Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

peräsuolen syöpä (CRC) on yksi yleisimmin diagnosoitu syövät. Kiertävä MikroRNA (miRNA) on ehdotettu mahdollisesti lupaavien markkereita varhaiseen havaitsemiseen CRC. Meidän tavoitteena oli tunnistaa ja arvioida paneelia miRNA joka voisi olla sopiva CRC varhaiseen havaitsemiseen.

Methods

miRNA profiloitiin by TaqMan MicroRNA Array ja seulotaan ero ilmaisun 5 plasmapoolin näytteiden CRC potilaista (N = 50) ja 5 altaat kasvaimen vapaan hallintalaitteet (N = 50). Muita miRNA valittiin kirjallisuuskatsauksen. Tunnistetut ehdokkaita arvioitiin riippumaton validointi näytteiden suhteen syrjintään CRC potilaista (N = 80) tai edistyneen adenooma potilailla (N = 50) ja kasvain-vapaa hallintalaitteet (N = 194). Diagnostinen suorituskyky paneelin miRNA arvioitiin useita logistinen regressio käyttäen bootstrap-analyysi korjata yli-optimistinen.

Tulokset

Viisi miRNA identifioitu differentiaalisesti ekspressoitu TaqMan MicroRNA Array (miR -29a, -106b, -133a, -342-3p, -532-3p), ja seitsemän miRNA raportoitu ekspressoituu differentiaalisesti kirjallisuudessa (miR-18a, -20a, -21, -92a, -143, -145 , -181b) valittiin validointi. Yhdeksän kahdestatoista miRNA (miR-18a, -20a, -21, -29a, -92a, -106b, -133a, -143, -145) havaittiin ilmentyä erilailla CRC potilaiden ja valvonnan validointi näytteissä. Optimismi korjattu AUC oli 0,745 (95%: n luottamusväli: +0,708-+0,846). Mikään valitun miRNA havaittiin huomattavia differentiaalikaavojen edistyksellisten adenooma potilaiden ja kasvain-vapaa valvontaa.

Johtopäätös

tunnistettu paneeli miRNA voisi olla potentiaalista käyttöä kehittämisessä usean markkeri veri koetta varhaisia ​​havaitsemiseen CRC. Vaikutus: Tutkimus korostaa suuren potentiaalin plasman miRNA parantamiseksi nykyiset tarjoukset noninvasiivisten CRC seulonnan.

Citation: Luo X Kanta C, Burwinkel B, Brenner H (2013) tunnistaminen ja arviointi plasma MikroRNA Early Detection of peräsuolen syövän. PLoS ONE 8 (5): e62880. doi: 10,1371 /journal.pone.0062880

Editor: Antonio Moschetta, University of Bari Consorzio Mario Negri Sud, Italia

vastaanotettu: 22 joulukuu 2012; Hyväksytty: 26 maaliskuu 2013; Julkaistu: toukokuu 14, 2013

Copyright: © 2013 Luo et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Kirjoittajat ei ole tukea tai rahoitusta raportoida.

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

yli 1,2 miljoonaa uutta tapausta ja 608700 kuolemantapausta kohden vuosi, peräsuolen syöpä (CRC) on kolmanneksi yleisin diagnosoitu syöpä miehillä ja toiseksi naisilla, ja neljänneksi yleisin kuolinsyy syöpään maailmanlaajuisesti [1]. Koska sen tyypillisesti hyvin hidas kehitys monien vuosien, näkökulmia varhaista havaitsemista ovat paljon parempia kuin monen muun syövän muotoja. On arvioitu, että yli 95% tapauksista CRC hyötyisivät parantava leikkausta, jos diagnoosi tehtiin aikaisessa tai premaligni polyyppi vaiheessa [2], [3]. Useita varhaisen havaitsemisen menettelyjä on kehitetty ja yhä käytetään, kuten endoskooppinen tutkimukset, stool- ja veripohjaisten testejä. Veri perustuvat testit näyttäisi olevan erityisen houkuttelevia, koska ne ovat vähän invasiivisia ja saisivat korkea sitoutuminen sovellettuna ensisijaisena seulontatestejä väestön seulontaa. Suuri määrä verta markkereita on ehdotettu ja tutkittu, mukaan lukien proteiini, Sytologisten, mRNA, ja DNA-markkereita [4], [5], mutta diagnostinen suorituskyky on ollut lähinnä riittämätön sovellus ensisijaisena välineenä väestöpohjaisen seulontaa. Lisäksi useimmissa tutkimuksissa tukeutunut pieniä mukavuutta näytteet hoitopaikassa, ja melko lupaavia tuloksia pieniä tutkimuksia on usein ole toistettu myöhemmissä suuremmassa mittakaavassa vahvistukset.

