Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

MikroRNA (miRNA) ovat pieniä, ei-koodaavaa RNA: t (ribonukleiinihapoista), jotka säätelevät käännös. Useita miRNA on osoitettu muuttaa kokonaan syöpäkudoksessa verrattuna normaaliin kudokseen, kun kvantitoitiin mikrosirulla. Aiempien tällaisia ​​todisteita differentiaalikaavojen, päätimme tutkia toiminnallista merkitystä miRNA

miR-30a

ja

-191

muutoksia ihmisen keuhkosyöpä.

Menetelmät /Keskeiset havainnot

toiminnallinen merkitys miRNA

miR-30a

ja

-191

tutkittiin luomalla vakaa transfektantteja keuhkon adenokarsinooman A549 ja kuolemattomaksi keuhkoputken epiteelisolujen line BEAS-2B vaatimaton yliekspressioon

miR-30a

tai

-191

käyttäen lentivirus järjestelmää. Kun verrataan vastaaviin kontrolleja sekä solulinjoissa yli-ilmentävät

miR-30a

tai

-191

eivät osoita mitään merkittäviä muutoksia solusyklin jakeluun, solujen lisääntymistä, joka tarttuu pesäkemuodostusta, pehmeä agar siirtomaa muodostus, ksenografti muodostumista ihonalaisen SCID hiirimallissa, ja huumeiden herkkyys doksorubisiini ja sisplatiini. On vaatimaton kasvu soluvaelluksen solulinjoissa yliekspressoivat

miR-30a

verrattuna niiden valvontaa.

Johtopäätökset /merkitys

yli-ilmentyminen

miR-30a

tai

-191

ei johda muutokseen solusyklin, lisääntymistä, ksenografti muodostumista, ja kemosensitiivisyys A549 ja BEAS-2B solulinjoissa. Käyttämällä microarray tietoja koko kasvaimista valita tiettyjä miRNA toiminnallinen tutkimus saattaa olla optimaalinen strategia.

Citation: Patnaik SK, Kannisto E, Yendamuri S (2010) yli-ilmentyminen MicroRNA

miR-30a

tai

miR-191

A549 keuhkosyövän tai BEAS-2B Normal Lung Cell Lines ei muuta fenotyyppiin. PLoS ONE 5 (2): e9219. doi: 10,1371 /journal.pone.0009219

Editor: Mikhail V. Blagosklonny, Roswell Park Cancer Institute, Yhdysvallat

vastaanotettu 11 joulukuuta 2009; Hyväksytty: 24 tammikuu 2010; Julkaistu: 15 helmikuu 2010

Copyright: © 2010 Patnaik et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukee tutkimusta avustusta Torakaaliikirurgia Foundation for tutkimus ja koulutus sekä syövän ja Leukemia Group B; SY tukee apurahan päässä Buswell Foundation. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

merkitys ei-koodaavan RNA: iden säätelyssä soluprosesseihin on tullut yhä enemmän arvostaa [1]. Parhaiten tutkittu ei-koodaavat RNA: t ovat MikroRNA (miRNA), 18-25 nt pitkä pieni RNA, joka epigeneettiseltä säätelevät käännös sitoutumalla täydentävä ”siemen” yhteinen sekvenssi niiden ”kohde” mRNA [2]. Koska tämä täydentävyys ei tarvitse olla täydellinen, yksi miRNA voi säätelemään useita satoja geenejä samanaikaisesti [3]. Räjähdys sirutekniikalla on johtanut sen soveltamista miRNA genomiikan. Näin ollen, ennen kuin toiminto huomattava osa miRNA tiedettiin, miRNA profilointi useita normaalin ja epänormaalin ihmisen kudokset on tehty [4]. Erillinen välinen ero saadut välillä miRNA profiloinnin ja mRNA profilointi on suuruus differentiaalikaavojen vertailussa nähdään ryhmissä. Useat kertaiseksi muutoksia yleisesti nähtävissä mRNA ilmaisun näiden teknologioiden, taitteen muuttuu miRNA kokeet ovat vaatimattomia ja ovat tyypillisesti 1- ja 2-kertainen alue. Siksi kokeita tutkia biologista merkitystä näitä vaatimattomia kertainen muutokset ovat tärkeää arvioida Näiden muutosten merkitystä. Perustuen aiemmin julkaistu miRNA microarray tiedot, jotka osoittavat eroja ilmaisun ihmisen syövissä verrattuna vastaavaan normaaliin kudokseen, kaksi miRNA valittiin tässä tutkimuksessa tällaista biologinen kokeiluja. Nämä kaksi miRNA valittiin siksi, että johdonmukainen muutoksia niiden ilmaisun välillä normaalin ja syöpäkudoksen eri elinten, bio-tietotekniikkaan analyysi ennakoiduista tavoitteita, jotka ehdotettu tärkeitä rooleja solujen lisääntymisen ja muuttoliike ja vähän julkaistua työtä niiden toiminnallisten roolien keuhkosyövän .

