Krooninen sairaus

tiivistelmä

MikroRNA käytetään hyväksi diagnoosin, ennusteen ja seurantaan syöpää ja muita sairauksia. Niiden korkea kudosspesifisyyttä ja kriittinen rooli syövän synnyssä tarjoavat uusia biomarkkereita diagnosointiin ja luokitteluun syövän sekä ennustamaan potilaan tuloksia. MikroRNA allekirjoitukset on tunnistettu monen ihmisen kasvaimista, mukaan lukien peräsuolen syöpä (CRC). Useimmissa tapauksissa, etäpesäkkeitä on vaikea ennustaa ja estää riittävän hoitoja. Tutkimuksen tarkoituksena oli selvittää tunnistaa microRNA allekirjoituksen metastasoineeseen CRC, joka voisi ennustaa ja erottamaan metastasoituneen kohde-elimessä lokalisointi. Normaali ja syöpä kudosten kolme ryhmää CRC potilaista analysoitiin. RNA mikrosirujen ja TaqMan Array analyysi tehtiin 66 Italian potilaalla ei imusolmukkeiden ja /tai maksan toistuminen. Tiedot, jotka saatiin kahdesta analyysistä analysoitiin erikseen ja sitten leikkaavat tunnistaa ensisijaisen CRC metastaattinen allekirjoitus. Viisi ilmentyvät eri MikroRNA (HSA-miR-21, -103, -93, -31 ja -566) todensi qRT-PCR toinen ryhmä 16 American metastaattisen potilaille.

In situ

hybridisaatio suoritettiin 16 American potilaiden sekä kolme erillistä kaupallista kudosten microarray (TMA), joka sisältää normaalin viereisen paksusuolen, ensisijainen adenokarsinooma, normaali ja metastaattisen imusolmukkeiden ja maksassa. HSA-miRNA-21, -93, ja -103 säätelyä yhdessä HSA-miR-566 downregulation määritelty CRC metastaattinen allekirjoitus, kun taas

in situ

-hybridisaatio data tunnistanut lymphonodal hyökkäystä profiilin. Annoimme ensimmäisenä MikroRNA allekirjoituksen, joka voisi syrjiä peräsuolen toistuminen imusolmukkeisiin ja maksan ja välillä peräsuolen maksan etäpesäke ja ensisijainen maksan kasvain.

Citation: Drusco A, Nuovo GJ, Zanesi N, Di Leva G, Pichiorri F , Volinia S, et ai. (2014) MicroRNA Profiilit syrjiä Colon Cancer Metastasis. PLoS ONE 9 (6): e96670. doi: 10,1371 /journal.pone.0096670

Editor: Alfons Navarro, University of Barcelona, ​​Espanja

vastaanotettu: 04 tammikuu 2014; Hyväksytty: 10 huhtikuu 2014; Julkaistu: 12 kesäkuu 2014

Copyright: © 2014 Drusco et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ rahoittivat NIH Grant U01 CA152785 MikroRNA /UCRs: biomarkkereita syöpäriski, kasvainten havaitseminen, etenemisen ja hoito. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

tärkein kuolinsyy syöpäpotilailla on etäpesäkkeitä [1]. Syöpäsolut levittäminen on pidetty myöhään monivaiheinen tapahtuma kasvaimen kehitystä. Kun primaarikasvaimen kasvun, geneettisesti valittu, pahanlaatuisten solujen hyökätä paikalliseen kudokseen, enter veri ja /tai imusuonten kuljetetaan kaukaisiin sivustoja ja asuttaa uusi elinkudokset. Viimeaikaiset todisteet viittaavat siihen, että kasvaimen leviäminen voisi olla aikaisempi tapahtuma, joka lopulta ilmeistä useiden vuosien kuluttua diagnoosista [2] – [5].

peräsuolen syöpä on kolmanneksi yleisin maligniteetti kehittyneen maailman jälkeen keuhko- ja rinta- syöpä: noin puolet potilaista kuolee etäpesäkkeitä 5 vuoden sisällä diagnoosista [6]. Ensimmäinen sivustot etäpesäkkeitä paksusuolisyövän ovat paikallisiin imusolmukkeisiin ja maksassa. Patologinen tutkimus paksusuolen adenokarsinooma ei voi ennustaa potilaiden, jotka ovat välittäneet tauti imusolmukkeissa ja /tai kaukaisiin kohtiin. Kuitenkin paksusuolessa, sekä rinta- ja melanoomaa syöpäpotilaita, läsnäolo tai puuttuminen imusolmukkeiden invaasion voivat vaikuttaa kirurgisen resektion tai tyypin kemoterapiakäytäntö [7] – [9].

Vaikka etäpesäkkeitä maksaan tulevat usein paksusuolen syövät, on tapauksia, joissa etäpesäke on ensimmäinen ja ainoa löytää potilaille, joilla on tuntematon primaarikasvaimen sivusto [10], ja ero ensisijaisen maksan vaurioita ja maksan etäpesäke mahdolliset erilaiset sivustoja on terapeuttista ja ennusteen arvioinnissa [11].