MikroRNA (miRNA) ovat 18~22 nukleotidin ei-koodaavat RNA: t että transkription jälkeen säädellä geeniekspressiota ja ohjataan erilaisia ​​solumekanismeja [6]. On yhä enemmän todisteita siitä, että miRNA ovat laajalti väärin säädellystä syövän ja saattaa olla potentiaalisia hakemuksen syöpädiagnoosin, ennusteen ja hoidon [7]. Lisäksi viimeaikainen kehitys miRNA mikrosiruja on tehnyt suuria profilointi tutkimuksissa syöpäpotilailla mahdollista.

vakaus soluttoman miRNA kehon nesteistä mahdollistaa kiertävien miRNA mahdollisina biomarkkereita invasiivisen diagnoosin syövän ja muiden sairauksien [8 ]. Useat viimeaikaiset tutkimukset havaittu joitakin verenkierrossa miRNA, kuten miR-29a, miR-92a ja miR-221, voidaan ilmentää eri tavalla CRC potilailla, ja siksi on potentiaalista käyttöä ei-invasiivisen biomarkkereita CRC seulontaan [9] – [11 ].

tämän tutkimuksen tarkoituksena oli tunnistaa ja arvioida paneeli plasma miRNA, jota voisi käyttää biomarkkereita varhaiseen toteamiseen CRC.

Materiaalit ja menetelmät

Tutkimusasetelma ja Study Väestö

Kotelot kanssa satunnaista CRC rekrytoitiin ennen hoidon aloittamista yliopiston klinikalla Heidelberg yhteydessä Dachs + tutkimus, joka on satelliitin tutkimuksen Dachs, jatkuva tapauskontrollitutkimuksessa suoritettiin Rein-Neckar alueella Saksassa [12], [13].

Potilaat, joilla on kehittynyt peräsuolen adenoomien ja hallintalaitteet vapaa paksusuolen kasvainten valittiin satunnaisesti osallistujien seulonnan colonoscopy palvelukseen BLITZ tutkimuksessa jatkuva tutkimuksen tarkoituksena on arvioida uusia lupaavia merkkiaineita varhaiseen havaitsemiseen CRC ja aiemmin kuvattu yksityiskohtaisesti muualla [14] – [16]. Lyhyesti, potilasta rekrytoitiin, ja verinäytteet otettiin Gastroenterologit toimistoja valmistelevan vierailun, tyypillisesti noin viikkoa ennen seulonta kolonoskopia.

Sekä Dachs + ja BLITZ tutkimus hyväksyttiin eettisen valiokuntien lääketieteellisen tiedekunnan yliopiston Heidelbergin ja lääketieteellisen hallitusten badenwuerttemberg ja Rheinland-Pfalzissa. Kirjallinen suostumus saatiin kullekin osallistujalle.

tutkimuksen mukaan kaksi vaihetta, merkki määrittely- ja merkkiaine validointivaihe:

merkki tunnistamisen vaihe, lupaava miRNA seulottiin TaqMan MicroRNA Array yhdistetyt plasmanäytteet 50 CRC potilaista ja 50 kasvaimen vapaan valvontaa, käyttäen viittä plasmapoolin näytettä kymmenestä CRC potilaiden kukin, ja viisi plasmapoolin näytteitä kymmenen kasvainta vapaa ohjaimet kukin. Lisäksi seitsemän miRNA kuvattu ilmentyä erilailla CRC tapausten ja kontrollien aiemmissa julkaisuissa tunnistettiin systemaattinen kirjallisuuskatsaus (miR-18a, -20a, -21, -92a, -143, -145, -181b) [17 ].

merkki validointivaihetta, ilmaus tunnistettu miRNA arvioitiin riippumattomia näytteitä (i) 80 CRC tapauksissa ja 144 valvontaa vapaa peräsuolen kasvaimien ja (ii) 50, joilla on pitkälle adenoomien ja 50 ohjaa vapaa paksusuolen kasvaimet.

