Krooninen sairaus

tiivistelmä

aldehydidehydrogenaasille isoformin 1 (ALDH1) on osoittautunut hyödylliseksi tunnistamiseksi syövän kantasoluja. Kuitenkin tietomme ilmaisun ja toimintaa ALDH1 yhteistä epiteelisyövissä ja niitä vastaavat normaaleissa kudoksissa on edelleen suurelta osin poissa. Siksi meidän tunnettu ALDH1 ilmentymisen 24 tyyppisiä normaaleista kudoksista ja laaja kokoelma epiteelituumori yksilöt (kuusi syöpätyyppejä, n = 792) immunohistokemiallisella värjäyksellä. Käyttäen ALDEFUOR määritystä ALDH1 aktiivisuus tutkittiin myös 16 primaarikasvaimen yksilöitä ja 43 perustettu epiteelin syöpäsolujen linjat. Lisäksi munasarjasyöpä siirtogeenisen hiiren mallia ja 7 hiiren munasarjasyövän solulinjoissa analysoitiin. Huomasimme, että ekspressiotasot ja malleja ALDH1 vuonna epiteelisyövissä ovat huomattavan erillisiä, ja ne vastaavat niitä vastaavat normaaleja kudoksia. ALDH1 proteiinin ekspressiotasot korreloivat positiivisesti ALDH1 entsymaattinen aktiivisuus mitattiin ALDEFLUOR määrityksessä. Pitkäaikainen

in vitro

kulttuuri ei vaikuta merkittävästi ALDH1 aktiivisuutta epiteelikasvainsolut. Yhdenmukainen tutkimus muiden syöpien, huomasimme, että korkea ALDH1 ilmentyminen merkitsevästi yhteydessä huonoon kliiniseen tulokseen vuonna serous munasarjasyöpää sairastavilla potilailla (n = 439, p = 0,0036). Lopuksi ALDH

br kasvainsolujen osoittavat syövän kantasolujen ominaisuuksia ja kestävät kemoterapiaa. Uutena syövän kantasoluja markkeri, ALDH1 voidaan käyttää kasvaimia, joita vastaavat normaalien kudosten näihin ALDH1 suhteellisen rajoitettu tai rajoitettu tasoilla, kuten rinta-, keuhko-, munasarja- tai paksusuolensyöpä.

Citation: Deng S, Yang X , Lassus H, Liang S, Kaur S, Ye Q, et al. (2010) Distinct eksressoitumistasojen ja Patterns of Stem Cell Marker, aldehydidehydrogenaasi Isoformi 1 (ALDH1), Human epiteelisyövissä. PLoS ONE 5 (4): e10277. doi: 10,1371 /journal.pone.0010277

Editor: Yihai Cao, Karolinska Institutet, Ruotsi

vastaanotettu: 01 joulukuu 2009; Hyväksytty: 30 maaliskuu 2010; Julkaistu: 21 huhtikuu 2010

Copyright: © 2010 Deng et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustusta Breast Cancer Alliance (LZ), munasarjasyöpä Research Todettu (Liz Tilberis Scholar, LZ), Mary Kay Ash hyväntekeväisyysyhdistykseksi (LZ), National Cancer Institute (R01CA142776 ja munasarjasyöpä SPORE P50-CA83638-7951 projekti 3, LZ), ja Yhdysvaltain puolustusministeriön (W81XWH-10-1-0082, LZ). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Tutkimus on tuettu voimakkaasti syövän kantasolujen hypoteesi, jossa ehdotetaan, että suhteellisen harvinainen alapopulaation syöpäsolujen on ainutlaatuinen kyky aloittaa ja säilyttää kasvaimen kasvu [1], [2], [3], [4], [5], [6], [7], [8], [9], [10]. Nämä solut, joita kutsutaan syöpä kantasolut tai kasvaimeen aloittamista solujen jakaa eri ominaisuudet alkion ja somaattisten kantasolujen lukien itseuudistumiseen ja multi-voimakas eriytyminen [11], [12], [13], [14], [15] , [16], [17]. Syöpä kantasolut voivat olla erittäin vastustuskykyinen säteilyä tai kemoterapiaa [18], [19], [20], siis kehittämään tehokkaampia hoitomuotoja syöpään edellyttää tehokasta kohdentamista tämän solupopulaation [11], [12], [13 ], [14], [15], [16], [17]. Syövän kantasoluja voidaan tunnistaa ja eristää käyttäen spesifisiä markkereita normaali progenitori- tai kantasolujen saman elimen [16], [21]. Useat markkerit, ovat hyödyllisiä eristämiseksi osajoukkojen rikastettu epiteelin syövän kantasoluja, mukaan lukien CD44 /CD24 (HAS /PGP1) [3], CD133 (PROM1) [4], ATP-sitova kasetti B5 (ABCB5) [22], CD90 (THY1) [23], CD61 (β3 integriini) [24], 26S-proteasomin aktiivisuus [25], sekä Hoechst33342 syrjäytyminen [6], [26], [27].

