Krooninen sairaus

tiivistelmä

Noin 3-7% ei-pienisoluisen keuhkosyövässä satama anaplastiseksi lymfooma kinaasi (

ALK

) geenin fuusio, joka muodostaa uuden molekyyli alatyypin keuhkosyöpään, joka vastaa crizotinib, joka on

ALK

estäjä. Vaikka aikaisemmat tutkimukset ovat arvioineet

ALK

-rearranged keuhkosyövässä, kattava analyysi keuhkosyövän Chinese ole hyvin arvioida. Tässä olemme määritelleet 44 tapauksissa

ALK

-rearranged näytteitä fluoresoiva in situ -hybridisaatio (FISH), immunohistokemia (IHC), ja RT-PCR (RT-PCR) on suuri määrä kirurgisesti resekoitu keuhkosyövässä. Kaikki 44

ALK

-rearranged keuhkosyövässä olivat adenokarsinoomat, 2 tapausta ottaa ylimääräistä polttoväli squamous komponentteja. Tavoitteena oli analysoida kliinis ominaisuudet

ALK

-rearranged keuhkojen adenokarsinooman. Tuloksemme osoittivat, että seulamaisessa rakenne, näkyvä solunulkoisen liman ja mitä tahansa limakalvojen solukuvio voivat olla joko herkkiä tai spesifisiä ennustaa

ALK

uudelleenjärjestelyn. Käytimme FISH standardina havaitsemismenetelmä. Vertasimme

ALK

uudelleenjärjestelyn tarkkuus FISH, RT-PCR ja IHC. RT-PCR voi määritellä sekä

ALK

fuusiokumppanin ja fuusio variantti, mutta tuntui pysty havaitsemaan kaikkia translokaatiot joihin

ALK

geeni. On huomionarvoista, että IHC käyttäen D5F3-vasta-ainetta (Cell Signaling Technology) osoitti suurempi herkkyys ja spesifisyys kuin ALK1 vasta-ainetta (Dako). Tämän vuoksi päättelemme, että IHC on edelleen kustannustehokas ja tehokas menetelmä diagnosoimiseksi

ALK

uudelleenjärjestelyjä ja että D5F3 voi olla optimaalinen seulonta vasta-kliinisessä käytössä.

Citation: Li Y, Pan Y Wang R, Sun Y, Hu H, Shen X, et al. (2013)

ALK

-Rearranged Lung Cancer in Chinese: kattava arviointi Clinicopathology, IHC, FISH ja RT-PCR. PLoS ONE 8 (7): e69016. doi: 10,1371 /journal.pone.0069016

Editor: Giuseppe Viglietto, UNIVERSITY Magna Graecia, Italia

vastaanotettu: 15 helmikuu 2013; Hyväksytty: 11 Kesäkuu 2013; Julkaistu: 26 heinäkuu 2013

Copyright: © 2013 Li et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat varat National Natural Science Foundation of China (81101761, 81172218); Key rakentaminen ohjelma National ”985” Project (985-YFX0102) URL: https://www.nsfc.gov.cn/Portal0/default152.htm. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Keuhkosyöpä edelleen johtava syy syövän liittyvän kuoleman maailmassa. Kliininen merkitys molekyyli fenotyypin keuhkosyövän on pääasiassa vaikuttivat hoitoon, sillä eri alatyyppiä voivat reagoida eri kohde hoitoja. Fuusio geeni, joka liittyy piikkinahkaisten mikrotubuluksiin liittyvä proteiini-, kuten 4 (

EML4

) -geenin kanssa anaplastinen lymfooma kinaasin (

ALK

) geenin havaittiin osajoukossa ei-pienisoluinen keuhkosyövän (NSCLCs) vuonna 2007 [1]. Tämä fuusio johtunut kromosomi inversio tai translokaatio kromosomissa 2p, jolloin muodostuminen

EML4-ALK

fuusio geeni. Huolimatta suhteellisen alhainen taajuus

EML4-ALK

fuusio,

ALK

-rearranged keuhkosyöpä on ainutlaatuinen molekyyli alaryhmä, joilla on korkea herkkyys ALK estäjien, ja on toisensa poissulkevia muista hyvin tunnettu onkogeeniset mutaatiot, joissa EGFR tai KRAS [2] – [5]. Jotta voitaisiin paremmin ymmärtää

ALK

-rearranged keuhkosyövässä, on tärkeää luonnehtivat viittaavia tekijöitä. Tulokset yksityiskohtainen ennusteeseen viittaavia analyysit ovat vaihdelleet. Tutkimuksessamme 572 keuhkojen adenokarsinooman jaettiin

ALK

-rearranged, yhteinen kuljettaja mutaatio, ja pan-negatiivisten ryhmien mukaan mutaatiostatuksesta riippumatta. Vertasimme kliinis ominaisuudet

ALK

positiivisten ryhmä yhteisiä kuljettajan mutaatio, ja pan-negatiivinen ryhmä, jolla pyritään arvioimaan, oliko erottuva kliinis piirteitä liittyy

ALK

uudelleenjärjestely kohortissa.

