Krooninen sairaus

tiivistelmä

läsnäolo syövän kantasolujen kaltaisia ​​soluja (CSCS) on yksi mekanismien vastaava chemoresistance joka on ollut merkittävä este kohti keuhkojen adenokarsinooma (LAD) käsittely. Viime aikoina olemme tunnistaneet microRNA (MIR) -200b keskeisenä säätelijänä chemoresistance ihmisen dosetakselia kestävä LAD soluissa. Kuitenkin myös miR-200B on vaikutuksia säännellään CSCS vielä pitkälti epäselvä, ja sitä selvennetään edelleen. Täällä, osoitimme että miR-200B merkittävästi vaimentua vuonna CD133

+ /CD326

+ soluja, jotka osoittivat ominaisuudet CSCS peräisin dosetakseli kestävästä LAD soluissa. Myös palauttaminen miR-200b voi estää huolto- ja kääntää chemoresistance of CSCS. Lisäksi vaimennin on zeste-12 (Suz-12) tunnistettiin suora ja toiminnallinen kohteena miR-200b, ja vaimentaminen Suz-12 phenocopied vaikutuksia miR-200b päälle CSCS. Lisäksi yli-ilmentyminen histonideasetylaasi- (HDAC) 1 tunnistettiin keskeinen mekanismi vastaa miR-200b sortotoimia CSCS kautta spesifisyys proteiini (Sp) 1-riippuvaisen mekanismin ja palauttaminen miR-200b by HDAC1 tukahduttaminen merkittävästi tukahdutti CSCS muodostumista ja käänteinen chemoresistance of CSCS säätelemällä Suz-12-E-kadheriinin signalointi. Myös downregulation HDAC1 tai ylössäätely miR-200b vähensi

in vivo

kasvainten muodostumiseen of CSCS. Lopuksi Suz-12 korreloi käänteisesti miR-200b korreloi positiivisesti HDAC1 ja säädellään ylöspäin dosetakselia kestävä LAD kudoksissa verrattuna doketakseliin herkkien kudosten. Yhdessä tarkasteltuina HDAC1 /miR-200B /Suz-12-E-kadheriinin signalointi voisi selittää ylläpito CSCS ja muodostumisen solunsalpaajaresistentti fenotyypin dosetakselia kestävä LAD soluissa.

Citation: Chen DQ, Huang JY, Feng B, Pan BZ, De W, Wang R, et ai. (2014) histonideasetylaasi 1 /SP1 /MicroRNA-200B Signaling tilinpidon huolto Cancer Stem-Like Cells Human Lung Adenokarsinooma. PLoS ONE 9 (10): e109578. doi: 10,1371 /journal.pone.0109578

Editor: Jin Q. Cheng, H.Lee Moffitt Cancer Center Research Institute, Yhdysvallat

vastaanotettu: 17 kesäkuu 2014; Hyväksytty: 1. syyskuuta 2014; Julkaistu: 03 lokakuu 2014

Copyright: © 2014 Chen et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Tällä kirjoittajat vahvistavat, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi- ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tätä työtä tuki National Natural Science Foundation of China (https://www.nsfc.gov.cn/) (LBC o . 81272474, BF nro 81301914). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Keuhkosyöpä on eniten syöpään liittyvien kuolleisuutta sekä naisten että miesten käytettävissä kaikkialla maailmassa [1]. Kemoterapia on tärkeä osa ensilinjan hoitoja keuhkoadenokarsinooma (LAD), joka muodostaa yleisin histologinen muoto keuhkosyöpään. Kuitenkin chemoresistance edustaa hallitseva este kohti kemoterapeuttisen hoidon LAD, mikä johtaa huonoon ennusteeseen potilaista. Täten tutkimalla mahdollinen molekyylitason mekanismeja chemoresistance on tullut keskeinen kysymys kliinisen hoidon ihmisen LAD.