miR-30a

sijaitsee ihmisen kromosomissa 6q.13 ja tuotetaan introni- -transkriptioyksikön joka tuottaa kolme miRNA:

miR-30a

,

-30C

ja

-30e

[5]. Kaksi kypsät muodot geenin olemassa –

miR-30a-3p

ja

miR-30a-5p

. Useissa tutkimuksissa on havaittu muutoksia

miR-30a

ilmentymistä ihmisen syövässä. Calin et ai. osoitti alas-säätely

miR-30a

kroonisen lymfaattisen leukemian (KLL) potilasta [6]. Vastaavasti

miR-30a

on säädellä vähentävästi keuhkosyövän [7], paksusuolen syöpä [8], haimasyöpä [9], metastaattinen hepatosellulaarinen syöpä (verrattuna ensisijainen) [10] ja akuutti myelooinen leukemia (AML) sairastavien potilaiden at (11q23) translokaatio (verrattuna muihin AML potilasta) [11].

MiR-30a

on tärkeää kehityksen kannalta etuaivokuoren kautta sääntely brain-hermokasvutekijä (BDNF) [12] ja selkärankaisten sappiteiden kehittämiseen [13]. Muut kokeellisesti vahvistettu tavoitteet

miR-30a

ovat adenylaattikinaasi (AK1) ja GW182 proteiini (Tnrc6a), komponentti RNA interferenssin hiljentäminen monimutkaisia ​​[13].

MiR -191

sijaitsee ihmisen kromosomissa 3p21.31 ja tuotetaan introni- transkriptionaalisen yksikön, joka voi tuottaa kaksi miRNA:

miR-191

ja

-425

[5]. Vain yksi kypsä muoto

miR-191

tiedetään esiintyvän.

MiR-191

ilmentymistä säädellään ylöspäin haiman [14], paksusuoli-, keuhko- ja eturauhassyövän [7] syöpiä. Se on myös säädellään ylöspäin AML potilailla, joilla on epänormaali karyotyyppejä [11], ja alassäädetty KLL-potilailla [6].

MiR-191

ilmentyminen myös muuttunut keuhkot altistuvat tupakansavulle [15]. Ei mRNA tavoitteet

miR-191

on kokeellisesti todistettu.

Tässä tutkimuksessa arvioimme fenotyypin muutosten nähdä konstitutiivinen ilmentyminen

miR-30a

ja

-191

, on keuhkojen adenokarsinoomasolulinjasta (A549) [16] ja kuolemattomaksi keuhkoputken epiteelisolujen linja (BEAS-2B) [17]. A549-solulinja valittiin siksi, että on olemassa suuri määrä kokeellista tietoa sen käytettäväksi erilaisissa määrityksissä. Beas-2B-solulinja valittiin, koska se on immortalisoitu solulinja lähinnä normaalia keuhkoputken epiteelissä. Koska vaikutukset yliekspressio mikroRNA on asiayhteyskohtaisia ​​vertasimme muutoksia fenotyypin pahanlaatuisten ja ei-pahanlaatuisten solujen.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

kaikki in vivo tutkimuksissa hyväksyi Institutional Animal Care ja käyttö komitea Roswell Park Cancer Institute.