Laboratorio menettelyt

(i) näytteen käsittely ja RNA.

verinäytteet kerättiin EDTA-putkiin. Verinäytteistä syöpäpotilasta otettiin ennen leikkausta tai muuta hoitoa ja verinäytteet osallistujilta joille tehtiin seulonta kolonoskopia otettiin ennen kolonoskopia. Verinäytteitä sentrifugoitiin 2123g 10 minuutin ajan 4 ° C: ssa ja supernatantti siirrettiin uusiin putkiin. Plasman näytteitä säilytettiin -80 ° C: ssa käyttöön asti. Kokonais-RNA sisältävät pieniä RNA eristettiin 200 pl (näytteet tunnistamisessa käytetään vaiheessa) tai 115 ui (näytteet käytetään validointivaihe) plasma yhdistämällä Trizol LS reagenssia (Invitrogen, Carlsbad, Kalifornia, USA) ja miRNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Saksa) sekä 5 fmol /ul cel-miR-39 ulkoinen valmiste ohjaus edellä kuvatulla tavalla [18]. Näytteet eluoitiin lopullisessa tilavuudessa 30 ui.

(ii) MicroRNA profilointi plasmanäytteistä.

Profilointi suoritettiin käyttäen TaqMan MicroRNA Array (Applied Biosystems, Foster City, Kalifornia, USA) joka mahdollistaa kvantifiointi 667 ihmisen MikroRNA. (Taulukko S1) Megaplex käänteistranskriptioreaktio ja pre-monistusreaktio suoritettiin G-Storm GS2 lämpösyklilaitteeseen (G-Storm, UK). Reaaliaikainen kvantitatiivinen polymeraasiketjureaktio (qRT-PCR) suoritettiin käyttäen 7900HT Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems). Syklin kynnys (Ct) määritellään jaksojen määrä tarvitaan fluoresoiva signaali ylittää kynnyksen qRT-PCR: ssä. Raaka Ct-arvot laskettiin käyttäen SDS-ohjelmiston versio 2.2 soveltamalla automaattisia lähtötilanteen asetukset ja kynnys 0,1 asetettiin. Vain miRNA jonka Ct-arvo oli yhtä suuri tai alle 33 ainakin joko tapauksessa tai kontrolliryhmän otettiin huomioon edelleen tietojen analysointi. Data normalisointi tehtiin, kuten on kuvattu Kroh et al. [19].

(iii) Reaaliaikainen kvantitatiivinen PCR todentaminen.

Valitut miRNA mitattiin TaqMan MicroRNA Analyysit (Applied Biosystems) mukaan valmistajan protokollaa. Kolmena rinnakkaisena qRT-PCR kutakin näytettä suoritettiin käyttäen LightCycler 480 Reaaliaikainen PCR -järjestelmää (Roche Applied Science, Saksa). ACt laskettiin vähentämällä Ct-arvoja sisäisen valvonnan päässä Ct arvot miRNA kiinnostava, ja keskimääräinen ACt verrattiin tapausten ja kontrollien välillä. Multiplex analyysit suoritettiin käyttäen ennalta altaissa RT-alukkeita (taulukko S2). Tehokkuus kunkin miRNA: n määritys määrittää laskennallisesti standardikäyrästä käyttämällä sarjaa kokonais-RNA laimennoksia. Kaikki määritykset osoittivat, hyvä lineaarisuus (R

2 0,96) välillä Ct-arvoja ja log lähtöaineiden määrä kokonais-RNA kutakin laimennosta (tuloksia ei ole esitetty).

