Krooninen sairaus

tiivistelmä

tavoite

5-fluorourasiili (5-Fu) on laajalti käytetty ensilinjan lääke peräsuolen syöpä (CRC) hoitoa, mutta rajoittaa lääkeresistenssin ja vakavaa myrkyllisyyttä . Chemo-herkistävät aineet, jotka lisäävät sen tehokkuutta ja voittamaan sen rajoittamista tarvitaan kiireellisesti. Pentaphy (Gyp), tärkeimmät osat

Gynostemma pentaphyllum

(Thunb.) Makino, on osoittanut potentiaalia kasvaimen vastaisen ominaisuus vähän sivuvaikutusta. Täällä me huolellisesti tutkittu kemiallis-herkistymisestä Gyp voimistavan kasvaimen vastaisen vaikutuksen 5-Fu

in vitro

ja

in vivo

.

Menetelmät /Principal Havainnot

3- (4, 5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -2, 5-diphenyltertrazolium bromidi tetratsolium määrityksessä ja pesäkkeiden muodostumisen testi osoittavat, että Gyp voitaisiin lisätä merkittävästi 5-Fu-aiheuttama SW-480, SW- 620 ja Caco2 solujen elinkelpoisuuden menetys. CalcuSyn- analyysi osoittaa, että Gyp vaikuttaa synergistisesti 5-Fu. Anneksiini V-PE /7-AAD värjäys osoittaa 5-Fu + Gyp voisi aiheuttaa SW-480 solujen apoptoosin. Aktivointien kaspaasi 3, kaspaasi 9 ja poly (ADP-riboosi) polymeraasi (PARP) on mukana prosessissa. Gyp havaittiin myös säätää ylös 5-Fu-aiheutti fosfo-p53 ilmaisun ja siten lisätä 5-Fu aiheuttama G0 /G1 vaiheen pysähtymisen. Gyp kohonnut solunsisäinen ROS tasolla, merkittävästi parannettu 5-Fu laukaisema DNA-vaurioita vastaus osoituksena virtaussytometrialla, comet ja ilmentymistä Ser139-histoni H2A.X. Esto ROS ja p53 vastaavasti kääntänyt solukuoleman aiheuttama 5-Fu + Gyp, mikä viittaa päätehtävien ROS ja p53 prosessissa. Lisäksi 5-Fu ja Gyp yhdistettynä osoittaa paljon parempi kasvaimen tilavuus ja paino estoa CT-26 ksenografti hiirimallissa verrattuna 5-Fu tai Gyp yksin. Immunohistokemia-analyysi viittaa siihen, yhdistelmät suuresti esti tuumorin lisääntymistä. Alustavat toksikologiset tulokset osoittavat, että 5-Fu + Gyp hoito on suhteellisen turvallista.

Päätelmät

Mahdollisena kemoterapia-herkistävä, Gyp näyttää loistava synergistinen vaikutus 5-Fu estämään syöpäsolujen lisääntymistä ja kasvaimen kasvua. Käyttämällä 5-Fu ja Gyp yhdistettynä olisi lupaava terapeuttinen strategia CRC hoitoon.

Citation: Kong L, Wang X, Zhang K, Yuan W, Yang Q, Fan J, et al. (2015) pentaphy parantaa synergisesti Anti-kasvain vaikutus 5-fluoriurasiili on peräsuolen syövän In vitro ja in vivo: rooli Oksidatiivinen stressi-välitteistä DNA-vaurio ja p53 aktivointi. PLoS ONE 10 (9): e0137888. doi: 10,1371 /journal.pone.0137888

Editor: Wei-Guo Zhu, Pekingin yliopiston Health Science Center, Kiina

vastaanotettu: Kesäkuu 27, 2015 Hyväksytty: 24 elokuu 2015; Julkaistu: 14 syyskuu 2015

Copyright: © 2015 Kong et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi.

rahoitus: kirjoittajat eivät tuki ja rahoitus raportoida.

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

peräsuolen syöpä (CRC) on kolmanneksi yleisin pahanlaatuinen syöpä ja neljänneksi suurin syy syöpään liittyvien kuolemien maailmanlaajuisesti, että osuus on noin 1,2 miljoonaa uutta tapausta ja 600 000 kuolemaa vuosittain [1]. Kirurginen resektio, jota seurasi kemo- tai sädehoidon, on ainoa vahvistettu parantavaa hoitoa CRC, mutta rajoittaa lääkeresistenssin ja vakavaa myrkyllisyyttä [2].