Cell Culture

A549 ihmisen bronchioloalveolar keuhkokarsinooma sekä BEAS-2B normaali keuhkoputken epiteelisolujen linjat olivat saatu ATCC® (Manassas, VA). Soluja viljeltiin vastaavasti Dulbeccon Modified Eagle Medium (+ DMEM; Invitrogen®, Carlsbad, CA), jossa oli 10% naudan sikiön seerumia (PAA Laboratories®, Itävalta), ja LHC-9-alustassa (Invitrogen®) 37 ° C: ssa 5% CO

2. Stabiilisti transfektoituja soluja viljeltiin, kun läsnä oli 2 ug /ml puromysiiniä (Roche®, Indianapolis, IN).

Generation of stabiilisti transfektoituja solulinjoja

yksisäikeinen DNA-oligonukleotidit, joissa ihmisen

pre-miR-30a

tai

-191

(miRBase liittymisen tunnukset MI0000088 ja MI0000465, vastaavasti) sekvenssit ja restriktioentsyymin ulokkeet saatu Integrated DNA Technologies® (Coralville, IA). Komplementaariset sekvenssit hybridisoitiin ja tuloksena kaksijuosteista DNA: ta ligoitiin Xho I /Not I: llä pilkottuun pLemiR ™ -vektoriin (Open Biosystems®, Huntsville, AL). A549-soluja infektoitiin sitten plasmideja käyttäen Trans-Lentivirusvektorikonstruktit ™ GIPZ pakkaus järjestelmä (Open Biosystems, Huntsville, AL) mukaan valmistajan protokollaa. Lyhyesti, TLA-HEK293TTM-solut transfektoitiin käyttäen pidätys-In ™ ja 37,5 ug plasmidi-DNA: seerumittomassa väliaineessa 4 tunnin ajan. Media korvattiin sitten seerumia sisältävässä väliaineessa 36 tunnin ajan. Media kerättiin, sentrifugoitiin solujätteen poistamiseksi ja käytetään transfektoimaan A549 ja BEAS-2B-soluja. Neljäkymmentä kahdeksan tuntia lisäämisen jälkeen virus, transfektoidut solut valittiin lisäämällä 2 ug /ml puromysiiniä kasvualustaan.

Real Time RT-PCR (qPCR) ja kvantifiointi Small RNA: iden

Yhteensä RNA: ta (20 ng), joka on eristetty soluista käyttäen PureLink ™ Micro-to-Midi kokonais-RNA: eristäminen (Invitrogen) mukaisesti valmistajan protokollan, käänteiskopioitiin käyttäen TaqMan ™ käänteistranskriptio kit (Applied Biosystems®, Foster City, CA) ja RNA-spesifisiä alukkeita varustettu TaqMan ™ microRNA määritykset (Applied Biosystems®) 15 ul: ssa, jossa lämpökäsittely 16 ° C: ssa 30 minuuttia, mitä seurasi pidennys 42 ° C: ssa 30 minuutin ajan. 1,33 ui RT-reaktiota käytettiin sitten 1 ui alukkeina joko

RNU6B

,

miR-30a

tai

miR-191

(Applied Biosystems®, Foster city, CA) triplikaattikaivoissa 44 syklin PCR on 7900HT lämpösyklilaitteessa (Applied Biosystems®). Denaturointivaihe 95 ° C: ssa oli 15 s, ja hehkutus ja laajentaminen vaihe 60 ° C: ssa oli 1 min. SDS-ohjelmisto (Applied Biosystems®, Foster City, CA) käytettiin määrittämään syklin kynnys (Ct) arvot mitattiin fluoresenssi PCR: n aikana. Prism 5.0b ohjelmistot (GraphPad®, La Jolla, CA) käytettiin tilastolliseen analyysiin ja kuvaajien.

Pathway rikastus Analysis

julkisesti saatavilla miRgator ohjelmisto (http: //genome.ewha. ac.kr/miRGator/miRGator.html) käytettiin suorittamaan reitin rikastamiseen analyysi. Erityinen miRNA valitut olivat

miR-191

ja –

30a-5p

. Kohde-valinta-algoritmi valittiin Miranda [3].

proliferaatiomääritystä

soluproliferaatiomääritykset suoritettiin käyttäen Cell Titer 96® kit (Promega, Madison, WI), joka käyttää muuntaminen MTS (3- (4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -5- (3-karboksimetoksifenyyli) -2- (4-sulfofenyyli) -2H-tetratsolium, sisäinen suola) ja formatsaaniksi mitata solujen elinkelpoisuus. Lyhyesti, solut maljattiin 96-kuoppaisille levyille 4000 solua 100 ui per kuoppa. Solut kerättiin neljänä eri ajankohtina 150 tuntia. Korjattua soluja, 20 ui määrityksen reagenssia lisättiin ja elävät solut mitattiin absorbanssi 450 nm: ssä 1 tunti myöhemmin Multiskan Plus (MTX Lab Systems, Wien, VA) lukulaite. Absorbanssiarvot normalisoitiin median valvontaa.