Syöpä kantasolujen kaltaisia ​​soluja (CSCS) tai kasvain aloittamisen kantasolut ovat väestöryhmästä kasvainsolujen ja pelata keskeisiä rooleja syövän aloittamista, etenemistä, uusiutumisen ja chemoresistance [2] – [5]. CSCS johdettu sekä CSCS ja ei-CSCS, aiheuttaa kasvaimia kautta itseuudistumiseen ja pystyvät erilaistumaan useiksi solutyyppejä [6] – [9]. Monet syövän hoidot, mukaan lukien kemoterapian jotka tappavat suurin syöpäsolujen, voi lopulta epäonnistua, koska ne eivät poista CSCS että sitten aiheuttavat uusiutumisen kasvaimia [10]. Viime aikoina se on vakiinnuttanut että CSCS liittyvät epiteliaaliseen-mesenkymaalitransitioon (EMT), metastaasin, lääkeresistenssin, etenemisen ja uusiutumisen keuhkosyövän [11] – [15]. Tämän seurauksena hyödyntäminen erityisiä hoitoja tavoittelemiseen CSCS on ollut keskeinen kysymys kemoterapeuttisen Keuhkosyövän hoidossa. MikroRNA (miRNA) hiljaisuus geenin ilmentymisen sitoutumalla 3′-transloitumattoman alueen kohdegeenien ja on raportoitu säätelemään CSCS itseuudistumisen, tuumorigeenisyyden, etäpesäke, ja chemoresistance monissa ihmisen syövissä [2], [7], [ ,,,0],16]. Esimerkiksi miR-34a tukahduttaminen aiheuttaa paksusuolen CSCS suorittamaan epäsymmetrinen solujen jakautumista ja edistää tytär solujen jäädä paksusuolen CSCS säätelemällä Notch signalointi. Voimistunut miR-143 CSCS erilaistumiseen edistää syöpäsolujen etäpesäkkeiden moduloimalla FNDC3B ilme. MiR-21 säätelee EMT fenotyypin ja hypoksia-indusoituva tekijä-1α ilmentymisen kolmannen alalla muodostavat rintasyöpä kantasolun kaltaisia ​​soluja. MiR-200b tärkeä jäsen miR-200 perheisiin sijaitsee miR-200b /c /429-geenin klusteri, toimii tuumorisuppressori erilaisissa ihmisen kiinteiden kasvainten, ja sillä on kyky inhiboida CSCS kasvun ja käännetään EMT fenotyyppiä CSCS [17], [18]. Viime aikoina olemme tunnistaneet miR-200B keskeisenä säätelijänä chemoresistance ja palauttaminen miR-200b merkittävästi kääntää chemoresistance doketakselin (DTX) -kestävät LAD solut indusoimalla solusyklin pysähtymisen ja apoptoosin lisälaite [19]. Kuitenkin myös miR-200B säätelee CSCS johdettu dosetakseli kestävästä LAD solujen edelleen huonosti ja on edelleen selvittämättä.

Tässä tutkimuksessa ensin osoittaa, että miR-200B toimii tuumorisuppressorina molemmat

in vitro

ja

vivo

in CSCS jotka ovat peräisin ihmisen dosetakseli kestävästä LAD soluissa. Lisäksi tunnistamme HDAC1 erityisenä säädin mukana vaiennettu miR-200b kautta SP1-riippuvaisen mekanismin ja palauttaminen miR-200b välittävät HDAC1 tukahduttaminen suppressoi merkittävästi ylläpitoa CSCS ja kääntää chemoresistance of CSCS säätelemällä Suz-12-E -cadherin signalointia. Parhaan tietomme mukaan ei ole ollut raportteja HDAC1 /miR-200B /Suz-12 /E-kadheriinin sääntelyverkon säätelyssä CSCS huolto- ja chemoresistance ihmisen LAD soluissa ja nykyinen työ on tuoda esiin uusi strategia peruutettaessa chemoresistance ihmisen LAD.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics selvitys

tutkimus hyväksyi tutkimuksen eettinen komitea Jinling sairaalan Nanjing University (Luvan numero: 12-027) ja suoritettiin noudattaen Helsingin julistuksen. Kaikki eläimet pidettiin spesifisissä patogeenivapaissa olosuhteissa. Kaikki kokeelliset menettelyt suoritettiin mukaisesti Jinling sairaalan Nanjing University Guide for Care ja koe-eläinten käytön.

mikrohelmiä lajittelu

Lyhyesti, 3,0 x 10

7 single-soluja läpäissyt 30 pm nylon mesh ja sentrifugoitiin 300 x g 10 minuutin ajan. Supernatantti imettiin pois. Sitten 300 ui puskuria ja 100 pl FcR reagenssia lisättiin ja sekoitettiin. 100 ui CD326 mikrohelmiä lisättiin, sekoitettiin hyvin ja inkuboitiin 30 minuuttia jääkaapissa (2-8 ° C). Solut pestiin sitten lisäämällä 2 ml puskuria ja sentrifugoitiin 300 x g 10 minuutin ajan. Supernatantti imettiin pois. Solut suspendoitiin uudelleen 500 ul: aan puskuria. Sitten solususpensiota levitettiin erotin sarake asetetaan magneettikenttään. Läpivirtaus, joka sisälsi leimaamatonta solut kerättiin. Sitten pylväs pestiin, ja poistettiin erottimesta ja asetetaan sopivaan keräysputki. Sitten sopiva määrä puskuria pipetoitiin pylvääseen ja virtauksen kautta, joka sisältää CD326 soluja kerättiin. Vihdoin, sopiva määrä CD326

+ soluja sitten lajitellaan CD133 Mikrohelmiä varten rikastamista CD133

+ /CD326

+ soluihin edellä kuvatulla tavalla. CD133

+ /CD326

+ CSCS viljeltiin sitten seerumivapaassa CSCS-viljelynestettä: Dulbeccon Modified Eagle Medium (DMEM) /F12 -alustassa, joka sisälsi 0,4% BSA: ta, 2% B27, 4 mg /ml insuliinia, ja 40 ng /ml EGF.

