Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Etäpesäke on prosessi, jossa syöpäsolut oppia muodostamaan satelliitti kasvaimia kaukaisilla elinten ja edustaa periaate kuolinsyy potilailla oli kiinteitä kasvaimia. NSCLC on kaikkein vaarallisin ihmisen syövän koska sen korkea etäpesäke.

Menetelmät /Principal Havainnot

puute sopivan eläinmallin on toistaiseksi haitannut analyysi metastasointiin. Olemme tutkineet c-MYC sen kyky aiheuttaa etäispesäkkeiden C-RAF-driven hiirimallissa ei-pienisoluinen keuhkosyöpä. c-MYC yksin aiheuttama Frank kasvaimen kasvua vasta pitkän viiveen jolloin toissijainen mutaatiot K-Ras tai LKB1 havaittu muistuttavat ihmisen NSCLC. Yhdistelmä C-RAF johti välittömään kiihtymiseen kasvaimen kasvua, muuntaminen papillaarinen epiteelisolujen ja angiogeenisen kytkin induktio. Lisäksi Lisäksi c-MYC oli riittävä indusoimaan macrometastasis maksassa ja imusolmukkeet lyhyen viiveen liittyy linjaa kytkimen tapahtumia. Niinpä olemme luoneet ensimmäisen ehdollisen mallin etäpesäke NSCLC ja tunnistettu geeni, c-myc, joka pystyy ohjaamaan kaikkia vaiheita tässä prosessissa.

Johtopäätökset /merkitys

Mahdolliset merkkiaineita havaitsemiseen metastaasin tunnistettiin ja validoitu diagnosointiin ihmisen koepaloja. Nämä merkit voidaan esittää tavoitteista tuleville terapeuttisesta ne sisältävät geenejä, kuten Gata4 joita yksinomaan ilmaistaan ​​aikana keuhkojen kehitystä.

Citation: Rapp UR, Korn C, Ceteci F, Karreman C, Luetkenhaus K, Serafin V, et ai. (2009) Myc Onko Etäpesäke Gene Non-Small-Cell Lung Cancer. PLoS ONE 4 (6): e6029. doi: 10,1371 /journal.pone.0006029

Editor: Syed A. Aziz, Health Canada, Kanada

vastaanotettu: 29 huhtikuu 2009; Hyväksytty: 25 toukokuu 2009; Julkaistu: 24 kesäkuu 2009

Copyright: © 2009 Rapp et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Deutsche Krebshilfe – Mildred Scheel Foundation (avustus 106253) ja jonka DFG (avustukset TR17). Emanuele Zanucco tukivat myöntäminen Saksan Excellence Initiative Graduate School of Life Sciences, University of Würzburg. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

etäpesäke on monimutkainen monivaiheinen prosessi, jolla solut primaarikasvaimen kyetä tulla ja lähteä verisuoniston, asettuvan kaukaisiin kohtiin ja lopulta kasvaa makroskooppisen sekundaarikasvaimia [1]. Yleisesti ajatellaan, että metastaattinen muuntaminen on mutaatio ohjaamina. Useita geenien ja geenituotteiden on tunnistettu, että positiivisesti tai negatiivisesti vaikuttaa todennäköisyys vahvistettu ihmisen kasvaimen solulinjojen etäpesäkkeitä [2], [3], [4]. Gene tuotteet ovat kasvutekijän reseptorit ja tekijät niiden solunsisäisen signaalitransduktion porrastetusti. Regulators solun polariteetti ovat toisen luokan geenejä, jotka saattavat edistää etäpesäkkeiden [5], [6]. Käyttämällä hiiren keuhkosyöpään solulinja, Lewisin keuhkokarsinooma (LLC), kolmanteen luokkaan etäpesäkkeiden sääntelyviranomaisten on hiljattain kuvattu, että korosti tulehdus käyttövoimana [7]. Lisäksi ehdokas etäpesäke indusoivia tai -suppressing geenit ovat myös geenit, jotka koodaavat mikro-RNA: t, jotka säätelevät sarjaa liittyviä geenejä leviämisen, invaasio tai muuttoliike [8], [9].