Tilastollinen analysointi

miRNA ekspressiotasoja verrattiin välillä CRC potilaiden ja kasvain-vapaa ohjaimet ja edistyksellisten adenooma potilaiden ja kasvain-vapaa ohjauksista Wilcoxonin-Mann-Whitney-testi (jäljempänä: Wilcoxonin testi). Vertailu miRNA ekspressiotasoja välillä CRC potilaiden ja kasvain-vapaa valvonnan markkeri tunnistamisen vaihe suoritettiin käyttäen tarkkaa versiota Wilcoxonin testi. Kaikki testit olivat kaksipuolisia ja P-arvot 0,05 tai vähemmän katsottiin olevan tilastollisesti merkitsevä.

Useita logistinen regressio käytettiin arvioimaan yhteiskäytössä on tunnistettu paneeli miRNA ennustamisessa CRC merkki validointivaihetta . Vastaanotin toimii (ROC) konstruoitiin ja alueilla ROC käyrät (AUC) laskettiin sekä oikaisemattomista (näennäinen) ja säätää ( ”optimismi-korjattu”) arvioi arvioida syrjinnän ennustemallissa potilaiden välillä ja ilman CRC. The.632 + bootstrap menetelmällä (1000 toistoa) käytettiin sopeuttaa overfitting näennäisen Luokitteluvirheillä virhe ja yli-arvio AUC jonka oikaisematon arvioiden [20], [21]. 95%: n luottamusväli (CI) varten säätää ja oikaisemattomien arvioita saatiin tavallisella bootstrap analyysit (1000 kopioi).

korrelaatio plasman miRNA ekspressiotasoja poikki 324 osallistujat validointivaihetta arvioitiin Spearman korrelaatiokertoimet.

SAS versiossa 9,2 (SAS Institute Inc., Cary, North Carolina, USA) käytettiin suorittamaan Wilcoxonin testit ja R versio 2.15.0 (R Foundation for tilastollinen tietojenkäsittely, Wien, Itävalta) käytettiin suorittaa kaikki muut analyysit. R-paketteja ”Daim” ja ”boot” oli käytetty suorittamaan bootstrap analyysit [22], [23].

Tulokset

Tutkimus Väestö

yhteensä 424 yksilöt sisällytettiin (130 CRC potilasta, 50 kehittyneet adenooma potilasta ja 244 kasvain-vapaa tarkastukset) tutkimuksessa. Demografiset ominaisuudet tutkimusväestöstä ja jakelu kasvaimen vaiheet yhteen, jotta markkeri määrittely- ja merkkiaineen validointivaiheen taulukossa 1.

tunnistaminen ilmentyvät eri miRNA CRC Potilaat ja Kasvaimen vapaa Controls

microarray analyyseissä, viisi miRNA todettiin olevan tilastollisesti merkitsevästi yli-ilmaistu plasmassa CRC potilaista verrattuna kasvaimen vapaa ohjaimet (miR-29a: p = 0,016, miR-106b: p = 0,008, miR -133a: p = 0,032, miR-342-3p: p = 0,008, miR-532-3p: p = 0,016, tarkka Wilcoxonin testi).

arviointi sisäisen valvonnan Real Time Quantitative PCR

meidän microarray data havaitsimme merkittävää eroa kannalta Ct arvojen miR-188-5p (p = 0,83, Wilcoxonin testi) ja miR-16 (p = 0,40, Wilcoxonin testi) välillä CRC ja kasvain-ilmaiseksi valvontaa. RNU6B ja miR-16 on ollut laajimmin käytetty endogeeninen kontrolli miRNA varten qRT-PCR: ssä miRNA tutkimuksissa [8]. Siksi nimetty kolme miRNA katsottiin sisäisen valvonnan varten miRNA kvantifiointiin. Kuitenkin ekspressiotasot RNU6B ja miR-188-5p plasmassa olivat liian alhaisia ​​määrä määritetään TaqMan MicroRNA Pitoisuus (keskiarvo Ct-arvot olivat suurempia kuin 35). Siten miR-16 valittiin sisäisen valvonnan, koska se osoitti korkea runsautta ja vähemmän vaihtelua ilme. Mitään merkittävää eroa ei havaittu kannalta Ct arvojen miR-16 (p = 0,40, Wilcoxonin testi) välillä CRC ja kasvain-vapaa näytteitä.

