Krooninen sairaus

tiivistelmä

BTN3A2 /BT3.2 butyrophilin mRNA ilmentyminen tuumorisoluissa aiemmin tunnistettiin ennustetekijä pieni kohortin korkealuokkaisesta vakavien epiteelin munasarjasyöpä (HG-EOC). Täällä arvioimme ennustetekijöiden arvo BT3.2 proteiinitasolla sisään näyte 199 HG-EOC potilaille. Koska ainoa tunnettu rooli butyrophilin proteiinien on immuuni asetus, arvioimme yhdistyksen välillä BT3.2 ilmaisun ja kasvaimensisäisenä immuunisolujen soluttautumista immunohistokemiallisesti erityisiä vasta-aineita BT3.2, CD3, CD4, CD8, CD20, CD68 ja CD206. Epiteelin BT3.2 ilmentyminen merkitsevästi yhteydessä pidempi eloonjäämiseen ja pienempi riski taudin etenemiseen (riskisuhde = 0,651, p = 0,006 ja HR = 0,642, p = 0,002, vastaavasti) ja merkittävästi liittyä suurempi tiheys soluttautua T-solujen, erityisesti CD4 + solujen (0,272, p 0,001). Havaitsimme myös vahvan yhteyden suhteellinen tiheys CD206 + solujen, kuten arvioitiin suhde kasvaimensisäisenä CD206 + /CD68 + ilme, ja taudin etenemisen riski (riskisuhde = 1,355 p = 0,044, tässä järjestyksessä). Lopuksi BT3.2 proteiini on potentiaalinen ennustetekijöitä biomarkkereiden tunnistamiseen HG-EOC sairastavien potilaiden parempaan tulokseen. Sen sijaan korkea CD206 + /CD68 + ilmentyminen liittyy suuri riski taudin etenemiseen. Vaikka rooli BT3.2 ei vielä tunneta, tuloksemme osoittavat, että BT3.2 ilmentyminen epiteelisoluissa voidaan moduloi kasvaimeen immuunisolujen infiltraatio.

Johdanto-: Le Page C, Marineau A, Bonza PK, Rahimi K, Cyr L, Labouba I, et ai. (2012) BTN3A2 ilmentäminen epiteelikasvaimet munasarjasyövän liittyy korkeampi Kasvain infiltroivien T Cells ja paremman ennuste. PLoS ONE 7 (6): e38541. doi: 10,1371 /journal.pone.0038541

Editor: Salvatore V. Pizzo, Duke University Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 06 helmikuu 2012; Hyväksytty: 7. 2012 Julkaistu: 07 kesäkuu 2012

Copyright: © 2012 Le Page et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustusta Cancer Research Society ja Fondation Carole Epstein. Dr. Cailhier omistaa clinicien-chercheur apurahan Fonds de Recherche en Santén du Québec. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

epiteelikasvaimet munasarjasyöpä (EOC) on johtava kuolinsyy gynecologic pahanlaatuisia kasvaimia [1]. Koska sen puutteen oireet, tämä tauti diagnosoidaan usein edennyt pitkälle (vaihe III tai IV), kun syöpä on jo levinnyt toissijainen sivustoja. Standardi hoito näille potilaille on leikkaus ja platinapohjaisen kemoterapian, vaikka tauti etenee usein jopa leikkauksen jälkeen ja tulee vastustuskykyinen tavanomaisen kemoterapian [2]. Niinpä eloonjäämisaste potilaiden myöhäisvaiheen EOC on erittäin alhainen (alle 40%). Kliiniset muuttujat, kuten taudin vaiheessa ja jäljellä tauti, ovat ennustavia [3], [4], mutta suurelta osin epäinformatiivisia niille myöhäisvaiheen sairaus.

Aikaisemmassa tutkimuksessa [5], teimme mRNA ilmentymisen profilointi korkealuokkaisesta vakavien EOC tuumorikudoksista tunnistaa molekyylimarkkereita ennusteen käyttämällä Affymetrix-pohjainen geeniekspressiota mikrosirujen alustalla. Niistä prognostisia markkereita tunnistettu, löysimme BTN3A2, joka tunnetaan myös nimellä BT3.2 ja BTF4 geeni, joka kuuluu BT3 butyrophilin perheen, myös B7 alaperheen. BTN3A2 mRNA oli vahvin biomarkkereiden joukossa 8 muuta testattu. Se ei ainoastaan ​​ole ennustetyövälineenä merkitystä yhden ja usean analyysejä, mutta se osoitti myös korkeimman riskisuhde verrattuna muihin molekyyli- ja kliinisten ennustetekijöiden muuttujia. Korkea mRNA ilmentyminen BT3.2 oli voimakkaasti yhteydessä hyvän ennusteen suhteessa tautivapaan elinajan ja kokonaiselossaolo. Koska EOC ennustetekijöiden merkki se saavutti 87%: n spesifisyys ja 77% herkkyys ennustaa aikaisin toistumisen ( 18 kk) kohortin 52 potilasta [5].