Adherent Pesäkkeenmuodostusta

soluviljelytutkimuksista trypsinoitiin ja maljattiin kahtena kappaleena 6-kuoppaisille levyille 200 ja solua kuoppaa kohti A549 ja 500 solua kuoppaa kohti for BEAS-2B solulinjassa johdannaisia ​​vastaavasti. Solujen annettiin kasvaa 37 ° C: ssa, 5% CO2 median muuttuu joka 3-4 päivä, kunnes pesäkkeet olivat nähtävissä silmin. Imettiin ja solut värjättiin 0,2% metyleenisineä 40% metanolia 30 minuutin ajan. Solut pestiin ja levyt skannattiin käyttäen Epson Perfection V700 Photo skanneri jotta avoimuus. Kvantitointi pesäkkeiden tehtiin käyttämällä ImageJ ohjelmistoa (Research Services Branch, National Institute of Mental Health, Bethesda).

Soft Agar pesäkemuodostusta

Base agar /mediamixiin lisättiin 6-kuoppaisille levyt (lopullinen pitoisuus 0,7% agaria, 1 x + DMEM, 10% FBS: ää, 2 ug /ml puromysiiniä) levyn päällystämiseksi ja sen annettiin polymeroitua. Solut suspensiot tehtiin 100 solua /ml väliaineessa, /agar-seosta (lopullinen pitoisuus 0,35% agaria, 1 x + DMEM, 10% FBS: ää, 2 ug /ml puromysiiniä). 1,5 ml solususpensiota maljattiin päälle pohjan agaria kuhunkin kuoppaan ja sen annettiin polymeroitua. 2 ml täydellistä väliainetta lisättiin päälle agar kerran polymeroidaan. Levyt pantiin 37 ° C: ssa, 5% CO2, ja overlay media vaihdettiin joka 3-4 päivä. Viljelmiä kasvatettiin, kunnes muutamia pesäkkeet olivat nähtävissä paljain silmin, 2 mg /ml tiatsolyyli Blue liumbromidi PBS: ssä lisättiin soluihin ja palautettiin inkubaattoriin kunnes pesäkkeet värjättiin. Kun pesäkkeet värjättiin sininen, tahra poistettiin kuopista ja kuvat on otettu käyttämällä Cannon Powershot A590IS kamera.

In vitro Scratch Pitoisuus

Voit arvioida eroja solujen vaeltamiseen, in vitro naarmu määritys suoritettiin. Tähtäin piirrettiin pohjassa 6-kuoppaisille levyille suunta kuvantamiseen. Solut maljattiin kolmena rinnakkaisena, joka on korkean tiheyden saavuttamiseksi 100% konfluenssiin 24 tuntia myöhemmin. Naarmu jälkeen tehtiin suoraan vieressä pystyviiva piirretään levyyn maltillinen ja johdonmukainen paine käyttäen 10 ui kärjen ja levyn kansi kuin suora reuna. Naarmut oli kuvattu asetetaan välittömästi Axio Observer (Zeiss, Maple Grove, MN) 5x suurennus ja orientaatio hiusristikko totesi. Sitten solut palautettiin 37 ° C, 5% CO2 ja kuvattiin eri ajankohtina, kunnes kaikki naarmut olivat kiinni.

Vieraslajisiirteen muodostumisen määritys

Kaikki in vivo tutkimuksissa hyväksyi Institutional Animal Care ja käyttö komitea Roswell Park Cancer Institute. Ohjaus ja yli-ilmentäviä A549-solulinjoja (6,0 x 105 solua) injektoitiin subkutaanisesti lapaluiden väliin 4-5 viikkoa vanhojen SCID-hiirten (5 hiirtä kussakin kohortissa). Kasvaimia seurattiin 2-3 kertaa viikossa mittaharppimittauksilla kunnes suurin kasvain oli 2 cm pisin suuntaan, minkä jälkeen kaikki hiiret tapettiin. Kasvaimet leikeltiin ja punnittiin.