Solut ja viljelyolosuhteet

ihmisen LAD solulinjoja (SPC-A1 ja H1299) ostettiin kasvainsolun Bank of Kiinan Academy of Medical Science (Shanghai, Kiina). Dosetakseli- kestävä LAD soluja valmistettiin kuten kuvattu aikaisemman työn ja säilytetty 50.0μg /L doketakseli [19]. Soluja viljeltiin kuten kuvattu edellisessä työssä [20]. CD133

+ /CD326

+ solut lajiteltiin Dosetakseliryhmän kestävästä LAD soluihin CD133 ja CD326 mikrohelmiä (Miltenyi Biotec) mukaan valmistajan ohjeiden.

Potilasnäytteet

Tämä työ hyväksyttiin Ethic komitean meidän sairaalassa ja kirjallinen suostumus saatiin kaikki potilaat. LAD kudokset kerättiin potilailta, joilla LAD jo pitkällä meidän sairaalassa syyskuusta 2006 joulukuuta 2008. potilaat täyttivät kaikki seuraavat kriteerit: histologista diagnoosia ensiarvoisen LAD vähintään yhdellä mitattavissa vauriota; kliinisessä vaiheessa IIIB-IV; ensilinjan kemoterapiaa joko dosetakseliannoksella 75 mg /m

2 ja sisplatiinia 100 mg /m

2 tai doketakselia 75 mg /m

2 ja karboplatiinin AUC 6 mg /ml /min annettuna joka 3. viikkoa enintään 5 sykliä. Kudosnäytteet sitten jaettu ”herkkiä” (täydellinen tai osittainen vaste) ja ”tunteeton” (stabiili tai etenevä tauti) ryhmät perustaa potilaan vastaukset arvioitiin lääketieteellisten kuvien analysointi ja havaitseminen seerumissa kasvainmerkkiaineet jälkeen 4 tai 5 sykliä docetaxel- kemoterapiaan.

Plasmidit ja Solutransfektiot

Viimeaikaiset tutkimukset ovat raportoineet, että miR-200B on kaksi toiminnallista promoottorit, joka sijaitsee ~ 4 kb ja ~ 2 kb ylävirtaan 5′- stemloop, vastaavasti [ ,,,0],21]. Sitten kaksi keskeistä alueilla, jotka sijaitsevat chr1: 1087797-1088137 (341 bp) ja chr1: 1089316-1090354 (1039 bp), tässä järjestyksessä (UCSC Genome selain, maaliskuu 2006) monistettiin PCR: llä ja kloonattiin pGL3-perusvektoriin (Promega ) Kpnl- ja Hindlll, nimeltään (pGL3) promoottori-1 ja promoottori-2. Lisäksi useita SP1 sitoutumiskohtia havaittiin kahdessa ydinalueille. Ja, Sp1 sitoutumiskohdat sijaitsevat chr1: 1087926-1087932, chr1: 1088073-1088079 ja chr1: 1089779-1089785, vastaavasti. Sitten, Sp1 sitova-site-directed mutantti reportteri vektorit konstruoitiin mutaatio PCR: llä. Lusiferaasireportteri- sisältävät villin tyypin 3′-UTR Suz-12 (pLUC /Suz-12 /3′-UTR-wt), jossa nukleotidit Suz-12-3′-UTR komplementaarinen miR-200b insertoitiin pLUC vektori, ja meillä on myös tuotti mutantti toimittaja (pLUC /Suz-12 /3′-UTR-mut), jossa ensimmäisen kuuden nukleotidin miR-200b siemenen alueen täydentävien alueiden mutatoitiin. Kaikki alukkeen sekvenssit on lueteltu taulukossa S1. MiR-200B ekspressioplasmidin (pcDNA /miR-200B), mock pcDNA-negatiivinen kontrolli (pcDNA /miR-NC), miR-200b estäjä (Anti-miR-200B) ja epäspesifinen miRNA ohjaus (Anti-miR-NC) olivat käytettiin edellisessä kuvattu [18]. HDAC1-shRNA (tai kontrolli-shRNA), SP1-shRNA (tai kontrolli-shRNA) vektorit saatiin GenePharma. Suz-12-ekspressioplasmidi (pcDNA /Suz-12) rakennettiin jatkokloonaamalla Suz-12 pcDNA 3.0 (Invitrogen), PCR: llä alukkeilla taulukossa S2. Kaikki vektorit varmistettiin DNA-sekvensoinnilla. Solut transfektoitiin Lipofectamine 2000 (Invitrogen) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti.

virtaussytometrinen analyysi CD133

+ /CD326

+ solujen

virtaussytometrinen analyysi CD133

+ /CD326

+ solut tehtiin CD133-PE ja CD326-FITC-vasta-aineita (Miltenyi Biotec) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Lyhyesti, noin 1,0 x 10

6 solua sentrifugoitiin 300 x g 10 minuutin ajan. Supernatantti heitettiin sitten pois. Solut suspendoitiin uudelleen 80 ul: aan puskuria. 20 ui FcR Blocking Reagent lisättiin sitten puskuriin. 10 ui CD133 /CD326-vasta lisättiin, sekoitettiin hyvin ja inkuboitiin 10 minuuttia pimeässä jääkaapissa (2-8 ° C). Seuraavaksi solut pestiin lisäämällä 1-2 ml: aan puskuria ja sentrifugoidaan 300 x g 10 minuutin ajan. Supernatantti imettiin pois. Vihdoin, solut suspendoitiin uudelleen 400 ui puskuria analysoitaviksi virtaussytometrillä.