butyrophilin (BTN) perhe sisältää BTN1A1, BTN2A1 , BTN2A2, BTN2A3, BTN3A1, BTN3A2, BTN3A3, ja BTN-Like jäsentä. Mielenkiintoista, nämä uudet BTN perheenjäseniä jakaa huomattava homologia B7 perheenjäsenten, joilla on IGV kaltainen exoplasmic domain seurasi toinen exoplasmic HVK kaltaisen domeenin. Sytoplasminen domeeni sisältää proteiinia sitovan SPRY /PRY B30.2 domain [6], [7], [8]. Toisin kuin muut BTN jäsentä, BT3.2 ei ole B30.2 verkkotunnuksen solunsisäisen alueen [7], [9]. BT3 molekyylejä (BTN3A1 /BT3.1, BTN3A2 /BT3.2 ja BTN3A3 /BT3.3) tiedetään ilmentyvän endoteelisoluissa [10], on kalvo, joka ympäröi maitorasvaa erittävät pisara maitorauhasen epiteelisolujen [11] puolesta immuunisolujen, ja joissakin kasvainsolulinjoihin [5], [12].

B7-molekyylit voivat olla negatiivisia tai positiivisia sääntelyviranomaisten T-soluaktivaation. B7-H1 /PD-L1, B7-H3, B7-H4, B7DC /PD-L2, B7S3, B7S1, BTNL2, BTN1A1, BTN2A2 voi estää T-solujen proliferaatiota tuottaa estävää signaalin. Kääntäen, B7-H3 on pidetty positiivinen ja negatiivinen säätelymolekyyli kykenee stimuloida tai estää CD4 + ja CD8 + T-solujen riippuen matkapuhelinverkon yhteydessä [13], [14], [15], [16]. Vastaavasti jotkin BTN perheenjäsenet ovat viime aikoina tullut uusia säätelijöinä immuunijärjestelmää. Näitä ovat BTNL2 [17] – [18] BT1.1, BT2.2 [19], BTNL1 [20], [21] ja BT3 molekyylejä. Esimerkiksi, Yamashiro

et al.

[22] käsiteltiin PMBC vastaisella vasta-aineella BT3.3 ja havaittu inhibitio CD4 + ja CD8 + solujen lisääntymistä, sekä vähentynyt sytokiinierityksen molempia T-soluja. Toisessa raportissa, Cubillos-Ruiz

et al

. osoittivat, että BT3 ilmentymistä antigeeniä esittelevien solujen (APC) esti

in vitro

T-solujen proliferaatiota ja Th1 sytokiinierityksen [23]. Vaikka nämä tutkimukset ovat tarkastelleet funktio B7 perheenjäsenten, kun ilmaistaan ​​immuunijärjestelmän komponentti, se ei ole selvää, miten nämä molekyylit voivat vaikuttaa immuunivasteen, kun sitä ekspressoidaan muissa solutyypeissä. Todellakin, julkaistut tiedot tukevat ilmaus BT3 on EOC solujen ensisijainen kudoksissa ja metastaattinen kudoksissa [23]. Lisäksi Messal N.

et al

. raportoi äskettäin, että BT3 toimii kostimuloivana molekyyliä CD4 + T-solujen ja NK-solujen [24]. Kiinnostavaa, he havaitsivat ero immuunisäätelytoimintoja rooli eri BT3 isoformeja. Kaikkiaan tämä viittaa siihen, että monimutkaisten mekanismien voidaan säädellä toimintaa BT3 molekyylejä. Muita havaintoja ymmärtämiseksi tarvitaan tarkkaa roolia näiden molekyylien yhteydessä erityisellä tavalla.

paremmin ymmärtää roolin BT3.2 munasarjasyövän ja erityisesti vahvistamaan meidän havaittu yhdistys mRNA BT3.2 ilmaisun hyvän potilaan ennusteeseen [5], suoritimme immunohistokemiallista analyysiä BT3.2 proteiiniekspressiossa suuren kohortin 199 korkealaatuista serous EOC potilaiden ja vahvisti yhdistyksen BT3.2 ja ennusteen EOC potilaista. Samanaikaisesti olemme analysoineet tiheys kasvaimensisäisenä immuunisolujen ja löysi positiivinen korrelaatio BT3.2 ilmentymistä EOC solut ja kasvaimensisäisenä infiltraatiota T-solujen, kun taas korkea CD206 + /CD68 + ilme suhde liittyi lyhyemmän tautivapaan elinajan. Nämä tulokset viittaavat rooli BT3.2 kasvaimen immuunisolujen soluttautumista.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

Ethics hyväksyntä saatiin paikallisen institutionaalisten eettisten lauta (Comité d’éthique de la recherche du Centre hospitalier de l’Université de Montréal). Kasvaimen kerättiin ja varastoitujen asianmukaisten kirjallinen suostumus leikkauspotilaiden sisällä onkologian osasto Centre Hospitalier de l’Université de Montréal vuodesta 1993 vuoteen 2010.

