Krooninen sairaus

tiivistelmä

Kasvain kehityksen mukana on monimutkainen isännän systeemisen vasteen, joka sisältää tulehdus- ja angiogeenisen reaktioita. Sekä kasvainperäinen ja systeemisen proteiinit havaitaan plasmassa syöpäpotilailla. Ottaen kuitenkin huomioon niiden epäspesifinen luonne, systeemisen proteiinit voivat hämmentää havaitsemista tai diagnoosiin neoplasia. Täällä olemme käyttäneet perusteellisen määrällisen proteomic lähestymistapaa, jossa analysoidaan plasman proteiineihin muutoksia hiirimalleissa subakuutti ärsyttävä-odotuksiin tulehdus, autoreaktiivisia tulehdus, ja matriisi liittyy angiogeneesiä ja verrattiin tuloksia aiemmin kuvattu havaintoja hiirimalleissa polyooma middle T-ajettu rintasyöpä ja Pdx1-Cre Kras

G12D INK4a /Arf

lox /lox aiheuttama haimasyöpä. Niistä sekoittava malleja, noin 1/3 kaikki mitattavissa plasman proteiineihin osoitti merkittävää muutosta runsaasti vertailuryhmän hiiret. Proteiinien, joka muutti runsaasti, suurin osa oli ainutlaatuinen jokaiselle mallin. Altered proteiinit sisältyvät osallistuvien akuutin vaiheen vaste, tulehduksen, soluväliaineen remodeling, angiogeneesi, ja TGFp signalointi. Vertailu muutoksia plasman proteiineihin väliin sekoitin mallien ja kaksi syövän mallia paljasti proteiinit, jotka oli rajattu syöpää kantavia hiiriä, mikä tunnetaan biologia näistä kasvaimista. Tämä lähestymistapa tarjoaa perustan erotetaan toisistaan ​​proteiinin muutoksia plasman jotka ovat syöpään liittyvien ja ne, jotka ovat osa epäspesifisen isännän vasteen.

Citation: Kelly-Spratt KS, Pitteri SJ, Gurley KE, Liggitt D, Chin A, Kennedy J, et al. (2011) Plasma Proteome profiilit tulehdukseen, Angiogeneesi, ja syöpä. PLoS ONE 6 (5): e19721. doi: 10,1371 /journal.pone.0019721

Editor: Pierre Bobé, Institut Jacques Monod, Ranska

vastaanotettu 11 joulukuuta 2010 Hyväksytty: 14 huhtikuu 2011; Julkaistu: toukokuu 12, 2011

Copyright: © 2011 Kelly-Spratt et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ rahoittivat Paul G. Allen Family Foundation, NCI Mouse mallit Human Cancer Consortium (MMHCC) ohjelma ja Kanarian Foundation. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

tehokas syövän hoidossa perustuu tarkka diagnoosi varhaisessa vaiheessa tauti ja ennuste on merkittävästi parantunut, jos syöpä havaitaan varhaisessa vaiheessa [1]. Veripohjaisten testit syövän varhainen havaitseminen ovat ihanteellisia, koska veri vetää ovat edullisia, vähän invasiivisia, ja rutiini kliinisessä käytännössä. Vaikka käsite veripohjaisten syöpä testi on yksinkertainen, sen soveltaminen on ollut haastavaa, siihen pisteeseen, että hyvin vähän uusia syöpä biomarkkereita on FDA hyväksyi viime vuosina [2]. Lisäksi nykyisin käytössä, kuten CA125 ja PSA munasarjasyövän ja eturauhassyövän vastaavasti olennaisesti rajoittaa korkea vääriä positiivisia hinnat ja yli-diagnoosi [3], [4]. Suuren esteen kehittää uusia veren perustuu biomarkkereiden on ollut tekninen haaste kyselevän plasman proteomiin [5]. Toinen este on ollut valinta tapaus /kontrolli vertailut biomarkkereiden löytö [6]. Tasot ehdokkaan biomerkkiaineissa syöpäpotilaista usein verrattuna terveisiin yksilöihin. Näissä tutkimuksissa, se on vaikea kontrolloida geneettisiä tai ympäristön muuttujien, sekä ei-syöpä ”sekoittavia” olosuhteissa. Esimerkiksi tulehdusta ja angiogeneesiä ovat tunnusmerkkejä syöpä, mutta myös esiintyä infektioita, krooninen tulehdus, auto-reaktiiviset sairauksia ja muita ehtoja, jotka eivät liity erityisesti syövän [7]. Vaikka jotkut biomarkkereiden tutkimuksissa on käytetty tulehdustiloja kontrolleina [8], [9], tämä ei poista tarvetta alueen määrittämiseksi proteiinien, joita esiintyy tulehdustiloja. Nimittäin se seikka, että monet ehdokas syöpä biomarkkereita ole tarpeeksi spesifinen hyödylliseksi esittää uutta lähestymistapaa [1], [6].

