin kaistan edustavat normalisoitu LC3-II intensiteetin (yhteensä pikseliä) Esitetyn western blot määritettynä UN-SCAN-IT-ohjelmiston (Silk Scientific Inc., Orem, UT).

koska ATO indusoi autophagy PC3-soluissa, käytimme western blotit ja YK-SCAN-IT-ohjelmiston määrittämiseksi vaikutuksia miR-182 LC3-II ilme. Transfektion miR-182-estäjän (miR-182-in) vähensi perusilmennystä LC3-II -30% (n = 3, edustava Western blot on esitetty kuvassa. 6C).