Cell Cycle Analysis

Soluja kasvatettiin 70% -90% konfluenssiin irrotettiin trypsinoimalla, kiinnitettiin 70% etanolilla 4 ° C: ssa 1-2 päivää, pestiin PBS: llä ja inkuboitiin tiheydellä 1-2 x 10

6 solua /ml, jossa 0,3 uM 4,6-diamino-2-fenyyli-dihydrokloridi (DAPI; MP Biochemicals®, Solon, OH) PBS: ssä huoneen lämpötilassa pimeässä 100 min. Kun oli pesty kerran PBS: llä, DAPI fluoresenssia soluista määritettiin virtaussytometrialla käyttämällä LSR II (BD Biosciences®, San Jose, CA) väline on varustettu 408 nm: violetti laserdiodin ja 450/50 nm: n emissiosuodatin.

Drug Sensitivity Pitoisuus

jälkeen soluja kasvatettiin 50% -60% konfluenssiin 96-kuoppalevyille (5 syvennystä per solu-line), väliaine korvattiin joka sisälsi 1 ug /ml doksorubisiinihydrokloridia (Enzo Life Sciences®, Farmingdale, NY) tai sisplatiinin (Calbiochem®, San Diego, CA). Jälkeen 1,5-2päivä viljelyn Solujen elinkelpoisuus mitattiin, kuten on kuvattu solulisäkasvumääritykselle ja verrattuna niihin, jotka eivät ole altistuneet lääkkeitä.

Tulokset

luominen Stable Cell Lines yli-ilmentäminen miR-30a ja -191

Stable solulinjat yli-ilmentävät

miR-30a

ja

-191

luotiin käyttäen lentiviraalinen järjestelmää edellä kuvatulla tavalla.

MiR-30a

yliekspressoitui ~ 2 taittaa ja ~ 3 taita sekä A549 (A-30a) ja BEAS-2B (B-30a) vastaavasti verrattuna kontrolleihin (A0 ja B0 vastaavasti). Verrokkeihin verrattuna,

miR-191

yliekspressoitui ~ 2 taittaa ja -7 taita A549 (A-191) ja BEAS-2B (B-191) (kuvio 1). Yliekspressio on vahvistanut myös visualisoinnin RFP sisältävien solujen mikroskopialla.

Expression normalisoidaan ohjata solulinjoja (A0 tai B0).

Pathway rikastus Analysis

Target ennustuksen Miranda algoritmin tunnistetut 731 tavoitteet

miR-30a-5p

ja 570 tavoitteita

miR-191

. Kymmenen reitit tunnistetaan polku rikastamiseen analyysiin sisältyi väyliä vaikuttavat solusyklin, solujen lisääntymistä, lääkeresistenssin ja solun liikkuvuus, mm (taulukko 1).

Yli-ilmentäminen

asennuspalveli- 30a

tai

-191

ei muuta Asian leviämisen sekä in vitro in vivo-549 ja BEAS-2B Cell Lines

Pathway rikastamiseen analyysi viittasi siihen, että

miR -30a

ja

-191

vaikuttanut solusyklin ja solujen lisääntymistä. Vaikutuksen tutkimiseksi yliekspressiosta

miR-30a

ja

-191

A549 ja BEAS-2B, kasvukäyrät piirrettiin mittausten perusteella solujen elävyyden eri ajankohtina yli 150- tunnin aikana. Eroa kasvukäyrät havaittiin A-30a ja A-191 verrattuna A0 ja B-30a ja B-191 verrattuna B0 (kuvio 2A, 2B). Solujen lisääntyminen eri solulinjoissa verrattiin myös käyttämällä kiinnittynyt pesäkkeiden muodostumista. Mitään eroa ei havaittu joko numero tai koko tarttuneiden pesäkkeiden solulinjoissa yli-ilmentävät

miR-30a

tai

-191

verrattuna vastaavaan kontrolliin solulinja (kuvio 2C).