Vaikka työ ihmisen tuumorisolulinjojen hiirillä on valaiseva, tietämättömyys ohjelmistoaan syövän geenien sekä kyvyttömyys tutkia kinetiikkaan spontaani syövän etenemisen näissä malleissa rajoittavat niiden käyttökelpoisuutta. Siksi olemme perustaneet hiirimallissa ihmisen ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC), jossa premaligni adenooma aiheutetaan

RAF

siirtogeeni nimenomaan ilmaistu keuhkojen keuhkorakkuloiden tyypin II epiteelisoluissa [10]. NSCLC on yleisin ihmisen keuhkosyöpää ja yleisin kuolinsyy syöpään ihmisellä. Sukupolven yhdistettä hiiriä, jotka kuljettavat lisäksi

RAF

muut siirtogeenien, jotka koodaavat proteiineja moduloiva signalointireiteissä usein muuttaa ihmisen NSCLC antoi meille mahdollisuuden purkaa kaksi keskeistä vaiheista etäpesäkkeiden, induktio angiogeenisen kytkimen ja eteneminen mikrometastaasin liittyy kyseeseen suoliston valitsimen geenien [11]. β-kateniinin tunnistettiin kriittinen kytkin indusoijan sekä vaiheiden ja myös edistänyt invasiivisia kasvua [11].

50% ihmisen NSCLC mutaatioita geeneissä, jotka koodaavat aktivaattoreita mitogeenista Cascade (RAS-RAF- MEK-ERK) [12] ja tämä cascade tiedetään aiheuttavan kohdegeenin beta-kateniinin, c-MYC [13], päätimme suoraan tutkia kykyä c-MYC edistää syövän etenemisen meidän RAF rakentuvassa hiiren keuhkosyöpä malli. Lisäksi MYC oli ehdokkaana, koska tiedettiin vaikuttavan uudelleenohjelmointi kasvaimissa perustuvat aiemmat havainnot RAF /MYC yhteistyö hiiren verisoluista [14], [15]. Ihmisillä, vahvistusta ja uudelleenjärjestelyt Myc geenien havaittiin murto NSCLC [16]. Useat ryhmät ovat alkaneet arvioida c-MYC hiirimalleissa NSCLC. Endogeeninen c-MYC on mukana ei metastasoituneen K-Ras aiheuttama NSCLC kuten osoitettiin käyttämällä vallitsevan negatiivisen c-MYC mutantti [17]. Indusoituva ilmentyminen tai toiminta Siirtogeenisten c-MYC osoitti yhteistyössä mutantti K-Ras in kasvainprogression eriasteisina [18], [19] mutta ei malli synnytti etäpesäkkeitä. Tässä osoitamme, että konstitutiivinen tai indusoituva ilmentyminen c-MYC lisäksi C-RAF tyypin II soluissa on riittävä nopeasti aiheuttaa etäpesäkkeitä maksaan ja imusolmukkeisiin. Yhdistämällä c-MYC ja C-RAF siirtogeenien aiheutti ulkonäkö fenotyyppisen siirtyminen cuboidal keuhkorakkuloiden papillaarinen /columnar epiteelisolujen (APECs), jotka ovat nopeimmin kasvava kasvain soluja ja myös enemmistönä maksan etäpesäke. Lisäksi c-MYC indusoi VEGF kasvaimen mikä johtaa kasvaimen vaskularisaationsa epätavallinen alukset tulevat mosaiikit sisältäviä PECAM-1 positiivisia ja PGP 9,5 positiivisia endoteelisolujen. PGP 9.5 tunnettiin aiemmin nimellä markkerina kypsymättömiä neuroendokriinisoluissa [20]. Metastaattinen muuntaminen c-MYC voidaan rekonstruoida soluviljelmässä käyttämällä ei-metastasoituneen A-549 NSCLC-solujen ja infektio MYC transdusoivia retrovirus.