aldehydidehydrogenaasille ( ALDH) katalysoi peruuttamattomasti hapettumista erilaisia ​​alifaattisten ja aromaattisten aldehydien vastaavat karboksyylihapot [28]. Korkea ALDH-aktiivisuus havaitaan kanta- ja progenitorisolujen eri suvusta, kuten hematopoieettiset [29], [30], [31], mesenkymaaliset [32], hermo [33], rintarauhasen [34], [35] ja eturauhasen [36] . ALDEFLUOR määritys on alun perin kehitetty havaitsemaan ALDH aktiivisuutta hematopoieettisten kudosten Fluoresoivan ALDEFLUOR reaktiotuotteen kerääntyy kantasoluja ja korreloi ALDH toimintaa [29]. ALDH muuntaa ALDH alustan, BAAA (BODIPY-aminoasetaldehydidietyyliasetaali), osaksi fluoresoiva tuote BAA (BODIPY-aminoasetaatti), joka pysyy sisällä eläviä soluja. Solut, jotka ilmentävät korkeita ALDH tullut kirkkaasti fluoresoiva (ALDH

br) ja voidaan tunnistaa ja luetella tavallisella virtaussytometriä tai eristetään solulaji lisäpuhdistusta ja karakterisointia. ALDECOUNT® on FDA-hyväksytty

in vitro

diagnostinen tuote, joka perustuu ALDEFLUOR määritystä ja sitä käytetään tunnistus- ja luettelointi kantasoluja kliinisiä sovelluksia. Viimeisimpänä ALDEFLUOR määritys on sovellettu menestyksekkäästi tunnistamaan kantaisä ja syövän kantasoluja ei-hematopoieettista kudoksissa kuten rintarauhasen ja rintasyöpiä [34]. ALDEFLUOR reagenssi tiedetään toimivan substraattina ALDH1. Tärkeämpänä, ALDH1 spesifistä vasta-ainetta voidaan käyttää havaitsemaan syövän kantasoluja parafinoidut kliinisissä näytteissä [34]. Useat riippumattomat ryhmät ovat raportoineet, että ALDH1 ilmaisua voidaan käyttää prognostisena markkerina epiteelisyöpien [34], [37], [38], [39], [40], [41], [42], [43]. Siksi ALDEFLUOR määritys ja ALDH1 immunovärjäys voi osoittautua hyödylliseksi havaitsemista ja eristämisen syövän kantasoluja epiteelin kasvaimissa, mikä helpottaa käyttöönottoa syövän kantasolujen käsitteitä kliiniseen käytäntöön [34]. Kuitenkin tietomme ilmaisun ja toimintaa ALDH1 ihmisen epiteelisyövissä ja niitä vastaavat normaaleissa kudoksissa, sekä sen kliinistä merkitystä, on vielä lapsenkengissä. Voidaan parantaa tietämystä tällä tärkeällä alueella, olemme tunnettu ALDH1 ilmentymisen 24 tyyppisiä normaalin ihmisen kudosten sekä laaja kokoelma parafiiniin upotetut ihmisen epiteelituumori yksilöt (kuusi syöpätyyppejä, n = 792) immunohistokemiallisella värjäyksellä. Käyttäen ALDEFUOR määritystä ALDH1 aktiivisuus tutkittiin myös 16 primaarikasvaimen yksilöitä ja 43 perustettu ihmisen epiteelin syöpäsolujen linjat. Lisäksi munasarjasyöpä siirtogeenisen hiiren mallia ja 7 hiiren munasarjasyövän solulinjoissa analysoitiin tutkimukseen.

Materiaalit ja menetelmät

tuore Kasvaimen näytteet

Kudokset saatiin sen jälkeen, kun potilaiden kirjallinen lupa yleisen kudos kokoelma protokolla hyväksymän toimielimen Institutional Review Board (IRB), University of Pennsylvania. Kaikki näytteet kerättiin aikaan rajaamisvai- kirurgian aiemmin hoitamattomia potilaita, joilla myöhäisvaiheen munasarjasyöpään. Erytrosyytit lyysattiin ammoniumkloridiliuoksella. Yksisoluiset suspensiot valmistettiin käyttämällä 40 um: n solusiivilän. Kuolleet solut poistettiin käyttäen magneettisia helmiä (Dead Cell Removal Kit, Miltenyi Biotec) ja MidiMACS erotin.

kudossiruina

Tissue array verkko kohortti:

FDA normaalin ihmisen elinkudoshomogenaa- microarray käytettiin luonnehtimaan ALDH1 ilmentymisen normaalissa elimissä. Tätä kudosta joukko alustan mukana 24 eri normaalista ihmisen elinten perustuu FDA ohjeita, ja kukin urut otettiin näyte 3 terveillä henkilöillä. Kuusi eri ihmisen epiteelituumori kudossiruina käytettiin kuvaamaan ALDH1 ilmaisun epiteelin kasvaimissa. Jokainen potilas edusti ainakin kaksi keskeistä kudosbiopsioista.

Helsinki kohortti:

munasarjasyöpäsolu kudos microarray käytettiin tutkimaan ennustetekijöiden merkitystä ALDH1 munasarjasyövän. Array mukana potilaita hoidettiin ensisijaisesti serous munasarjakarsinooma Helsingin yliopistollisessa keskussairaalassa.