5-fluorourasiili (5-Fu), analogi urasiilin , on yleisimmin käytetty kemoterapeuttisen lääkkeen hoitoon kiinteitä kasvaimia, erityisesti paksusuolen ja peräsuolen syövän [3]. Tuumorisoluissa, 5-Fu muunnetaan fluorideoksiuridiini monofosfaatin (FdUMP) ja kohdistaa sen sytotoksista vaikutusta. FdUMP voi mis-sisällyttää DNA: han tai RNA: ta, estävät toiminnan tymidylaattisyntetaasin (TS), lopulta aiheuttaa apoptoosia [4]. Tästä huolimatta kokonaisvasteeseen 5-Fu monoterapia ensilinjan hoitoon CRC on varsin rajallinen (approximately10-20%) [5]. Entisestään annos tuottaisi lääkeresistenssin ja väistämättömiä sivuvaikutuksia siten rajoittaa sen terapeuttista vaikutusta. Äskettäin, yhdistelmä tai usean komponentin (mieluummin kuin yhden aineen) hoidon, jossa kaksi tai useampia erilaisia ​​lääkkeitä käytetään samanaikaisesti, on todistettu syövän hoitoon [6,7]. 5-Fu yhdistettynä uusiin sytotoksisten lääkkeiden, kuten oksaliplatiini, resveratrol ja irinotekaani ei ole ainoastaan ​​parantanut hoitovaste 40-50%, mutta myös vähensi toivottuja reaktio näiden lääkkeiden [8-10], mikä viittaa siihen, että 5-Fu on suotuisa turvallisuusprofiili ja voivat olla sopivia yhdistelmä hoito muilla lääkkeillä. Näistä parannuksista huolimatta uusia terapeuttisia strategioita ja uusia Chemo-herkistävät aineet tarvitaan pikaisesti.

pentaphy (Gyp), pääkomponenttien otteet

Gynostemma pentaphyllum

(Thunb.) Makino, esiintyy pääasiassa dammarane tyyppinen triterpene glykosidit (kuvio 1A) ja on käytetty perinteistä suosittu kansanlääkinnässä Aasiassa vuosisatoja syövän hoitoon [11-13], hyperlipoproteinemiaa [14], hepatiitti [15], ja sydän- ja verisuonisairauksien [16]. Kokeellinen tutkimus on raportoitu, että Gyp voisi laukaista apoptoosin paksu- ja peräsuolisyövän 205 solua läpi mitokondrioiden-riippuvaisen reitin ja kaspaasi-3 [17]. Aikaisemmat tutkimukset viittaavat myös siihen, että Gyp esti ihmisen kolorektaalisyövän SW-480 ja SW-620-solujen proliferaatio ja migraatio annoksesta ja ajasta riippuvaisella tavalla [18,19]. Huolimatta näistä potensseissa, Gyp oli suhteellisesti vähemmän myrkyllistä ihmisen normaaleille soluille [20], joka osoittaa potentiaalisia käyttömahdollisuuksia syövän hoidossa. Kuitenkin, ei ole mitään tietoa siitä, kemiallis-herkistymistä vaikutus Gyp asti. Ja onko Gyp voi tulla hyvä kemiallis-herkistävä täydentää tehokkuus kemoterapian klinikalla ei ole selvä. Tässä tutkimuksessa käytämme ihmisen kolorektaalisyövän SW-480, SW-620, Caco2 solut ja CT-26 ksenografti hiirimallissa tutkimaan mahdollisia kemiallis-herkistymistä vaikutus Gyp voimistavan kasvaimen vastaisen vaikutuksen 5-Fu

in vitro

ja

in vivo

. Parhaan tietomme mukaan esillä oleva tutkimus on ensimmäinen,

in vitro

ja

in vivo

prekliinisen tutkimuksen, jossa arvioidaan kemiallis-herkistymistä vaikutus Gyp ja anti-kasvain vaikutus käyttämällä 5 -Fu ja Gyp yhdistelmänä. Nämä havainnot voivat tarjota uusia terapeuttisia strategiasta syöpälääkkeen synergia.

(A) kemiallinen dammarane luuranko rakenne pentaphy. (B) Solujen elinkelpoisuus mitattiin MTT: llä 48 h kuluttua 5-Fu hoidon SW-480, SW-620 ja Caco2 soluja. (C-F) Solujen elinkelpoisuus mitattiin MTT: llä 24 ja 48 h kuluttua 5-Fu ja /tai Gyp käsittely SW-480, SW-620 ja Caco2 soluja. Yhdistelmä-indeksi (CI) arvo analysoitiin CalcuSyn- ohjelmistoa. CI 1 osoittaa synergististä vaikutusta. (G) Pesäkkeenmuodostusta SW-480 ja Caco2 solujen jälkeen 5-Fu ja /tai Gyp hoitoon. Kaikki tiedot ilmaistaan ​​keskiarvoina ± SD kolmen rinnakkaisen ja

p

* 0,05,

p

** 0,01 vs. kontrolli;

p

##

0,01 vs. 5-Fu tai Gyp yksin ryhmä.

Materiaalit ja menetelmät

Kemikaalit ja reagenssit

pentaphy (Gyp) luovutti ystävällisesti ankang Pharmaceutical instituutin Beijing University (Shaanxi, Kiina) ja liuotetaan 80% etanolia (EtOH) lopulliseen varastointiin pitoisuus on 100 mg /ml. 5-fluorourasiili (5-Fu) ostettiin sigAm-Aldrich (St. Louis, Mo, USA) ja liuotettiin dimetyylisulfoksidiin (DMSO), myös lopulliseen varastointiin pitoisuus on 100 mg /ml. Gyp ja 5-Fu liuos steriloitiin läpi 0,22 um: n suodattimen myöhemmissä kokeissa käytettäväksi ja varastoidaan -20 ° C: ssa.