ALK

-rearranged keuhkosyöpä voidaan tunnistaa IHC, FISH, tai RT-PCR kunkin menetelmän, jolla etuja ja haittoja seulontaan. Nykyiset kliiniset kokeet crizotinib käytön FISH kuin diagnostinen testi [6]. Kuitenkin FISH edellyttää erikoistunutta teknistä resursseja ja osaamista, ja signaalit nopeasti haalistuvat ajan mittaan. Lisäksi kustannukset FISH määrityksen rajoittaa sen soveltamista seulonnassa kliinisessä työssä. RT-PCR kytkin suora sekvensointi on käytetty tunnistamaan tunnettujen fuusio variantteja, mutta voi jäädä tuntemattomia muunnoksia. IHC on suhteellisen edullista, nopeammin, ja suoritetaan rutiininomaisesti formaliinilla kiinnitetyt, parafiiniin upotettuja (FFPE) kudoksiin. Kuitenkin tulokset ALK IHC testaus keuhkosyöpä on edelleen olla tyytymätön, koska suhteellisen alhainen herkkyys tai spesifisyys, ja puuttuminen ihanteellinen vasta-aineen. Nyt erittäin herkkä ALK monoklonaalinen vasta-aine, D5F3 voivat tunnistaa epitoopit ALK proteiinin kaikkien tiedossa fuusioista. IHC on helposti saatavilla rutiini patologian käytännössä ja testi maksaa vain yhden kahdeskymmenesosa FISH testin Kiinassa. Siksi tämä IHC analyysi pitää lupauksen olla kustannustehokas ja nopea seulontamenetelmä [7]. Kuitenkin tarkkuus ja herkkyys D5F3 vasta-ei ole testattu. Vertasimme viskositeettiluku keskuudessa IHC, FISH ja RT-PCR määrittää optimaalisen seulontamenetelmää. FISH on tarkin ja RT-PCR voi määrittää eniten ALK fuusio variantteja, mutta ei välttämättä tunnista kaikkia ALK translokaatioita. Huomasimme, että IHC kanssa D5F3 monoklonaalisella vasta-aineella osoitti sekä korkea herkkyys ja spesifisyys (91% ja 98%, tässä järjestyksessä) ja näin saattaa olla rutiininomaisesti sovellettavissa kliinisessä käytössä.

Materiaalit ja menetelmät

Case valinta

yhteensä 572 jäädytettyä keuhkoadenokarsinooma kudosnäytteitä ja niitä vastaavat parafinoidut kasvainkudoksista hankittu Fudanin yliopiston Shanghai Cancer keskuksen välillä lokakuu 2007 kautta kesäkuu 2011, kirjallinen tietoon perustuva suostumus kaikilta potilailta. Kaikki tutkimukset, joissa ihmisen Tutkimukseen osallistui hyväksyi eettinen komitea Shanghai Cancer sairaala (Shanghai syöpä keskus), Fudanin yliopiston Kiinassa. Olemme aiemmin osoittaneet, että 90% keuhkojen adenokarsinooman välillä koskaan tupakoineet kanna toisiaan poissulkevia onkogeeninen mutaatioita vain neljästä geenistä (

EGFR

,

KRAS

,

HER2

ja ALK) [ ,,,0],8]. Nykyisissä tutkimuksessa olimme mukana 527 keuhkojen adenokarsinooman riippumatta tupakoinnista lisäksi 45 kasvaimet (41

EGFR

, 3

EML4-ALK

fuusiot ja 1

KRAS

) aiemmin julkaistu [8]. Oli 411 572 näytteiden kanna tunnettu mutaatiot, mukaan lukien 361

EGFR

, 40

KRAS

ja 10

BRAF

kasvaimia, kun taas 161 572 näytteet eivät satama tahansa edellä mutaatiot. Havaitsemiseksi

EML4-ALK

fuusiot, alukkeet suunniteltiin monistamaan kaikkia tunnettuja fuusio variantteja, käyttäen cDNA: ta, kuten aiemmin on kuvattu [9]. Mukaan mutaatiostatuksesta riippumatta, 572 keuhkojen adenokarsinooman jaettiin kolmeen ryhmään. Oli 44 tapauksia tunnistettu ALK uudelleenjärjestely FISH ja ryhmitellään

ALK

-positiivisille. Oli 411 tapauksia, jotka tunsivat hyvin tunnettu onkogeenisiä mutaatioita (361

EGFR

, 40

KRAS

ja 10

BRAF

) tunnistetaan RT-PCR ja ryhmitellään keskuskäytöllä mutaatiot . Oli 117 tapaukset, jotka eivät satama jokin edellä mutaation ja oli siten ryhmitellään pan-negatiivinen. Kliinis kerättyjä analyyseihin sisältyy ikä, sukupuoli, kasvaimen koko, tupakointi historia, keuhkopussin invaasio, imusolmuke tila ja patologisen vaiheessa. Kullekin tapauksessa useita dioja vastaavat kokonaisia ​​kudosleikkeiden tarkisti kaksi patologit ja luokitellaan nykyinen IASLC /ATS /ERS luokitus [10]. Kaikki kasvaimet luokitellaan teemaan perustuva luokitusjärjestelmä ehdottama Sica osaksi luokan I, luokan II tai luokan III. Grade I, joka on lepidic hallitseva kuvio; II-luokan, joka on acinar, papillaarinen tai mucinous hallitseva kuvio; ja luokka III, kiinteä, micropapillary tai seulamaisessa kuvio [11]. Tapaukset, joissa erot arvioijat olivat uusia arvioita, yksimielisyys tulkinta on suoritettu.