Näin ollen on olemassa kasvava tarve uusien diagnostisten ja prognostisia biomarkkerit, jotka voivat syrjiä primaarikasvaimen ja eri paikoissa etäpesäkkeiden, sekä ennustamaan metastaasien taipumuksesta primaarikasvaimen.

MikroRNA tai miRNA, ovat pieniä (19-25 nukleotidia) ei koodaavat RNA: t, jotka säätelevät geenien ilmentymistä transkription jälkeen tukahduttamalla mRNA käännös, ja /tai aiheuttaa mRNA: n hajoamisen. Ne ovat mukana säätelyyn enemmistön fysiologisten prosessien [12], ja ne poikkeavasti ilmaistaan ​​kasvaimen taudin alkamisen ja etenemisen ennustaminen tautitilanne ja kliiniseen tulokseen [13], [14]. Mielenkiintoista, MikroRNA allekirjoitukset ovat erittäin kudosspesifistä ja voidaan luokitella syöpiä, ja tunnistaa primaarikasvaimen on metastaattisen vaurion tuntematonta alkuperää [15] – [19].

Tutkimuksen tarkoituksena oli tunnistaa microRNA allekirjoitus, joka saattaa mahdollistaa erotella lymphonodal ja maksan etäpesäkkeiden potilailla, joilla kolorektaalikarsinoomasta.

Materiaalit ja menetelmät

Patient kudosnäytteitä

Kolme ryhmää potilaista oli tutkimuksessa mukana (taulukko 1).

Parafiini upotetut kudokset lähtöisin 66 potilaalla diagnosoitu paksusuolen syöpä oli valittu Rooman yliopistosta ”La Sapienza”, UOC Anatomia ed Istologia Patologica C /Cardiovascolare, kudospankin mukaan että TNM lavastus.

Out of 66 potilasta, 18 esitteli ensisijainen paksusuolen kasvain ilman etäpesäkkeitä (Kaikki T, N0, M0), 33 oli paksusuolen syöpä kanssa imusolmukkeiden etäpesäke vain (ei T, väliä N, M0) ja 15 oli diagnosoitu paksusuolen syöpä, imusolmukkeiden ja maksametastaaseista (tahansa T, Ei väliä, M1). Erillinen kasvain näytteet primaarikasvaimen, metastaattista imusolmukkeiden ja maksan etäpesäke kerättiin kunkin potilaan ja käsitellään kudosten microarray ja TaqMan Array MicroRNA kortit.

Toinen ryhmä 16 potilasta tulevat tiedostot OSU Patologian laitos otettiin tutkimukseen. Kullekin potilaalle, on normaalia koolonin kudokseen, ensisijainen paksusuolen adenocarcnoma, metastaattinen imusolmukkeiden ja metastasoituneen maksan analysoitiin, samoin kuin vastaavassa normaalissa imusolmukkeiden ja maksan, kun käytettävissä. TMA että muodostettiin näistä potilaista näytteistä plus kolme sarjaa US Biomax kudosmatriisien (BN05014 24 tapauksissa BC05118 50 tapauksissa CO702 69 tapausta) käytettiin In situ -hybridisaatio (ISH). Yhdysvaltain Biomax- tapaukset edustavat kolmanteen ryhmään kuuluvien potilaiden tutkimuksessa mukana normaalin viereisen paksusuolen kudoksiin, ensisijainen koolonadenokarsinooma ilman imusolmuke /etäispesäkkeitä ja ensisijainen paksusuolensyöpä osallistuneilla potilailla oli todettu imusolmukkeiden ja maksan etäpesäke, ja varsinainen imusolmuke ja /tai maksan etäpesäkkeiden.

hyväksyi projektin Italian (Presidente – Prof. Aldo ISIDORI, professori Lucio MIANO, Dott.ssa Amalia Allocca, Dott.ssa Enrica ARDUINI, Dott.ssa Maria Caporale, Prof. Luciano Caprino, Dott.ssa Avia CARABELLI, professori Francesco COGNETTI, Dott.ssa Anna DALLE ORE, Prof.ssa Marzia Duse, Dott.ssa Giuseppina DI Giammarco, Dott. Domenico Antonio IENTILE, professori Giovanni Fabbrini, Prof.ssa Paola FRATI , Dott.ssa Maria Teresa LUPO, professori Franco MANDELLI, Dott. Enrico MARINELLI, Dott.ssa Boza MAURO, professori Paolo MENE ’, Dott.ssa Elisabetta SIMONGINI, professori Pietro SERRA, professori Giovanni Spera, Dott. Ettore Tiberi , Avv. Angelo TUZZA, Prof.ssa Annarita Vestri, professori Vincenzo ZIPARO) ja amerikkalainen (https://orrp.osu.edu/irb/irbforms/) Ethical -työryhmä (Prot.1119 /13, Prot.2007E0748 vastaavasti). Erityisesti molemmat Commettees, Ohio State University Institutional Research Board ja il Comitato Etico ”La Sapienza”, vapautetaan meidät potilaiden tietoon perustuvan suostumuksen jälkeen, molemmissa tapauksissa, parafiiniin kudoksessa anonyymisti arkistoitu näytteitä, valitaan niiden TNM lavastus ja potilaiden eivät ole enää käytettävissä.