Potilaille ja kudosnäytteiden

kasvain kerättiin ja varastoitujen asianmukaisten suostumusta leikkauspotilaiden sisällä Division of gynecologic Oncology Centre Hospitalier de l’Université de Montréal vuodesta 1993 vuoteen 2010. riippumaton patologi sai kasvaimen ja vaihe ja gynekologista onkologi sai kasvaimen jäljellä psoriaasioireet perusteiden kansainvälisen liiton gynekologien ja synnytyslääkärit [25]. Alle 10% näytteen suljettiin laatuun, ja tämä ei korreloi iän näytteen. Kliiniset tiedot etenemisestä vapaa väli määriteltiin mukaan skannata kuvantamisen ja veren CA125 [26]. Kokonaiselossaoloaika määriteltiin aika leikkauksesta kuoleman munasarjasyöpään. Potilaita, joiden tiedetään olevan vielä elossa klo analyysin sensuroitiin heti viimeisen seurannan. Potilaan sairaus elinaika (DFS) laskettiin leikkauksen aikana, kunnes ensimmäinen etenemiseen. Tukikelpoisuusvaatimukset sisällyttämistä tutkimuksessa olivat seuraavat: ei leikkausta edeltävän kemoterapeuttisen hoito munasarjasyöpä, platina-pohjainen postoperatiivinen solunsalpaajahoitoa, korkealaatuista kasvaimet, serous histopatholgy alatyyppi ja valmistunut tietoon perustuvan suostumuksen. Kaikki potilaat saivat platinapohjaisen kemoterapian alustavana hoito leikkauksen jälkeen kanssa exeption potilaiden kuoli pian ( 3 kk) leikkauksen jälkeen. Potilaat, jotka kuolivat toinen sairaus sensuroitiin ajankohtana viime seurannan. Gynekologista onkologi tarkastelivat kliiniset tiedot kaikille potilaille. Sillä taudista vapaan etenemisen tutkimuksessa, vain potilaille, joilla on kliinistä seurantaa vähintään 18 kuukauden ajan tai kunnes tauti uusiutuu olivat mukana. Ominaisuudet kasvaimia ja potilaan lopputulokseen näytejoukoille on koottu taulukkoon 1.

Soluviljelmät ja solupellettien vuonna Histogel

todentamiseksi Spesifisyyttä on BT3.2 vasta TOV-112D-solut ja solulinjat viljeltiin OSE väliaineessa (50:50 sekoitus 199 ja 105 Sigma väliaineet), jota oli täydennetty 0,5 ug /ml amfoterisiini B: tä, 50 ug /ml gentamysiiniä ja 10% FBS (sikiövasikan seerumi). Peräisin olevat solut media täydennettiin myös 0,5 ug /ml puromysiiniä. Soluja pidettiin inkubaattorissa kostutetussa 37 ° C: ssa ilmakehässä, joka sisälsi 5% CO2: ta olennaisesti, kuten on kuvattu [27]. Solut pelletti parafiiniin valmistettiin aikaisemmin kuvatulla [28].

Plasmidit

BT3.1, BT3.2 ja BT3.3 sekvenssit alakloonattiin pef6v5 vektorit ja olivat antelias lahja tohtori Rhodes (Cambridge, UK) [7]. Kaikki plasmidit varmistettiin sekvensoimalla. BT3 isoformi sekvenssit PCR-monistettiin ja subkloonattiin pENTR ™ /D-TOPO® (Invitrogen, Carlsbad, CA), ja sitten rekombinoida Plenti-CMV /TO-puoDest (ABgene) [29]. Lentivirusvektorikonstruktit hiukkasia tuotannon ja solujen infektio suoritettiin kuten aiemmin raportoitu [30].

Tissue Microarray

Alueet kasvaimen valittiin perustuen uudelleentutkimiselle hematoksyliini- eosiini-värjättyä dia. FFPE kasvainkudospalasta Sitten koepala käyttäen 0,6 mm kudoksen ryhmittäjällä ja tuloksena ytimet puettu ruudukoksi vastaanottajassa parafiiniblokkiin. Kudos joukko koostui 260 munasarjasyövän näytteet ja 11 näytteitä alueiden normaalista munanjohtimet syöpäpotilaita. Sen jälkeen kun tarkastelun kliinisiä tietoja 61 potilasta jätettiin loppujen lopuksi, koska ne eivät täyttäneet kriteerit. Tämä kudos array sitten leikattiin, värjättiin hematoksyliinillä-eosiinilla ja sai toisen patologian tarkastelu vahvistaa kasvaimen sisältöä.

immunohistokemia (IHC) B

Formaliinifiksoidusta parafiiniin upotettuja kasvaimet leikattiin 4 um ja objektilasit värjättiin manualy penkillä tai käyttämällä BenchMark XT automatisoitu värjäyslaitteesta (Ventana Medical System Inc.). Manuaalisessa menetelmässä, kudosleikkeet kuumennettiin lyhyesti 50 ° C: ssa 15 minuuttia, parafiini tolueeniin ja niihin lisätään etanolia kaltevuus. Objektilasit upotettiin Tris-EDTA-puskuriin (10 mM Tris-emästä, 1 mM EDTA pH säädettiin arvoon 9,0) ja paine keitetty 15 minuuttia paljastamaan antigeenejä. A 0.6 tai 3% H