Solulinjat ja Cell Culture

Yhteensä 50 perustettiin syövän solulinjoja käytettiin tässä tutkimuksessa myös 15 ihmisen rinta-, 18 ihmisen munasarja-, 7 hiiren munasarjan, ja 10 ihmisen paksusuolen. Kaikki syöpäsolulinjoja viljeltiin RPMI 1640 -alustassa, jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia (Invitrogen). Kolme riippumatonta ikuisti ihmisen munasarjan pinnan epiteelisolujen (IOSEs) oli jalomielinen lahjoitus tohtori Auersperg, ja viljeltiin 01:01 yhdistelmä väliaineen 199 ja MCDB 105 väliaineen (Sigma) täydennettynä 15% FBS. Hiiren munasarjojen pinnan epiteelisolujen (Moses) eristettiin ja viljeltiin kuten aiemmin raportoitu [44].

siirtogeenisiä hiiriä

Eläin tutkimusprotokolla tarkasteli ja hyväksyi laitoksen eläinten hoito ja käyttö komitea ( IACUC) ja University of Pennsylvania. Munasarjasyöpä MISRII-SV40 siirtogeenisen hiiren muodostettiin tri Denise Connolly laboratoriossa [45].

immunohistokemia ja kuva-analyysi

immunohistokemia (IHC) suoritettiin käyttäen Vectastain ABC Kit, kuten on kuvattu valmistaja (Vector). Seuraavat ensisijaiset vasta-aineita käytettiin tässä tutkimuksessa: hiiren anti-humaani ALDH1 (klooni 44 /ALDH, 1:250, BD Pharmingen) [34], [39], [46]; hiiren anti-humaani-Ki67 (1:100, DAKO) ja kanin anti-humaani CD45 (1:200, Millipore). Vasta-aineita inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa. Immunorektiosta visualisoitiin 3,3′-diaminobentsidiiniä. Double immunofluoresenssivärjäyksellä suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [47].

ALDEFLUOR Pitoisuus

ALDH-aktiivisuus havaittiin käyttäen ALDEFLUOR iinianalyysikitissä (StemCell Technologies) kuten valmistaja on kuvannut. Lyhyesti, erottaa yksittäisiksi soluiksi solulinjoista tai tuumorinäytteitä suspendoitiin ALDEFLUOR määrityspuskurissa, joka sisältää ALDH substraattia, BODIPY-aminoasetaldehydi (BAAA), 1,5 uM, ja niitä inkuboitiin 1 tunti 37 ° C: ssa. Erityinen ALDH-inhibiittoria, diethylaminobenzaldehyde (DEAB), on 10-kertainen mooliylimäärä, käytettiin negatiivisena kontrollina. Virtaussytometria analysoitiin BD FACSDiva ohjelmisto V6.1.3 (BD ​​Biosciences) tai FlowJo ohjelmisto (TreeStar).

Protein eristäminen ja Western blot

Viljellyt solut hajotettiin 200 pl hajotuspuskuria joka sisälsi 50 mM Tris-HCI (pH 7,4), 150 mM NaCl: a, ja 1% Triton X-100. Proteiinit erotettiin 10% SDS-PAGE denaturoivissa olosuhteissa, ja siirrettiin nitroselluloosamembraaneille. Membraanit inkuboitiin anti-ALDH1 primäärinen vasta-aine (1:300, BD Pharmingen), jota seurasi inkubointi anti-hiiri-vasta-ainetta, joka oli konjugoitu piparjuuriperoksidaasiin (1:5,000, Amersham Biosciences). Immunoreaktiivisia proteiineja visualisoitiin käyttämällä ECL Western Blotting Substraatti (Thermo Scientific).

Mammosphere kulttuuri

Mammosphere viljelmät suoritettiin, kuten on kuvattu Dontu

et ai

[48]. Lyhyesti, yksi solua maljattiin ultra-low kiinnitys 24-kuoppaisille levyille (Corning) tiheyteen 20000 elävää solua /ml ja 5000 solua /ml Myöhemmissä siirroissa. Soluja kasvatettiin seerumittomassa mammosphere elatusaineessa (MammoCult, StemCell Technologies), jota oli täydennetty MammoCult Proliferation lisäravinteet. Mammospheres kerättiin varovasti sentrifugoimalla (800 rpm) jälkeen 7-10 päivää ja liukenevat sekä mekaanisesti ja entsymaattisesti (10 min 0,05% trypsiiniä, 0,53 mM EDTA-4Na).

In vivo

tuumorigeenistä määritys

eläin tutkimusprotokolla tarkasteli ja hyväksyi laitoksen eläinten hoidon ja käytön komitea (IACUC) ja University of Pennsylvania. Kuudesta kahdeksaan viikkoa vanhoja naaraspuolisia immuunijärjestelmän hiirissä käytettiin näissä tutkimuksissa. ALDH

alhainen ja ALDH

br (ALDH

kirkas) solut eristettiin FACS lajittelua. Solut suspendoitiin fosfaattipuskuroituun suolaliuokseen sekoitetaan yhtä suureen tilavuuteen Matrigel (BD Biosciences), 10 mg /ml. Kokonaistilavuus 0,3 ml, joka sisälsi 500; 5000 tai 50000 solua, injektoitiin ihonalaisesti (joilta on poistettu munasarjat ja estrogeeni-pelletti täydennetty hiiret).