Tulehdus ja angiogeneesin tärkeä rooli kaikissa vaiheissa syövän etenemistä, mukaan lukien kasvain aloittamista , kasvu ja metastaattisen leviäminen. Todellakin, krooninen tulehduksellinen ehdot ovat vahva riskitekijä syöpään [10]. Tulehdus yllyttää ja edistää syövän syntymistä aiheuttamalla solujen ja perimän vaurioita, stimuloiva solujen liikevaihdon kautta sytokiinien ja kasvutekijän vapautumista, ja luoda kudos mikroympäristön jotka voivat parantaa invaasio, muuttoliike ja angiogeneesiä. Lopuksi, immuunijärjestelmä ohjaa myös syövän etenemisen kautta immuunitutkimusohjelmasta ja immunoediting [11]. Tulehdus on monimutkainen prosessi säätämien isännän ohjaamaan kudosvaurioita patogeenisia, traumaattinen tai myrkyllisiä vahinkoa ja on yleensä luokiteltu akuutti, nopeita toimia, subakuutin siirtymävaiheessa, ja sitkeä, mutta hitaasti kehittyvä krooninen sairaus. Akuutti tulehdusreaktio kuuluu nopea toimitus veren komponenttien, plasma, neutrofiilien ja valkosolujen infektio- tai vamma, jonka jälkeen virtaa makrofagien ratkaista ja korjata vahinko [12]. Akuutin vaiheen proteiinien löydetty plasmasta määritellään joko positiivinen tai negatiivinen riippuen siitä, ovatko ne nousta tai laskea aikana tulehduksellinen sairaus. Jos akuutti tulehdusreaktio ei kyetä ratkaisemaan vahinkoa, tapahtuu siirtyminen muuttuvaan subakuutti vaiheessa, sitten krooninen tulehdustila. Krooninen tulehdus, kuten nähdään joissakin autoreaktiivisten olosuhteissa, voi olla ”aktiivinen”. Tämä on tunnettu siitä, että kudoksen uudelleen, makrofagit, T- ja B-solut, angiogeeninen ja muut tekijät. Krooninen tulehdus voi puolestaan ​​johtaa liialliseen kudosvaurioita, immuunijärjestelmän sääntelyn purkaminen, ja autoimmuniteetin [10], [13].

Angiogeneesi, versomistilanteen uusien verisuonten ennestään verisuonistoon, on annettava happea ja muita ravintoaineita kasvaimen kasvun tukemiselle; ja aste vascularization on ennustetekijä joka korreloi kasvaimen aggressiivisuus [14]. Kuitenkin, angiogeneesi liittyy myös ei-syöpä olosuhteissa, kuten haavan paranemisessa, kudosten korjaamiseen, nivelreuma, ja muut krooniset tulehdussairaudet [15]. Siten tulehduksen ja angiogeneesin ovat kiinteästi mukana syövän sekä muiden yhteisten sairauksista. Nämä ehdot laukaista monimutkainen ja dynaaminen systeemisiä vasteita, mutta laajuus päällekkäisyyden systeemisen syöpä ja ei-syöpä olosuhteissa ei juuri tunneta.

Luonnehtia systeemisen syövän ja tulehdussairauksien, haimme plasma proteomiikka hiiren malleja subakuutti tulehdus, krooninen tulehdus, ja angiogeneesi. Hiiri malleja voittaa joitakin keskeisiä esteitä biomarkkereiden löytö, mukaan lukien teknologian kehittäminen [16]; tarkempi sovitus tapausten ja kontrollien vähentää geneettistä, ikä, ja ympäristön muuttujat; kyselemällä dynaamisia muutoksia plasman Proteome kautta taudin etenemistä; ja integroida tuloksia laajaa biologisen tietämyskantoja [17]. Karrageeni injektiot käytettiin mallintamaan subakuutti tulehdus [18]. Tämä malli edustaa ihonalainen vastetta kehittyvien paikallista ärsytystä ja kuolion samanlainen kuin mitä voidaan pitää seuraavia tuumorinekroosi. Krooninen tulehdus, käytimme kollageenin indusoima Artriittimallissa [19]. Tämä malli liittyy antigeeniyhdistelmät, yhdenmukainen auto-reaktiivinen vaurio, jossa tunkeutuminen on mononukleaaristen solujen, luun, fibroplasiaa ja verisuonten kasvua ympäröivän liitoksen. FGF injektiot käytettiin aktivoimaan angiogeneesin, mikä johtaa nopeaan in-verisuonten kasvua ja tukevat peruskudoselementeistä [20].