Validation riippumaton otos CRC Potilaat ja Kasvaimen vapaa Controls

vahvista viisi miRNA (miR-29a, -106b, -133a, -342-3p, -532-3p) yksilöity mikrosiruanalyysi ja toinen seitsemän miRNA (miR-18a, -20a, -21 , -92a, -143, -145, -181b), jotka on aiemmin raportoitu ilmentyä erilailla CRC (paitsi miR-92a, he olivat kaikki tutkimuksista perustuu kudosnäytteiden) [17], qRT-PCR suoritettiin analysoida ilmentymisen valitun miRNA meidän validointi asettaa (224 plasmanäytteistä yhteensä 80 CRC potilaista ja 144 kasvain vapaa tarkastukset).

(i) ilmentäminen miRNA.

Nine miRNA ( miR-18a, -20a, -21, -29a, -92a, -106b, -133a, -143, -145) osoitti korkeampia ilmentymistä plasmassa CRC potilailla kuin kasvain-vapaa ohjaimet (miR-18a: p 0,0001, miR-20a: p = 0,001, miR-21: p 0,0001, miR-29a: p = 0,001, miR-92a: p = 0,004, miR-106b: p = 0,028, miR-133a: p = 0,0002, miR-143 0,0001, miR-145: p = 0,0004, Wilcoxonin testi). Ei miRNA havaittiin vaimentua. Vastaavat ekspressiotasot plasman CRC potilaiden ja kasvain-vapaa ohjaimet (normalisoitu miR-16) esitetään kuviossa 1.

Rasiakuvaajat pienimmällä havainto, alakvartiili, mediaani, yläkvartiili ja suurimmat tarkkailu ovat esitetty. Viikset ulottuvat huomautukset, jotka ovat enintään 1,5 kertaa niin pitkä laatikon (kvartiiliväli) pois laatikosta. Äärimmäisiä havaintoja pidetään poikkeavia havaintoja. P-arvot perustuvat Wilcoxonin testeissä.

(ii) välinen suhde miRNA ja kliinis-CRC potilaista.

tutkinut yhdistyksen välillä miRNA ekspressiotasot ja joitakin kliinis. MiR-181B: n ilmentymisen määrä oli suurempi potilailla, joilla imusolmuke etäpesäke kuin potilailla, joilla ei imusolmuke etäpesäke (p = 0,024, Wilcoxonin testi). Yksikään miRNA osoittivat mitään yhteyttä kasvaimen sivuston tai kasvain vaiheessa. Samoin ei yhdistysten havaittu iän, ei niissä tapauksissa, eikä kasvain-free-kontrolleihin (tuloksia ei ole esitetty).

Sen arvioimiseksi, onko ekspressiotasot tutkittujen miRNA liittyy kehittämiseen CRC, potilaat olivat stratifioitu AJCC vaiheittain. Yleensä ekspressiotasot olivat hyvin samankaltaisia ​​varhaisessa ja myöhäisessä vaiheessa syöpiä. MiR-18a, 20a, 21, 29a, 133a, 143 ja 145 havaittiin olevan yli-ilmentynyt plasmassa CRC potilaiden alkuvaiheessa verrattuna kasvain-free valvontaa. MiR-18a, -20a, -21, -92a, -133a, -143, -145 ja -181b osoittivat korkeampia ekspressiotasoja plasmassa CRC potilaiden myöhäisessä vaiheessa verrattuna kasvain-ilmaiseksi valvontaa. MiR-181B osoittivat suurempi ekspressio plasmassa myöhäisessä vaiheessa CRC potilaille kuin alkuvaiheen CRC potilasta (taulukko 2).

(iii) Monimuuttuja-analyysi.