2O

2 Hoitona käytettiin poistamaan endogeenisen peroksidaasin. Kohdat blokattiin proteiinin esto seerumitonta reagenssia (DakoCytomation Inc., ON, Kanada) ja inkuboitiin eri vasta-aineen 60 tai 120 minuuttia huoneenlämpötilassa. Optimaalinen pitoisuus primäärienergialähteittäin vasta-aine määritettiin sarjalaimennoksia. Vasta-aineet ja IHC ehdot on esitetty taulukossa S1. Kudoksia inkuboitiin vuohen anti-hiiri-HRP-konjugoitu vasta-aine (1:150) (sc-2005, Santa Cruz Biotechnology, CA, USA). Sillä BT3.2, kudoksia inkuboitiin sekundäärisen biotinyloitua vasta-ainetta (DakoCytomation Inc., ON, Kanada) 30 minuuttia, mitä seurasi inkubaatio streptavidiini-peroksidaasi-kompleksia (DakoCytomation Inc., ON, Kanada) 30 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Reaktiotuotteet kehitettiin käyttämällä diaminobentsidiinitetrahydrokloraattia sisälsi 0,3% H

2O

2 kuin peroksidaasisubstraatilla. Tumat vastavärjättiin hematoksyliinillä. Automatisoidulla värjäyslaitteesta, antigeeni haku uudelleen CD206 ja CD4 toteutettiin Cell Conditioning 2 (VMSI; # 950-123). Esilaimennetusta vasta-aine valuu automaattisesti, ja laseja inkuboitiin 37 ° C: ssa 30 minuutin ajan. UltraView DAB havaitseminen pakki (VMSI; # 760-091). Objektilasit vastavärjättiin hematoksyliinillä (VMSI; # 760-2021). Kaikki osat havaittiin valomikroskoopilla 400 kertaisella suurennuksella. Vaihdosta primaarisen vasta-aineen kanssa fosfaattipuskuroitua suolaliuosta ja toimi negatiivisena kontrollina.

Immunofluxorescence (IF) B

formaliinilla parafiiniin kasvaimia värjättiin manualy jälkeen antigeeni haku Tris-EDTA: ta (10 mM Tris emästä, 1 mM EDA säädettiin pH-arvoon 9,0) 15 min pressur liesi. Kohdat blokattiin proteiini estää seerumitonta reagenssia (DakoCytomation Inc., ON, Kanada) ja inkuboitiin anti-CD68-vasta-aineita 90 min ajan huoneen lämpötilassa. Kudoksia inkuboitiin sitten vuohen anti-hiiri-Cy5 (1/200) 45 min. Hiiren IgG-vasta-aineita estettiin sitten yön yli M.O.M. ™ reagenssilla (Vector Laboratories, Burlingame, CA). Anti-CD206-vasta-aineita inkuboitiin 90 minuuttia huoneen lämpötilassa. Kudoksia inkuboitiin sitten vuohen anti-hiiri Alexa Fluor A488 (1/250) 45 minuuttia ennen pesua ja hoitoa 0,1% Sudan black B 10 min vähentämiseksi autofluoresenssia. Objektilasit vastavärjättiin ProLong® kulta mikroskooppipreparaatin haalistumista estävää loisteputki kiinnitysväliaineet DAPI (Molecular Probes). Lukema suoritettiin mikroskoopin analyysi suurella teholla ja sen jälkeen kaksi immunoflourescent värjäytyminen arvioitiin vahvistettavaksi.

Värjäys Kvantifiointi

tuumorisektioiden skannattiin ja digitaalisesti visualisoida. Sillä BT3.2, epiteelin vyöhykkeitä pisteytettiin mukainen värjäytymisen intensiteetti epiteelikalvo (arvo 0 poissaolon, 1 heikko, 2 kohtalainen, 3 korkean intensiteetin), kuten on esitetty kuviossa 1. ydintä, jossa värjäytyminen oli muuttuva intensiteetti keskimääräinen intensiteetti oli raportoitu. Kvantifiointi tunkeutuvia lymfosyyttejä toteutettiin laskemalla Tumallisten solujen positiivisella värjäyksellä intraepiteliaalisten luotoa. Tulokset sitten luokiteltiin 0 (ei soluja), 1 (0 n 10), 2 (10 n 90) ja 3 (n 90) vastaavasti on solujen lukumäärä laskettiin. Määrällinen makrofagien suoritettiin arvioimalla prosenttiosuus värjättiin solujen intraepiteliaalisten alueella. Suhteellinen tiheys CD206 + -solujen on laskettu suhde CD206 + /CD68 + värjäytyneiden solujen. Jokainen järjestelmä on itsenäisesti analysoitiin sokea tutkimuksessa kaksi riippumatonta tarkkailijaa. Inter-luokitus korrelaatio oli 75%. Kun vahva eroja pisteytys kahden tarkkailijaa (yli 1 yksikkö per ydin) esiintyi ydin arvioitiin uudelleen saavuttaa yhtäpitäviä pisteytys välillä kaksi tarkkailijaa. Keskimääräinen kaikki ytimet, joilla on syöpä samasta potilaasta käytettiin analyysiin.