Suuri määrä plasman proteiineihin muuttui runsautta kunkin mallin, mikä monimutkainen biologia jokaisen kunto. Nämä plasmaprofiileja verrattiin aiemmin tunnistettu kaksi hyvin tunnettu hiiri malleja haiman [21] ja rintasyövän [22]. Kun rintasyövän malli, onkoproteiinia polyoma keskimmäinen T-antigeeni (PyMT) ohjaa MMTV LTR ja on rajoitettu rintaepiteelin. Nämä hiiret kehittävät karsinoomat, jotka muistuttavat ihmisen rintasyöpä ja, jotka liittyvät leukosyyttien infiltraatiota ja sen jälkeen keuhkojen etäpesäkkeiden [23]. Kehittäminen haimasyövän Pdx1-Cre Kras

G12D INK4a /Arf

lox /lox malli merkitsee etenemistä haiman intraepiteliaalisten neoplasia (PanINs) haiman adenokarsinooma (PDAC), uskollisesti pääpiirteittäin ihmisten sairauksien [24]. Tässä osoitamme, että suurin osa plasman proteiineihin muutosten havainneet näissä kasvainten mallit olivat ainutlaatuisia kunkin mallin ja ei ole nähty sekoitin malleissa. Lisäksi monet näistä proteiineista ovat tunnettuja rooleja syövän etenemisessä. Tunnistaminen ja luonnehdinta proteiiniprofiileja syöpään liittyvän vs. ei-syöpä patologioiden voidaan ymmärtää monimutkaisia ​​biologia isännän vaste syövän ja asettamaan etusijalle ehdokas biomarkkerit, jotka liittyvät syöpään.

Materiaalit ja menetelmät

Eläinkokeet

Eläinkokeet suoritettiin alla IACUC asetusten hyväksymä FHCRC eläimen käytön komitean (Protocol # 1311). Kymmenen naispuolinen FVB hiiriä käytetään kunkin kunnossa pariksi kymmenen pesuetove- käsittelemättömien kontrollien. Mallintaa akuutin tulehduksen, joka siirtyy osaksi subakuutti tulehdus, käytimme tunnettu proinflammatoristen ärsyttävä, karrageeni, hiilihydraatti merilevästä saatuja [18]. Tämä toimitettiin kautta Sienisiirros joka ylläpitää karrageeni vapautumista ja edistää klassista roskan vastausta. 10 x 10 mm kirurgisten sienet injektoitiin 1% karrageenin (Sigma C1867-5G) ja istutettiin ihonalaisesti oikeaan kylkeen. Plasma kerättiin sydänpunktiolla 3 viikkoa myöhemmin. Plasman proteiineihin tunnistettu näistä hiiristä tulee vastata myöhäisessä vaiheessa, subakuutti vastauksena karrageenanin ja liittyy sieni vaikutusta, sen sijaan aloittamista akuutin tulehdusvasteen, joka tapahtuu 72 tunnin kuluessa. Arvioida proteiinin profiili, joka liittyy krooniseen tulehdukseen, käytimme kollageenilla aiheutettu niveltulehdus hiirimallissa [19]. Naudan tyypin II kollageenia (CII) (BD Biosciences, San Jose, CA) emulgoitiin täydelliseen Freundin adjuvanttiin (Pierce, Rockford, IL), jonka lopullinen pitoisuus on 4 mg /ml ja yhteensä 0,1 ml injektoitiin intradermaalisesti pohjan lähellä häntää. Tämä johtaa kehittämiseen krooninen niveltulehdus takakäpäliin kuluessa 14-21 päivää. Hiiriä seurattiin 2-3 päivän välein kehittämiseen ja artriitin etenemistä ja plasman yhteydessä kerättyjen kehittämiseen turvoksissa takakäpälien 4 viikkoa. Mallintamaan angiogeneesiä, matrigeelin (BD Biosciences, San Jose, CA) plus FGF (500 ng /ml) (Invitrogen, Carlsbad, CA) ihonalaisesti oikeaan kylkeen johtaa nopeaan in-verisuonten kasvua ja tukevat peruskudoselementeistä mutta juurikaan liittyy tulehdukseen [20]. Plasma kerättiin 3 viikkoa myöhemmin. Näiden mallien verta kokeellisia ja ohjaus hiirillä kerättiin sydänpunktiolla, kun käytetään 1 cm

3 ruiskua ja 23 g neula, ja sijoitetaan K3-EDTA putki (Webster Veterinary Supply, Sterling, MA) [17 ]. Plasma erotettiin sentrifugoimalla 2000 x g 5 minuutin ajan ja alikvootteja siirrettiin kylmäpulloon ja pakastettiin -80 ° C: ssa.