RT-PCR ja Mutaatiotutkimukset Analyysit

Oli 572 tapausta alistettiin RT-PCR. Jäädytetyt kudokset karkeasti jakaa osiin TRIZOL (Invitrogen Inc.) RNA uutetaan uudelleen vakioprotokollia. Kokonais-RNA-näytteet käänteiskopioitiin yksijuosteiseksi cDNA käyttäen RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas, EU). Mutaatiostatuksesta asema

EGFR

(eksonit 18-22),

KRAS

(eksonit 2-3) ja

BRAF

(eksonit 11-15) oli käyttää tavallisilla RT- PCR ja kytketty suoralla sekvensoinnilla. Havaitsemiseksi

EML4-ALK

fuusiot, alukkeet suunniteltiin monistamaan kaikkia tunnettuja fuusio vaihtoehdot käyttäen cDNA: ta, kuten aiemmin on kuvattu [8], [9]. Eteenpäin alukkeiden

EML4

E2F (5′-TGATGTTTTGAGGCGTCTTG-3 ’),

EML4

E13F (5′-AGATCGCCTGTCAGCTCTTG-3′),

EML4

E18F (5 ’ -TTAGCATTCTTGGGGAATGG-3 ’), ja reverse-aluketta

ALK

E20R (5′-TGCCAGCAAAGCAGTAGT TG-3′). Multiplex PCR-analyysi tehtiin KOD plus DNA-polymeraasia (Toyobo, Osaka, Japani), jossa seuraava ohjelma: 94 ° C 5 minuuttia; 94 ° C 30 sekuntia, 60 ° C 30 sekuntia, 68 ° C 1 minuutti, 35 sykliä; 68 ° C: ssa 10 minuuttia. PCR-tuotteet sekvensoitiin suoraan eteenpäin että taaksepäin. Kaikki mutaatiot varmistettiin analyysi riippumattoman PCR eristää. PCR-tuotteet sekvensoitiin suoraan eteenpäin että taaksepäin. Kaikki mutaatiot varmistettiin analyysi riippumattoman PCR eristää.

Fluoresenssi in situ

ALK

-rearranged keuhkosyöpä on molekyyli alaryhmä ja toisensa poissulkevia muista mutaatioista tällaiset kuten

EGFR

,

KRAS

ja

BRAF

. 161 tapaukset, jotka eivät satama mitään edellä mainituista mutaatioista alistettiin FISH. FISH suoritettiin formaliinilla kiinnitetyt, parafiiniin upotetut (FFPE) näytteet käyttäen kaupallisesti saatavilla break-erilleen koetin nimenomaan

ALK

geeni (Vysis LSI ALK Dual Color, break-toisistaan ​​uudelleenjärjestely koetin, Abbott Molecular, Abbott Park, IL) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Koetin hybridisoitui nauhaan 2p23, kummallakin puolella ALK-geenin keskeytyskohta. 5’ALK signaali leimattiin Spectrum Green (vihreä), ja 3 ’

ALK

signaali leimattiin Spectrum Orange (oranssi). 4, 6-diamino-2-fenyyli (DAPI) II haettiin ytimiä counterstaining. Signaalit kaikille koetin arvioitiin mikroskoopilla varustettu kolminkertainen ylipäästösuodatin (DAPI /vihreä /oranssi; Abbott Molecular) ja immersioöljyobjektiivilinssillä. FISH-positiivisten tapausten määriteltiin kaksi positiivista

ALK

uudelleenjärjestelyn kuvioita. Yksi oli hajoamisen erilleen kuvion yhdellä fuusio signaalin ja kaksi erillistä oranssi ja vihreä signaaleja. Etäisyys kahden erillään signaalit arvioitiin käyttäen kaksinkertaiseksi suurin signaalin koko. Toinen määritelmä oli eristetty punainen signaali kuvion yhdellä fuusio signaali ja yksi punainen merkkivalo ilman vastaavaa vihreä signaali. Positiiviset tapausta määriteltiin yli 15% tauko toisistaan ​​signaaleja tai eristetty punainen signaali signaalit 50 kasvainsoluissa. FISH-negatiivinen tapauksissa määriteltiin ne esitellään päällekkäisyyttä punaista ja vihreää signaalia (kellertävä) tuumorisoluissa, mikä osoittaa, että

ALK

ei järjestetty uudelleen.

immunohistokemia

Oli 161 tapaukset, jotka eivät harbor tahansa edellä mutaatioita. Nämä tehtiin D5F3, ALK1, p63 ja TTF-1 IHC. IHC suoritettiin 4 pm paksu FFPE kohdat. Objektilasit poistettiin parafiini ja esikäsiteltiin 1 mmol /l EDTA ja lämpöä välittämä antigeenin haku ratkaisu mikroaaltouunissa. Lisätoimia tehtiin huoneenlämpötilassa hydratoidun kammiossa. Objektilasit esi- inkuboitiin 20% normaalia vuohen seerumia. ALK (D5F3) XP Rabbit monoklonaalinen vasta-aine (Cell Signaling Technology, Danvers, MA), hiiren monoklonaalinen anti-ihmis ALK1 (Dako) 1:10 laimennoksena Dako laimentimessa, p63 (1:400, 4A4, DAKO), ja TTF-1 ( 1:100, 8G7G3 /1, DAKO) levitettiin. Objektilasit pestiin sitten Tris-HCI: a ja havaittu piparjuuriperoksidaasiin konjugoidulla anti-kani-EnVision + kit (Dako). Kaikki objektilasit vastavärjättiin hematoksyliinillä.