Kun paneelin 12 miRNA (miR-18a, -20a, -21, -29a, -92a, -106b, -133a, -143, -145, -181b, -342-3p, -532-3p), ROC-analyysit saatiin tasoittamattomina AUC 0,803 (95% CI: 0,774-,888) ja säädettiin, eli optimismi korjattu, AUC 0,745 (95% CI: +0,708-0,846). ROC-käyrät on esitetty kuviossa 2. Kunkin miRNA, ROC-käyrät kuviossa S1.

säätö yli-optimistinen tehtiin the.632 + bootstrap-menetelmällä. Lyhenteet: AUC, ala-vastaanotin toimii ominaiskäyrää.

ilmentäminen miRNA Advanced Adenooma Potilaat ja Kasvaimen vapaa Controls

Advanced peräsuolen adenoomien edustavat esiaste vaiheessa CRC. Arvioimaan mahdollinen käyttö varhaisen havaitsemisen jopa kehittyneiden adenoomia, tunnistetut 12 miRNA määritettiin qRT-PCR Plasmanäytteissä 100 TET (50 kehittyneitä adenooma ja 50 kasvaimen vapaa tarkastukset). Tilastollisesti merkitseviä eroja miRNA ekspressiotasoja havaittiin plasmassa kehittyneiden adenooman potilaiden ja kasvain-vapaa valvontaa.

korrelaatiot Expression Plasman miRNA

joukossa osallistujat validointivaihetta, vahva korrelaatioita havaittiin välillä ekspressiotasot miR-18a ja miR-20a (r = 0,800, p 0,001), jotka molemmat koodattu miR-17-92 klusteri; miR-143 ja miR-145 (r = 0,762, p 0,001), jotka molemmat koodattu miR-143/145 klusteri; ja miR-29a ja miR-106b (r = 0,694, p 0,001), kaksi tiiviisti kotipaikka miRNA kromosomissa 7q. Ilmentymistasojen joidenkin muiden miRNA, joita ei ole sijoitettuja genomissa myös korreloi. Toisaalta, miR-92a, joka on myös koodattu miR-17-92 klusteri ei korreloivan hyvin miR-18a tai miR-20a (r = 0,340 ja 0,251 vastaavasti) (taulukko S3).

keskustelu

tässä tutkimuksessa vertasimme ekspressiotasot kahdentoista miRNA plasmassa näytteitä CRC potilaiden ja kasvain-vapaa valvontaa. Tietääksemme tämä on ensimmäinen raportti verenkierrossa miRNA CRC havaitsemiseksi käyttäen TaqMan MicroRNA Array for miRNA profilointia. Viisi miRNA (miR-29a, -106b, -133a, -342-3p, -532-3p) tunnistettiin microarray analyysit ja seitsemän valittiin kirjallisuudessa (miR-18a, -20a, -21, -92a, -143, -145, -181b) lisätutkimuksia varten [17]. Meidän validointitutkimuksella ilmentymistasojen miR-18a, -20a, -21, -29a, -92a, -106b, -133a, -143 ja -145 todettiin olevan merkitsevästi suurempi CRC potilailla kuin neoplasm- vapaa valvontaa. ROC analyysi tunnistettu miRNA mukautettu yli-optimismi by bootstrap tuotti AUC 0,745 (95% CI: ,708-+0,846). Tämä tulos hyvä verrattuna tuloksiin muiden veripohjaisten testit CRC havaitsemiseksi [5].

Diagnostic ominaisuudet kiertävän miRNA CRC arvioitiin aiemmin kahdessa viimeaikaisissa tutkimuksissa. Ng et ai. raportoitu 0,89 herkkyys ja 0,70 spesifisyys tietyllä rajakohta Mir-92a, ja AUC 0,885 (95% CI: 0,83-0,94), joka perustuu 90 CRC potilaista (TNM I /II /III /IV: 6 /34/23/27) ja 50 ohjaa [10]. Huang et al. raportoitu 0,830 herkkyys ja 0,847 spesifisyys, ja AUC 0,883 (95% CI: 0,830-,937) saatu Monimuuttuja-analyysissä, kuten miR-29a ja miR-92a perustuu 100 CRC potilaalla (TNM I /II /III /IV : 27/25/38/10) ja 59 valvonta [9]. Siten molemmissa tutkimuksissa havaittu suurempi AUC arvioita kuin saatu tässä tutkimuksessa. Näissä tutkimuksissa ei ollut mukautettu yli-optimismi. Vaikka 95%: n luottamusväli (0,774-+0,888) tarkistamattomasta AUC tutkimuksessamme käsitti AUC raportoimat Ng et al. ja Huang et al., säätö yli-optimismi heikennetty AUC noin 6 prosenttiyksikköä. Kuitenkin jopa meidän tasoittamattomina AUC arvio oli hieman pienempi kuin edellisenä raportoitu niitä, vaikka suuremman määrän mukana miRNA. Tekijöitä, jotka voivat osittain selittää näitä poikkeamia vaiheessa jakelun CRC ja mahdollisuus. Prosenttiosuus alkuvaiheen CRC potilailla (AJCC vaiheen I ja II) oli suurempi tutkimuksessamme (59%) kuin aikaisemmin raportoidussa tutkimuksessa (44% ja 52%, tässä järjestyksessä) ja luultavasti lähempänä vaiheeseen jakelun odotetaan seulonta ympäristössä [5]. Kuitenkaan ole suurta eroa ilmaisun tasoilla vaiheessa havaittiin tutkimuksessamme.