RNA

Kokonais-RNA uutettiin käsittely viisi 20 um: n paksuisia leikkeitä kustakin parafiiniin kudosta, käyttäen RECOVERALL- Yhteensä Nucleic Acid Isolation Kit (Ambion # 1975) ja seuraavat valmistajan ohjeita.

RNA merkintöjä ja -hybridisaatiolla miRNA microarray pelimerkkejä tehtiin aikaisemmin kuvatulla [20]. Viisi ug kutakin näytettä kokonais-RNA hybridisoitiin meidän miRNA mikrosirulla (Ohio State Kattava Cancer Center, versio 2.0), joka sisältää 460 kypsä miRNA koettimet, täplikäs neljänä (235

Homo sapiens

, 222

Mus musculus

, ja kolme

Arabidopsis thaliana

). Eri koettimia käytettiin tunnistamaan jokaisen kypsä miRNA ja useimmat miRNA esiasteita. Hybridisaatiosignaaleja havaittiin streptavidiini Alexa Fluor 647-konjugaatteja ja skannattujen kuvien (Axon 4000B) kvantitoitiin käyttäen Genepix 6.0 -ohjelmisto (Axon Instruments). Samat näytteet analysoitiin myös RT-PCR-kortit (Applied Biosystems).

miRNA mikrosirujen

mikrosirut olivat olennaisesti analysoitiin kuten kuvattu Liu et al [21]. Quantiles normalisointi ja tilastollinen analyysi suoritettiin käyttäen BRB ArrayTools kehittämä Richard Simon ja Amy Peng Lam [22].

Differentially ilmaistuna miRNA tunnistettiin käyttäen random-varianssi t-testiä. Satunnaisen-varianssi t-testi on parannus standardi erillisiä t-testiä, koska se sallii välistä tietojenvaihtoa geeneistä noin sisällä luokan vaihtelu ilman olettaen, että kaikki geenit on sama varianssi. Geenit katsottiin tilastollisesti merkittäviksi, jos niiden P-arvo oli pienempi kuin 0,05. [23].

Useita testaus ohjata väärien paljastumisaste. miRNA nimikkeistön perustettiin mukaan UCSC Genome Browser (https://genome.ucsc.edu/) ja miRBase (https://www.mirbase.org/); tapauksessa ristiriidat miRBase seurattiin.

Mittaustulosten löytyvät GEO verkkosivuilla (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE56350) .

TaqMan Array MicroRNA kortit ja kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR

Real Time PCR suoritettiin käyttäen TaqMan Array Human MicroRNA paneeli (v.1, Applied Biosystems, Foster City, CA) ja 50 ng RNA porttia kohden, yhteensä 400 ng. Tämä joukko sisältää 365 miRNA tavoitteista sekä endogeeninen valvontaa. Normalisointi tehtiin pieniä ydin- RNA: iden (snRNA) U44 ja U48. Expression of single kypsä miRNA arvioitiin TaqMan miRNAassay (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), ja normalisoitiin RNUB6 (Applied Biosystems). Raakadataa löytyvät GEO verkkosivuilla (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE56350).

In situ -hybridisaatio

In situ -hybridisaatio suoritettiin valittu MikroRNA seuraavat aikaisemmin kuvatun protokollan [24], käyttämällä Exiqon LNA-5’DIG leimattuja koettimia. Kolme USBiomax kudossiruina (TMA) liukuu (Colon normaali Tissue array 21 normaalitapauksissa ja 3 adenokarsinooma tapauksissa Colon syöpä ja sovitettu viereisen normaalin kudoksen array 25 tapauksissa paksusuolisyöpäkudoksessa array etäpesäkkeitä ja viereisen normaalin kudoksen kanssa 68 tapausta) ja dian kudosta ydintä 16 potilasta (OSU TMA) käytettiin. Kullekin valitulle microRNA, TMA pisteytettiin mukaan suhteellisen microRNA ilmentymisen kunkin ytimen kaksi patologit määritelty prosenttiosuus positiivisia kasvainsoluja ja signaalin voimakkuus näissä syöpäsoluja positiivisten tapausten. Tulokset olivat generoidaan sokkoutettu läsnäolo tai puuttuminen etäpesäkkeitä ja Mann-Whitney testiä sovellettiin verrata luokkiin.