Sytoplasmiset värjäytyminen katsottiin positiiviseksi D5F3 ja ALK1. Tämä tunnistaa epitoopit sisällä ALK proteiini, joka säilytetään kaikissa tunnetuissa ALK fuusioita. IHC värjäytyminen pisteytettiin seuraavasti: 0 (ei värjäys); 1 (heikko, sytoplasminen värjäys); 2 (kohtalainen, tasainen sytoplasman värjäytyminen); 3 (voimakas, rakeinen sytoplasminen värjäys) yli 10%: kasvainsoluja. Pisteytys suoritettiin kaksi patologia. Tumavärjäystä kasvainsolujen pidettiin positiivisia TTF-1 ja p63.

Tilastollinen

yhteenliittymät keuhkojen adenokarsinooman kanssa

ALK

positiivisten ja yhteinen kuljettaja mutaatio tai pannulla -negatiivinen ryhmä kliiniset ominaisuudet arvioitiin käyttäen Chi-square (kategorisen datan) ja Wilcoxonin-summa (jatkuvien tiedot) testejä.

p

arvot perustuvat kaksipuolisen hypoteesi.

p

arvot alle 0,05 pidettiin merkittävinä.

Tulokset

Kliiniset piirteet

ALK

-rearranged keuhkosyöpä

572 kirurgisesti resektoitiin vaiheen I-IV keuhkojen adenokarsinooman potilaat olivat kaikki Kiinasta, heidän ikänsä vaihtelee 22-84 vuotta, ja keskimäärin 59 vuotta. Potilaat koostuu 215 miestä ja 357 naista. Kasvain halkaisijat vaihtelivat 0,5-11 cm. Patologinen vaiheet olivat I 285 ja II-IV 287 potilaalla. Mukaan mutaatiostatuksesta asema, 572 potilasta jaettiin kolmeen ryhmään, nimeltään

ALK

positiivisten ryhmässä (44 tapausta), yhteinen kuljettaja mutaatio ryhmä (411 tapausta) ja pan-negatiivinen ryhmä (117 tapausta). Kaikissa

ALK

positiivisia tapauksia, ei samanaikainen aktivoivat mutaatiot

EGFR

,

KRAS

ja

BRAF

havaittiin. Vertasimme kliinis ominaisuudet

ALK

positiivisten ryhmä yhteismarkkinoille kuljettajan mutaatio ja pan-negatiivisia ryhmiä. Tapauksista, joissa kliiniset tiedot,

ALK

positiivisten keuhkosyövässä liittyivät nuorempina verrattuna yhteiseen kuljettaja mutaatio ryhmä (

p

= 0,023, taulukko 1), mutta ikä

ALK

positiivisten ryhmässä ei ollut merkittävästi erilainen vuoasta-negatiivinen ryhmä (

p

= 0,83, taulukko 1).

ALK

positiivisten ryhmässä oli savuton historia verrattuna yleiseurooppalaisen negatiivinen potilas (

p

0,001, taulukko 1), kun taas

ALK

– positiivinen ryhmä osoitti ole merkitystä eroa verrattuna yhteiseen kuljettaja mutaatio ryhmä (

p

= 0,828, taulukko 1). Vaikka

ALK

-rearranged potilailla esiintyi taipumusta yhdessä positiivisen imusolmukkeiden tila ja suurempi vaiheessa aiemmissa raporteissa [12], [13], meidän

ALK

positiivisten ryhmässä ei ollut merkitystä eroa muista 2 ryhmää. Kliiniset ominaisuudet

ALK

-positiivinen ryhmä, yhteinen kuljettaja mutaatio ryhmä, ja pan-negatiivinen ryhmä on koottu taulukkoon 1.

Patologiset havainnot

ALK

-rearranged keuhkosyövässä

Taulukko 1 on yhteenveto patologisia piirteitä kaikista 44 tapausta. Kaikki 44 olivat adenokarsinomia ja 2 oli ylimääräistä polttoväli levyepiteelikarsinooma komponentteja (osuus 10% kasvaimen tilavuudesta). Mukaan teemaan perustuva luokitusjärjestelmä, ei ollut eroja kasvaimen välillä

ALK

-positiivinen, yhteinen kuljettaja mutaatio tai yleiseurooppalainen negatiivinen ryhmät (

p

= 0,59 ja

p

= 0,344, tässä järjestyksessä). Mukaan hallitsevuus alatyyppeihin perustuu IASLC /ATS /ERS luokitusta, meidän

ALK

positiivisten ryhmässä oli eri hallitseva alatyypeistä: basaalisoluissa 15 tapausta (34,09%), kiinteää 19 tapauksessa (43.18%), lepidic 1 tapaus (2,27%), papillaarinen 6 tapausta (13,64%), micropapillary 1 tapauksessa (2,27%, kuvio 1A), mucinous 2 tapausta (4,55%).