Tulokset

c-MYC yhteistyötä C- RAF aiheuttavan syöpää liittyvä kuolema

Voit testata, onko C-RAF ja c-MYC yhteistyötä muutosta keuhkoepiteelisolujen tyypin II solujen in vivo, SPC-C-RAF BXB hiiriä risteytettiin SPC-c-MYC siirtogeenisiä hiirillä. Tarkkailu ajaksi ≥2 vuoden osoittaneet nopeutettua kuoleman yhdistettä (SPC-C-RAF BXB /SPC-c-MYC) hiirissä (kuvio 1A), vaikka aste kiihtyvyys oli alle nähty aiemmin hematopoieesijärjestelmän kanssa MYC /RAF retrovirukset [21]. Kuitenkin yhdiste hiirillä oli keskimääräinen viive, joka merkittävästi poikkeaa yhden SPC-c-MYC siirtogeenisiä hiiriä log-rank analyysi. Histologinen tutkimus eri ajankohtina osoitti, että yksittäinen siirtogeenisiä hiiriä erosivat kasvaimen elinaika. Kun taas SPC-C-RAF BXB tai yhdiste hiiret olivat kauttaaltaan kasvain positiivisia kahden viikon iässä, SPC-c-MYC single siirtogeenisiä hiiriä kehittyi kasvaimia myöhässä ja epätäydellisiä penetranssi osoittaa, että c-MYC ei nopeutta rajoittava lisääntymisen tyypin II solujen ja /tai että reagoiva solut poistetaan apoptoosi (kuvio 1 B).

(A) Kaplan-Meier-kuvaaja SPC-C-RAF BXB (n = 24), SPC-c-MYC (n = 52 ), yhdistettä (n = 35) ja villi- tyypin (n = 28) samasta poikueesta kontrollihiiriin. Log-rank analyysi eloonjäämisprosentteina yhdisteellä hiiriä vs SPC-C-RAF BXB = p 0,05; SPC-C-RAF BXB vs SPC-c-MYC = p 0,0001; yhdiste hiirillä vs SPC-c-MYC = p 0,0001. n: eläinten lukumäärä. (B) Kasvaimen esiintyvyys SPC-C-RAF BXB (n = 51), SPC-c-MYC (n = 30), yhdistettä hiiriä (n = 109) ja villin tyypin poikueesta ohjaus hiiriä (n = 58). Log-rank analyysi kasvaimen elinaika varten SPC-C-RAF BXB vs SPC-c-MYC = p 0,0001; yhdiste hiirillä vs SPC-c-MYC = p 0,0001; villityypin vs SPC-c-MYC = p 0,0001. n: eläinten lukumäärä. (C) kinetiikka syövän etenemisen. Edustavia keuhkojen kasvain kohdat värjätään hematoksyliinillä ja eosiinilla (H punaisen laatikon ja nuolet osoittavat pleomorphic soluja (upotus) SPC-c-MYC hiiret ja valkoiset laatikot osoittavat sarakepohjainen solun adenooma (upotus) yhdisteessä hiirillä. Sillä arviointi invaasiokyvyn kasvaimen-strooman käyttöliittymä, boxed alueet kolmannen paneelin suurennetaan pohjaan paneelissa. Genotyypit ja iät hiirien kuten. Eristetty pieni kasvainsolun klustereiden tärkein kasvain oli merkitty punaiset nuolet. Mitta-asteikko: 100 um. (D, E) H 70% vaiheen II ja IIIA kasvaimia [32]. meidän NSCLC mallissa suurin osa kasvaimen solut ovat negatiivisia tämän deubiquitinating entsyymin kaikissa vaiheissa riippumattomia genotyyppien (tuloksia ei ole esitetty). Sen sijaan, värjäys näyttää merkitä alusten primäärikasvaimissa SPC-c-MYC single siirtogeenisiä ja yhdistettä hiirissä (vertaa kuvio S6D). Itse asiassa yhteistyössä värjäys tuumorisektioiden PGP 9.5 ja PECAM-1 osoitti colocalisation Näiden merkkiaineiden samassa aluksiin (kuvio S6E). Jotta voidaan tutkia, onko PGP 9,5 on merkkiaine patologisen angiogeneesin, myös värjätään villityypin keuhkoleikkeissä jossa värjäytyminen havaittiin ainoastaan ​​suurissa aluksissa, mutta ei hiussuonia (kuvio S6E) sopusoinnussa tuoreessa julkaisussa osoittaa ilmaus PGP 9,5 inhimilliseen kaulavaltimoiden [33]. Meidän havainnot ovat ensimmäinen raportti koskien Esiintymisen endoteelisolujen kasvaimen verisuonistossa.