peräsuolen adenoomien edustavat esiaste vaiheessa adenocarinoma. Aiemmassa tutkimuksessa oli raportoitu, että ero ilmentyminen plasma miR-29a ja miR-92a voisi syrjiä kehittyneitä adenooman potilaita kasvain-free valvonta vaikka syrjintä oli vähäisempää kuin CRC potilaille [9]. Tutkimuksessamme mikään tutkittujen miRNA havaittiin merkitsevästi differentiaalisesti ilmaistut kehittyneen adenooma potilaita verrattuna kasvaimen vapaa valvontaa. Nämä tulokset viittaavat siihen, että tutkimuksen kohteena miRNA ei ehkä ole hyötyä diagnosointiin kehittyneiden adenoomia. Kuitenkin puute merkittäviä eroja saattaa johtua myös rajoitettu voima havaita kohtalainen erojen kanssa otoskoko meidän alatutkimus vertaamalla kantajia kehittyneiden adenoomien ja kasvain-vapaa aiheita Koska havaittu puute differentiaalikaavojen yksittäisten miRNA, Monimuuttuja malli ennustaminen kehittynyt adenoomien ei ole sovellettu.

Vaikka ero ilmaus plasman miR-18a, -20a, -21, -106b, -133a, -143, -145 ja -181b CRC potilailla tutkittiin vuonna joissakin kudosnäytteestä perustuvat tutkimukset [24] – [27], tämä on, tietojemme mukaan ensimmäinen tutkimus raportointi ilmentymistä näiden miRNA plasmassa näytteitä suuri määrä potilaita, joilla CRC ja kasvain-vapaa valvontaa. Tilastollisesti merkitseviä eroja ilmaus Kaikkien analysoitujen miRNA paitsi miR-181 b, miR-342-3p ja miR-532-3p havaittu. Kiehtovan, meidän tiedot osoittivat, että ekspressiotasot miR-133a -143 ja -145 merkittävästi yli-ilmaistu plasmassa CRC potilaista verrattuna kasvaimen vapaan valvontaa, mikä näyttää olevan ristiriidassa tietojen johdonmukaisesti osoittavat vähemmän ilmentymistä näiden kolmen miRNA syövän kudosnäytteessä perustuvat tutkimukset [28] – [34]. Lisätutkimukset runsaasti potilaita ja samanaikaiseen mittaukseen miRNA ilmaisun plasmassa ja kudoksessa voi olla perusteltua selventämään tätä asiaa.

Yleinen ongelma tutkimustuloksiin kiertävän miRNA on, ettei yksimielisyyttä sisäinen valvonta on perustettu. Arvioimme miR-16, miR-188-5p ja RNU6B, ja koska johdonmukainen, vakaa ja korkea ilmaisun kaikissa plasmanäytteiden, miR-16 valittiin sisäisen valvonnan plasmassa verinäytteestä testeissä, mutta empiirinen vahvistukset ovat edelleen tarvitaan yksimielisyys vankka ja tarkka sisäinen valvonta.