. Western-blot-analyysi kokonaisproteiinia otteita TOV112D solulinjasta infektoitiin Plenti (vektorisäätö), BT3.1, BT3.2 tai BT3.3 virus- konstruktioita. Uutteet ladattiin kolmena rinnakkaisena 10% SDS /PAGE-geelillä ja kalvot hybridisoitiin anti-CD277 (eBioscience), anti-BT3.3 (Atlas vasta-aineet) ja anti-BT3.2 (SDIX Inc.), kuten alaosassa hahmo. B. Immunohistokemia analyysi parafinoidut solujen pelletit TOV112D solulinja infektoitiin joko Plenti (vektori-ohjattu), BT3.1, BT3.2 tai BT3.3 viruksen konstrukteja. Ainoastaan ​​solut, jotka on transfektoitu BT3.2 konstrukti värjäytyivät positiivisesti anti-BT3.2 (SDIX Inc.). C. immunohistokemia of ksenograftikasvaimissa peräisin TOV112D transfektoitiin joko tyhjällä vektorilla tai BT3.2 konstruktio. Ainoastaan ​​solut, jotka on infektoitu BT3.2 konstrukti värjäytyivät positiivisesti anti-BT3.2 (SDIX Inc.). D. edustaja värjäystä immunohistokemiaan of BT3.2 on korkealaatuinen vakavasta EOC TMA. Vasemmalta oikealle: negatiivinen, matala, kohtalainen ja korkea intensiteetti.

Western Blot analyysi

Solut hajotettiin kylmällä hajotuspuskuria (10 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT /1 mM NaF: ää /0,5% NP-40 /ja proteiinin inhibiittorit) ja sentrifugoitiin 10 minuutin ajan 13000 rpm. Clear lysaatit sitten keitettiin latauspuskurissa, erotettiin 10% SDS-PAGE ja siirrettiin nitroselluloosakalvolle. Kalvot kyllästetty 5% maito /PBS /0,1% Tween 20 immunodetektio tehtiin kuvatulla protokollan ECL (Amersham Pharmacia): eli inkuboitiin 2 tuntia huoneenlämpötilassa tai O /N 4 ° C: erityisten vasta-aine, pestiin PBS /Tween 0,01% ja inkuboitiin vielä 30 min huoneenlämmössä peroksidaasiin konjugoitu vasta-aineita (Santa-Cruz Biotechnology Inc.). Western-blot-analyysi suoritettiin beeta-aktiini AC-15 (ab6276 päässä Abcam inc. MA, USA), anti-CD277 /BT3.1 (# 14-2779 päässä eBioscience, San Diego, CA, USA), anti-BT3 0,2 (SDIX, Newark DE, USA), anti-BT3.3 (HPA007904, Atlas Antibodies, Tukholma, Ruotsi). Kokeet tehtiin kolmena kappaleena.

Tilastollinen analyysi

Pearson korrelaatio koe (kaksisuuntainen) käytettiin arvioitaessa korrelaatio kliinis-patologinen muuttujat ja merkit kuten jatkuvia muuttujia. Survival käyrät piirrettiin käyttäen Kaplan-Meierin käyrä analyysi ja log-rank-testiä käytettiin testaamaan merkittäviä eroja. Vastaanottimesta (ROC) käyriä käytettiin määrittämään raja-arvo kunkin markkerin vastaavat parhaita herkkyys ja spesifisyys potilaan etenemisen ennen 18 kuukautta (varhainen taudin etenemisen) tai 20 kuukauden aikana (myöhäinen taudin etenemiseen) alkuperäisestä diagnoosista (p 0,05 ja alue 0,60) kuten jo raportoitu [5]. Yhden ja usean Coxin suhteellisen vaaran malleja käytettiin arvioitaessa riskisuhde kunkin merkkiainetta jatkuvia muuttujia. Monimuuttujamenetelmin tehtiin käyttäen eteenpäin vaiheittain riskin malliin yhden muuttujan analyysiin, tuloa varten tarvittavat malliin. Vain neljä muuttujia kuten monimuuttujakalibrointiin Coxin regressiomallin välttää yli istuva. Monimuuttuja-analyysi suoritettiin käyttäen tulla riskin malliin. Näytteen koko (n 100 jossa n = 10k /p) ja normaali jakelu BT3.2 ilmaisun katsottiin ennen kuin Coxin malli. Kaikki tilastolliset analyysit tehtiin käyttäen Statistical Package for Social Sciences ohjelmistoversio 11.0 (SPSS, Inc.), ja tilastollinen merkitsevyys asetettiin

P

0,05.