MTT-määritystä

MTT määritykset suoritettiin 96-kuoppalevyillä käyttäen Cell Proliferation Kit (I) ( Roche) valmistajan ohjeiden mukaisesti.

tilastollinen

tilastollinen analyysi suoritettiin SPSS ja StatView tilastollisia ohjelmapaketteja.

tulokset

Expression ja jakelu ja ALDH1 proteiinin normaaleissa ihmisen kudoksissa

kantasolujen markkeri, ALDH1 on käytetty syövän toteamiseksi kantasolujen useita eri ihmisen kasvaimia käyttäen immunohistokemiallista värjäystä; kuitenkin, sen ilme ja leviäminen normaaleissa ihmisen kudokset ovat vielä suurelta osin tuntemattomia. Käsitellä tätä tärkeää kysymystä, me tunnettu ekspressiokuviota ALDH1 normaaleissa ihmisen kudoksissa immunohistokemiallisella värjäyksellä. FDA-hyväksytty normaalin ihmisen elinkudoshomogenaa- microarray käytettiin tässä tutkimuksessa. Täällä, 24 tyypit normaalin ihmisen elinten sisältyivät perustuvat FDA suuntaviivojen jossa jokainen elin otettiin 3 normaalin ihmisen yksilöitä. Hiiren anti-humaani ALDH1 vasta-aine (klooni 44 /ALDH) [34], [39], [46], käytettiin havaitsemaan ALDH1 ilmentymisen. Kuten kuviossa 1A on esitetty, ALDH1 positiivista värjäytymistä havaittiin pääasiassa sytoplasmassa, ja se ilmentyy laajasti ruoansulatuskanavan (mukaan lukien epiteelin ja ruokatorven, mahan, suolen ja paksusuolen, sekä maksan ja haiman), hormonitoimintaa (mukaan lukien lisämunuaisen, aivolisäkkeen, kilpirauhasen ja sylkirauhasten) ja sukuelimiin (munasarja- ja kiveksissä). Ei ollut havaittavissa ALDH1 positiivisten solujen aivoissa ja pikkuaivoissa (kuvio 1A). Muissa elimissä, ALDH1 jaettiin tietyillä alueilla ja tietyissä solutyypeissä. Esimerkiksi pernassa, ALDH1 positiiviset solut olivat pääasiassa esiintyy valkosoluissa punainen massan alueilla, mutta ei valkoinen massa (kuvio 1A). Tärkeää on, sopusoinnussa muiden raporttien [34], [46], [49], voimakkaasti ALDH1 positiivisia soluja havaittiin alat, joilla epiteelin kantasolujen /-esisoluja oletettavasti sijaitsevat rinta, paksusuoli ja vatsa (kuvio 1 B). Normaalissa rinta, ALDH1 positiiviset solut sijaitsevat pääasiassa luminal alueella (kuvio 1 B), ja ne olivat suhteellisen harvinainen väestöstä (1-2% luminal epiteelisolujen). Pieni ALDH1 positiivisia soluja havaittiin myös normaaleissa rinta- strooman (kuvio 1 B). Double immunohistokemiallisella värjäyksellä osoitti, että useimmat näistä soluista ( 90%) oli CD45 leukosyyttiä (tuloksia ei ole esitetty). Normaalissa paksusuolessa, mutta heikosti ALDH1 positiivisten solujen voitiin löytyy lähes kaikissa tavanomaisissa crypts määrä vahvasti positiivinen ALDH1 solujen melko vähäinen (kuvio 1 B). Nämä voimakkaasti positiivinen soluja lähinnä sijaitsevat perustaa kryptissa (kuvio 1 B). Samanlaisia ​​värjäyskuviot nähdään myös mahassa (kuvio 1 B).

. FDA normaali ihmisen elinkudoshomogenaa- microarray käytettiin luonnehtimaan ilmaisua ja jakelu ALDH1 24 kudoksiin. B. vahvasti positiivisia ALDH1 solujen havaittiin alueilla, joilla epiteelin kantasolujen /-esisoluja oletettavasti sijaitsevat rinta, paksusuoli ja vatsa.