Mammosphere muodostumisen määritys

Mammosphere muodostumisen määritys suoritettiin arvioimaan kykyä CSC itseuudistumisen. Mammosphere muodostumisen määritys suoritettiin maljaamalla yksisoluiset suspensiot (1000 solua /kuoppa) osaksi ultra-low tarttuva 6-kuoppaisille levyille. Sitten soluja kasvatettiin seerumittomassa CSCS-viljelyväliaine, ja täydennetty väliaine joka 3 päivä. Jälkeen 7 päivää inkuboinnin jälkeen levyt analysoitiin mittaamiseksi mammosphere numeroita.

Western blotting-määritys

ensisijainen vasta-aineita E-kadheriinin, Sox-2 ja Oct-4 (Abcam, Hongkong ), BMI-1, HDAC1, Suz-12 (Cell Signaling Technologies) ja GAPDH (Santa Cruz Biotechnology), käytettiin tässä tutkimuksessa. GAPDH käytettiin sisäisenä kontrollina. Kokonaisproteiinia lysaatti erotettiin 10% natriumdodekyylisulfaattia-polyakryyliamidigeelielektroforeesilla (SDS-PAGE). Sitten proteiinit siirrettiin polyvinylideenifluoridi (PVDF) (Millipore). Seuraavaksi immunoblottaus suoritettiin ja visualisoitiin kemiluminesenssimittaus Kit (Thermo Scientific).

Reaaliaikainen kvantitatiivinen Käänteiskopiointia polymeraasiketjureaktio (qRT-PCR) määritys

Yhteensä-RNA uutettiin TRIzolia reagenssia (Takara). Käänteinen transkriptio suoritettiin PrimeScript RT reagenssipakkauksen (Takara) sen pohjalta valmistajan ohjeita. qRT-PCR suoritettiin SYBR PrimeScript RT-PCR Kit (Takara) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. MIR-200B tai mRNA laskettiin 2

– △△ Ct-menetelmällä U6 rRNA tai GAPDH mRNA vertailukohtana geenejä. Ilmaisu mitattiin suhteessa kertainen muutos kontrollisoluihin, jotka määriteltiin 1,0. Kaikki kokeet suoritettiin kolmena kappaleena. Kaikki alukepareja taulukossa S3.

Drug herkkyys ja solunelinkykyisyysmääritys

Drug herkkyys ja solunelinkykyisyysmäärityksen mitattiin Cell Counting Kit-8 (CCK-8) määritys ( Dojindo) mukaan valmistajan ohjeiden. For Drug herkkyys määrityksessä, 3 x 10

3-solut ympättiin 96-kuoppaisille levyille 24 tuntia transfektion jälkeen. Kiinnittymisen jälkeen, juuri valmistettu dosetakseli lisättiin sitten eri lopulliseen konsentraatioon. 48 tuntia myöhemmin, 10 ui CCK-8, lisättiin ja inkuboitiin 4 tunnin ajan 37 ° C: ssa. Absorbanssi mitattiin sitten 450 nm: ssä. Solujen elinkyvyn, 2,0 x 10

3-solut ympättiin 96-kuoppaisille levyille 24 tuntia transfektion jälkeen ilmaistuilla vektoreilla. 12, 24 tai 48 tunnin kuluttua, 10 ui CCK-8, lisättiin ja inkuboitiin 4 tunnin ajan 37 ° C: ssa. Absorbanssi mitattiin sitten 450 nm: ssä. Kaikki koe suoritettiin kolmena kappaleena ja toistettiin ainakin kolme kertaa.

lusiferaasireporttiterilla määritys

Noin 2,0 x 10

3 /kuoppa CSCS ympättiin 96-kuoppalevyille ja sitten kotransfektoitiin erityiset lusiferaasireportteri- plasmidit, miR-NC tai miR-200b. Renila-TK-plasmidia (Promega) kotransfektoitiin kaikki näytteet. 48 tuntia transfektion jälkeen, lusiferaasiaktiivisuudet mitattiin Dual-Luciferase Reporter Assay sarjat (Promega). Lusiferaasiaktiivisuudet normalisoitiin renilla lusiferaasi toimintaa. Tiedot olivat suhteessa kertainen muutos vastaavien verrokkiryhmien joka määriteltiin 1.0. Kaikki kokeet suoritettiin kolmena kappaleena.

Co-immuunisaostustesti

Co-immunosaostus analyysi suoritettiin käyttäen Co-immunosaostus Kits (Thermo tieteellinen Pierce) perustaa valmistajan ohjeiden mukaisesti. Lyhyesti, 75 ug affiniteettipuhdistettua vasta-aineita (SP1, HDAC1, Cell Signaling Technologies) kytkettiin osaksi spin sarakkeisiin. Solulysaatti valmistettiin sitten ja esipuhdistettiin ohjaus agaroosin hartsit. Tämän jälkeen solu- lysaattia co-immunosaostettiin ja eluoitiin. Lopuksi näytteet mitattiin western blotting-määritys.