Tulokset

ilmentäminen BTN3A2 /BT3.2 vuonna EOC kudokset

tutkimiseksi yhdistyksen välillä on BT3.2 ilmentymisen EOC soluissa ja potilaiden eloonjäämisen, suoritimme immunohistokemiallista analyysiä kohortin 199 korkealaatuisesta serous munasarjojen syöpäpotilailla. Ensin arvioitiin spesifisyys saatavilla vasta-aineita BT3 isoformeja. Olemme löytäneet 3 eri vasta-aineita on kaupallisesti saatavilla: anti-CD277 (eBioscience Inc.), anti-BT3.3 (Atlas) ja anti-BT3.2 (maasta SDIX Inc.). Vasta-aineet testattiin western blotting solu- otteita TOV112D munasarjasyövän solulinja infektoitiin joko BT3.1 tai BT3.2 tai BT3.3 retroviruspartikkeleihin. Kuten kuviossa 1A, anti-CD277 tunnustettu BT3.1 ja BT3.2 isoformit. Kuten odotettua, anti-BT3.3-vasta yksinomaan tunnisti BT3.3 isoformia ja anti-BT3.2 tunnusti nimenomaan BT3.2 isoformin. Vahvista spesifisyys anti-BT3.2 vasta-aineella parafiiniin kudoksiin, myös analysoineet värjäytymisen parafinoidut solupelletteinä ja Ksenograftikudoksista alkaen 112D TOV transfektoitu joko tyhjällä vektorilla tai BT3 isoformin konstruktioita. Kuten nähdään kuviossa 1B ja 1C, anti-BT3.2-vasta-aine kykeni värjäämään ainoastaan ​​BT3.2 solupelletti ja BT3.2 ksenograftin kasvaimen.

ja sytoplasman ilmentymisen BT3.2 munasarjasyövän kudosten havaittiin ja teki mukaan värjäytymisen intensiteetti poissaolevaksi, alhainen, kohtalainen tai vahva (0, 1, 2, 3 vastaavasti) (kuvio 1 D). Läsnäolo BT3.2 proteiinin havaittiin epiteelisoluissa ja tietyissä kudoksen ytimet, se voisi myös löytyä strooman. Lähes kaikki EOC ytimet (n = 193, 97,5%) osoitti ilmentymisen BT3.2. Epiteelisolujen, sekä soluliman ja kalvon värjäytymistä nähtiin (kuvio 1 D) ja vaihteli poissa vahva (kuvio 1D, taulukko 1). Epiteelin BT3.2 ekspressiotasot eivät korreloi merkitsevästi potilaan ikä diagnoosin tai kasvaimen. Sitä vastoin potilailla, joilla on korkeampi epiteelisolujen BT3.2 yleensä alhaisempi jäljellä taudin ja alempi edennyt sairaus (p = 0,058 ja p = 0,043, taulukko 2).

BT3. 2 Protein Expression liittyy Kaiken Survival ja Tautivapaa eteneminen

Olemme aiemmin tutkineet suhde BT3.2 mRNA ilmaisun ja munasarjasyövän potilaan ennustetta. Kaplan-Meier ja Coxin suhteellisen riskin malliin käytettiin arvioida yhdistyksen välillä BT3.2 mRNA ja ennusteen määrittelemien kokonaiselossaoloaika tai tautivapaan elinajan (DFS) 18 kuukauden kuluttua leikkauksesta [5]. Esillä olevassa tutkimuksessa tutkimme onko BT3.2 proteiini voisi olla myös ennusteen arvioinnissa. Tätä varten proteiinin ilmentymistä BT3.2 analysoitiin 199 korkealaatuista serous potilaiden ja tilastolliset analyysit tehtiin osalta kokonaiselossaolo ja DFS. Kohortti ominaisuudet on kuvattu taulukossa 1.

Kaplan-Meier käyrät osoittivat, että siellä oli vahvan yhteyden korkea ilmentymisen BT3.2 proteiinin ja kasvanut potilaan eloonjäämisen (p = 0,014; log rank = 6,03) ( kuvio 2A). Mean selviytyminen väli oli 85 kuukautta potilailla, joilla on korkeampi BT3.2 ja 59 kuukautta potilailla, joilla on alhainen BT3.2. Samoin potilailla, joilla on korkeampi ilmaus BT3.2 oli keskimääräinen etenemistä välein 86 kuukautta verrattuna 55 kuukautta potilailla, joilla on alhainen ilmentyminen BT3.2 (p = 0,002, log rank = 9.65) (Kuva 2B).