ALK

positiivisten kasvainten liittyi merkittävästi kiinteä- ja acinar- hallitseva kuvioita verrattuna yhteinen kuljettaja mutantti adenokarsinoomat (

p

0,0001 ja

p

= 0,013, vastaavasti), mutta ei merkitsevää yhteyttä muihin hallitseva histologisen kuvioita. Lisäksi

ALK

positiivisia kasvaimia ei merkittävästi liittynyt jonkin hallitsevan histologinen kuvioita verrattuna yleiseurooppalaisen negatiivinen adenokarsinoomia.

(A) papillaarilihaksessa ja micropapillary malleja; (B) mucinous seulamaisessa malli koostuu runsas solunulkoisen liman ja seulamaisessa rakenteita; (C) kiinteä kuvio sinettisormus solujen; (D) mucinous seulamaisessa kuvio usein kelluva limassa täyttämä alveolaarinen tilat; (E) limakalvojen solujen muodossa pikarisoluille; (F) kiinteä kuvio hepatoid kasvainsolujen ottaa runsas eosinofiilinen sytoplasma, pyöreä ytimet, ja näkyvä nucleoli; kasvain soluytimet ovat suhteellisen monomorphic.

ALK

positiivisia kasvaimia liittyy myös erillisiä morfologisia ominaisuuksia. Niistä 44 kasvaimia, 52,27% (23/44) oli seulamaisessa kuvio (kuvio 1 B), joko keskeisten tai diffuusi. Sitä vastoin vain 20 411 yhteistä kuljettajan mutantti (

p

0,001) ja 34 117 yleiseurooppalaisen syöpäkasvain oli seulamaisessa kuvio (

p

= 0,006). Oli 29,55% (13/44) ja

ALK

positiivisten mutta vain 2% (8/411) yhteisen ohjaimen mutantin kasvaimia (

p

0,001), joka oli ainakin jossain määrin aste sinettisormus soluja (kuvio 1 C). Signet-rengas solut liittyvät kiinteän hallitseva kuvio 11

ALK

positiivisia kasvaimia, joka on acinar kuvio 1, ja molemmat acinar ja tasaisia ​​kuvioita yhdessä. Suhde signet-rengas solujen kokonais kasvainsoluihin vaihteli, joiden alueella 5 80 prosenttia. Mielenkiintoista,

ALK

positiivisia kasvaimia ei merkittävästi liittynyt sinettisormus-rengas solujen kuvio verrattuna yleiseurooppalaisen syöpäkasvain, joka osoittaa, että sinettisormus-soittoääntä voitiin havaita muita harvinaisia ​​kasvaimia synnyttävän mutantti keuhkosyöpään. Myös löysi olivat näkyvästi solunulkoisen liman ja mitä tahansa limakalvon soluista olivat merkitsevästi yleisempiä

ALK

positiivisia kasvaimia (P 0,0001) verrattuna muihin 2 ryhmä (

p

0,001 ). 22 tapauksessa (50%) oli merkittävä solunulkoisen liman, ja limaa laajenemassa keuhkorakkuloiden tiloihin kasvaimen kehällä (kuvio 1 D). Mikä tahansa limakalvon soluista havaittiin 26 tapauksessa (59.09%) ja oli useita kuvio, mutta ne todettiin useimmiten kiinteässä tai acinar kuvio. Limakalvojen solut useimmiten sinettisormus-rengas ja columnar pikari tyypit (kuva 1 E). 2 mucinous tapauksissa pikari soluja jakautumaan acinar ja lepidic kuvioita. 11 (25%) tapauksista oli ainakin polttoväli populaatio hepatoid kasvainsolujen runsaasti eosinofiilinen sytoplasma, pyöreä ytimet, ja näkyvä nucleoli on pääasiallisesti kiinteää kuvio (kuvio 1 F). Lisäksi mikään yksittäinen histologinen malli oli täysin herkkä tai erityisiä ennustaa

ALK

uudelleenjärjestelyn, ja jopa tapauksia sinettisormus-rengas solu tai seulamaisessa kuviot voivat olla läsnä muissa 2 ryhmää. Kaikissa

ALK

positiivisia tapauksia, kasvainsolu ytimet olivat suhteellisen monomorphic (kuvio 1 F), lukuun ottamatta kahta tapausta osoittavat painopistealueina pleomorfisimia. Niistä 44, 40 olivat TTF-1 positiivisia, kun taas 6 pesäkkeitä adenokarsinoomaa koekspressoi TTF-1 ja p63.

EML4-ALK fuusio variantti havaitsemista multiplex RT-PCR ja sekvensointi pakastettuina materiaali

tutkineet läsnäolo

EML4-ALK

fuusio variantti 161 tapauksissa, jotka eivät harbor

EGFR

,

KRAS

ja

BRAF

RT-PCR: llä. Havaitsimme 38 tapausta

EML4-ALK

fuusio variantti RT-PCR.