A, B. Solujen lisääntyminen käyrät solulinjojen A0, A-30a ja A-191 (A) ja B0, B-30a ja B-191 (B) osoittavat mitään muutosta solujen lisääntymisen. C. Metyleenisini värjättyä soluviljelmälevyihin osoittavat eroa tarttuu pesäkkeenmuodostusta A-30a ja A-191 verrattuna A0 ja B-30a ja B-191 verrattuna B0. D. Vieraslajisiirteen muodostuminen SCID hiirillä A549 ei muutu yli-ilmentyminen

miR-30a

tai

-191

.

Anchorage riippumattomuus on yksi tunnusmerkkejä muutosta. Olemme pyrkineet vaikutuksen määrittämiseksi yliekspressio

miR-30a

tai

-191

ankkurointi riippumaton kasvu A549 ja BEAS-2B-soluissa käyttäen pehmytagar- -pesäkemääritys edellä kuvatulla tavalla. Kaikki linjat muodostivat harvoja pesäkkeitä, jotka olivat nähtävissä mikroskoopilla vain 2-3 pesäkkeitä nähtävissä paljain silmin. Mitään eroja ei havaittu värjäyksen jälkeen tai mikroskopialla (dataa ei esitetty).

Vieraslajisiirteen muodostumisen on ajateltu edustamaan biologisesti relevantteja toimenpide kasvaimen aggressiivisuus. Olemme arvioineet vaikutusta yli-ilmentymisen

miR-30a

tai

-191

ksenograftin muodostumiseen SCID hiiriin A549-soluja. Kun kontrolliin verrattuna solulinja (A0), A-30a ja A-191 eivät muodosta suurempaa ksenografteja (kuvio 2D). Kasvu kasvaimen ajan ei myöskään ole erilainen näissä solulinjoissa kontrolliin verrattuna (tietoja ei esitetty). Koska BEAS-2B solulinja on ei-tuumorigeenisiä, emme arvioida ksenografti muodostumista käyttämällä B0, B-30a tai B-191.

Vaikutus Yli-ilmentäminen

miR-30a

tai

-191

Cell Migration and Cell Cycle Distribution A-549 ja BEAS-2B Cell Lines

Lisääntynyt solujen vaeltamiseen on tärkeä mekanismi, joka on ajateltu lisätä metastaattisen potentiaalin syöpäsolujen . Tämä voi olla riippumaton solujen lisääntymisen hinnat. Siksi tutkimme vaikutus

miR-30a

tai

-191

solujen migraatio A549 ja BEAS-2B solulinjoissa käyttäen tyhjästä menetelmää edellä kuvatulla tavalla. On vaatimaton kasvu muuttoa A-30a ja B-30a verrattuna A0 ja B0 vastaavasti. Ei ollut mitään merkittävää eroa migraation etäisyys solulinjoja, jotka yliekspressoivat

miR-191

verrattuna vastaavaan kontrolliin solulinjoissa (kuvio 3A).

. Solujen migraation A-30a ja B-30a nostetaan verrattuna kontrolleihin; mitään vaikutusta yli-ilmentymisen

miR-191

nähdään. B. Solusyklianalyysiä vakaiden transfektanttien osoittavat eroa solujen yli-ilmentävät

miR-30a

ja

-191

kontrolleihin verrattuna.

tarkastelu ennustettu tavoitteet

miR-30a

ja

-191

ja solujen prosessit vaikuttavat ne osoittavat tilastollisesti merkittävän rikastamisen reittejä, joihin liittyy solusyklin. Siksi tutkimme vaikutus yli-ilmentymisen

miR-30a

tai

-191

solusyklin jakeluun. Virtaussytometria värjäyksen jälkeen DAPI käytettiin suorittamaan solusyklin analyysi kaikista solulinjoissa. Kontrolleihin verrattuna, solulinjat yli-ilmentävät

miR-30a

tai

-191

eivät osoita merkittäviä muutoksia solusyklin jakautumisen (kuva 3B).