Kaplan-Meier käyrät kokonaiselinaika (A) ja taudista vapaan eloonjäämisen (B) 194 ja 171 potilaista. Merkitys (s) on merkitty log rank.

yhden muuttujan Coxin regressioanalyysi, jatkuva taso BT3.2 proteiinin arvioitiin heijastaa suhdetta lisääntyneisiin BT3.2 ilmaisun ja parannetun ennusteen . Tässä analyysissä lisääntynyt ilmentyminen BT3.2 liittyi suhteellisen suuren vaaran riskin (HR) eloonjäämisestä (HR = 0,651, 95% luottamusväli +0,479-,884, p = 0,006, taulukko 3). Samoin lisääntynyt BT3.2 ilmentyminen merkitsevästi yhteydessä myöhemmin sairauden etenemiseen (riskisuhde = 0,642,% 95CI ,483-0,853, p = 0,002) (taulukko 3).

Coxin monimuuttuja regressioanalyysi, kun standardi ennustetekijöitä muuttujia tehtiin (ikä, vaihe ja jäljellä tauti), BT3.2 pysyi itsenäinen muuttuja ennustavat suuri riski selviytymisen (HR = 0,597,% 95CI ,415-,859, p = 0,005) ja myöhäinen etenemisen riski tässä monimuuttuja mallissa (HR = 0,675% 95CI 0,487-0,935, p = 0,018) (taulukko 3).

Suhde BT3.2 Expression and Immune Infiltrate

arveltu, että suhde epiteelin BT3. 2 ilme ja hyvä ennuste johtui vaikutusta kasvaimeen infiltroivien immuunisolujen, koska tiedetään, että B7-molekyylit ovat yhteistyössä sääntelytoiminnot T-soluissa. Lisäksi taso kasvaimensisäisenä immuunisolujen infiltraatio on liittynyt ennuste munasarjasyöpä potilaiden [31]. Tutkia tätä hypoteesia, arvioimme immunohistokemialla läsnä T-solujen CD3 +, CD4 + ja CD8 + värjäytymistä samalla TMA käytetään BT3.2 analyysiä. Olemme myös arvioinut, millainen merkitys kasvaimensisäisenä B-solujen (CD20 +) ja makrofagi (CD68 +) tunkeutuminen. Kaksi luokkaa makrofagien on kuvattu, anti-kasvaimen (M1) ja pro-kasvaimen (M2). Koska useimmissa kasvaimia, kasvaimeen liittyvä makrofagit (TAM) on M2-fenotyyppi [32], [33], määritimme tiheys soluttautua CD206 + solujen korvikemarkkerina vaihtoehtoisten pro kasvaimen M2 makrofagit, koska ne ovat yleensä ilmaista korkeampia taso CD206 merkki kuin M1 makrofageja. Vahvista spesifisyyden CD206 ilmentymisen makrofagien EOC kasvaimissa, teimme ohjaus kaksinkertainen immunofluoresenssivärjäyksellä rajalliseen määrään kudoksia (kuva S1). CD206 ilmentyminen lähes aina yhdessä paikallistaa CD68 ekspressio viittaa siihen, makrofagien ilmaisua.

Kuten kuviossa 3 ja kuviossa 4A-B, immuuni tunkeutumisen T-solujen, B-solujen ja TAM havaittiin EOC kudoksissa eri tiheydet intraepiteliaalisten alueet. Intraepiteeliset infiltraatio T-solujen CD3 +, CD4 + ja CD8 +, korreloi voimakkaasti läsnä CD20 + B-solujen (p 0,001), ja CD68 + makrofagien (P 0,001), kuten CD206 + soluja (taulukko 4). Intraepiteeliset infiltraatio B-solujen liittyi myös läsnäolon CD68 + ja CD206 + -solujen (r = 0,364 ja r = 0,171, p 0,001 ja p = 0,022, vastaavasti). Mielenkiintoista on, että osa CD206 + -solujen suhteessa koko tiheys CD68 + makrofagien, suhde CD206 + /CD68 + ilmentymistä, oli korreloi käänteisesti läsnä CD3 + T-solujen ja yleensä korreloi läsnä B-solujen (r = -0,216, p = 0,005 ja r = -0,141, p = 0,063, vastaavasti) (taulukko 4).

Merkittävää on, että ilmaus BT3.2 EOC solujen korreloi intraepiteliaalisten tunkeutumisen CD3 + -solujen (r = 0,174 , p = 0,018), mukaan lukien CD8 + -soluja (r = 0,176, p = 0,018), ja CD4 + -solujen (r = 0,272, p 0,001). Mitään merkittävää korrelaatiota BT3.2 ilmaisun ja läsnäolon CD20 + solujen tai makrofaagien havaittiin (p = 0,137, taulukko 4).

korkean ja alhaisen tiheyden CD3 + (T-solut), CD4 + (T-solut), CD8 + (T-solut) ja CD20 + (B-solujen) näkyy vasemmalla ja keskellä paneelit. Suurennos korkean tunkeutumisen alue näkyy oikealla paneelin jokaisen värjäystä.