Kromatiini immunosaostuksella (ChIP) määritys

ChIP määritys suoritettiin Immunosaostusmääritys Kits (Millipore) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Lyhyesti, solut silloitettu 1% formaldehydiä 10 minuutin ajan 37 ° C: ssa. Sitten solut suspendoitiin uudelleen 200 ul: aan lyysipuskuria ja inkuboitiin 10 minuuttia jäillä. Lysaattia leikattiin pituuteen 200 ja 1000 emäsparia sonikoimalla. Supernatantti esipuhdistettiin kanssa lohen sperman DNA /proteiini A agaroosi-50% lietteen. Talteen otettu supernatantti inkuboitiin Suz-12 immunosaostus vasta-aineella (Abcam), histoni H3 trimetyyli-lysiinin 27 (H3-trimetyyli-K27) immuunisaostamiseksi-vasta-aine (Millipore), asetyyli-Histone H3 (Lys9) (Millipore), tai isotyyppikontrolli-IgG yön yli 4 ° C: ssa rotaatiossa. Sitten vasta-aine /DNA-kompleksi kerättiin lohen sperman DNA /proteiini A-agaroosia Lietteen yksi tunti 4 ° C: ssa rotaatiossa. Monimutkainen eluoitiin eluutiopuskurilla. Sitten silloitukset purettiin 5 M NaCl kuumentamalla 65 ° C: ssa 4 tunnin ajan. DNA-näytteet puhdistettiin sitten ja mitattiin qRT-PCR. Alukkeet luetellaan taulukossa S4.

Vieraslajisiirteen elinsiirrot

BALB /c atyymisissä nude-hiiriin (mies, SPF, 4-6 viikkoa) toimittivat osasto kokeen eläinten keskellä meidän sairaalassa . Ja in vivo tutkimus eettisesti hyväksyttyjä ja suoritettiin vakiintuneiden ohjeiden. Suorittamaan tuumorigeenisyyden nude-hiirissä, CSCS mistä SPC-A1 /DTX pysyvästi transfektoitujen solujen miR-200b miR-NC, sh-ohjaus tai sh-HDAC1 # 2 vektorit injektoitiin subkutaanisti oikeaan kylkeen nude-hiirten. Kasvaimet kerättiin, kun he olivat käsin kosketeltava. Vaikutuksen tutkimiseksi Mir-200b ilmentymisen tai HDAC1 tukahduttaminen on

in vivo

sääntelyn LAD soluja, 3,0 x 10

6 H1299 /DTX pysyvästi transfektoitujen solujen sh-ohjaus, sh-HDAC1, asennuspalveli- NC tai miR-200B vektorit, subkutaani- istutetaan oikealla puolella takaosan kylkeen nude-hiirten. Tuumoritilavuudet mitattiin edellinen on kuvattu [19]. Kun taas keskimääräinen kasvaimen mitta oli noin 50 mm

3, jonka pitoisuus on 1,0 mg /kg dosetakselia (DTX), yksi annos joka toinen päivä, ja kolme annosta yhteensä, annettiin läpi vatsaonteloon [19]. Jälkeen 5 viikkoa, kaikki hiiret tapettiin ja kasvaimen kudokset käytettiin myöhemmissä tutkimuksissa.

Tilastollinen analyysi

Kaikki tilastollinen analyysi suoritettiin SPSS-ohjelman versiota 17.0 (SPSS Inc., Chicago, IL , USA). Tiedot esitetään keskiarvona ± keskivirhe keskiarvon, ja virhepylväät edustavat vähintään kolmen riippumattoman kokeen. Keskiarvot kahdesta ryhmästä verrattiin Studentin

t

testi. Erot useita ryhmiä analysoitiin yksisuuntaisella ANOVA. Kaikki

P

arvojen 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

CD133

+ /CD326

+ soluilla ominaisuudet CSCS

Ymmärtääksemme paremmin taustalla olevien mekanismien vastuussa chemoresistance LAD, CD133

+ /CD326

+ solut lajiteltiin Dosetakseliryhmän kestävästä LAD soluihin CD133 ja CD326 mikrohelmiä. Puhtaus CD133

+ /CD326

+ solut lajiteltiin SPC-A1 /DTX ja H1299 /DTX oli 93,13% ± 4,06% ja 92,74% ± 3,12%, vastaavasti, ja CD133

+ /CD326

+ solut voivat erilaistua dosetakselia resistenttien LAD solujen alaisena erilaistumista ehto (kuvio 1A

1, A

2 ja A

3). Sitten me selvitettävä, CD133

+ /CD326

+ soluilla ominaisuuksia CSCS. Ensinnäkin olemme analysoineet mammosphere muodostava kyky CD133

+ /CD326

+ soluja, ja tiedot osoittivat, että määrä mammosphere vuonna CD133

+ /CD326

+ soluja oli huomattavasti enemmän kuin vastaavalla dosetakselia kestävä LAD soluissa (kuvio 1 B). Myös CD133