EML4-ALK

variantti 1 havaittiin 19 näytteissä. Viisi tapaukset olivat variantti 2, 7 tapaukset olivat variantti 3a /3b ja 1 oli V3b, E17; A20, E17 ins 65; A20, E17b ins 39; A20 E10a /b, E13; A20, E6a /b ins 18; A20 ja E6a; A19 kukin (taulukko 2). Fuusiot varmistettiin suoralla sekvensoinnilla.

ALK

uudelleenjärjestelyjä havaitsemista FISH

Oli 161 tapausta alistettiin ALK FISH. ALK uudelleenjärjestely määritellään yleensä split vihreä ja oranssi signaalit sijaitsevat vähintään kaksinkertainen kertaa suurimman signaalin koon. Oli 44 tapauksia positiivinen tunnistaa FISH. Tyypillisesti kaksi erillistä halkeaa punavihreänä signaaleja havaittiin 38 tapausta (taulukko 2, kuvio 2A). Kuusi FISH-positiivisia tapauksia oli ominaista menetys yksi vihreä signaali (kuvio 2B). Kolme näistä 6 tapausta oli kaksi variantti 1 tapauksissa yksi vaihtoehto 3b tapauksessa ja kolme negatiivista tapausta. Kuusi RT-PCR- negatiivinen tapaukset olivat positiiviset FISH. Kaksi tapausta rinnakkaiselon sekä adenokarsinooma ja polttoväli okasolusyöpä osoitti FISH-positiivinen signaali olla läsnä vain adenokarsinooman komponentti.

(A) kaksi erillistä punaista ja vihreää signaalia. (B) eristetty punainen merkkivalo.

ALK uudelleenjärjestelyjä havaitsemista IHC käyttämällä ALK1 ja D5F3 vasta-

ALK IHC testaus keuhkosyöpä edelleen haastava koska suhteellisen alhaisen ilmentymisen ALK proteiinia, monet tulokset osoittavat tämän olevan näin käyttää ALK1 vasta-ainetta. Sen määrittämiseksi, ovatko IHC käyttäen D5F3 vasta-ehkä parempi, arvioimme sekä 161 tapauksissa. ALK1-vasta-aineen ekspressiota havaittiin 32, jolloin IHC tulokset 1 (n = 14), 2 (n = 14), ja 3 (n = 4), kun taas 28 potilasta oli FISH-positiivisia (taulukko 2). Havaitsimme, että kaikki IHC 0 tapaukset olivat FISH-negatiivisia, kaikki IHC 3+ ja 2+ tapaukset olivat FISH-positiivisia, 4 IHC 1+ tapaukset olivat FISH-negatiivisia, ja 10 IHC 1+ tapaukset olivat FISH-positiivisia. Niistä 32 ALK1 IHC-positiivisia tapauksia, vain 4 IHC 3+ osoitti voimakasta sytoplasminen värjäys voimakkuus, havaittiin 20% 100% positiivisia soluja (tuloksen keskiarvo 60%). IHC1 + ja 2+ tapauksia havaittiin vain 10%: sta 50% positiivisia soluja (tuloksen keskiarvo 30%) (kuviot 3B, 3D, 3F).

Tapaus 1: (A) pisteet 3+ osoittaa voimakasta rakeinen sytoplasminen värjäys D5F3 vasta-aine; (B) pisteet 1+ osoittaa heikko sytoplasmista värjäytymistä kanssa ALK1; Tapaus 2: (C) pisteet 3+ osoittaa voimakasta rakeinen sytoplasminen värjäytyminen D5F3; (D) pisteet 2+ maltilliseen, rakeinen sytoplasminen värjäytyminen ALK1; Tapaus 3: (E) pisteet 3+ osoittaa voimakasta rakeinen sytoplasminen värjäytyminen D5F3; (F) pisteet 1+ osoittaa heikko, tuskin havaittavissa sytoplasminen värjäys ALK1.

Meidän tutkimuksessa D5F3 IHC testi osoitti erittäin suuri herkkyys ja spesifisyys havaitsemiseksi ALK ilmaisua. D5F3 immunopositivity tunnistettiin 41 tapauksessa (kuviot 3A, 3C, 3E). Positiivinen immunovärjäyksellä löydettiin vain adenokarsinooma komponentin 2 adenosquamous karsinoomat. Niistä 41 D5F3-positiivisia tapauksia, 34 oli 3+ esillä vahva sytoplasmista värjäytymistä intensiteettiä, todettiin 60% 100% positiivisia soluja (keskiarvo pisteet 80%). Lopuista 7 tapauksissa 2 tapauksissa näytteillä soluliman ja ydinvoiman positiivista värjäytymistä. Oli 4 IHC-positiivisia, jotka olivat 2+, maltilliseen sytoplasminen värjäys, ja 3 IHC-positiivisia tapauksia olivat 1+, osoittaa heikko sytoplasmista värjäytymistä. Ei tausta havaittu stroomasoluissa tai normaalina keuhko. Vertasi immunologisen of ALK1 vasta-, D5F3 osoitti voimakkaampi värjäytymistä syöpäsoluja. Suhteellinen määrä värjäämällä alue D5F3 oli myös huomattavasti suurempi. Näin ollen, intensiteetti tulokset D5F3 vasta-aineen värjäys olivat korkeammat kuin ALK1 vasta-ainetta (taulukko 2). Mielenkiintoista, D5F3 IHC tuloksia 1 tapauksessa osoittavat, että heterogeeniset värjäys voi esiintyä. Yksi kudos lohko ei näkynyt värjäytymistä toistuvista IHC testausta, kun taas toinen lohko osoitti positiivista värjäytymistä. FISH-analyysi vahvisti läsnäolo geneettisen epänormaaliuden. Me harkitsi mahdollisuutta, että erilaiset tulokset johtui heterogeenisuus.