Näytteiden keräys haiman [21] ja rintojen [22] syövän hiirimalleissa on ollut aikaisemmin on kuvattu. Lyhyesti, hiiret haimasyövän Proteomiikan analyysi saatiin jalostukseen Pdx1-Cre

INK4a /Arf

lox /lox ja

Kras

G12D

INK4a /Arf

lox /lox hiirillä. Kokeellinen Pdx1-Cre

Kras

G12D

INK4a /Arf

lox /lox hiiret ja ohjaus

Kras

G12D

INK4a /Arf

lox /lox ja Pdx1-Cre

INK4a /Arf

lox /lox hiiret tapettiin 5,5 ja 7 viikon iässä. Sekä kotelo ja valvonta hiiret, tappavia Comas indusoitiin injektoimalla hiiriä i.p. joiden 0,6-0,8 ml 5% Avertin (2,2,2-tribromietanoli, Sigma). Tämä ero eutanasia menetelmässä esittelee mahdollinen, vaikkakin todennäköisesti vähäinen, caveat verrattaessa haima malleja muut mallit. 1 ml ruisku, jossa on 22 g neulaa käytettiin sydänpunktio verinäytteen. Veri pantiin K3-EDTA-putkiin (Fisher), ja sentrifugoitiin 4 ° C: ssa 5 minuutin ajan 3000 rpm: ssä. Plasma poistettiin ja sitä säilytettiin -80 ° C: ssa.

rintasyövän hiirimallissa, siirtogeenisiä FVB /N-Tg (MMTV-PyVT) 634Mul /J (PyMT) hiiret saatiin National Cancer Institute, ja kasvatetaan talon plasman saamiseksi näytteitä on kasvain ja poikuekumppaniverrokista kahdessa ajankohtina rintasyövän kehitystä. PyMT heterotsygootti urokset olivat ristissä FVB villityypin naaraita tuottaa kohortin PyMT heterotsygoottianalyysiin ja villityypin naisilla opiskeluun. Puolueellisuuden välttämiseksi, PyMT siirtogeenisiä ja ohjaus hiiriä pariksi vieroitettaes- ja oli sovitettu suhteen iän, pentueen, ja häkki. Kaikki hiiret syötettiin standardia muonaa (Harland Tekland, 8664) ja happovedellä

ad libitum

ja jota pidetään 12 tunnin valo-pimeä sykli. Alkaen 5 viikon iässä hiiret tunnustellaan joka toinen päivä havaita rinta- kasvaimen kasvua. Rintojen kasvainten annettiin kehittyä joko 0,5 tai 1 cm halkaisijaltaan, jonka jälkeen kukin kasvain hiiri ja ohjaus tapettiin back-to-back samana päivänä CO

2 hengitettynä. Veri saatiin sydänpunktiolla ja plasman eristettiin ja varastoitiin, kuten on kuvattu tulehduksen ja angiogeneesin hiirimalleissa.

Immunodepletion runsas proteiinien ja isotooppileimaukseen

50 ui plasmaa 5 hiiriä yhdistettiin kunkin lajin tapauksessa ja kontrollinäytteiden. Altaat olivat immunodepleted kolmesta runsain proteiineja (albumiini, IgG ja transferriini) käyttämällä MS-3 sarake (4,6 x 10 mm, Agilent). Immunodepletion Pylväs tasapainotettiin puskurilla A (0,5 ml /min) 13 minuutin ajan ja alikvootit seerumiseos injektoitiin suodatuksen jälkeen 0,22 um: n ruiskun läpi. Läpivirtausta fraktiot kerättiin 10 minuutin ajan virtausnopeudella puskuri A: 0,5 ml /min, yhdistettiin ja säilytettiin -80 ° C: ssa. Kolonnin sidottu materiaali otettiin talteen eluoimalla 8 min puskurilla B nopeudella 1 ml /min. Sen jälkeen, immunodepleted näytteet väkevöitiin käyttämällä Centricon YM-3-laitteet (Millipore Corp, Bedford, MA) ja uudelleen laimennettiin 8 M ureaa, 100 mM Tris pH 8,5, 0,5% OG (oktyyli-beta-D-glukopyranosidi, Roche). Sen jälkeen ehtyminen ja puskurin vaihto, proteiini pitoisuudet määritettiin Bradford määrityksiä: angiogeneesiä 2,5 mg (tapaus) ja 3,8 mg (kontrolli), krooninen tulehdus 4,3 mg (tapaus) ja 3,8 mg (kontrolli), ja akuutin tulehduksen 2,8 mg (tapaus) ja 3,1 mg (kontrolli), ja koko proteiinin määrä kutakin näytettä käytettiin myöhemmin akryyliamidin merkintöjä. Näytteet pelkistettiin DTT (0,66 mg DTT /mg proteiinia), ja isotooppileimaamiseksi kysteiinitähteiden proteiineille suoritettiin. Ohjaus näytteet leimattiin valo 12C akryyliamidin isotooppi (7,1 mg /mg proteiinia) ( 99,5%: n puhtaus, Fluka), ja koenäytteiden leimattiin raskaan 13C-akryyliamidi isotooppi (Cambridge Isotope Laboratories, 7,4 mg /mg proteiinia) varten 1 h huoneen lämpötilassa. Altaat valvonta- ja kokeellisen jälkeen näytteet yhdistettiin kokonaisen proteiinin erottamista.