yhdeksän miRNA havaittiin olevan yli-ilmentynyt plasmassa CRC potilaiden tutkimuksessamme on myös tutkittu suhteessa muihin sairauksiin aiemmissa tutkimuksen [9] , [10], [33], [35] – [48]. (Taulukko 3) Esimerkki, plasma miR-21: n havaittiin olevan yli-ilmentynyt monenlaisia ​​maligniteetteja, mukaan lukien maksasyövän, eturauhassyövän, ja mahasyövän [35], [36], [42], [46] – [49]. Nämä yhteiset in miR-21 ilmentämiskuviota syöpätyypin suggestes että miR-21 voimin toimivat onkogeeni. Toiminnalliset tutkimukset osoittivat, että miR-21 tavoitteet tuumorisuppressorigeeneille kuten fosfataasi ja tensin homologi (PTEN) ja kääntäen säätelee sen ilmentymistä [50]. PTEN on sijoittunut toiseksi yleisimmin mutatoitunut tuumorisuppressorigeeniä jälkeen p53. Se voidaan inaktivoida mutaatiolla, jossa heterotsygoottisuuden menetys, promoottorin metylaation, miRNA häiriöitä ja joitakin muita mekanismeja useita syöpiä, kuten aivo-, eturauhas-, kohtu- syöpä [51]. Differential kuvaamaan joitakin miRNA useita syöpiä tukevat ehdotuksia, että ne pitäisi yleensä yhdistää ylimääräisiä miRNA kun toteamiseen käytettävien tiettyjen syöpien.

On joitakin rajoituksia, jotka on otettava huomioon tulkittaessa tämän tutkimuksen tulokset. Ensinnäkin, otoskoko on vielä pieni, varsinkin merkki valintavaiheessa. Toiseksi paljon miRNA ”runsaus plasmassa ovat liian alhaisia ​​tarkasti kvantifioida qRT-PCR siksi joitakin mahdollisia asiaan markkereita ei voida pitää. Kolmanneksi on vielä määritettävä, missä määrin muokattu ekspressiotasot miRNA keskuudessa CRC tutkimuspotilaat ovat CRC erityisiä.

Johtopäätökset

Plasma miRNA näyttävät olevan potentiaalisesti käyttökelpoisia biomarkkereita varhaiseen havaitsemiseen ja diagnoosi CRC. Vaikka tutkimus plasma perustuva miRNA profilointi on vielä hyvin varhaisessa vaiheessa verrattuna tutkimuksen kudoksessa miRNA profilointi, sillä saattaa olla potentiaalia edistää uusien lähestymistapojen noninvasiivisten, veri perustuu CRC seulonnan. Kuitenkin diagnostinen suorituskyky tunnistettu paneeli miRNA ehkä ole vielä riittää kilpailla suorituskykyä joidenkin muiden ei-invasiivisia kokeita, erityisesti immunokemiallinen verta ulosteessa testit [52]. Lisätutkimusta usean merkki verta pohjainen testi, mahdollisesti myös paneeli miRNA tunnistettu tässä tutkimuksessa saattaa olla lupaava tapa parantaa ohjelmistoon ei-invasiivisen syövän seulontaa.

tukeminen Information

Kuva S1 .

Receiver operating ominaiskäyrät käyttäen 12 valittua MikroRNA (miR-18a, -20a, -21, -29a, -92a, -106b, -133a, -143, -145, -181b, -342-3p ja asennuspalveli- 532-3p) syrjinnän 80 peräsuolen syövän potilaiden ja 144 kasvain-ilmaiseksi valvontaa. Lyhenteet: FPR, vääriä positiivisia. TPR, oikeita positiivisia korko. AUC, ala-vastaanotin toimii ominaiskäyrää.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0062880.s001

(DOC) B Taulukko S1.

667 ihmisen MikroRNA testattiin TaqMan MicroRNA Array.

doi: 10,1371 /journal.pone.0062880.s002

(DOC) B Taulukko S2.

RT-aluketta allasta käytetään multiplex Real-Time kvantitatiivinen PCR.

doi: 10,1371 /journal.pone.0062880.s003

(DOC) B Taulukko S3.

Spearmanin korrelaatiokertoimet MikroRNA ilmentymisen tasot 324 osallistujien validointi (p 0,001 jos ei selityksin).

doi: 10,1371 /journal.pone.0062880.s004

(DOC) B