Krooninen sairaus

tiivistelmä

olevat tiedot viittaavat siihen, että NF-kappaB signalointi on keskeinen säätelijä syövän aiheuttamaa luuston lihasten kuihtumista. Kuitenkin tunnistaminen komponentit tämän signalointireitin ja NF-KB-transkriptiotekijöiden, jotka säätelevät Viivyttelyllä kaukana täydellisestä. Lihakset C26 kasvain kantavien hiirten, yliekspressio hallitseva negatiivinen (D. N.) IKKβ estänyt lihasten kuihtumista 69% ja IκBα-super repressori estää tuhlaa 41%. Sen sijaan, yliekspressio D.N. IKKα tai D.N. NIK ei estänyt C26 aiheuttama näivettyminen. Yllättäen, yliekspressio D.N. p65 tai D.N. c-Rel ei vaikuttanut lihasten kuihtumista. Genominlaajuisten mRNA ilmaisun paneelit osoitti säätelyä monien geenien aiemmin sekaantunut lihasten surkastumista. Testata, jos nämä voimistunut geenit olivat kohdistu suoraa NF-KB transkriptiotekijöitä, vertasimme genominlaajuisten p65 DNA: han sitoutumisen hallinnassa ja kakektisissa lihas käyttäen chip sekvensointia. Bioinformatiikka- analyysi ChIP-sekvensointi tietoja ohjaus ja C26 lihaksia osoitti hyvin vähän p65 sitoutumalla geenien kuihtuminen ja vähän siitä, että ilmen- tymisen lisääntymisen p65 sitova vaikutteita geenin ilmentyminen liittyy lihasten perustuu kuihtuminen. P65 chip seuraavat tiedot ovat yhdenmukaisia ​​meidän ei todettu merkittäviä muutoksia proteiinin sitoutumista NF-KB-oligonukleotidin geelin siirtyminen määrityksessä aktivoitumatta NF-KB-riippuvaisia ​​reportteri, eikä vaikutusta dnp65 yli-ilmentymisen lihaksissa kasvaimen kantavien hiirten. Yhdessä nämä tiedot tukevat ajatusta, että vaikka inhibitio IκBα, ja erityisesti IKKβ, estää syövän aiheuttama näivettyminen, vaihtoehto NF-KB-signalointireitin ei tarvita. Lisäksi alavirran NF-KB-transkriptio- tekijät, p65: n ja c-Rel eivät näytä säädellä transkription muutosten aiheuttama C26 kasvain. Nämä tiedot ovat yhdenmukaisia ​​kasvava määrä kirjallisuutta osoittaa, että on olemassa NF-KB-riippumaton substraatteja IKKβ ja IκBα jotka säätelevät fysiologisia prosesseja.

Citation: Cornwell EW, Mirbod A, Wu CL, Kandarian SC, Jackman RW (2014) C26 Syöpä aiheuttama lihasten kuihtumista Onko IKKβ riippuva ja NF-kappaB-Independent. PLoS ONE 9 (1): e87776. doi: 10,1371 /journal.pone.0087776

Editor: Imed Eddine Gallouzi, McGill University, Kanada

vastaanotettu: 09 heinäkuu 2013; Hyväksytty: 30 joulukuu 2013; Julkaistu: 29 tammikuu 2014

Copyright: © 2014 Cornwell ym. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat National Institutes of Health (NIH) palkinnon AR060217. (https://grants.nih.gov/grants/oer.htm.) Rahoittajat ei ollut roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut : kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

kuihtuminen on aineenvaihdunnan sairaus liittyy monia kroonisia sairauksia ja se on ominaista vakava tuhlausta luurankolihasten ja rasvakudoksessa, jotka eivät voi käännettävä lisäämällä kalorien saanti [1]. Syöpäkakeksiassa nähdään useimmissa pitkälle edenneisiin syöpiin, mutta se on yleisimmin nähdään keuhko- ja ylemmän maha-suolikanavan [1]. Syöpäpotilaat kakeksia on alhaisempi elämänlaatu vuoksi immuunipuutospotilailla, insuliiniresistenssi, heikkous ja väsymys [2]. Potilaat, joilla on jopa lievä kakeksia voi sietää solunsalpaajahoitoa, joka edelleen pahentaa sairaudesta [3]. Kuihtuminen vaikutus arvioidaan kuolemaan noin 30% syöpäpotilaista [4]. Kaikkien vakavuutta vaivan hoidot ovat edelleen lievittävä. Koska vakavampia seurauksia kuihtuminen näyttävät oleskella luuston lihaksen menetys [1], kehittää parempaa ymmärtämistä solun signalointi mekanismeja ja geenisäätelyn lihasten voisi tuoda uusia terapeuttisia strategioita hoitoon tämän edellytyksen.