Ehjä proteiinin erottaminen

Yhdistetty isotooppileimatussa näytteet erotettiin automaattinen online-2D-HPLC-järjestelmää ohjataan Workstation Class-VP 7,4 (Shimadzu Corporation). Yhdistetyt merkitty plasmanäytteet erotettiin ensimmäisessä ulottuvuus anioninvaihtopylvääseen (Poros HQ /10, 10 mm id x 100 ml, Applied Biosystems) käyttäen 8 vaihe-eluutio (0 mM NaCl 1000 mM NaCl) 0,8 ml: ssa /min. Fraktiot kustakin 8 anioninvaihto- erotus eluointi vaiheet automaattisesti siirrettiin käänteisfaasi-pylvääseen (PorosR2 /10, 4,6 mm ID x 100 ml, Applied Biosystems) ja toisen ulottuvuuden erotuksen. 25 min gradienttieluointi (5%: sta 95% liikkuvaa faasia B) käytettiin 2,4 ml /min. 3 fraktiot kerättiin per minuutti, ja jokainen fraktio, joka sisälsi 800 ui. 576 käänteisfaasi jakeet kerättiin yhteensä (8 anioninvaihto- jakeet kukin jaettu 72 käänteisfaasi jakeet). Liikkuva faasi A anioninvaihtokromatografialla koostui 20 mM Tris (Sigma), 6% isopropanolia (Fisher), 4 M urea, pH 8,5 ja liikkuva faasi B oli sama koostumus ja pH A 1 M NaCl (Fisher) lisättiin . Liikkuva faasi A käänteisfaasikromatografialla koostui 95% vettä, 5% asetonitriiliä, 0,1% TFA: ta (Supelco), ja liikkuva faasi B koostui 90% asetonitriiliä, 10% vettä, 0,1% TFA: ta.

Mass spektrometria-analyysi

-liuosta hajotus suoritettiin lyofilisoidun erillä alkaen käänteisfaasi- (toinen ulottuvuus) Fraktiointivaiheeseen. Proteiinit yksittäisten fraktioiden suspendoitiin uudelleen 0,25 M ureaa (Fisher), joka sisälsi 50 mM ammoniumbikarbonaattia ja 4% asetonitriiliä ja sitten digestoitiin yön yli 200 ng modifioidun trypsiinin (Promega) 37 ° C: ssa. Saatu peptidi seokset tehtiin happamaksi 5 ui 1%: ista muurahaishappoa. Eriä alistettiin massaspektrometria haulikko analyysi jälkeen yhdistämällä useiden peräkkäisten fraktioiden (proteiinipitoisuus arvioitiin UV jälki). 12 altaat yksittäisten käänteisfaasilla jakeet kunkin 8 anioninvaihtaja vaiheet luotiin yhdistämällä seuraavat peräkkäiset jakeet: 1-22, 23-24, 25-26, 27-28, 29-30, 31-32, 33 -34, 35-36, 37-38, 39-40, 41-42, ja 43-72. 96 fraktiot analysoitiin kullekin kokeelle, jonka LTQ-Orbitrap (Thermo) massaspektrometrillä yhdistettynä NanoLC-1D (Eksigent). Nestekromatografia erotus suoritettiin 25 cm: n pylväs (Picofrit 75 um id, New tavoitteet, pakattu-talon MagicC18 hartsia) käyttäen 90 min lineaarinen gradientti 5-40% asetonitriiliä 0,1% muurahaishappoa 300 nl /min haulikko analyysiä. Noin 10 ug proteiinia injektoitiin per osa. Spectra hankittiin data-riippuvainen tilassa

m Twitter /

z

valikoima 400-1800, kuten valinta 5 runsaimmin +2 tai +3 ionien kunkin MS-spektri MS /MS-analyysi. Massaspektrometriparametrit olivat kapillaarinen 2,0 kV, kapillaarinen 200 ° C, resoluutio 60000, ja tavoitearvo 1,000,000.