Expression ja jakelu ALDH1 proteiinin ihmisen epiteelikasvaimissa

Seuraavaksi tutkimme ALDH1 ilmentymistä ihmisen epiteelin kasvaimissa käyttäen kudosmatriisien. Kuten edellä on esitetty, kuvioita ja ekspressiotasoja ALDH1 normaaleissa ihmisen kudoksissa ovat huomattavan erilaisia ​​ja ne voidaan luokitella kolmeen tyyppiin: 1) kudoksen poissa tai rajoitettu ALDH1 ilmaisu, kuten rinta- tai keuhkosyöpä; 2) kudos suhteellisen heikko ALDH1 ilmaisu, kuten paksusuolen tai mahalaukun epiteelin; ja 3) kudoksen laaja ja korkea ilmentymä ALDH1 kuten, kuten maksa- tai haimatulehdus (kuvio 1A). Niinpä päätimme kuusi (rinta-, n = 69; keuhkot, n = 66; munasarja-, n = 65; paksusuoli, n = 67; maksa, n = 67, ja haimasyöpä, n = 19) epiteelisyövissä jonka vastaava normaali epitheliums edustivat kunkin alatyypin. Kaikki kuusi kasvaintyypeissä, suuri määrä ALDH1 positiivisia kasvainta infiltroivia strooman solujen havaittiin (kuvio 2B). Immunohistokemiallisen osoitti, että suurin osa näistä oli CD45-positiivisia soluja. Prosenttiosuus ALDH1 positiivisia kasvainsoluja kasvaimen saarekkeiden itsenäisesti kvantitoitiin kaksi tutkijaa kanssa patologinen koulutusta. Stroomakasvaimet ALDH1 positiiviset solut jätetään tämän analyysin. Olemme havainneet, että ALDH1 ilmentyminen oli negatiivinen 79,7% (55/69) Rintojen, 18,2% (12/66) keuhkojen ja 23,1% (15/65) munasarjojen syöpien. Päinvastoin, vain 6,0% (4/67) paksusuolen ja 5,3% (1/19) haiman syövistä olivat ALDH1 negatiivisia, ja kaikki maksasyövän näytteet olivat ALDH1 positiivisia. Lisäksi, näiden ALDH kasvaimia, prosenttiosuus ilmentävien kasvainsolujen ALDH1 analysoitiin myös. Yksityiskohtainen prosenttiosuus ALDH1 positiiviset syöpäsolut on esitetty yhteenvetona kuviossa 2C. Lukuun ottamatta rintasyövän (4,3%), suuri osa ALDH1 ilmaisun (välillä 75-100% kasvainsolujen) havaittiin kussakin viiden muun syövän tyypit (munasarjojen: 29,2%, paksusuolen: 38,8%, keuhkojen : 43,9%, haiman 78,9% ja maksan: 97,0%). Yhdessä oli selvä korrelaatio ALDH1 ilmaisun välillä kasvainten ja vastaavien normaaleissa kudoksissa. Esimerkiksi niissä syöpätyypeissä, jossa ALDH1 oli hyvin ilmaistu vastaavassa normaalissa epitheliums, kuten maksan ja haiman syövät, ALDH1 ilmaistiin useimmissa kasvaimen yksilöitä huomattavan korkealla tasolla.

kudossiruina käytettiin kuvaamaan ilmaisun ja jakelu ALDH1 syövissä (n = 353). A. ilmentäminen ALDH1 vastaavassa normaaleissa kudoksissa. B. ALDH1 + kasvainta infiltroivia soluja havaittiin strooman. C. ilmentäminen ALDH1 epiteelin kasvaimissa. Prosenttiosuus ALDH1 + kasvainsolujen tiivistää. D. Korkea prosenttiosuus ALDH1 + soluja liittyy huono kliinisten tulosten vakavasta munasarjasyöpä.

On raportoitu riippumattomien ryhmien, että suuri osa ALDH1 positiivisia kasvainsoluja liittyy lyhyempi selviytymisen kertaa rintojen [34], [37], [42], keuhkosyöpä [38], haiman [40], virtsarakon [41] ja eturauhasen [43] syöpäpotilailla. Testasimme prognostinen arvo ALDH1 käyttäen kudosta joukko vakavien munasarjojen syöpien, yleisin histotype ihmisen munasarjan epiteelin syövän. Näytteet kerättiin osastolta Gynecology and Obstetrics Helsingin yliopistollisessa keskussairaalassa. Mediaani seuranta-ajan potilaiden elossa lopussa tutkimuksen aikana oli 101 kuukautta, jotka vaihtelevat 4-475 kuukautta. Potilaat jaettiin kahteen ryhmään perustuen ALDH1 immunovärjäyksellä: ALDH1 alhainen (alle 10% kasvainsoluista olisi ALDH1 positiivinen) ja ALDH1 korkea (≥10% kasvainsoluista olisi ALDH1 positiivinen). Vastaa tuloksia, rinta- [34], [37], [42], keuhkosyöpä [38], haiman [40], virtsarakon [41] ja eturauhasen [43] syöpäpotilailla, olemme havainneet, että potilailla, joilla on korkea ALDH1 oli lyhyempi tauti vapaa ja kokonaiselinaika kertaa verrattuna niihin, joilla on alhainen ALDH1 (p = 0.0036 ja p = 0,023, vastaavasti, kuvio 2D).