3- (4, 5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -2, 5-diphenyltertrazolium bromidi tetratsolium (MTT), Hoechst 33342, propidiumjodidi (PI), RNaasi A, N-asetyylikysteiini (NAC), ja pifithrin-α ostettiin Sigma-Aldrich. Guava neksiini reagenssi saatiin Millipore Corporation (Billerica, MA, USA). 2 ’, 7’-dikloorifluoreskiiniliuoksella-diasetaatti (DCFH-DA) oli Molecular Probes Inc. (Eugene, OR, USA). Aspartaattiaminotransferaasi (ASAT), alaniiniaminotransferaasin (ALAT), veren ureatyppi (BUN), ja seerumin kreatiniini (Cr) määritys kit toimittivat Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute (Nanjing, Kiina).

Solulinjat

paksu- ja peräsuolisyövän SW-480, SW-620, Caco2 solut ja ihmisen normaalia napalaskimon endoteelisolujen HUVEC saatiin Cell Bank of Kiinan Academy of Science (Shanghai, Kiina). Soluja viljeltiin RPMI-1640, L-15-alustassa (sigAm-Aldrich) tai Dulbeccon modifioidussa Eaglen väliaineessa (DMEM, Gibco, Life Technologies, USA), johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia (FBS, Hyclone, USA), 100 U /ml penisilliiniä, 100 ug /ml streptomysiiniä ja 1 mM glutamiinia. Viljelmiä ylläpidettiin 37 ° C: ssa kosteuden ja 5% CO

2.

solunelinkykyisyysmääritys

Solujen elinkyky arvioitiin käyttäen MTT-määritystä, ja pesäkkeiden muodostumisen testi. MTT-määritys, soluja (1 x 10

5 solua /ml) siirrostettiin 96-kuoppaisille levyille (Corning Inc., NY, USA) yön yli ja altistusta 5-Fu (1, 5, 10, 50, 100 , 300 ug /ml), Gyp (70, 85, 100 ug /ml) tai 5-Fu + Gyp 24 ja 48 h (liuotin ohjaus altistuminen 80% etanolia ja DMSO samanaikaisesti). Käsittelyn jälkeen solujen elinkykyisyys määritettiin lisäämällä 10 ui MTT-liuosta (5 mg /ml PBS: ssä) kuhunkin kuoppaan ja sen jälkeen inkuboitiin 4 tunnin ajan 37 ° C: ssa, 5% CO

2. MTT-seos poistettiin ja 150 ui DMSO: ta lisättiin kuhunkin kuoppaan. Näytteet sekoitettiin ravistimessa 15 minuutin ajan, ja absorbanssi 570 nm: ssä rekisteröitiin käyttämällä mikro-levynlukijaa (Bio-Tek, ELX800, USA). Solujen elinkelpoisuus laskettiin seuraavasti: (1 keskimääräinen absorbanssi käsitellyssä ryhmässä /keskimääräinen absorbanssi kontrolliryhmän) x 100%.

Pesäkkeenmuodostusta suoritettiin arvioimiseksi pitkän aikavälin proliferaatiopotentiaali SW-480 tai Caco2 soluissa 5-Fu ja /tai Gyp hoitoon. Solut siirrostettiin 6-kuoppaisille levyille tiheydellä 1000 solua /kuoppa ja viljeltiin 7-10 päivää 37 ° C: ssa, 5% CO

2. Väliaine vaihdettiin joka 3. päivä, kunnes näkyvissä muodostuneiden pesäkkeiden. Sitten pesäkkeet kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä 4 ° C: ssa 15 min ja värjätään Giemsa 30 min. Näytteet pestiin PBS: llä ja kuivataan huoneenlämpötilassa. Määrä värjättyä pesäkkeiden joka sisälsi 50 solua manuaalisesti laskettiin. Leviämisen potentiaali laskettiin seuraavasti: suhteellinen pesäkkeiden muodostumisen korko (%) = pesäkkeiden lukumäärä hoitoryhmässä /pesäkkeiden lukumäärä kontrolliryhmässä x 100%.

Arviointi yhdistelmäindeksiä

Kun tunnistaminen yhden ja yhdistelmän estäviä vaikutuksia 5-Fu ja Gyp, yhdistelmä-indeksi (CI) laskettiin menetelmän Chou ja Talalay [21] avulla CalcuSyn- ohjelma (Biosoft, Cambridge, UK). Arvo CI on kvantitatiivinen mitta aste vuorovaikutus huumeita. CI 1, osoittaa synergiaa; CI = 1, merkitsee vahvistava vaikutus; CI 1, merkitsee antagonismia.

määritys solun apoptoosin

Solun apoptoosin havaittiin käyttäen guava neksiini määritystä, jossa käytetään anneksiini V-PE havaita fosfatidyyliseriinin ulkoisen kalvon apoptoottisten solujen [22] . SW-480-soluja (2 x 10

5 solua /ml) siirrostettiin 24-kuoppaisille levyille ja käsiteltiin 5-Fu ja /tai Gyp 24 tunnin ajan, sitten solut kerättiin ja pestiin PBS: llä. Sen jälkeen 100 ui soluja kutakin näytettä suspendoitiin seokseen, jossa oli 100 ui anneksiini V-PE ja 7-AAD sitovaa puskuria, inkuboitiin 37 ° C: ssa 20 minuutin ajan pimeässä ja alistettiin virtaussytometria-analyysi (Millipore, USA) heti . Histogrammit analysoitiin FCS Express V3 ohjelmisto.