+ /CD326

+ solut ilmensivät korkeampia ekspressiotasoja kantasolujen markkereita (kuten Sox-2, Oct-4, Suz-12, ja Bmi-1) kuin vastaava doketakseli kestävä LAD solut (kuvio 1 C, 1D

1 ja D

2). Toiseksi, olemme analysoineet kasvaimia kapasiteetti CD133

+ /CD326

+ soluja, ja sitten noin 1,000~100,000 CD133

+ /CD326

+ soluja tai vastaavaa doketakselin vastustuskykyisten LAD soluja ihon alle ympätty paljaisiin hiiriin. 1000 CD133

+ /CD326

+ solujen riittivät muodostamaan kasvaimia kaikissa nude-hiirten kuitenkin enintään 1,0 × 10

5 dosetakseli vastustuskykyisten LAD solujen pysty onnistuneesti muodostaa kasvaimia kussakin nude hiirillä, mikä osoitti, että CD133

+ /CD326

+ solut hallussaan suurempi kyky kasvaimien kuin vanhempien doketakseli kestävä LAD soluissa (kuvio 1 E). Siksi CD133

+ /CD326

+ alaryhmästä soluilla ominaisuuksia CSCS.

(A

1, A

2 A

3) Prosenttiosuus CD133

+ /CD326

+ CSCS kuten analysoitiin virtaussytometrillä ilmoitettuina ajankohtina jälkeen viljellä CD133

+ /CD326

+ CSCS (hankittu lajittelemalla SPC-A1 /DTX ja H1299 /DTX soluja, tässä järjestyksessä) alle erilaistumisolosuhteissa. (B) Mammosphere muodostavat kyky osoitti solujen (1000 solua) 7 päivän jälkeen alle CSC-viljellä olosuhteissa. (C) qRT-PCR havaitseminen suhteelliset mRNA tasojen CSC liittyviä markkereita on osoitettu soluissa. Tiedot laskettiin 2

– △△ Ct menetelmällä käyttämällä GAPDH RNA vertailukohtana geeni. Ilmentymistaso mitattiin suhteessa kertainen muutos emosoluilta ryhmiä, jotka määriteltiin 1,0. (D

1, D

2) proteiini tasot CSC liittyviä markkereita on osoitettu soluissa. GAPDH käytettiin sisäisenä kontrollina. (E) Kasvaimen esiintyvyys nude-hiirillä, jotka injektoitiin subkutaanisti ilmaistuihin soluihin. Tulokset esitettiin keskiarvona ± SD vähintään kolmen itsenäisen kokeen. *

p

0,05, **

p

0,01.

MiR-200B estää CSCS muodostumista ja kääntää chemoresistance of CSCS

Aiemmin olemme osoittaneet, että ylössäätely miR-200b voi kääntää chemoresistance että doketakselin vastustuskykyisten LAD soluissa estämällä solujen kasvua, joka indusoi solusyklin pysähtymisen ja apoptoosin tehostamiseksi. Sitten suoritimme qRT-PCR-määritys tunnistaa ilmentymisen miR-200b CSCS ja vastaava dosetakseli vastustuskykyisten LAD soluja, ja osoitti, että suhteellinen taso miR-200b CSCS oli alhaisempi kuin dosetakselin kestävä LAD soluissa (kuvio 2A). Tutkia tarkemmin, ovatko on miR-200B vaikutus CSCS dosetakselin kestävä LAD solua, pcDNA /miR-200B (tai pcDNA /miR-NC) tai anti-miR-200B (tai anti-miR-NC) oli vakaasti tai ohimenevästi transfektoitiin SPC-A1 /DTX tai H1299 /DTX soluja. Kuten on esitetty kuviossa 2B, suhteellinen ilmentymistaso miR-200b oli merkittävästi yläreguloituja dosetakselia kestävä LAD pysyvästi transfektoitujen solujen pcDNA /miR-200b, samalla kun sen suhteellinen ilmentymistaso on merkittävästi vaimentua niissä soluissa, jotka oli transfektoitu tilapäisesti anti-asennuspalveli- 200b. Virtaussytometria testi osoitti, että ylössäätely miR-200b merkittävästi vähentynyt prosenttiosuutta CD133

+ /CD326

+ CSCS kasvu dosetakselia kestävä LAD solujen ja downregulation miR-200b oli päinvastainen vaikutus (kuvio 2C). Samanlainen ilmiö havaittiin mammosphere muodostava kyky määritys sekä (kuva 2D). Samaan aikaan, palauttaminen miR-200b voisi johtaa alentuneeseen IC

50 arvo DTX CSCS peräisin SPC-A1 /DTX tai H1299 /DTX soluja (kuvio 2E). Nämä tulokset osoittivat, että miR-200B voi olla ratkaiseva merkitys CSCS kasvun ja chemoresistance ihmisen LAD.