Over -ilmaisu on

miR-30a

tai

-191

ei muuta Kemosensitiivisyys doksorubisiinille tai Cisplatin

Doksorubisiini ja sisplatiinia käytetään yleisesti kemoterapia-aineita. A549 on kohtalaisen herkkä sisplatiinin ja doksorubisiini (https://dtp.nci.nih.gov), jolloin voidaan arvioida sekä lisätä ja vähentää herkkyyttä näitä lääkkeitä. Yliekspressio

miR-30a

tai

-191

ei muuta kemosensitiivisyys A549 ja BEAS-2B joko lääkeaineen (kuva 4).

herkkyys A549-soluja ( A, B) ja BEAS-2B-soluja (C, D) doksorubisiinille ja sisplatiinia. Harmaa ilmaisee ohjaus soluja.

Keskustelu

Mirna muutoksia yleisesti nähtävissä syöpäkudoksen verrattuna niiden normaaliin kollegansa. Suuruudesta nämä muutokset ovat vaatimattomia ja niiden toiminnallinen merkitys tuntematon. Yksi vaikeuksista tutkimuksessa miRNA ovat, että yksi miRNA on useita satoja ennustettu tavoitteita ja nämä Bioinformatiiviset ennustukset eivät ole kovin tarkkoja. Myös rooli miRNA solussa riippuu geneettisen perustuslain ja transcriptome solun kerrallaan ja tämä monimutkaisuus ei jää pelkästään niiden pakotetaan-ilmaisua. Kuitenkin fenotyyppisiä muutoksia toissijainen pakko yliekspressio voi antaa vihjeitä ymmärtää niiden osuus pahanlaatuiseen fenotyyppiin. Tässä tutkimuksessa olemme luotu vakaa transfektantit että konstitutiivisesti yliekspressoivat

miR-30a

tai

-191

ja eivät osoita merkittäviä muutoksia fenotyypin eri määrityksissä, jotka tehtiin. Useita mahdollisia selityksiä voi selittää tämän puutteen muuttaminen fenotyypin. Ensinnäkin on mahdollista, että ekspression taso miRNA saavutettu, ei riitä luoda ero. Vaikka kertamuutoksia nähdä microarray kokeiluja on tyypillisesti vaatimaton, tällaisia ​​kokeita voi aliarvioida todellisia muutoksia pahanlaatuisten epiteelisolujen johtuen laimeneminen muutosten pahanlaatuisten epiteelisoluissa stroomasolut, jotka muodostavat merkittävän osan patologiset näytteet. Myös muutosten suuruus nähdä mikrosiruja on usein pienempi kuin vastaavat muutokset nähdään RT-PCR: llä. Siksi todellinen muutokset pahanlaatuiset solut voivat olla enemmän kuin joka saavutettiin mallissamme järjestelmässä. Toisaalta on mahdollista, että havaitut muutokset miRNA mikrosiruissa spuriously yliarvioida muutoksia. Esimerkiksi tutkimuksessa, jonka Peltier et al [18], että huolellisesti arvioinut useita ehdokas miRNA vakauden ilmaisun viidellä syöpien ja normaaleissa kudoksissa RT-PCR,

miR-191

oli niin pysyvästi ilmensivät että on ehdotettu, kuten geeni, voidaan käyttää normalisointi. Tämä puolla rooli

miR-191

karsinogeneesissä. Siksi valitsemalla miRNA perustuvat microarray data voi olla hyvä strategia. Kolmanneksi, miRNA ei ehkä voi johtaa fenotyypin muutokset omasta; niiden vaikutus voi olla yhteydessä erityinen ja ehkä yhdistettynä korjauksilla ilmentymisen joko muiden miRNA tai mRNA: iden muuttaa fenotyyppiä.

Yhteenvetona voimme päätellä, että yli-ilmentyminen

miR-30a

tai

-191

ei johda muutokseen solusyklin, lisääntymistä, ksenografti- muodostumista ja kemosensitiivisyys A549 ja BEAS-2B solulinjoissa. Käyttämällä microarray tietoja koko kasvaimista valita tiettyjä miRNA toiminnallinen tutkimus saattaa olla optimaalista strategiaa. On tärkeää varmistaa toiminnallista merkitystä havaitut muutokset miRNA ilmentymisen tietoja tietyn kasvaintyypeissä määritellä biologisia rooleja tiettyjen miRNA.