Hoechst 33342 värjäystä

Hoechst 33342 värjäystä käytettiin vahvistamaan korjauksilla ytimien morfologia SW-480-solujen jälkeen 5-Fu, Gyp tai 5- Fu + Gyp hoitoa. Lyhyesti, sen jälkeen, kun oli inkuboitu 24 ja 48 tuntia, solut värjättiin 10 mM Hoechst 33342 37 ° C: ssa pimeässä 15 minuutin ajan, pestiin sitten kolme kertaa PBS: llä ja havaittiin käyttäen fluoresenssimikroskooppia standardin heräte-suodattimet (Nikon, Japani) .

Solusyklianalyysiä

SW-480-soluja siirrostettiin 24-kuoppaisille levyille ja altistusta 5-Fu, Gyp tai 5-Fu + Gyp 24 ja 48 tuntia. Sitten käsitellyt solut otettiin talteen ja hävittää seuraavat vaiheet: pestiin kahdesti kylmällä PBS: llä, kiinnitettiin 70%: isella jääkylmällä etanolilla -20 ° C: ssa yön yli, pestiin kaksi kertaa kylmällä PBS: llä, inkuboitiin 100 mg /ml RNaasi A: lla 30 min 37 ° C: ssa, jonka jälkeen värjättiin 50 mg /ml PI pimeässä 30 minuutin ajan ja altistettiin virtaussytometria-analyysi. Kutakin koetta varten, 5000 solut muistiin. Saadut tulokset analysoitiin Cell Quest ohjelmisto.

arviointi DNA-vaurion

PI interkalatoituu DNA ja koko DNA-fragmenttien näkyy hypoploid DNA histogrammin [23]. Solut 24-kuoppalevyille käsiteltiin 5-Fu, Gyp tai 5-Fu + Gyp 24 ja 48 h, värjättiin sitten 5 ug /ml PI, permeabilisoitiin jäädytys-heitto ja alistettiin virtaussytometria-analyysi. Histogrammit analysoitiin FCS Express V3-ohjelmisto.

Comet määritys, herkkä ja nopea tekniikka havaitsemiseksi DNA-vaurioita yksittäisissä soluissa, suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [24].

mittaus solunsisäisen ROS tuotanto

muutos solunsisäisten ROS taso mitattiin käyttäen oksidatiivisen konversion herkkä fluoresoiva koetin 2 ’, 7′-dikloorifluoreskiiniliuoksella-diasetaatti (DCFH-DA) loisteputki 2′, 7’-dikloorifluoreskiiniliuoksella (DCF ). DCFH-DA helposti diffundoituu solukalvon läpi ja hydrolysoidaan entsymaattisesti solunsisäisten esteraasien muodostaa ei-fluoresoiva DCFH, joka sitten nopeasti hapettuu muodostaen erittäin fluoresoivaa DCF: n läsnä ollessa ROS, ja fluoresenssin intensiteetti on verrannollinen ROS. Soluja inkuboitiin 5-Fu, Gyp tai 5-Fu + Gyp 6 ja 12 tuntia, sitten värjätään 10 uM DCFH-DA 37 ° C: ssa pimeässä 30 minuutin ajan. Kun oli pesty PBS: llä kolme kertaa, solut tarkasteltiin fluoresenssimikroskoopilla, heti (Nikon, Japani).

NAC (5 mM), käytettiin ROS puhdistusaineena lisätään viljelyväliaineeseen samanaikaisesti 5-Fu ja /tai Gyp lisääminen. ROS sukupolvi, DNA-vaurioita ja solujen apoptoosin analysoitiin kuten edellä on kuvattu.

Pifithrin-α (10 uM) käytettiin estäjä p53 vähentämään p53: n ja elatusaineeseen, kun soluja inkuboitiin 5 -Fu ja /tai Gyp. Solujen elinkelpoisuus, ROS: n syntyminen ja DNA-vaurioiden analysoitiin kuten edellä on kuvattu.

Western blotting -analyysi

Western-blottaus suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [25]. Proteiinit (60 ug) suoritettiin elektroforeesi 5-13,5% polyakryyliamidigeeleillä, ja geelit siirrettiin nitroselluloosakalvoille (Millipore, MA, USA), jotka inkuboitiin asianomaisten vasta-aineita. Seuraavia vasta-aineita käytettiin: Phospho-p53 (Ser15), Phospho-cdk2 (Thr160), Caspase 3, Caspase 9, Bcl-2, Ser139-Histone H2A.X, pilkotaan-PARP, β-aktiini (Cell Signaling Technology, Danvers , MA, USA) ja sykliini E (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA). Β-aktiinin ilmentymistä käytettiin viitealueen. Proteiini ilmentymisnopeudessa kvantifioitiin Määrä Yksi ohjelmisto.