angiogeenisten kytkin oletettavasti ole mukana tyypillinen epiteelin mesenkymaalitransitioon (EMT) kasvaimen reunat emme havaitse solujen kaksinkertaisesti positiivinen pro SP-C ja vimentiinista tai pro SP-C ja N-kadheriinin (kuvio S8B). Lisäksi E-kadheriinin liittymissä columnar solujen kasvaimen säilyi ennallaan (kuvio S8A). Johdonmukaisesti emme tarkkailla invasiivisia rintamalla papillaarinen kasvaimissa (kuvio 1 C). Sen sijaan erillisiä ryhmiä kasvainsolujen löydettiin läheisyydessä primäärikasvaimissa muistuttaa kollektiivinen muuttoliike [34] (kuvio 1 C).

Pitkä viive kasvaimia SPC-c-MYC hiiret ovat positiivisia

K -Ras

tai

LKB1

mutaatioita

koska kinetiikka viivästytti kasvaimen kehitystä SPC-c-MYC hiirissä verrattuna SPC-C-RAF BXB tai yhdiste hiirillä ja numero myöhään kasvainten kohti keuhkojen oli pienempi (kuvio 3A) etsittiin toissijainen mutaatioita. Kohti tätä tavoitetta, paneeli geenien (Text S1), jotka ovat usein muuttuneet ihmisen NSCLC tutkittiin satunnaisessa kokoelma kasvainten kymmenestä hiiristä joka johti tunnistamiseen usein pistemutaatioiden

K-Ras

ja

LKB1

geenien (kuvio 3B). Useimmat

K-Ras

mutaatiot olivat eksonin 1 ja olivat heterotsygoottinen. Oli yksi kyseessä on eksonin 2 mutaatio (kuvio 5B) ja kolmessa tapauksessa ei ole mutaatiota löytyivät

K-Ras

tai muita geenejä paneelin paitsi

LKB1

(kuvio 3B) . Itse mutaatiot eksonissa 6 tämän tuumorisuppressorin, että se on mutatoitunut 34% ihmisen NSCLC [35] havaittiin kaikissa kolmessa

K-Ras

negatiivinen SPC-c-MYC keuhkokasvaimia (kuvio 3B). Vain yhdessä tapauksessa oli

LKB1

– ja

K-Ras

– mutaatioita havaittiin rinnakkain. Tässä esimerkissä eri mutaatiota

LKB1

havaittiin, joka oli läsnä molemmissa alleeleissa (kuvio 3B). Kaikissa muissa tapauksissa,

K-Ras

mutaatioita tai esiintyminen onkogeenisten C-RAF olivat toisensa poissulkevia kanssa

LKB1

mutaatio (kuvio 3B). Tämä havainto saattaa viitata siihen, että K-Ras /C-RAF signaloinnin tyypin II solut voivat yleensä aiheuttaa inaktivaatioon tämän tuumorisuppressorin. Samanlainen suhde välillä todettiin

K-Ras

mutaatioita ja läsnäolo onkogeenisten C-RAF, sopusoinnussa toisensa poissulkevia mallia

RAF

ja

RAS

mutaatioita ihmisen kasvaimissa [36] [37] (kuvio 3B).

(A) Kasvaimen esiintyvyys per keuhko SPC-c-MYC-hiirten iän funktiona. Eläinten numerot ovat 17 2 kuukautta, 10 6-+10,5kuukausi ja 15 13-17 kuukautta. Kukin symboli edustaa yksilön keuhkoissa. Huomaa, että ordinaatta on pesäkkeitä /cm

2 vastakohtana mm

2 kuvassa 2. (B) esiintyminen

K-Ras

ja

LKB1

mutaatioita ensisijainen keuhkojen kasvaimia. 10 sattumanvaraisesti kasvain positiiviset hiiret tutkittiin paneeli kandidaattigeenejä (

EGFR

,

K-Ras

,

B-RAF

,

C-RAF

,

p53

,

PI3K

,

PTEN

,

Akt

ja

LKB1

). Kuvassa on tietoja

K-Ras

ja

LKB1

, ainoa geenit paneelin, jossa mutaatiot löydettiin. Tsygoottisuus on kuten on osoitettu. Yksittäiset hiiret listattu tunnistenumerot helpottaa vertailua taulukoita.