Tulokset

tutkimus on kehitetty neljässä vaiheessa käyttämällä hyväksi: (I) DNA-siru, (II) Taqman-high density-kortteja, (III) Taqman yhden määrityksen qRT-PCR: llä ja (IV) in situ -hybridisaatio. Saavuttaa enemmän luotettavia tuloksia, käytimme kolmea eri potilasryhmissä (taulukko 1). Ensimmäiseen ryhmään kuului 66 Italian potilasta (III Clinica Chirurgica, Universita ’di Roma ”La Sapienza”, Rooma, Italia), jossa koolonadenokarsinoomasolulinjalla: 18 potilasta ei ollut etäpesäkkeitä, 33 oli vaikuttanut imusolmukkeiden ja 15 osoitti etäpesäkkeitä sekä imusolmukkeet ja maksa. Yhteensä RNA: t 18 paksusuolen primaarikasvainten (T) ilman etäpesäkkeitä, 33 paksusuolen primaarikasvainten (T

N) lymphonodal toistuminen ja vastaava 33 metastaattinen imusolmukkeiden (N

N), 15 paksusuolen primaarikasvainten (T

L,) sairastavien potilaiden lymphonodal ja maksan etäpesäkkeitä ja vastaava 15 metastaattinen imusolmukkeiden (N

L) ja maksaleesioiden (L), testattiin mukautetun mikrosirulla alustan, joka oli aiemmin käytetty luomaan syöpä microRNA allekirjoitukset useissa tutkimuksissa [13], [14], [21], ja Taqman Array microRNA kortit (Applied Biosystems). Data normalisoitiin mukaan alustan vaatimukset ja samalla välisessä vertailussa luokkien sovellettiin sekä aineistoja erikseen. Merkittävästi muuttuneen miRNA tunnistettiin ja tulokset leikkaavat. Vain MikroRNA kanssa kertamuutos ero suurempi kuin 2 tai pienempi kuin 0,5 katsottiin otaksuttu pro-metastasoitunut ja antimetastaattisia miRNA vastaavasti. Kaksitoista MikroRNA olivat johdonmukaisesti säädellään ylöspäin etäpesäkkeitä (HSA-miR-103, -155, -16, -191, -200c, -21, -24, -26A, -26b, -29a, -31 ja 93), ja vain kaksi oli alassäädetty (HSA-miR-328 ja -566) (taulukko 2).

kaksinkertainen joukko strategia pystyimme testaamaan samat näytteet kahdella eri teknisiä lähestymistapoja.

edelleen varmistamiseksi tunnistettu ”metastaattinen” allekirjoitus, valitut MikroRNA testattiin kuusitoista American Metastasoivassa paksusuolen syöpä (OSU Pathology Dept., Columbus, OH). Kunkin potilaan kokonais-RNA parafiiniin upotettu kudoksen ytimiä normaalien ja pahanlaatuisten koolonin, imusolmuke ja maksassa, määritettiin single qRT-PCR. Mann-Whitneyn testiä sovellettiin vertaamaan PCR tuloksia eri potilasryhmille.

Ensisijainen metastaattinen paksusuolen adenokarsinooman osoitti merkittävää yliekspressio HSA-miR-21 (P-arvo = 0,0011), -31 (P -arvo = 0,0003), -93 (P-arvo = 0,0048), -103 (P-arvo = 0,0142) ja downregulation HSA-miR-566 (P-arvo = 0,0075) verrattuna niiden viereiseen normaaliin kudokseen (taulukko 2 ). Lisäksi nähden normaali, HSA-miR-21 ja -93 merkittävästi yläreguloituja maksan etäpesäke, joiden P-arvo = 0,020 ja P-arvo = 0,0002 vastaavasti. HSA-miR-21 oli myös merkitsevästi yli-ilmennetään metastaattisessa imusolmukkeiden (P-arvo = 0,009) (kuvio 1). Nämä viisi validoitu MikroRNA ei korreloinut kasvaimen lavastus.

Normal paksusuolikudos (NORM), paksusuolen adenokarsinoomien (ADENOCA), lymphonodal etäpesäkkeiden (POSLYM) ja paksusuolen maksa (LIVERMET) Mir-21 (A), miR -31 (B), miR-93 (C), miR-103 (D) ja miR-566 (E). Mann-Whitneyn testiä käytettiin vertaamaan ryhmiä. Ryhmät näkyvät boxplots ”x-akselin, kun taas delta-Ct-arvot ovat edustettuina y-akselilla. Kunkin laatikon, baari edustavat mediaani, alue 25

th ja 75

persentiili ja viikset kuvaajan suurimman ja pienimmän arvot. Kukin P-arvo bar vastaavat vertailu: jokaiselle miR ensimmäisen alemman tanko viittaa NORM vs ADENOCA vertailun; miR-21 toiseen alempaan bar P-arvo vastaa NORM vs POS IMUSOLMUKEMÄÄRITYSMENETELMÄ vertailun kun ensimmäinen yläpalkista sekä miR-21 ja -93 vastaa NORM vs LIVER MET vertailun.