Vieraslajisiirteen kasvainmuoto

Hiiren kolorektaalisyövän CT-26-solut saatiin Cell Resource Center, Institute of Basic Lääketieteen (Peking, Kiina), ja kunnon kulttuurin oli sama SW-480-soluissa. BALB /c-hiiriä (naaraita, 18-20 g ruumiinpainoa) toimitti Experimental Animal Center of neljännen Military Medical University (Xi’an, Kiina). Heidän majoitettiin ilmastoidussa huoneessa 23 ± 2 ° C, jossa on vapaa pääsy ruokaan ja veteen ja niitä pidettiin 12 tunnin valo-pimeä sykli. Sen jälkeen, kun syötetään meidän järjestely 1 viikko, odottaa kolmea hiirtä käytettiin normaalia ohjausta, kaikki muut ympättiin 0,1 ml: lla CT-26-soluja (1 x 10

7 solua /ml) vasempaan oxter alueella ja satunnaisesti jaettu 6 ryhmään 6-8 eläintä kussakin ryhmässä. Hoito aloitettiin seuraavana päivänä CT-26-solujen istutusta (päivä 1). Ryhmä I annettiin käänteisosmoosivettä kautta vatsahuuhtelua päivittäin ja säännöllisesti suolaliuoksella kautta intraperitoneaalisesti joka toinen päivä kuin kontrolliryhmässä; Ryhmä II injektoitiin 5 mg /kg 5-Fu intraperitoneaalisesti joka toinen päivä; Ryhmä III sai 25 mg /kg Gyp kautta mahahuuhtelulla päivittäin; Ryhmä IV sai 50 mg /kg Gyp kautta mahahuuhtelulla päivittäin; Ryhmä V annettiin 5 mg /ml 5-Fu + 25 mg /ml Gyp ja ryhmä VI annettiin 5 mg /kg 5-Fu + 50 mg /kg Gyp. Pitkä (a) ja lyhyt (b) halkaisijat kasvaimet mitattiin käyttäen työntömitta päivittäin päivän jälkeen 6 laskettuna kasvaimen tilavuus kuin kaava: ab

2/2. Kehon paino mitattiin myös.

Hiiriä tarkkailtiin päivittäin kliinisten oireiden ja uhrataan yhdeksäntenätoista päivänä. Kasvaimen näytteet punnittiin ja kiinnitettiin 10% formaliinilla ainakin 24 tuntia, upotettu parafiiniin, värjättiin hematoksyliinillä-eosiinivärjäykset ja immunohistokemia. Esto laskettiin seuraavasti: (1 keskimääräinen tuumorin paino käsitellyssä ryhmässä /kasvaimen keskimääräinen paino vertailuryhmässä) x 100%. Samaan aikaan, perna leikattiin irti ja punnittiin laskettu perna indeksit seuraavasti: perna /ruumiinpainon x 100%. Tasot ASAT, ALAT, BUN ja Kr seerumissa havaittiin myös.

Kokeet hiirillä suoritettiin mukaisesti National Institute of Health oppaassa Care ja koe-eläinten käyttöä ja hyväksyi ne yliopiston Institutional Animal Care ja käyttö komitean Shaanxi Normal University (Xi’an, Kiina).

immunohistokemia määritys

Immunohistokemia suoritettiin 7 um osissa parafinoidut näytteitä käyttäen monoklonaalisia anti-PCNA vasta-aine (Abcam, Cambridge, UK). Lyhyesti, sen jälkeen, kun deparaffinization ja nesteytys, leikkeet käsiteltiin lämmöllä-välitteinen antigeenin haku käyttäen 10 mM sitraattipuskurilla (pH 6,0) 15 minuutin ajan ja tehtiin läpäiseviksi 0,2% Triton X-100: ssa 15 min. Sitten endogeeninen peroksidaasiaktiivisuus pysäytettiin 3% vetyperoksidiliuosta 10 minuutin ajan. Epäspesifinen sitoutuminen estettiin inkuboimalla 5% normaalia vuohen seerumia 15 min. Tämän jälkeen leikkeitä inkuboitiin anti-PCNA-vasta-ainetta (1: 8000 laimennosta) yön yli 4 ° C: ssa kosteassa kammiossa. Vasta-aineen sitoutuminen havaittiin käyttämällä piparjuuren peroksidaasi-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineen 37 ° C: ssa 30 minuutin ajan. Sitten osat visualisoitiin diaminobentsidiini ratkaisu, vasta- kevyesti hematoksyliinillä, kuivattu etanolilla ja havaittu valomikroskoopilla (Nikon, Japani).

Tilastollinen

SPSS 16.0 ohjelmistolla (SPSS Inc., Chicago ) käytettiin tilastolliseen analyysiin. Arvot ilmaistaan ​​keskiarvona ± keskihajonta (SD) kolmesta näytteestä saatiin kolmesta itsenäisestä kokeesta. Tilastolliset vertailut tehtiin käyttämällä yksisuuntaista varianssianalyysiä (ANOVA),

p

* 0,05 pidettiin merkittävää eroa,

p

** 0,01 ja

p

##

0,01 katsottiin olevan erittäin merkittävää eroa.

Tulokset

Gyp synergistisesti tehostaa 5-Fu aiheuttama solujen elinkelpoisuuden esto

Kuvio 1B esittää sytotoksisuutta 5-Fu on SW -480, SW-620 ja Caco2 solujen käsittelyyn 48 tuntia vastaavasti. Caco2 solut suoritetaan herkempiä kuin SW-480 ja SW-620 soluja 5-Fu hoito (IC 50-arvo laskettiin 31,75 ug /ml Caco2 ja 257,23, 366,40 ug /ml SW-480, SW-620-solut). Kun pitoisuus ylittää 50 mikrog /ml, SW-480 ja SW-620 solu näyttää jonkin verran vastustuskykyä 5-Fu hoitoa. Kuitenkin Gyp esti SW-480, SW-620 ja Caco2 soluproliferaatiota annoksesta ja ajasta riippuvaisella tavalla (IC 50-arvo laskettiin 99,59, 107,53 ja 112,22 ug /ml SW-480, SW-620 ja Caco2 solujen sen jälkeen, kun oli inkuboitu 24 tuntia, kuvio 1C-1E). Kun co-käsiteltyjen solujen Gyp (70, 85, 100 ug /ml) ja 5-Fu (5, 10 ug /ml) samanaikaisesti, yhdistetty hoito jopa pieninä annoksina näkyy paljon suurempi antiproliferatiivinen toimintaa SW-480 , SW-620 ja Caco2 soluja kuin yksi hoitokerta. Esimerkiksi hoito SW-480-soluja 5 ug /ml 5-Fu tai 70 ug /ml Gyp yksin 24 h inhiboi solujen elävyys 14,6 ± 2,67% (