Tietojenkäsittely

Hankitut tietoja käsitteli automaattisesti laskennallisen proteomiikka Analysis System (CPAS) [25] putki käyttämällä X! Tandem hakualgoritmi [26] määritetty komeetta pisteet moduulin plug-in. PeptideProphet [27] ja ProteinProphet [28] käytettiin validointi hakutulosten ja proteiinia päättely. Kvantifiointi suoritettiin käyttämällä Q3 kvantitoimiseksi työkalu [29]. Tandem Massaspektrit vastaavuushaku versio 3.48 hiiren IPI tietokantaan [30]. Kaikki tunnuksilla joiden PeptideProphet todennäköisyys yli 0,2 toimitettiin ProteinProphet, ja myöhemmät proteiini tunnistusmerkinnät suodatettiin vähintään 5% virheprosentti. Kvantitoimiseksi, tunnusluvut proteiinit lasketaan käyttämällä vain niitä peptidejä saavuttaa PeptideProphet todennäköisyys on vähintään 0,75. Proteiini ryhmät määrittämä ProteinProphet yhdistettiin yhteisellä geeni symboli ja tästä lähtien nimitystä ”proteiini”. Asia /ohjaus suhde kunkin proteiinin lasketaan ottamalla keskiarvo log2 suhteet kaikkien peptidien määritetty proteiinin. Yli 1.000.000 MS /MS-spektrit kerättiin ja proteiinien 2289 ainutlaatuinen geeni nimet tunnistettiin yli 3 kokeellisissa malleissa.

Tilastollinen merkitys proteiinin kvantifiointiin massaspektrometrillä määritettiin kahdella menetelmällä. Proteiineja, joilla on useita pariksi MS tapahtumia raskaan ja kevyen akryyliamidin yhden otoksen t-testiä käytettiin laskettaessa p-arvo keskiarvon suhde koko proteiini kaikissa jakeet. Toinen, todennäköisyys sille, että suhde kutakin MS tapauksessa laskettiin jakauman suhde on ohjaus-ohjaus koetta, jossa samasta näytteestä jaettiin ja leimattiin raskaan ja kevyen akryyliamidia. Jos p-arvo kunkin yksittäisen tapahtuman oli 0,05, proteiini suhde pidettiin tilastollisesti merkitsevä.

Verkko analyysi

lisätä ja vähentää proteiinien tunnistettiin päässä IPAS analyysiä käytettiin biofunction ja polku analyysi käyttäen Ingenuity Pathway Analysis (IPA) Software (Ingenuity Systems, Mountain View, CA). IPA-tietokanta muodostuu omista ontologian edustavat 300000 biologinen geenien, proteiinien ja molekyyli- ja solutason prosesseja.

Entsyymi-immunologinen (ELISA) määritykset

plasmatasot PF4, IGF1-, Igfbp5, ja Lcn2 mitattiin käyttäen kaupallisesti saatavilla hiiren DuoSet sarjat on saatu R 0,05) ja näistä kaksi tai kolme kertaa niin paljon pieneni verrattuna kasvoi kaikissa kolmessa mallissa (taulukko 1, kuva S1). Kun ajatellaan vain proteiineja määrällisesti kaikilla kolmella hiiren mallia, vertailuja plasmaprofiileja mallien välillä paljasti 35% limityksellä muuttuneessa proteiinien välillä subakuutti ja krooninen tulehdus malleja, verrattuna vain 15% päällekkäisiä tulehdus mallien ja angiogeneesin malli ( Pöytä 1). Rajallisen näytteenoton massaspektrometrin, useita proteiineja ei ole määrällisesti kaikissa kolmessa hiiren mallia. Kun emme edellytä proteiineja voidaan mitata kaikissa kolmessa hiiren mallia, päällekkäisyys ylä- ja alassäädetty proteiinit on esitetty kuviossa 1A ja 1B vastaavasti. Vertailut muutosten proteiinin tasot kunkin mallin paljasti vahvan korrelaation subakuutti ja krooninen tulehdus, joka Pearson testi pisteet 0,67 (kuvio 1 C), kun taas vertailuja kunkin tulehduksen mallia -angiogeneesimalli paljasti alle 50% korrelaatiot (Pearson testi tulokset 0,49 ja 0,31, tässä järjestyksessä). Siten plasmaprofiileja olivat samankaltaisia ​​tulehdus mallien kuin välillä angiogeneesin ja joko tulehduksen mallin, joka kuvastaa omaisuuserien biologiaan näitä ehtoja. Lisäksi, suurin osa muuttaa proteiinit olivat ainutlaatuisia kullekin sekoitin malli, osoittaa biologisen spesifisyyden. Suhteellinen runsaus yksittäisten tunnistettujen proteiinien kussakin kolme mallia on lueteltu taulukossa S1.