ALDH1 entsyymiaktiivisuus epiteelikasvainsolut

ALDEFLUOR reagenssi, alunperin pyritään havaitsemaan ALDH toimintaa hematopoeettisissa kudoksissa [29], tiedetään toimivan substraattina ALDH1. Viime aikoina ALDEFLUOR määritys on onnistuneesti sovellettu havaitsemaan ALDH

br syövän kantasoluja ei-hematopoieettista kasvaimia [34]. Esillä olevassa tutkimuksessa olemme käytetään tässä määrityksessä tutkia ALDH1 entsyymiaktiivisuus epiteelikasvainsolut

in vitro

. Ensimmäinen, vahvistaa tulokset kudoksen array, päätimme solulinjat kolmen epiteelituumori muodoissaan, mukaan lukien rinta (n = 15), munasarjojen (n = 18) ja paksusuolen (n = 10). Kuten kuviossa 2 on esitetty, osuus kasvainten, joilla on korkea taajuus ALDH1 positiivisten solujen oli suurempi paksusuolensyöpä verrattuna rinta- tai munasarjasyöpä. Tämän mukaisesti havainnon, huomasimme, että prosenttiosuus ALDH

br solujen koolonsyöpäsolulinjaa (15,5 ± 11,5%) oli huomattavasti korkeampi kuin rinta (3,5 ± 4,8%) tai munasarjojen (6,2 ± 13,5%) syöpäsolun linjat (kuvio 3B ja taulukko S1). Edelleen vahvistaa tämän seurauksena olemme havainneet ALDH1 proteiinin ilmentyminen western blotit näissä solulinjoissa. Kuten odotettua, ALDH1 proteiinin ilmentymisen tasot korreloivat positiivisesti prosenttiosuus ALDH

br solujen solulinjoissa (kuvio 3C ja kuvio S3). Vaikka oli olemassa selkeä positiivinen korrelaatio

in situ

immunovärjäyksen ja ALDEFLUOR määrityksen tulokset näissä kolmessa kasvaintyypeissä, solujen prosenttiosuus, joilla ALDH1 entsyymiaktiivisuutta virtaussytometrillä oli pienempi kuin prosenttiosuus ALDH1 positiivisten solujen immunovärjäyksellä . Esimerkiksi, 4,3%, 29,2% ja 38,8% rinta-, munasarja- ja paksusuolen syövän yksilöt ilmentyy voimakkaasti ALDH1 (välillä 75-100% tuumorisolujen olivat ALDH1 positiivinen, kuvio 2C), kuitenkin yksikään kasvainsolulinjojen koostuivat yli 75% ALDH

br soluja (taulukko S1). Seuraavaksi me valitsimme munasarjasyövän esimerkkinä tutkia ALDH entsyymiaktiivisuuden primaarisen kasvaimen soluihin. Kuusitoista myöhäisessä vaiheessa munasarjasyöpään näytteet tutkittiin. Koska huomasimme, että kasvainta infiltroivien leukosyyttien ilmaistuna korkea ALDH1 (kuvio 2B), ensin erottaa askites solujen CD326 (EpCAM, epiteelin merkki portille kasvaimen solupopulaation) tai CD45 (lymfosyytti maker portin lymfosyyttipopulaatiossa) jälkeen poistamalla kuolleet solut käyttäen magneettisia helmiä. ALDEFLUOR määritystä käytettiin havaitsemaan solujen ALDH aktiivisuus kussakin edellä populaation (kuvio 4A). Olemme havainneet, että 2,6 ± 3,1% (0,1-11,3%) ja CD45-positiiviset solut olivat ALDH

br (kuvio 4B). Yhdenmukainen solulinjan tutkimuksessa 1,1 ± 1,9% (0,1-7,0%) on CD326 positiivisia kasvainsoluja olivat ALDH

br (kuva 4B), alhaisempi kuin Immunovärjäyksen tuloksiin.

. ALDH1 entsymaattinen aktiivisuus havaittiin käyttäen ALDEFLUOR määritystä. DEAB käytettiin estä reaktiota ALDH kanssa ALDEFLUOR reagenssin, joka tarjoaa negatiivisen kontrollin. B. Yhteenveto ALDH1 entsyymiaktiivisuus perustettu rinta (n = 15), munasarjojen (n = 18) ja paksusuolen (n = 10) syöpäsolulinjoissa. C. ALDH1 proteiinin ekspressio havaittiin Western blot. Oli positiivinen korrelaatio ALDH1 proteiinin ilmentymisen ja ALDH1 entsymaattinen aktiivisuus. Täyspitkä blotteja on esitetty Supplemental kuvassa S3.

. ALDH1 entsymaattinen aktiivisuus soluissa, eristettiin yhdestä munasarjasyöpä näyte. Kuolleet solut poistettiin käyttäen magneettisia helmiä ja MidiMACS erotin. Sillä Immunofenotyypitys ALDH

br askites solut, APC-CD45 tai APC-CD326 käytettiin counterstaining. DEAB käytettiin estä reaktiota ALDH kanssa ALDEFLUOR reagenssin, joka tarjoaa negatiivisen kontrollin. B. Yhteenveto prosenttiosuuksien ALDH

br jokaisessa solussa väestön 16 myöhäisvaiheen munasarjasyöpä potilaille.