p

˂ 0,05

vs.

ohjaus) ja 13,8 ± 2,80% (

p

˂ 0,05

vs

ohjaus), tässä järjestyksessä. Kuitenkin, hoitoa SW-480-soluja 5 ug /ml 5-Fu + 70 ug /ml Gyp 24 tuntia merkittäviä inhiboi solujen elinkelpoisuuden 53,29 ± 1,02% (

p

˂ 0,01

vs.

ohjaus ja 5-Fu yksin). Kun inkubaatioaika nostettiin 48 h solujen elinkelpoisuuden inhibitio 5 ug /ml 5-Fu oli 32,37 ± 3,22% (

p

˂ 0,01

vs

ohjaus), 70 ug /ml Gyp oli 24,87 ± 1,83% (

p

˂ 0,01

vs

-ohjattu), 5 ug /ml 5-Fu + 70 ug /ml Gyp oli 72,11 ± 1,53% (

p

˂ 0,01

vs

ohjaus ja 5-Fu yksin).

edelleen vahvistaa synergistisen ominaisuus 5-Fu ja Gyp, solujen elävyys esto vaikutukset yhden ja kombinaatio analysoitiin käyttämällä CalcuSyn ohjelmistoa. CI-arvo 5-Fu + Gyp hoito SW-480-soluissa oli 0,68 ± 0,05, SW-620-soluissa oli 0,65 ± 0,10 ja Caco2 soluissa oli 0,72 ± 0,07 käytetyissä annoksissa (Kuva 1C-1E). SW-480-soluja, yhdistelmä 5-Fu (5 ug /ml) ja Gyp (70 ug /ml), joka näkyy parhaiten synergistinen inhibitio kapasiteetin (Cl-arvot olivat 0,63 ja 0,68 24 ja 48 h), joka on valittu edelleen mekaaniset tutkimukset. Lisäksi 5-Fu ja Gyp yhdistelmänä esillä paljon heikompi myrkyllisyys kohti ihmisen normaalia napalaskimon endoteelisolujen HUVEC (kuvio 1 F).

Pesäkkeenmuodostusta Testi suoritettiin edelleen todentamiseksi proliferaatiopotentiaali SW-480 ja Caco2 solujen jälkeen 5-Fu ja /tai Gyp hoitoon. Kuvio 1G osoitti, että 5-Fu, Gyp, 5-Fu + Gyp kaikki estävät pitkäaikaisen proliferaatiopotentiaali SW-480 tai Caco2 soluja, verrattuna hoitamattomiin ryhmään (

p

0,01 vs. kontrolli), ja merkittävin yksi vähemmän kaksoispisteillä muodostumista havaittiin 5-Fu + Gyp ryhmä (

p

0,01 vs 5-Fu tai Gyp yksin).

Apoptotic vasteen laukaisee 5- Fu ja /tai Gyp

Kuten kuvassa 2A, vuonna käsittelemätön kontrolli, 93,35 ± 0,84% oli elinkelpoisia, 0,2 ± 0,06% solupopulaation oli alkuvaiheessa apoptoosin (alhaalla oikealla) ja 2,75 ± 1,32% solupopulaation olivat myöhäisessä vaiheessa apoptoosin (ylhäällä oikealla). 5-Fu hoitoryhmässä, apoptoottisen solupopulaatio (alhaalla oikealla ja ylhäällä oikealla) oli 3,65 ± 0,81%. Vuonna Gyp testiryhmässä 20,6 ± 1,63% soluista oli siinä vaiheessa apoptoosin (

p

0,01

vs

ohjaus). Kun taas 5-Fu + Gyp ryhmä, 42.15 ± 0,67% soluista olivat apoptoottisia vaiheessa (

p

0,01

vs

ohjaus ja 5-Fu yksin).

(A) solujen apoptoosin havaittiin anneksiini V-PE /7-AAD määrityksessä jälkeen 5-Fu ja /tai Gyp hoitoa 24 h SW-480-soluissa. (B) ekspressiotaso kaspaasi 3, kaspaasi 9, Bcl-2 ja pilkotaan-PARP SW-480-soluja havainnoitiin Western-blottauksella. (C) Nuclear tiivistyminen ja solujen morfologian muutokseen SW-480-solujen jälkeen 5-Fu co-käsitelty Gyp havaittiin käyttämällä Hoechst 33342 värjäystä. Kokeet tehdään itsenäisesti kolminkertaisina parametriyhdistelmää kohti, ja edustavia tuloksia on esitetty. Kaikki tiedot ilmaistaan ​​keskiarvoina ± SD kolmen rinnakkaisen ja

p

* 0,05,

p

** 0,01 vs. kontrolli.

Western blottaus suoritettiin analyysi mahdollisen mekanismin työskenteli 5-Fu ja Gyp laukaisi apoptoosin. Kuten kuvassa 2B, 5-Fu + Gyp suuresti parannettu kaspaasi 3, kaspaasi 9 ja PARP pilkkominen ja alassäädetty ilmentymistä Antiapoptoottisten proteiini Bcl-2 in SW-480-solut (

p

0,01 tai

p

0,05

vs

ohjaus).