Venn kaaviot verrataan (A) lisääntynyt ja (B) väheni proteiineja plasmassa subakuutin ja kroonisen tulehduksen ja angiogeneesin mallien verrattuna kontrollihiiriin. Kaaviot osoittavat proteiinipitoisuuden joko kohonnut tai alennetaan siinä mallissa, ja jotka ovat ainutlaatuisia tai jaetaan kunkin 3 mallia. Suurin osa joko lisääntynyt tai vähentynyt proteiinit olivat ainutlaatuisia kunkin mallin. (C) korrelaatiopisteet määrällisesti proteiineja. Asia /ohjaus (log2) suhteet Kunkin määrällisesti proteiinin piirretään X- ja Y- akseleita. Tontit kuvastavat runsaasti eroja tiettyjen proteiinien välillä kaksi mallia. Proteomic vertailuja krooninen vs. subakuuttiin tulehdus vertailu on useampia (R = 0,67) kuin ovat vertailuja joko tulehdus malli ja angiogeneesin malli (R = 0,49 ja 0,31, vastaavasti).

vertasi proteomic profiilit näiden sekoittava mallien aiemmin saatu profiileja varhaisessa ja myöhäisessä vaiheessa rintasyöpä [22], ja profiileja alkuvaiheen (PanINs) ja myöhäisessä vaiheessa (PDAC) haimasyövän [21]. Toisin kuin sekoitin malleja, suurin piirtein yhtä suuri määrä proteiinien lisätä ja vähentää kasvaimen kantavien hiirten verrattuna ei-kasvain-hiirille (taulukko 2). Näistä muuttunut proteiineja, suurin osa ( 75%) ei ollut muuttunut sekoittavien tekijöiden (taulukko 2). Kolme malleja Plasmaproteiineihin jakelu havaittu: kasvoi sekä sekoittavat ja syöpä mallit (kuvio 2A), kasvoi sekoittavat mutta ennallaan tai pienentynyt syövän (kuvio 2B), ja väheni sekoittavien tekijöiden ja lisääntynyt syövän (kuvio 2C). Vain 27% proteiineja, joilla on muuttunut tasoja tutkimuksessa korotettiin sekä sekoittavat tekijät ja syövän, kun taas suurin luokka, osuus 55% koko, koostui proteiinien määrä väheni sekoittavat mutta kasvoi tuumoreita kantavaa hiirtä. Suhteelliset tasot edustavien proteiineja, näitä malleja on esitetty kuviossa 3. Huomaa, lysyyli oksidaasi, kuten 1 (Loxl1) ja proteoglykaanin 4 (Prg4) vähennetään plasmassa sekoittavat ja lisääntyi sekä rinta- ja haiman on kasvain, kun taas rasvahappo syntaasi (Fasn) ja lipocalin2 (Lcn2) ovat suurempia sekä sekoittavat ja syövän mallien (taulukko S1).

(A) proteiinit lisääntyi sekä sekoittavat ja syövän mallien verrattuna kontrolleihin ( 1,25 kertainen, p 0,05), (B) proteiinit kasvoi sekoittavien tekijöiden ja laski syövän malleja, ja (C) proteiinien vähentynyt sekoittavien tekijöiden ja lisääntynyt syövän mallit (punainen = ylös, vihreä = alas, musta = ei muutosta, harmaa = ei määrällisesti).

Tontit osoittavat massaspektrometrialla perustuu log2 tapauksessa /ohjaus suhteet tiettyjen proteiinien kussakin sekoitin ja syövän malli näyttää ero runsaasti kuvioita. Loxl1 edustaa proteiineja, jotka pelkistetään sekoittavat ja koholla syövän malleista. Fasn näyttää korkeus kaikissa malleissa, mutta enemmän niin Panin. Prg4 on kohonnut pääasiassa haimasyövän mallia. Lcn2 on kohonnut tulehdusta ja suuremmassa määrin syövän malleja, mutta ei angiogeneesiä mallia.