Vertailu IHC ja RT-PCR

Oli 26 38 tapausta, jotka olivat RT-PCR-positiivisia oli ALK1 IHC-positiivinen , muiden 12 tapauksessa oli IHC negatiivinen. Herkkyys ALK1 IHC havaitsemiseksi ALK uudelleenjärjestelyä oli näin ollen 68,4% (26 38) verrattuna RT-PCR: llä. Kuitenkin, 36 38 RT-PCR-positiivisia tapauksia olivat D5F3-positiivisia (taulukko 3). Siten herkkyys D5F3 oli 94,7% (36 38) verrattuna RT-PCR: llä (taulukko 3). D5F3-positiiviset tapaukset sisältyvät variantti 1, 2, 3a /3b, 3b, E17; A20, E17 ins 65; A20, E17b ins 39; A20, E10a /b, E13; A20, E6a /b ins 18; A20 ja E6a; A19. Kaksi D5F3-negatiivisia tapauksia 38 RT-PCR-positiivisia tapauksia oli muunnelma 3a /b ja E17b ins 39; A20 tapauksessa (taulukko 2). Viisi 123 RT-PCR-negatiivinen tapaukset olivat D5F3-positiivisia.

Vertailu IHC ja FISH

Oli 28 44 FISH-positiivisia tapauksia, jotka olivat ALK1 IHC-positiivisia, ja 4 ALK1 IHC-positiivisia tapauksia, jotka olivat FISH-negatiivisia. Yleinen herkkyys ja spesifisyys ALK1 IHC verrattuna FISH olivat 64% ja 91%, vastaavasti. Sen sijaan 40 44 FISH-positiivisia tapauksia olivat D5F3-positiivisia. Neljä 44 FISH-positiivisia tapauksia olivat D5F3-negatiivisia. Yksi FISH negatiivinen asia oli D5F3-positiivinen. Kaiken herkkyys ja spesifisyys D5F3 verrattuna FISH olivat 91% ja 98% (taulukko 4).

Keskustelu

Vaikka

ALK

-rearranged keuhkosyöpätapauksista tehdä up vain 5%: sta 7% kaikista NSCLC tapauksissa ne ovat osoittaneet vaikuttavan reagointikykyä ALK tyrosiinikinaasiestäjä, crizotinib, ja ovat terapeuttisesti tärkeitä alaluokka. Aiemmat tutkimukset ovat arvioineet ALK uudelleenjärjestely keuhkosyöpää, mutta kattava analyysi

ALK

-rearranged keuhkosyövässä Kiinan ole hyvin arvioida. Havaitsimme 44 tapausta

ALK

-rearranged tapausta 572 keuhkosyövässä. Meidän sarjassa nämä kasvaimet puuttui mutaatio

EGFR, KRAS tai BRAF

, yhteisymmärryksessä ennen havaintojen [14]. Aiemmissa raporteissa tulokset yksityiskohtainen ennusteeseen viittaavia analyysit

ALK

-rearranged keuhkosyövässä ovat vaihdelleet. Perusteellinen tutkimus viittaavia tekijöitä tällaisten potilaiden verrattuna yhteiseen mutaatiot

EGFR

ja

KRAS

tai harvinainen tuntematon mutaatioita on syntymässä ongelma kliinisen edun. Olemme vertasi clincopathologic ominaisuudet

ALK

-rearranged keuhkosyöpä yhteismarkkinoille kuljettajan mutaatiot ja pan-syöpäkasvain.

Tärkein klinikka havainnot Tutkimuksemme olivat seuraavat: (1)

ALK

-rearranged keuhkosyövässä olivat yleisempiä nuoremmilla potilailla verrattuna yhteiseen ajaa mutaatio ryhmä (

p

= 0,023), yhteisymmärryksessä aiempien tutkimusten kanssa, [4], [15], kun taas ei ollut merkitystä eroa verrattuna potilaisiin yleiseurooppalaiseen-negatiivinen ryhmä (

p

= 0,83). (2)

ALK

-rearranged potilailla liittyy tupakointi historia verrattuna yleiseurooppalaisen negatiivinen ryhmä (

p

0,001), kun taas tupakointi historia

ALK

– Uudelleenjärjesty- potilailla ei poikennut yhteisestä ajaa mutaatio ryhmä (

p

= 0,828). (3) ei ollut eroja seksi, kasvaimen koon, imusolmuke tila, kasvaimen tai vaihe välillä

ALK

-positiivinen, yhteinen kuljettaja mutaatio tai yleiseurooppalainen negatiivisia ryhmiä. Tämä ero saattaa johtua harvoissa tapauksissa tutkittu toisessa tutkimuksessa, tai erilaisia ​​kokeilu ryhmittymän suunnittelu, tai sitä, että etnisen. Siksi kliiniset ominaisuudet eivät yksin riitä valitsemalla yksittäistapauksissa lisätestejä

ALK

uudelleenjärjestely.