kasvaimet, tulehduksellinen ja strooman solut hajallaan hyvänlaatuiset ja pahanlaatuiset epiteelisolut, ja vaihtelevasti edistää cellularity vaurion. Se on siis tärkeää ymmärtää, minkä tyyppinen solu ekspressoi tiettyä microRNA. Tätä tarkoitusta varten, in situ -hybridisaatio kokeet tehtiin TMA primaarista adenokarsinoomat, metastaattinen imusolmukkeiden, maksan etäpesäkkeiden ja normaaleissa kudoksissa. HSA-miR-21, -93, -103 ja -566 koettimet hybridisoi- päälle OSU TMA ja USBiomax TMA dioja. Kaksi itsenäistä patologia teki kunkin liukukeernassa sokaissut paikalle ydin biopsia ja kliinisen lavastus historiaa, kun otetaan huomioon signaalin voimakkuuden paksusuolen pahanlaatuisten solujen verrattuna viereiseen normaaliin epiteelin ja ei-epiteelisolujen (kuva 2). HSA-miR-21 (P-arvo 0,0001) ja -103 (P-arvo = 0,0009) olivat merkitsevästi yliekspressoitu adenokarsinooman ja metastasoituneen syövät verrattuna normaaleihin (Kuva 2: A, B). Chi-squared testi paljasti lineaarisen trendin molemmille, HSA-miR-21 (P-arvo 0,0001) ja HSA-miR-103 (P-arvo 0,0001): ne yhä voimistuvan etenee normaalista, että adenokarsinooma ja etäpesäkkeiden (kuvio 3, kuvio 4). Kuitenkin, kun taas HSA-miR-103 yliekspressoituvat merkittävästi maksan etäpesäkkeitä verrattuna adenokarsinoomia ja positiivisia imusolmukkeita, HSA-miR-21 eivät osoittaneet mitään merkittävää eroa kolmen luokkaa. ISH HSA-miR-93 vahvisti säätelyyn ylöspäin adenokarsinooman ja maksan etäpesäke, joka osoittaa merkittävää eroa normaalien ja joko adenokarsinoomat (P-arvo = 0,0345) tai maksan etäpesäke (P-arvo = 0,007) sekä adenokarsinoomista ja maksan etäpesäke (P -arvo = 0,043). Ei havaittu merkittävää eroa verrattaessa normaalit ja adenokarsinoomista versus positiivisia imusolmukkeita (Fig. 2C ja kuvio 5). Täten HSA-miR-93 ekspressiokuviota voisi erottaa normaali paksusuolen ensisijainen adenokarsinooma, ja normaali paksusuolen ja ensisijainen adenokarsinooma maksan etäpesäke, mutta ei johdetusta kasvainten lymphnodal hyökkäystä. HSA-miR-566 oli yhtä yli-ilmentynyt normaalissa viereiseen koolonkudoksessa, ensisijainen adenokarsinooma pahanlaatuisten solujen ja maksan paksusuolen metastaattinen soluja (Fig. 2D). Kuitenkin positiivinen imusolmukkeet oli selvästi heikompi signaali nähden normaalit (P-arvo = 0,002) ja adenokarsinooma (P-arvo = 0,043), mikä viittaa siihen, että menetys HSA-miR-566 voi helpottaa imusolmuke hyökkäyksen paksusuolensyöpä.

normaalin paksusuolen kudosta (NORM), paksusuolen adenokarsinoomien (ADENOCA), lymphonodal etäpesäkkeiden (POSLYM) ja paksusuolen maksassa (LIVERMET) ja miR-21 (A), miR-103 (B), miR-93 ( C), miR-566 (D) ja miR-200C (E). Mann-Whitneyn testiä käytettiin vertaamaan ryhmiä. Ryhmät näkyvät boxplots ”x-akselin, kun keskimääräinen pistemäärä Arvot ovat edustettuina y-akselilla. Kunkin laatikon, baari edustavat mediaani, alue 25

th ja 75

persentiili ja viikset kuvaajan suurimman ja pienimmän arvot. Kukin P-arvo bar vastaa vertailun: Mir-21, -103, -93, ja -200c ensimmäisen alemman pylväs vastaa NORM vs ADENOCA vertailun; miR-21, -103, ja -93 ensimmäisen ylemmän baareja viittaavat NORM vs LIVER MET vertailu, kun taas miR-566 ja -200c ylempi palkki näyttää NORM vs POS IMUSOLMUKEMÄÄRITYSMENETELMÄ vertailun; miR-566 ja miR-200C alempi palkit ilmaisevat ADENOCA vs POS IMUSOLMUKEMÄÄRITYSMENETELMÄ ja NORM vs POS IMUSOLMUKEMÄÄRITYSMENETELMÄ vertailua vastaavasti.

Kuten julkaisuissa, miR-21 osoitti heikko signaali normaalissa paksusuolen suhteen adenokarsinooma (P-arvo = 0,0011), ja se oli erittäin ilmaistu etäpesäkkeitä. MiR-21 ilmentyminen havaittiin vain ensisijainen adenokarsinooma ja metastaattinen pahanlaatuisia soluja.