(A) qRT-PCR havaitseminen miR-200b CSCS. Data normalisoitiin U6 rRNA ja määritetään suhteessa vastaavaan vanhempien solun ryhmiä. (B) qRT-PCR havaitseminen suhteessa mRNA-tasolla ja miR-200b dosetakselia kestävä LAD-solujen transfektion jälkeen ilmaistuilla vektoreilla. Data normalisoitiin U6 rRNA ja määritetään suhteessa vastaavaan kontrolliryhmiin. (C) Prosenttiosuus CD133

+ /CD326

+ CSCS kuten analysoitiin virtaussytometrillä transfektion jälkeen ilmaistuilla vektoreilla. (D) Mammosphere muodostavat kyky osoitti solujen (1000 solua) transfektion jälkeen osoitti vektorit. (E) Solujen elävyys mitattiin Cell Counting Kit-8 (CCK-8) määritys. Tulokset esitettiin keskiarvona ± SD vähintään kolmen itsenäisen kokeen. *

p

0,05, **

p

0,01.

Suz-12 taso nousee CSCS ja tunnistettu toiminnallinen tavoite asennuspalveli- 200b

Suz-12 on osa Polycomb tukahduttavia kompleksin 2 (PRC2) ja on välttämätön PRC2-välitteisen geenien tuottamalla trimethylation lysiinin 27 tähteen histoni H3 (H3K27Me3). In CSCS tuotettu transformoitujen rintojen epiteelisolut (MCF-10A), Suz-12 on vahvistettu kohdegeenin on miR-200b. Kuitenkin myös miR-200B voivat kohdistaa Suz-12 CSCS johdettu doketakseli kestävä LAD soluissa on epäselvä. qRT-PCR ja Western blottauksella määritykset osoittivat, että Suz-12 oli säädellään ylöspäin CSCS verrattuna vastaaviin doketakselin kestävä LAD solujen sekä transkription ja translaation tasoja (kuvio 3A ja B). Sitten olemme analysoineet vaikutuksia miR-200b ilmentymistä koskevat Suz-12 CSCS. Ylössäätely miR-200b johti vähentynyt ilmentyminen Suz-12 CSCS SPC-A1 /DTX ja H1299 /DTX-soluissa, kun taas silencing of miR-200b johtanut lisääntyneeseen ekspressioon Suz-12 näiden CSCS (kuvio 3C ja D). Saadakseen lisää suoria todisteita siitä, että Suz-12 oli tavoite miR-200b, tutkimme sitoutumiskohdan miR-200b 3′-UTR-sekvenssin Suz-12 mRNA: sta. Rakensimme lusiferaasireportteri- (pLUC /Suz-12 /3′-UTR-wt), jossa nukleotidit Suz-12-3′-UTR komplementaarinen miR-200b insertoitiin pLUC vektoriin, ja myös tuotti mutantti toimittaja (pLUC /Suz-12 /3′-UTR-mut), jossa ensimmäisen kuuden nukleotidin miR-200b siemenen alueen täydentävien alueiden mutatoitiin. Lusiferaasiaktiivisuuden pLUC /Suz-12 /3′-UTR-wt-transfektoituja soluja kotransfektoitiin pcDNA /miR-200b on merkittävästi vähentynyt kuin että pLUC /Suz-12 /3′-UTR-mut-transfektoiduissa soluissa kotransfektoitiin pcDNA /miR-200b (kuvio 3E). Nämä tulokset viittaavat siihen, Suz-12 saattaa olla välittömänä kohteena miR-200b on CSCS johdettu doketakseli kestävästä LAD soluissa.

(A) qRT-PCR havaitseminen suhteellisen Suz-12 mRNA ilmentymistä osoitettu soluissa. Data normalisoitiin GAPDH RNA: ta ja määritettiin suhteessa vastaavaan emo-solujen ryhmiä. (B) proteiini tasot Suz-12 mitattuna Western-blottauksella on osoitettu soluissa. GAPDH käytettiin sisäisenä kontrollina. (C) qRT-PCR havaitseminen Suz-12 mRNA: n ekspression CSCS transfektion jälkeen osoitti vektorit. (D) Western blotting havaitseminen Suz-12-proteiinin ilmentymisen CSCS transfektion jälkeen ilmaistuilla vektoreilla. GAPDH käytettiin sisäisenä kontrollina. (E) Lusiferaasiaktiivisuutta on CSCS (SPC-A1 /DTX) kotransfektoitiin pcDNA /miR-200b (tai pcDNA /miR-NC) tai pLUC /Suz-12 /3′-UTR-wt (tai pLUC /Suz -12 /3′-UTR-mut). Tiedot olivat keskiarvoja ± SD vähintään kolmen itsenäisen kokeen. *

p

0,05, **

p

0,01.

edelleen selvittää Suz-12 oli mukana säätelyyn CSCS, Suz- 12-shRNAs (Suz-12-shRNA # 1, # 2 ja # 3) suunniteltiin ja transfektoitiin dosetakseli-resistenttejä LAD-soluihin ja inhiboiva vaikutus Suz-12-shRNA3 oli suurin (kuvio 4A). Hiljentäminen Suz-12 voisi merkittävästi vähentää mammosphere muodostava kyky SPC-A1 /DTX ja H1299 /DTX soluja (kuvio 4B). Lisäksi prosenttiosuus CD133