onko kysymyksessä pitkäaikainen

in vitro

kulttuuri vaikuttaa merkittävästi ALDH aktiivisuutta syövän solulinjoissa, päätimme munasarjasyöpäsolu siirtogeenisen hiiren mallia, jossa onkogeenin (transformoivan alue SV40) yliekspressoitui jonka munasarjojen pinnan erityinen Mullerin estävä aine tyypin II reseptori (MISRII) promoottori (Kuva S1A). ALDEFLUOR Määritys suoritettiin sekä primaarisen eristetyn kasvainsoluja ja kaksi pitkän aikavälin viljelmiä kasvainsolulinjojen (yli 40 kohdat), jotka eristettiin samasta mallista. Huomasimme, että ei ollut merkittävää eroa prosentteina ALDH

br solujen välillä primaarikasvainten (9,5 ± 7,6%, n = 5) ja pitkän aikavälin soluviljelmissä (6,8 ± 4,9%, n = 2, P 0,05 , kuvio S1B). Koska vain rajoitettu määrä solulinjoja analysoitiin tässä tutkimuksessa, tämä johtopäätös on vielä vahvistaa muissa malleissa.

Lopuksi vertasimme ALDH aktiivisuutta munasarjasyöpäsoluja ja niiden vastaavassa normaalissa epitheliums, munasarjojen pinnan epiteelisolujen. Kolme ihmisen immortalisoitu munasarjojen pinnan epiteelisolujen solulinjoja verrattiin 18 ihmisen munasarjasyövän solulinjoissa, ja primaarisen eristetyn hiiren munasarjojen pinnan soluja verrattiin 7 hiiren munasarjasyövän solulinjoissa (mukaan lukien kaksi riviä MISIIR-SV40 siirtogeeninen hiiri). Olemme havainneet, että prosenttiosuus ALDH

br soluissa oli suhteellisesti suurempi normaalin munasarjan pintaepiteelisolujen (ihminen: 13,1 ± 6,72%, n = 3, hiiren: 7,6%, n = 1) verrattuna munasarjasyöpä soluja (ihmisen: 6,2 ± 13,5%, n = 18; hiiren: 3,8 ± 2,92%, kuvio S2). Vastaavasti osuus ALDH

br soluissa oli suhteellisesti suurempi normaaleissa nisäepiteelisoluissa (8,18 ± 4,31%, n = 14) [34] verrattuna rintasyövän soluja (3,5 ± 4,8%, n = 15, kuvio 3) .

ALDH

br tuumorisolut ovat syöpä kantasolujen ominaisuuksia ja vastustetaan kemoterapia

on osoitettu, että ALDH

br kasvainsolut eristettiin primaarisista ihmisen kasvaimia tai lyhyestä -term kohdat soluja NOD /SCID-hiiriin syövän kantasolujen ominaisuuksia [34] ja ne kestävät kemoterapiaa [50], [51]. Tutkia syövän kantasolujen ominaisuuksia ALDH

br soluja eristettiin perustettu pitkäaikaisen viljellyt solulinjat, ALDH

alhainen ja ALDH

br kasvainsolut eristettiin perustettiin ihmisen rinta- ja munasarjasyövän solulinjoissa FACS lajittelu. Ensinnäkin, niiden itseuudistumista kyky tutkittiin käyttäen mammosphere määritystä [48] neljä rintasyövän soluissa. Määrä mammospheres muodostettu ALDH

br kasvainsoluja oli huomattavasti korkeampi kuin ALDH

alhainen kasvainsoluja (kuvio 5A). ALDH

alhainen soluja T47-D ja ZR-75-1 solulinjat puuttui kyky muodostaa mammospheres suspensioviljelmässä. Seuraavaksi tutkimme heidän

in vitro

kasvaimen kasvua ominaisuuksia käyttäen pesäkemuodostusta 5 rintasyövän solulinjoissa. ALDH

br kasvainsolut muodostivat näkyvästi suuremmat pesäkkeitä verrattuna ALDH

pieni kasvainsoluja (kuvio 5B). Lisäksi siirtomaa numerot ALDH

br kasvainsolut olivat huomattavasti korkeammat kuin mistä ALDH

pieni kasvainsoluja (kuvio 5B). Lopuksi

in vivo

tuumorigeenisia kyky ALDH

alhainen ja ALDH

br kasvainsolujen tutkittiin käyttäen kasvainsoluja, jotka oli siirre-istutetut (500, 5000, tai 50000) immuunijärjestelmän hiirissä . Olemme havainneet, että 500 ALDH

br mutta ei ALDH

pieni kasvain solut kykenivät tuottamaan ksenograftikasvaimissa

in vivo

(kuvio 5C). Histologia kolmen ksenograftikasvaimissa tutkittiin HE värjäys. MCF-7 ja SKBR-3 solulinjoissa, ei ollut merkitsevää histologista eroa ALDH

br ja ALDH

pieni kasvaimia. Kuitenkin BT-474 kasvaimia, siellä oli rajoitettu stroomasoluista ALDH

br kasvaimissa verrattuna ALDH

pieni kasvain (kuvio 5D).

In vivo

soluproliferaatiota tutkittiin myös käyttäen Ki-67 värjäystä. Emme löytäneet mitään merkittävää eroa leviämisen indeksin (prosentteina Ki-67-positiivisia soluja) välinen ALDH

br ja ALDH

pieni kasvaimia kaikissa kolmessa solulinjoissa (kuvio 5E).