Normaalissa paksusuoli nuoli osoittaa puutteesta miR-103 ilmentyminen epiteelisoluissa. Vuonna primaarikasvaimen nuoli osoittaen lisääntynyt ilmentyminen miR-103 invasiivisia adenokarsinooma. Nuoli maksan toistuminen ja kaksi nuolet imusolmukemetastaaseja osoittavat dramaattinen lisääntynyt ilmentyminen miR-103 Metastasoituneessa adenokarsinooman epiteelin.

induktio epiteelisolujen-to-Mesenchimal Transition (EMT) on pidetty tärkeänä askeleena kehityksessä metastaattinen. Viime aikoina on osoitettu, että HSA-miR-103/107 epäsuorasti downregulates miR-200 perheenjäseniä, ja että tällainen kuvio liittyy mesenkymaalisten fenotyypin rintasyövän solulinjoissa [24].

Tutkimuksessamme microarray alustan ja Taqman-määritys, eristetty sekä HSA-miR-103 ja HSA-miR-200c. Halusimme ymmärtää, voidaanko, kuten rinta- metastaattinen, nämä kaksi miRNA oli korreloi käänteisesti paksusuolen metastaattinen. Vaikka ei merkittäviksi qRT-PCR, TMA hybridisoitiin HSA-miR-200c koetin ja teki (Fig. 2E). Vapaaehtoisiin verrattuna korkeampi signaalin intensiteettiä havaittiin adenokarsinoomat (P-arvo = 0,0023) ja positiivisia imusolmukkeita (P-arvo = 0,0006). Merkittävä positiivinen korrelaatio HSA-miR-103 ja HSA-miR-200c oli läsnä imusolmuke etäpesäke (P-arvo = 0,0225), mutta ei adenokarsinooman tai maksan etäpesäke. Siksi HSA-miR-103 ja HSA-200C eivät korreloi käänteisesti ja ei säännellä EMT metastaattisessa paksusuolen syövän

in vivo

, mutta molemmat yli-ilmennetään adenokarsinooman ja imusolmukkeiden etäpesäke. Emme tutkia HSA-miR-107 tai mitä tahansa muuta jäsentä miR-200 perhe, koska EMT ei ollut merkitystä Tutkimuksen tarkoituksena.

Mielenkiintoista, HSA-miR-31 ISH (tuloksia ei ole esitetty) paljasti erittäin vahva signaali tulehdussolujen ympäröivä kasvaimia. Heikompi värjäytyminen havaittiin kasvaimen ja normaalin paksusuolen solujen, mutta vain harvat HSA-miR-31 ilmentävien lymfosyyttien olivat läsnä normaalissa imusolmukkeissa, viittaa siihen, että HSA-miR-31 säätelyä johtui enimmäkseen tulehduksellinen pikemminkin kuin pahanlaatuinen osa kasvain.

Taulukko 1 raportteja tapausten määrä, joissa TNM pysähdyspaikan jotka analysoitiin kussakin tekninen vaiheessa Tutkimuksemme; Taulukossa 2 esitetään microRNA saamien allekirjoitusten jokaisen tekninen menettely.

Keskustelu

Vuoden 2009 AJCC painos on julkaissut uuden paksusuolisyövän TNM luokittelu, jossa, alaluokkia on lisätty (N) solmukohtien tauti lavastus. Muut kirjoittajat ovat ehdottaneet korvata nämä N kategoriaa useita positiivisia imusolmukkeiden, ja useat kirurgiset julkaisut ovat ehdottaneet radikaalimpaa imusolmukkeiden määritellä paremmin ennusteen parantamiseksi paksusuolen syöpäpotilaiden selviytymistä [26] – [29]. Solmukohtien invaasio on kriittinen vaihe määriteltäessä paksusuolen syöpäpotilaiden ennuste ja hoito. Kuitenkin 25% imusolmuke-negatiivinen potilailla esiintyy toistuminen ja kaikki potilaat, joilla on positiivinen imusolmukkeet on huono ennuste [30] – [32].

Toisaalta, ensisijainen kasvain leviää maksaan, on suurin syy sairauden etenemisen kolorektaalisyövässä potilailla, joilla 15-30%: lla potilaista, joilla oli synkronoitu maksan vaurioita aikaan ensisijaisen peräsuolen leikkauksen, ja osoittaen metachronous uusiutumista jälkeen aggressiivinen maksaresektio [33] – [35].

Näin ollen on tärkeää tunnistaa uusia molekyyli biomarkkereita, jotka yhdessä TNM lavastus järjestelmä, voi parantaa diagnoosia ja luokittelua metastasoituneen paksusuolen syöpäpotilaiden.

tämän tutkimuksen tarkoituksena oli tunnistaa microRNA allekirjoitus metastaattinen paksusuolen syövän, joka voisi syrjiä imusolmukkeiden ja maksan etäpesäke.

kirjallisuudessa, suurin osa raportoitu MikroRNA syöpä allekirjoitukset on tunnistettu ja validoitu samalla kudosnäytteitä. Luotettavuuden lisäämiseksi meidän tiedot, lukuun ottamatta kahta ensimmäistä analyysin jokaisen validoinnin vaihe suoritettiin eri potilasryhmässä.