morfologiset aiheuttamien muutosten 5-Fu ja Gyp SW-480-solujen

Kuva 2C osoittaa morfologiset muutokset jälkeen 5-Fu ja /tai Gyp hoitoon käytetään Hoechst 33342 värjäystä. Hieman sininen ja homogeeninen solujen havaittiin kontrolliryhmässä; 5-Fu tai Gyp käsitellyt solut osoittivat vähäistä parantamiseksi Hoechst 33342 värjäys; kun taas 5-Fu + Gyp ryhmä, solut kohdistama huomattavan muutokset: kondensoitu kromatiinin hajanaista pistemäinen sininen ydin- fluoresenssi. Lisäksi vaihe kuvat osoittivat, että solut 5-Fu + Gyp hoitoryhmässä oli kutistunut epänormaali pyöreä tyyppiä, ja solumäärät olivat myös vähentää selvästi.

Effects of 5-Fu ja /tai Gyp solun sykli jakelu

Virtaussytometria analysoida kuvassa 3A osoittavat, että verrattuna ohjaus (G0 /G1-vaiheen, 33,8 ± 1,06%, S-vaihe, 28,25 ± 0,59%, ja G2 /M-vaiheessa, 37,94 ± 0,65 %), oli kertymistä solupopulaation G0 /G1-vaiheen (51.56 ± 1,08%,

p

0,01

vs

ohjaus) ja S-vaiheen (36,6 ± 0,91%

p

˂ 0,05

vs

ohjaus) jälkeen 5-Fu hoitoa. Gyp aiheuttama kertymistä solupopulaation G0 /G1-vaiheen (45,97 ± 1,06%,

p

0,01

vs

ohjaus). 5-Fu + Gyp testiryhmässä oli enemmän soluja G0 /G1-vaiheen (56.58 ± 0,57%,

p

0,01

vs

ohjaus) ja S-vaihe (38.78 ± 0,46%,

p

0,05

vs

ohjaus). Samanlainen suuntaus havaittiin myös, kun 5-Fu, Gyp tai 5-Fu + Gyp hoitoa 48 tuntia.

(A) Cell cycle jakelu jälkeen 5-Fu ja Gyp hoitoa. (B) Ilmaisulla fosfo-p53, fosfo-cdk2 ja sykliini E jälkeen 5-Fu ja /tai Gyp käsittely SW-480-soluja havaittiin Western-blottauksella. Kokeet tehdään itsenäisesti kolminkertaisina parametriyhdistelmää kohti, ja edustavia tuloksia on esitetty. Kaikki tiedot ilmaistaan ​​keskiarvoina ± SD kolmen rinnakkaisen ja

p

* 0,05,

p

** 0,01 vs. kontrolli.

Ilmaisu fosfo-p53, fosfo-cdk2 ja sykliini E SW-480-solujen jälkeen 5-Fu ja /tai Gyp hoidon havaittiin Western blottauksella. Kuten on esitetty kuviossa 3B, 5-Fu + Gyp merkittävästi kasvanut ilmentyminen fosfo-p53, mutta laski ilmaus sykliini E ja fosfo-cdk2 (

p

0,01 tai

p

0,05

vs

ohjaus) 24 ja 48 tunnin inkuboinnin.

DNA vaurioita indusoiman 5-Fu, Gyp ja 5-Fu + Gyp

Kuten on kuvattu menetelmät, virtaussytometria-analyysi suoritettiin tehokkuuden tutkimiseksi 5-Fu + Gyp käsittely DNA: n fragmentoituminen SW-480-soluja. Kuvio 4A osoittaa, että taso DNA pirstoutuminen kontrolliryhmässä oli 4,66 ± 1,55%. Kun se on käsitelty 5-Fu, Gyp tai 5-Fu + Gyp 24 tuntia, oli kasvussa (8,2 ± 0,48%, 15,4 ± 2,74% ja 45,15 ± 1,63%, vastaavasti), on DNA: n fragmentoituminen tasoilla. Aste DNA pirstoutuminen 5-Fu + Gyp hoidettu ryhmä oli merkittävästi lisätä (

p

0,01

vs

ohjaus ja 5-Fu yksin). Samanlainen ilmiö havaittiin 48 tunnin kuluttua inkubaation ja DNA pirstoutuminen nostettiin 64,65 ± 3,62% (

p

0,01

vs

ohjaus ja 5-Fu yksin) jälkeen 5-Fu + Gyp kohtelun DNA pirstoutuminen hallinnassa, 5-Fu, ja Gyp yksin ryhmä olivat 4,2 ± 0,81%, 20,85 ± 2,70% ja 24.80 ± 1,96%, vastaavasti.