A. ALDH

br solupopulaatioiden (Blue) syntyy huomattavasti suurempi määrä mammospheres verrattuna ALDH

harvaan (keltainen). B. kasvainten muodostumiseen ja ALDH

br ja ALDH

alhainen solut tutkittiin

in vitro

avulla pesäkkeen muodostumista määrityksiä. C. kasvainten muodostumiseen ja ALDH

br ja ALDH

alhainen solut tutkittiin

in vivo

. D. histologia on ALDH

br ja ALDH

matalan BT-474 kasvaimet tutkittiin HE värjäys. E. lisäkasvu ALDH

br ja ALDH

matalan BT-474 kasvaimet tutkittiin Ki-67 immunovärjäys.

Nopeasti kertyvät todisteet osoittavat, että syöpä kantasolut voivat olla erittäin vastustuskykyinen säteilyä tai kemoterapiaa [18], [19], [20]. Yhdenmukaisesti näiden havaintojen, huomasimme, että ALDH

br solupopulaation laajennetaan joukko platinaa resistenttien munasarjasyövän solulinjoissa, A2780 /CP70, A2780 /C200 ja A2780 /C30, verrattuna niiden vanhempien platina herkkä viiva, A2780 /WT (kuva 6A). Lisäksi solujen käsittely sisplatiini (1XIC

50) merkittävästi rikastuttanut ALDH

br solupopulaation munasarja- ja rintasyövän solulinjoissa

in vitro

(kuvio 6B). ALDH

br väestöstä oli huomattavasti vastustuskykyisempiä platina hoitoon verrattuna ALDH

harvaan (kuva 6C). Lopuksi testaamme edellä havainto

in vivo

käyttämällä munasarjasyöpä ksenografti- hiirimallissa. Kolmen viikon kuluttua kiinnittymisestä kasvainsolujen, A2780 (5 x 10

6 eläintä kohden), hiiret jaettiin satunnaisesti kolmeen koeryhmään saada hoitoa i.p. injektio 1) ohjaus käsittelyä (n = 4), 2) 2 mg /kg cis-platina hoidon (½ suurin siedetty annos (MTD), n = 3), ja 3) 4 mg /kg cis-platina hoidon (koko MTD, n = 3). Q7d × 4 i.p. hoito-ohjelmaa (kuvio 6D), käytettiin kokeellisen hoito. Prosentuaalinen osuus ALDH positiivisilla analysoitiin ALDEFLUOR määrityksessä. Vastaa meidän

in vitro

data, cis-platina hoito lisäsi merkittävästi ALDH

br solupopulaation vierassiirrekokeissa kasvain

in vitro

(kuvio 6D, ½ MTD: 8,44-kertaisesti keskimääräisen ; täysi MTD: 4.67-kertaisesti keskimäärin verrattuna ei-käsiteltyjen kasvainten). Se ehdottaa, että ALDH

br tuumorisolupopulaatioon kestää kemoterapiaa. Samanlaisia ​​tuloksia raportoitiin myös paksusuolen syövän

in vivo

viimeksi riippumaton ryhmä [50].

. ALDH

br soluja huomattavan laajennettiin platinaa resistenttien solulinjojen (A2780 /CP70, A2780 /C200 ja A2780 /C30) verrattuna niiden vanhempien platina herkkä viiva (A2780 /WT). B.

In vitro

platina hoito lisäsi merkittävästi ALDH

br solupopulaation munasarja- ja rintasyövän solulinjoissa kolmen päivän jälkeen. C. ALDH

br solut olivat resistenttejä platina hoitoon. ALDH

br ja ALDH

alhainen solut eristettiin FACS lajittelua. D. ALDH

br tuumorisolupopulaatioon oli resistentti kemoterapiaa

in vivo

. Q7d × 4 i.p. hoito-ohjelmaa käytettiin kokeellista terapiaa. Kasvaimet kerättiin ja erottaa toisistaan ​​entsyymidigestiolla. Prosentuaalinen osuus ALDH

br väestö analysoitiin ALDEFLUOR määrityksessä.

Keskustelu

Koska uusi lähestymistapa, ALDEFLUOR määritys ja ALDH1 immunovärjäys voi osoittautua hyödylliseksi havaitsemista ja eristäminen syövän kantasolujen epiteelin kasvaimissa, mikä helpottaa soveltaminen syövän kantasolujen käsitteitä kliiniseen käytäntöön [34]. Huomasimme, että malli ja ekspression taso ALDH1 normaaleissa ihmisen kudoksissa ovat huomattavan erilaisia ​​ja voidaan luokitella kolmeen ryhmään: 1) kudoksen kanssa poissa tai rajoitettu ALDH1 ilmaisua, kuten rinta- tai keuhkosyöpä; 2) kudos suhteellisen heikko ALDH1 ilmaisu, kuten paksusuolen tai mahalaukun epitheliums; ja 3) kudoksen, jolla on laaja ja suuri ilmentymisen ALDH1, kuten maksan tai haiman (kuvio 1A).