Microarray ja kortteja alustojen leikkaavat tiedot tunnistetaan neljätoista ilmentyvät eri MikroRNA, joista viisi todensi qRT-PCR. HSA-miR-21, -31, -93, -103 ilmentyivät primaarikasvainten verrattuna normaaliin, kun taas HSA-miR-566 säädeltiin vähentävästi. HSA-miR-93 ja -31 myös ylösajettu maksan etäpesäkkeitä, mutta ei imusolmukkeiden positiivinen etäpesäkkeitä, kun taas HSA-miR-21 over-ilmentyminen oli ilmeistä molemmissa, maksassa ja imusolmukkeiden etäpesäkkeiden. Lukuun ottamatta HSA-miR-31, in situ -hybridisaatio (ISH) ja paksusuolen adenokarsinoomien ja vastaavan viereisen normaalin kudoksen, sekä sen solmukohtien ja maksan etäpesäkkeiden kudossiruina, vahvisti allekirjoitukset tunnistaa korttien ja qRTPCR analyysit. HSA-miR-31 on todettu väärin säädellystä useissa ensisijainen epiteelin kasvaimissa, mukaan kasvainpaikantumisen, se näyttää laukaista eri syövän reittejä: se on säädelty tietyissä karsinoomia [36] – [41], ja säädellä vähentävästi toiset [42] – [45]. Tällainen kaksinaisuus, on löydetty invasiivisia kasvaimet samoin: in koolonsyöpäsolulinjaa, invaasiota edistetään HSA-miR-31 yliekspressio [46], [47], kun taas, rintasyövän solulinjoissa, sen alhainen edistää enemmän aggressiivinen käyttäytyminen [42], joka korreloi huonompi potilaan ennustetta.

Kohdennetut toiminnot HSA-miR-31 sisältävät angiogeneesiä, jossa sen säätelyä lisää veren, mutta ei imusuonten itäneet [48], ja akuutin tulehduksen [49]. Huomasimme, että HSA-miR-31 on pääasiassa ajan säädellään peritumoraalista tulehdussolujen verrattuna syövän ja normaalit solut. Täten HSA-miR-31 säätelyhäiriötä primaarisessa aggressiivinen kasvaimissa on kiistatonta näyttöä, mutta vuorovaikutus sen toimintojen välillä tulehduksellinen, neoangiogenic ja kasvainten metastaattista yhteydessä tarvitsee vielä, selvittämättä.

Hsa-miR -21 on toinen moniajotöiden microRNA, joka on liitetty tulehdukseen [50] – [53], immuunijärjestelmän sairaus [54] – [57], kehittämiseen [58] – [61], angiogeneesin [62], [63], syöpä ja etäpesäkkeiden [18], [64] – [82]. Useat tutkimukset ovat itse asiassa raportoitu sen yli-ilmentyminen eri tyyppisiä kasvaimia, mukaan lukien peräsuolen syöpä, jossa sen tasot korreloivat taudin kliinistä etenemistä, huono selviytyminen ja hoitotulokseen [83], [84].

Yhteisymmärryksessä meidän aiempien tutkimusten ja toisten, qRT-PCR validoitu HSA-miR-21 säätelyyn ylöspäin paksusuolen adenokarsinooman ja etäpesäkkeiden verrattuna normaaliin. In situ -hybridisaatio tiedot osoittivat suuntaus: HSA-miR-21-tasot olivat alhaisimmat normaalissa kudoksessa, ja yhä suurempi adenokarsinooma ja etäpesäkkeiden puolestaan ​​vastaava ilmaisu havaittiin syöpäsolujen solmujen ja maksan uusiutumisen, mikä viittaa siihen, että HSA-asennuspalveli- 21 ylössäätely voisi ennustaa kehittynyt etäpesäkkeitä.

Kuten HSA-miR-31, korkea HSA-miR-21 ja -93 ovat kuvanneet muiden kirjoittajien maksasolukarsinoomassa [39], [85] [86], ja näin ollen niitä ei voida pitää diagnostinen ero allekirjoituksen välillä maksan etäpesäke ja maksasolukarsinoomaan.

ISH tiedot HSA-miR-93 kokonaan päällekkäin qRT-PCR tulokset: voimakas värjäytyminen havaittiin ensisijainen paksusuolen adenokarsinooman ja maksan etäpesäke. Indusoi yli-ilmentyminen HSA-miR-93 osoitettiin: olevan tuumorigeenisemmiksi in vitro ja in vivo, edistää selviytymistä, mutta ei leviämisen, ja parantaa neoangiogeneesiin [87]. Lisäksi lisääntynyt HSA-miR-93 tasot, korreloivat taudin etenemiseen ja laski potilaiden eloonjäämisen serous munasarjasyöpäpotilailla [88] ja, voi ennustaa taudin uusiutumisen rintasyövän [89].