Myc on riittävä indusoimaan etäpesäkkeiden

Kuten olemme aikaisemmin nähneet eteneminen mikrometastaasin SPC-C-RAF BXB hiiret jossa me provosoi angiogeneesin ablaatio E-kadheriinin, tutkimme hiirien etäpesäkkeiden eri ikäkausina. Yllättäen useita makroskooppinen maksa- (kuvio 4A ja 4B) ja imusolmukkeiden node- etäpesäkkeitä (kuvio 4C) havaittiin jo kymmenen kuukauden ikäisessä yhdistettä (SPC-C-RAF BXB /SPC-c-MYC) ja SPC-c- MYC single trasngenic eläimiä. Yhdiste hiirille kehittyi etäpesäkkeiden huomattavasti aikaisemmin, suuremmilla esiintyvyys kuin SPC-c-MYC yhden siirtogeenisiä hiiriä (kuvio 5A). Kun taas imusolmukkeiden makro- ja mikrotason etäpesäke nähtiin vain makro etäpesäkkeitä todettiin maksassa. Imusolmuke ja maksan etäpesäke olivat riippumattomia tapahtumia olivat makro- ja mikro- metastaasin viittaa siihen, että etäpesäke aloittamista solut (MIC) voi vaihdella kunkin luokan (kuvio 5A). Lisäksi SPC-c-MYC yhden siirtogeenisiä hiiriä, DOX indusoituva ilmentyminen c-MYC, joka nopeasti johtaa papillaarinen keuhkokasvaimia on C-RAF BXB pohjalla (kuvio S4) tutkittiin sukupolven etäpesäke. Nämä hiirille kehittyi keuhko- kasvainten (kuvio S9A) ja maksan etäpesäke (kuvio S9C ja 9D) koostuu columnar soluja. Yhdenmukainen taajuus etäpesäkkeiden konstitutiivisen hiirillä, kohortin 10 indusoituvia yhdistettä hiiriä, jotka oli indusoitu 11-12 kuukausi, yksi hiiri kehitettiin makroskooppinen maksa metastastasis ja toinen eläin oli positiivinen mikro etäpesäke alueellisella imusolmuke (kuva S9B) . Kohortin samanikäisiin ohjaus (indusoimaton) hiirillä, jotka olivat 14-17 kuukausi vanha ei näytä etäpesäkkeitä (tuloksia ei ole esitetty). Samanlaisia ​​konstitutiivinen hiiriä, kohdat maksan etäpesäke indusoituvan yhdistettä hiirten (Spc-C-RAF BXB /SPC-rtTA /tet-O-c-MYC) oli positiivinen pro SP-C ja pan-sytokeratiini (kuvio S9E ja S9F). Toisin kuin konstitutiivisen hiiriä, maksan etäpesäke indusoituva yhdiste hiirissä aiheutti voimakas strooman vasteen, joka erottaa kasvainkudoksen normaalista maksasta (kuvio S9D). Erityisesti tässä peruskudoksettoman rikas raja-alueella eristää klustereita syöpäsolujen, jotka olivat positiivisia yleiseurooppalaisen sytokeratiinivasta tai pro SP-C oli läsnä (kuvio S9E ja S9F) yhdenmukaisia ​​hyökkäystä kollektiivinen muuttoliike [34]. Tutkiessaan mutaation aseman K-Ras, eksoni 1mutation havaittiin ensisijaisesti keuhkojen kasvaimet ja vastaavat maksan etäpesäkkeiden (tuloksia ei ole esitetty).