Tutkimuksessamme kaikki 44

ALK

-rearranged keuhkosyöpätapauksista olivat adenokarsinoomat, 2 tapausta ottaa ylimääräistä polttoväli squamous komponentteja. Mielenkiintoista on, että kummassakaan tapauksessa oli

ALK

uudelleenjärjestelyn läsnä okasolukarsi- komponentti, vahvistettiin sekä kalaa ja IHC. Tämä on toisin kuin yksi raportti, jossa

ALK

uudelleenjärjestelyn olemassa samanaikaisesti sekä osia [15]. Vaikka useimmat

ALK

-rearranged keuhkosyöpätapauksista adenokarsinoomat, muita histologisia tyyppejä ei pitäisi sulkea pois sen läsnäoloa. Tutkimuksessamme

ALK

-rearranged kasvaimia oli ominaista kiinteä tai acinar kasvumalli ja puute lepidic kasvua. Verrattuna yhteinen kuljettaja mutaatio kasvaimet, kiinteät tai acinar-hallitseva kuvio, seulamaisessa rakenne, sinettisormus-rengas solujen hepatoid ulkonäkö, näkyvä solunulkoisen liman, ja mitä tahansa limakalvon soluja kaikki merkitsevästi yhteydessä

ALK

– positiivisia kasvaimia. Tämä on sopimukseen aiemman raportin [13]. Kun verrataan yleiseurooppalaiseen syöpäkasvain vain seulamaisessa rakenne, näkyvä solunulkoisen liman ja mitä tahansa limakalvon soluja merkitsevästi yhteydessä

ALK

-positiivinen keuhkojen adenokarsinooman. Siksi meidän tiedot osoittivat seulamaisessa rakenne, näkyvä solunulkoisen liman ja mitä tahansa limakalvon soluista kuvio ovat herkkiä ja /tai erityisiä ennustaa

ALK

uudelleenjärjestelyn. Useimmissa

ALK

jäsensi kasvaimia, kasvaimen ytimet olivat suhteellisen monomorphic, paitsi 2 tapausta osoittavat painopistealueina pleomorfisimia. Nämä erilliset morfologisia piirteitä

ALK

uudelleenjärjestelyn kasvaimet ovat yhtäpitäviä aiempien raporttien sekä länsimaisia ​​ja aasialaisia ​​kohortteja [15], [16] ja se voi olla avuksi valittaessa tapauksissa edelleen tarkasti molekyylitestauksella.

Vaikka p63 positiivisuus on usein käytetään merkkiaineena okasolusyöpä diagnostisen patologian, huomasimme, että muutamat

ALK

-rearranged kasvaimia ekspressoidaan p63 ja TTF1 että adenokarsinooma komponentti. Tuloksemme ovat paljon poikkea aiemman raportin, joka osoitti, että yli puolet niiden kasvainten koekspressoi TTF-1 ja p63, osoittaa diffuusia värjäytymistä sekä [16]. Jos p63 käytettiin okasolusyöpä merkki tehdä patologisen diagnoosin,

ALK

-rearranged kasvaimia voitaisiin misdiagnosed adenosquamous solukarsinoomat.

tarkka tunnistaminen

ALK

– Uudelleenjärjesty- kasvaimet vaatii herkkää ja erityistä testausmenetelmä. Tällä hetkellä useita tällaisia ​​menetelmiä on olemassa, kuten IHC, FISH, ja RT-PCR: llä. RT-PCR sopii havaitsemaan

EML4-ALK

tai vaihtoehtoisia fuusio selostukset [14], mutta ei ole saatavilla monissa rutiini patologian osastot. Lisäksi, suurin osa näytteistä tallennetaan FFPE, jolloin RNA voidaan olennaisesti heikkene. Lisäksi RT-PCR: llä ei välttämättä havaitse kaikkia translokaatiot, johon geeni. FISH käyttäen ALK break-erilleen koetin oli standardi testi ilmoittautuminen kliinisessä tutkimuksessa crizotinib [6]. Kuitenkin FISH pidetään matalan suoritusteho, joten ei sovellu havaitsemiseksi

ALK

uudelleenjärjestelyihin laajamittaisen seulonnan. IHC on kuitenkin edullinen, suhteellisen helppo tekniikka seulontaan ja diagnosointiin

ALK

-rearranged kasvaimia rutiini kirurginen patologia Käytännössä vaikka jotkut ALK vasta-aineita on raportoitu puuttuvan spesifisyys ja herkkyys [4].

arvioitiin

EML4-ALK

fuusio variantit käyttäen RT-PCR ja tunnistaa, että E13; A20 (variantti 1), E6a /b; A20 (variantti 3a /b), E20; A20 (variantti 2) ovat yleisimpiä variantteja. Tämä taajuus jaetaan on aivan samanlainen kuin raportoitu [17]. Tutkimuksessamme 6 RT-PCR-negatiivinen tapaukset olivat FISH-positiivisia, mikä viittaa esillä muiden tuntemattomia muunnoksia.