Kuitenkin ainoa sääteli validoitu microRNA tunnistettu meidän allekirjoitus, joka voisi syrjiä paksusuolen maksan etäpesäkkeiden ja ensisijainen maksasyövän oli HSA-miR-103. Tämän merkitystä miRNA syövässä on arvioitu haiman, virtsarakon, ruokatorven, mahalaukun ja rintojen kasvaimia [29], [90] – [93]. Korkea HSA-miR-103 oli heikkoihin eloonjäämisen ruokatorven syöpä ja ovat mukana etäpesäkkeitä rintasyövän ja mahasyövän. Erityisesti HSA-miR-103 säätelyyn ylöspäin havaittiin mahalaukun syöpäpotilailla laakeri positiivinen imusolmukkeita. Samoin Tutkimuksessamme qRT-PCR havaittiin HSA-miR-103 over-ilmentyminen primaarikasvainten sekä metastaattisen solmut ja maksassa. Jälleen ISH antoi meille tarkempia solu-alkuperämaihin liittyvää tietoa: vaikka, ei ollut merkittäviä eroja ensisijaisen kasvaimia ja positiivisia imusolmukkeita, maksan etäpesäke osoitti korkeimman HSA-miR-103 ilme.

Tutkimuksemme, vaikka ei vahvistanut qRT-PCR, HSA-miR-200c oli yksi valituista mikroRNA microarray ja kortteja alustoille. Äskettäin HSA-miR-103/107 tasot havaittiin korreloivan käänteisesti HSA-miR-200c säätelyssä epiteelisolujen-to-Mesenchimal Transition rintasyövässä [25]. Testata, jos voisimme vahvistaa saman korrelaation paksusuolensyöpä, suoritimme ISH paksusuolen TMA kanssa miR-200c anturi. Emme havainneet mitään käänteinen korrelaatio kahden miRNA. He olivat molemmat yli-ilmaisivat, mutta, HSA-miR-200c voimakkaasti säädellään ylöspäin imusolmuke solmukohtien etäpesäkkeitä verrattuna normaaliin paksusuolen, adenokarsinoomien ja maksan uusiutumista. Tämä viittaa siihen, että HSA-miR-103 ja HSA-miR-200C eivät valvo EMT paksusuolen syöpä, ja että korkea HSA-miR-200c tarvitaan solmukohtien hyökkäystä.

Hsa-miR-200c maksan etäpesäke ISH tulokset osoittivat vaihtelevat suuresti, joka kattaa keskiarvot normaalin kudoksen, adenokarsinoomat, ja positiivinen imusolmukkeet. Downregulation HSA-miR-200c on ehdotettu erottuva allekirjoitus ensisijainen maksasyövän (hepatosellulaarinen karsinooma, maksansisäisen kolangiokarsinooma ja maksan angiosarcoma) maksan etäpesäke epiteelin alkuperä [86], [94], kun taas sen säätelyyn ylöspäin koolonadenokarsinooma on ollut liittyvät huonoon ennusteeseen [95]. Tutkimuksessamme HSA-miR-200c säätelyyn ylöspäin solmukohtien etäpesäkkeitä vahvistettiin ISH, mutta ei vahvistanut qRT-PCR. Tämä havainto johtuu pääasiassa kokeellisia ja tekniset menettelyt. Ensinnäkin, käytimme eri potilasryhmille validointiin, joka tosin tarjoaa luotettavamman loppuun tietojen käyttöön enemmän vaihtelua osaksi kokeellista menettelyä. Toiseksi, RNA: t tulevat ensimmäinen mikrosiruja potilasryhmässä ei uutettu mikropaloitelluista parafiiniin kudokset ja sisälsi vaihteleva osuus syövän ja hyvänlaatuinen ympäröivää kudosta, kun taas RNA: t ja kudoksia analysoitiin qRT-PCR ja ISH olivat kudoksen microdissected kappaleet on merkittävä syöpä komponentti. Kuitenkin qRT-PCR ei pysty erottamaan hyvänlaatuisesta ja /tai ei syöpäsolut, kun taas ISH voi syrjiä eri tyyppisiä soluja. Muut kirjoittajat validoitu tietonsa samalla potilaille, ja RNA uutettiin koko kudoksesta. Lisäksi parhaan tietomme mukaan kirjallisuudessa ei ole tutkimuksen perusteella niin suuren asteikolla microRNA ISH. Olemme osoittaneet, että ISH voi tarjota erittäin hyödyllistä solu erityisiä tietoja, mikä viittaa siihen ylimääräisiä MikroRNA

in vivo

toimintoja lisätutkimuksiin.

Tärkeä uutuus meidän allekirjoitus oli HSA-miR-566. Ilmeisesti alassäädetty ainoastaan ​​adenokarsinooman suhteen valvontaa ja metastasoituneen paksusuolen kudoksiin qRT-PCR, HSA-miR-566 digoksigeniinillä leimattu koetin oli heikosti havaittiin positiivinen imusolmukkeiden syöpäsoluja, ja yhtä ilmentyy normaaleissa paksusuolen sekä adenokarsinoomat ja maksan etäpesäke, tukee käsitystä siitä, ISH voi antaa meille enemmän informatiivinen yksityiskohtia kuin mikrosiruja tai qRT-PCR. Valitettavasti kirjallisuudessa, ei ole tutkimuksen perusteella HSA-miR-566 osallistuminen syövän, tai jossa kuvataan biologisia toimintoja, jotka voisivat auttaa keskustelua meidän tietoja.