(A) tarkastus maksan etäpesäkkeiden (vasemmalla) peräisin SpC- c-MYC yhden siirtogeenisen hiiren. Normaali maksa (oikealla) ei-metastasoitunut SPC-C-RAF BXB yhden siirtogeenisen hiiren. (B) H 0,05. n = 17 hiirtä kutakin ryhmää. (D) analyysi etäpesäkkeitä. Parafiiniin osat keuhko, imusolmuke ja maksan kudoksia istutetut hiiret seulottiin etäpesäke käyttämällä sytokeratiini-7 (CK-7) vasta-aine. Spesifisyyden osoittamiseksi CK-7 ilmentymisen A-549-soluja primaarikasvaimille värjättiin puuttuessa (negatiivinen kontrolli) tai läsnä ollessa (positiivinen kontrolli) ja CK 7-vasta-ainetta. Jokaista urut vähintään 3 leikkeet värjättiin ja tarkastettu huolellisesti ainakin kaksi henkilöä. n = 17 hiirtä kutakin ryhmää. Mitta-asteikko: 50 um. (E) ilmaantuvuus Etäpesäke. LN: Imusolmuke.

käyttö mutaatioiden primaarikasvainten SPC-c-MYC single siirtogeenisiä hiiriä varten sukujuuret jäljittäminen etäpesäkkeiden

löytyminen usein

K-Ras

ja

LKB1

mutaatioita keuhkokasvaimia pääasiassa SPC-c-MYC single siirtogeenisiä hiiriä ehdotti, että voisimme käyttää mutaation tietoja linjaa jäljittämistä. Siksi tutkittiin DNA maksan ja imusolmukemetastaaseja varten mutaatioiden läsnä primäärikasvaimissa. Yllättäen tapauksessa

K-Ras

mutaatioita, neljä viidestä tapaukset c-MYC kasvain peräisin etäpesäkkeitä, joita voitaisiin tällä tavalla tutkituista oli negatiivinen mutaatio oli yksi tapaus yhdisteen hiiri oli

K-Ras

eksonin 1 mutaation primaarikasvaimen ja etäpesäkkeiden imusolmukkeisiin (kuvio 5B). Kuitenkin yksi viidestä tapauksista

K-Ras

positiivisia c-MYC kasvain peräisin etäpesäkkeitä oli positiivinen mutantti

K-Ras

. Mutaatio oli sama kuin keuhkojen kasvain. Tämä hiiri oli useiden elinten etäpesäkkeitä, joka sisälsi lisäksi maksa, munuaiset, haima ja aivot. Lisäksi etäpesäkkeiden eri paikoissa yhteinen ilmaus keuhkojen markkereita. Kuva S11 osoittaa, että hajallaan pro SP-C positiiviset solut ovat läsnä kaukaisia ​​etäpesäkkeitä maksassa, haimassa, aivoissa ja munuaisissa. Lisäksi munuaisissa, Clara solun eritys- proteiini (CCSP) positiivisia kasvainsoluja havaittiin (kuvio S11). Kun yhdessä tapauksessa

LKB1

-mutant keuhkojen kasvain, joka johti maksan etäpesäke, etäpesäke negatiivinen tulos mutaation. Se, että mutaatiot läsnä ensisijainen keuhkojen kasvaimet ovat enimmäkseen poissa niiden maksametastaaseista viittaa vahvasti siihen, että etäpesäke on varhainen tapahtuma.

histopatologia etäpesäke peräisin SPC-c-MYC single siirtogeenisiä ja yhdiste hiiriä

histopatologinen tutkimus etäpesäkkeet molempien genotyyppien olivat erottamattomat paitsi niiden runsaus (kuvio 4A ja kuvio 5A). Molemmissa tapauksissa löydämme kaksi etäpesäke maksassa ja imusolmukkeiden, papillaarinen ja sekoitetaan kystinen-papillaarinen (kuvio 4B). Yleisesti molemmat muodot toimia samalla kohde-elimen (kuva S12). Olipa näitä kahta voi interkonvertoida vai kystat ovat varhainen edeltäjä muotoja mixed kystisen-papillaarisen etäpesäkkeiden ei tällä hetkellä tiedetä.