(A) DNA pirstoutuminen havaittiin käyttäen virtausta cytometry jälkeen 5-Fu, Gyp ja 5-Fu + Gyp hoidon SW-480-solut 24 ja 48 tuntia. Histogrammit osoittivat useita solun kanavien (pystysuora akseli) vs. PI fluoresenssin (vaaka-akseli). (B) Comet määritys suoritettiin havaitsemiseksi DNA-vaurion jälkeen 5-Fu co-käsitelty Gyp. (C) ekspressiotaso Ser139-histoni H2A.X määritettiin käyttämällä Western blot. Kokeet tehdään itsenäisesti kolminkertaisina parametriyhdistelmää kohti, ja edustavia tuloksia on esitetty. Kaikki tiedot ilmaistaan ​​keskiarvoina ± SD kolmen rinnakkaisen ja

p

* 0,05,

p

** 0,01 vs. kontrolli;

p

##

0,01 vs. 5-Fu tai Gyp yksin ryhmä.

Comet määritys ja ilmaus γH2A.X tehtiin edelleen todentamiseksi, että DNA-vaurioita pahensi 5-Fu yhdistettynä Gyp. Kuvio 4B osoittaa, että 5-Fu, Gyp ja 5-Fu + Gyp kaikki aiheuttama eriasteisia DNA-vaurioita verrattuna hoitamattomaan verrokkiryhmään, ja merkittävin yksi enemmän solut tuottivat suuren hännän komeetta havaittiin 5-Fu + Gyp ryhmä. Kuvio 4C esittää, että 5-Fu yhdistettynä Gyp pahentaa fosforylaatiota γH2A.X.

ROS kertymistä jälkeen 5-Fu + Gyp hoito

Solunsisäinen ROS havaittiin DCFH-DA värjäys 6 ja 12 h jälkeen eri hoitoja. Kuten kuviossa 5A on kuvattu, verrattuna ohjata soluja 5-Fu + Gyp ryhmä osoitti vahvaa DCF fluoresenssi 6 ja 12 tuntia käsittelyn jälkeen, solu Gyp ryhmä osoitti näkyviä DCF fluoresenssi 6 h ja hieman parannettu 12 h, kun taas mitään ilmeistä fluoresenssi havaittiin 5-Fu yksin ryhmä. Edelleen vahvistaa roolia ROS anti-kasvain vaikutus 5-Fu + Gyp, NAC lisättiin vähentää ROS tasolla, niin DNA-vaurioita ja apoptoosia analysoitiin. Tulokset osoittivat, että NAC yhteistyössä hoito tehokas tukahdutetaan solunsisäistä ROS tuotanto DCF fluoresenssi katosi (kuvio 5B). DNA aiheuttamat vahingot 5-Fu + Gyp hoito osittain pelastettiin NAC (

p

0,01

vs

ohjaus, kuvio 5C). 5-Fu + Gyp aiheuttanut apoptoosia merkittävästi myös estää NAC (

p

0,01

vs

ohjaus, kuvio 5D).

(A) Solunsisäiset ROS tuotanto jälkeen 5-Fu ja /tai Gyp hoidon havaittiin käyttäen DCFH-DA värjäystä. (B-D) Solunsisäiset ROS tuotanto, DNA: n fragmentoituminen ja solujen apoptoosin SW-480-soluja mitattiin lisättiin ilmailuliiton elatusaineeseen samanaikaisesti 5-Fu ja Gyp. Kokeet tehdään itsenäisesti kolminkertaisina parametriyhdistelmää kohti, ja edustavia tuloksia on esitetty. Kaikki tiedot ilmaistaan ​​keskiarvoina ± SD kolmen rinnakkaisen ja

p

** 0,01 vs. kontrolli;

p

##

0,01 vs. 5-Fu + Gyp ryhmä.

rooli p53 5-Fu + Gyp hoito

liiallinen tuotanto ROS voi vahingoittaa DNA: ta ja aiheuttaa p53 aktiivisuus indusoida solusyklin pidätys ja apoptoosin [26,27]. Tuloksemme löytyi p53 fosforylaatio lisääntyi merkitsevästi, kun 5-Fu + Gyp käsittely (kuvio 3B). Jotta voitaisiin edelleen tutkia roolia p53: 5-Fu yhteistyössä käsiteltiin Gyp: n indusoiman apoptoosin, pifithrin-α, estäjä p53, lisättiin vähentämään p53: n, ja sitten solunsisäinen ROS tasolla, DNA-vaurioita ja solujen elinkelpoisuus oli havaittu. Kuvio 6A esittää, että pifithrin-α huomattavasti päinvastaiseksi 5-Fu + Gyp-indusoituvaa solukuolemaa SW-480-soluja, joissa solujen elävyys nostettiin 47,49 ± 2,1%: sta 79,22 ± 0,63% (

p

0,01

vs

ohjaus). Kuitenkin yhtäaikainen käsittely pifithrin-α eivät vaikuta solunsisäinen ROS kertymistä ja vakavia DNA aiheuttamia 5-Fu + Gyp käsittely (kuvio 6B ja 6C).

(A) Solujen elävyys, (B) solunsisäinen ROS tuotanto ja (C) DNA-vaurioita havaittiin jälkeen lisättiin pifithrin-α viljely-samanaikaisesti 5-Fu plus Gyp. Kokeet tehdään itsenäisesti kolminkertaisina parametriyhdistelmää kohti, ja edustavia tuloksia on esitetty.