+ /CD326

+ CSCS kasvu Suz-12-shRNA3-transfektoiduissa SPC-A1 /DTX tai H1299 /DTX-soluissa oli merkittävästi vähentynyt kuin kontrolliryhmän-shRNA-transfektoiduissa soluissa ( kuvio 4C). Sitten me vielä analysoineet vaikutuksia Suz-12 lausekkeen tuumorigeenisyyteen ja kemosensitiivisyys of CSCS. Ensin havaitaan proteiinin ilmentymistä Suz-12 CSCS päässä Suz-12-shRNA3 tai kontrolli-shRNA-transfektoiduissa SPC-A1 /DTX ja H1299 /DTX-soluja, ja osoitti, että ilmentymistaso Suz-12-proteiinin Suz- 12-shRNA3-transfektoiduissa soluissa oli merkittävästi pienempi kuin valvonta-shRNA-transfektoiduissa soluissa (kuvio 4D). Toiminnallinen analyysi osoitti, että hiljentäminen Suz-12 voisi merkittävästi estää

in vitro

kasvun ja

in vivo

aiheuttavan kasvaimia CSCS (kuvio 4E ja F). Lisäksi vaimentaminen Suz-12 voisi merkittävästi vähentää IC

50 arvo DTX vuonna CSCS (Kuva 4G). Siten vaimentaminen Suz-12 voivat jäljitellä vaikutuksia miR-200b päälle CSCS kasvuun ja chemoresistance, mikä viittaa siihen, että Suz-12 oli mukana säätelyssä CSCS aiheuttama miR-200B.

(A) proteiini taso Suz-12 dosetakseli-resistenttejä LAD-solujen transfektion jälkeen ilmaistuilla sh-RNA-vektorit (sh-RNA-Suz12 # 1, sh-RNA-Suz12 # 2, ja sh-RNA-Suz12 # 3). (B) Mammosphere muodostava kyky dosetakselin kestävä LAD-soluja (1000 solua) transfektion jälkeen osoitti vektorit. (C) Virtaussytometrianalyysi prosentteina CD133

+ /CD326

+ CSCS analysoituna in dosetakselia kestävä LAD-solujen transfektion jälkeen osoitti vektorit. (D) proteiini taso Suz-12 CSCS transfektion jälkeen kanssa sh-RNA-ohjaus- tai sh-RNA-Suz12 # 3 vektoreita. (E) CCK-8 analysoitiin solun elinkelpoisuuden CSCS transfektoitiin ilmoitetuilla vektoreilla ilmoitettuina ajankohtina. (F) vaikutus Suz-12 estoa

in vivo

kasvainten muodostumiseen on CSCS peräisin SPC-A1 /DTX soluja. (G) vaikutus Suz-12 estoa chemoresistance of CSCS. Solujen elinkelpoisuus mitattiin CCK-8-määrityksessä. GAPDH käytettiin sisäisenä kontrollina. Tulokset esitettiin keskiarvona ± SD vähintään kolmen itsenäisen kokeen. *

p

0,05, **

p

0,01.

varmistamiseksi edelleen, että Suz-12 oli toimiva kohteena miR-200b sääntelyn CSCS, pcDNA /Suz-12 tai pcDNA /kontrolli transfektoitiin CSCS (SPC-A1 /DTX) stabiilisti transfektoitu pcDNA /miR-200B tai pcDNA /miR-NC. 48 h transfektion jälkeen, Western Botting määritys suoritettiin ekspression havaitsemiseksi Suz-12-proteiinia, ja osoitimme, että pcDNA /Suz-12 voi kääntää vähentynyt ilmentyminen Suz-12 CSCS päässä SPC-A1 /DTX indusoiman miR -200b kiihdytyssäätely (kuvio 5A). Samaan aikaan yli-ilmentyminen Suz-12 voi vain kääntää laski prosenttiosuus CD133

+ /CD326

+ CSCS kasvua ja mammosphere muodostavat kyky, mutta myös kääntää laski kasvumahdollisuuksia ja IC

50 arvo dosetakselin CSCS alkaen SPC-A1 /DTX indusoiman miR-200B säätelyä (kuva 5B-E). Niinpä yli-ilmentyminen Suz-12 voisi kääntää vaikutuksia miR-200b kiihdytyssäätely sääntelystä CSCS, mikä viittaa siihen, että Suz-12 oli toimiva kohteena miR-200b sääntelyssä CSCS peräisin doketakseli kestävästä LAD soluissa.

(A) proteiini taso Suz-12 CSCS päässä SPC-A1 /DTX-soluja transfektoitiin osoitetuilla vektoreilla. GAPDH käytettiin sisäisenä kontrollina. (B) Virtaussytometrianalyysi prosentteina CD133

+ /CD326

+ CSCS SPC-A1 /DTX-solujen transfektion jälkeen osoitti vektorit. (C) Mammosphere muodostava kyky SPC-A1 /DTX-soluja (1000 solua) transfektion jälkeen osoitti vektorit. **

P

0,01. *

p

0,05.