Association of kasvaimensisäisiä Lymfosyytit, makrofagien ja EOC potilasennuste

Kuten raportoitu muut [ ,,,0],31], kun läsnä CD4 + soluja korreloi käänteisesti varhain sairauden etenemiseen (r = -0,187, p = 0,021, taulukko 5). Kaplan-Meier käyräanalyysi ja log rank testi vahvisti, että korkea intraepiteliaalisten tiheys CD4 + liittyi parempaan ennusteeseen (taulukko S2). Keskimääräinen etenemistä välein potilailla, joilla on korkea intraepiteelisiin CD4 + solut oli 69 kuukautta verrattuna 59 kuukautta potilailla, joilla on alhainen intraepiteliaalisten CD4 + tiheys (p = 0,011, log rank = 6,5). Emme kuitenkaan eivät havainneet mitään merkittävää yhdistyksen välillä intraepiteliaalisten tiheyden CD3 + tai CD8 + solujen ja potilaan ennustetta (taulukko 5 ja taulukko S2). Löysimme Merkitsevä yhteys CD20 + infiltraatiota ja kokonaiselinaikaa (log rank p = 0.039), kun taas vain suuntaus kohti parempaa tautivapaan elinajan saatiin (log rank p = 0,0677). Kuitenkin yhdessä eloonjäämisaste ei nähty, kun CD20 + pidettiin jatkuvana muuttujana Yksiulotteisissa Coxin regressiomallin (p = 0,21).

Vaikka emme havaita korrelaatio tiheyden CD68 + tai CD206 + -soluja ja potilaan ennuste (taulukko 5), lisääntynyt suhde CD206 + suhteessa CD68 + soluihin korreloi positiivisesti sairauden etenemiseen (r = 0,157, p = 0,049, taulukko 5). Tämä suhde vahvistettiin Kaplan-Meier käyräanalyysi (p = 0,005, log rank = 7,83, kuvio 4D, taulukko S2) ja yhden muuttujan Coxin regressioanalyysiä (HR = 1,355, 95% luottamusväli 1,223-5,332, p = 0,044). Lisäksi CD206 + suhteellinen tiheys oli taipumus yhdistää huono kokonaiselinaikaa (log rank = 3,53, p = 0,06) (kuvio 4C, taulukko S2), jossa riskisuhde 2,077 (% CI 95, 0,947-4,558, p = 0,068).

korkean ja matalan tiheyden CD68 + (kasvaimeen liittyvät makrofagit, TAM) (A) ja CD206 + (M2 alatyyppi TAM) soluja (B). Suurennus korkean tunkeutumisen alue näkyy oikealla paneelin jokaisen värjäytymistä (ylhäällä). C ja D. Kaplan-Meier-analyysi suhde tunkeutumisatmosfääri intraepiteliaalisten CD206 + /CD68 + -soluja, jotka edustavat suhteellinen tiheys CD206 + M2 TAM yli koko tiheys CD68 + intraepiteliaalisten tunkeutumisatmosfäärin makrofageissa. Kaplan-Meier käyrät kokonaiselinaika (C) ja taudista vapaan eloonjäämisen (D) 180 ja 174 potilaista. Merkitys (s) on merkitty log rank.

Keskustelu

Tässä tutkimuksessa immunohistokemia paljasti BTN3A2 /BT3.2 värjäytymistä korkealaatuisesta EOC serous kasvaimet 199 potilailla. Ilmentymistä havaittiin korkealla taajuudella (97,5%) mukaisesti aiempien tietojen analysointi mRNA: n ekspression serous EOC kudoksissa [5]. Tärkeä näkökohta tässä tutkimuksessa on vahvistus BT3.2 mahdollisena prognostinen merkkiaine korkealaatuisesta serous EOC proteiinitasolla. Alustavassa tutkimuksessa tunnistetaan BT3.2 mRNA ennustetyövälineenä markkeri oli rajoitettu suhteellisen pieni joukko 52 tapausta. Täällä ei vain me vahvistanut suhdetta BT3.2 ja parempiin tuloksiin suuren ikäluokan, vaan myös proteiinin tasolla immunohistokemiallisesti. Tämä muodostaa helpommin siirrettävissä tekniikka kliinisessä patologian osastolla kuin mRNA havaitsemiseen kuten Q-PCR. Potilaat, joilla on korkea epiteelin värjäytymisen BT3.2 oli 1,53 kertaa pienempi riski kuolla tautiin kuin potilailla, joilla on alhainen BT3.2 ilmaisua. Yhdistys BT3.2 selviytymiseen ja taudin etenemiseen oli itsenäinen parametrin sisällä Coxin monimuuttuja-regressioanalyysiä (taulukko 3). Yhdistäminen muiden riippumattomien molekyylimarkkereina voisi parantaa kliinistä suorituskykyä mennessä mikään yksittäinen merkki on osoittanut riittävän herkkä ja spesifinen.

rajoitus Tutkimuksemme on pieni määrä potilaita, joilla ei ole jäljellä tauti (n = 23) , joka ei salli meidän analysoida niitä itsenäisenä kohortin. Optimaalisesti rajatusta potilailla, yleinen on parempi ennuste kuin potilailla, joilla on jäljellä taudin [34], joille ennustetyövälineenä biomarkkereiden voi olla vähemmän tietoa.