Voit tarkistaa ero runsaus havaittu massaspektrometrialla, ELISA-määritykset suoritettiin valittujen proteiinit perustuen kaupallinen saatavuus (PF4, IGF1-, Igfbp5, ja Lcn2) (kuva 4). Huomaa, insuliinin kaltainen kasvutekijä 1 (IGF1) ja insuliinin kaltainen kasvutekijää sitova proteiini 5 (Igfbp5) on vähentynyt tai ennallaan sekoittavien tekijöiden mutta kasvoi rinta on kasvain. Lipokaliini 2 (Lcn2) lisääntyi kaikissa malleissa, mutta korkeammalle tasolle kasvaimia omaavilla hiirillä, kun taas verihiutaleiden tekijä 4 (PF4) aleni subakuuttiin tulehdus mutta kasvoi krooninen tulehdus ja syöpään. Muut plasman proteiineihin, jotka on erityisesti lisääntynyt kasvaimen kantavien hiirten sisältyvät asetyyli-CoA-asetyylitransferaasi 1 ja 3, rasvahappojen sitovat proteiinit 1 ja 4, Fibuliini, peroxiredoxins 1, 5 ja 6, SPARC, ja thrombospondins 1 ja 4

ELISA-analyysi PF4, IGF1, Igfbp5, ja Lcn2 oli lisääntynyt plasman pitoisuus PyMT rinta- kasvaimen kantavien hiirten verrattuna joko subakuutin tai kroonisen tulehduksen hiirillä. Plasma käsittelemättömästä hiiristä käytettiin kontrollina.

plasman proteiineihin havaitut muutokset tulehdukseen

vieressä analysoineet muuttunut plasman proteiineihin kustakin sekoitin kunnossa. Subakuutin tulehduksen mallia, on suurempi kuin 50% kasvanut proteiinien olla tunnetun rooli tulehduksen, mukaan lukien akuutti vaihe proteiinit [31], sekä kemokiinien Ccl8 ja PF4 (tunnetaan myös Cxcl4) (taulukko S1). Niistä laski proteiinit olivat viisi komplementin proteiineja, samoin kuin eritetyt signalointia proteiinien, kuten Rbp4, IGF1, IGF2, TGFp, ja Pdgfb. Komplementtikaskadin on tärkeä akuutissa vaiheessa vaste, kun taas IGF1 ja RB4 ovat negatiivisia akuutin vaiheen proteiineja. Verkko-analyysi liittyy monia proteiineja, joilla on muuttuneita tasoja solunsisäisen (NF-KB) ja erittävät (Il-1 ja TGF) immuunijärjestelmän säätölaitteet (kuvio 5A, B) [10]. TGF itse vähennettiin, koska oli useita proteiineja, jotka liittyvät TGF signalointi. Yhdessä proteomiikka-analyysi plasman tunnistaa tunnettujen akuutin vaiheen proteiineja, proteiineja liittyy tulehduksellinen sääntelyviranomaisten kuten TGF, ja muita proteiineja (esim tukirangan proteiineja actins, cofilins, VASP, profiliinia, ja destrin) ei ole aiemmin liitetty tulehdus (taulukko S1).

Top verkkojen määrittämä Ingenuity Pathway Analyysi sekä lisätä ja vähentää proteiinien subakuuttiin tulehdus (A, B), krooninen tulehdus (C, D) ja angiogeneesin mallien (E, F). Networksin subakuutin malli näyttää runsas fibrinogeenin ja ECM proteiinit, krooninen malli antaa näkyvä kasvutekijä ja kollageeni verkkoihin, kun taas angiogeneesin verkko näyttää kemokiinin ja hyytymisproteiinien. [Punainen = lisääntynyt, vihreä = vähentynyt, valkoinen = ei muutosta runsaasti tapauksissa kontrolliryhmään verrattuna hiiriin, 1,25 kertaiseksi p 0,05.].

Kuten subakuutin tulehduksen mallin, huomattava määrä proteiinien lisääntynyt alle krooninen tulehdus oli tiedossa linkkejä tulehdus. Erityisesti kuitenkin vähemmän akuutin vaiheen vaste proteiinit tunnistettiin kuin subakuutin malli (taulukko S1). Toinen merkittävä luokka proteiineja muuttunut krooniseen tulehdukseen ovat mukana soluväliaineen remodeling (kuvio 5C). Monet näistä olivat vähentyneet ja ovat tavoitteita Mmp2 proteaasin, joka oli itse kasvanut. Kuten subakuutin mallissa TGF ja proteiinit liittyvät sen asetuksen tai signalointi vähenivät, kuten Ltbp1, Ltbp4, ja Vasn (kuvio 5D).

Plasmaproteiineihin allekirjoituksen angiogeneesin

Huomattava muuntuneen tunnistettujen proteiinien angiogeenisen mallissa ovat tunnettuja mekanistinen linkkejä angiogeneesiä ja /tai ilmaistaan ​​endoteelisolujen, kuten trombospondiini 1 ja 4, reniini 1 ja 2, verihiutaletekijä 4, apilatekijän 1 ja kollageeni sitova proteiini 2, samoin kuin muut proteiinit, joita ei ole aiemmin liittyy angiogeneesiä. Lisäksi muutoksia komplementin proteiinien ja hyytymistekijöiden joilla on yhteyksiä angiogeneesiä, havaittiin (kuvio 5E) [32] [33].