Tutkimus eri syöpätyyppien on ehdottanut rooli NF-KB signalointi ja NF-KB transkription sääntelyn lihassurkastumatilaan [5], [6], [7]. Esto klassisen NF-KB-reitin yliekspressio ja IkappaBalpha Super repressori (IκBαSR), estetty lihasten kuihtumista Lewis-keuhkokarsinooma (LLC) kasvainta kantavissa hiirissä 50% [5]. Prototyyppiseen NF-KB-transkriptiotekijän, p65 (Rel A), osoitti lisääntynyt sitoutuminen ELISA-pohjainen NF-KB oligonukleotidi määritys lihasten hiiriltä kanssa LLC. Lisääntynyt sitoutuminen päinvastaiseksi, kun IκBαSR yliekspressoitiin lihaksen, viittaa siihen, että p65 on NF-KB-transkriptiotekijän mukana lihassurkastumatilaan syöpään, ainakin hiirillä LLC [5]. Fosforylaatiota p65 at seriini- 536, ajatellaan lisäävän transkriptioaktiviteettia, on lisääntynyt lihaksen C26 kasvain hiirille [6] ja lihasten ihmisistä haimasyöpä [8]. Toisaalta, jotkut tulokset roolista NF-KB transkriptiotekijöitä kuihtuminen ovat olleet moniselitteisiä. Esimerkiksi geeli shift määritykset osoittivat pieniä lisäyksiä sitoutumisen transkriptiotekijöiden ja NF-KB-oligonukleotidin lihaksissa C26 kasvain hiirille [6], [9], ja toisessa tutkimuksessa ei ollut lisäystä proteiiniin sitoutumaan NF KB-oligonukleotidi kakektisilla rotilla Yoshida -askiteshepatooma [10]. On mahdollista, että eri syöpätyyppien aiheuttaa lihassurkastumatilaan kautta eri solun mekanismeja. Kuitenkin vain yksi NF-KB signalointia proteiini (IκBα) ja yksi NF-KB transkriptiotekijä (p65) on tutkittu syövän aiheuttamaa lihasten kuihtumista, ja emme tiedä surkastumista indusoivan geenejä, jotka on kohdistettu NF-KB transkriptio tekijät.

tarkoitus tämän tutkimuksen tarkoituksena oli tunnistaa tunnetut nisäkkäiden NF-KB viestintäproteiinit ja NF-KB transkriptiotekijöiden, jotka säätelevät lihassurkastumatilaan johtuu syövästä. Toinen tarkoitus oli tunnistaa NF-KB-kohdegeenien on genomin laajuisesti, jotta voidaan määrittää, jos NF-KB-transkription verkko säätelee syövän aiheuttamaa lihasten kuihtumista. Testasimme NF-KB signalointi proteiineja tarvitaan lihasten kuihtumista yliekspressiolla hallitseva negatiivinen (D. N.) muodot ylävirtaan NF-KB: n kinaasien. Nämä ovat inhibiittori kappaB-alfan (IKKα), IKKβ, ja NF-KB-indusoivia kinaasi (NIK). Rooli IκBα testattiin yliekspressio trans- hallitseva Super repressori muodossa IκBα (IκBαSR). Onko NF-KB-transkriptiotekijän Rel A (p65) tai c-Rel tarvitaan lihasten kuihtumista testattiin yliekspressio D.N. p65 tai D.N. c-Rel, vastaavasti. NF-KB: n transkriptiotekijän sitoutumista NF-KB-oligonukleotidi ja NF-KB: n transkriptionaalista aktiivisuutta reportteri mitattiin kakektisissa lihaksia. Sen määrittämiseksi, kanoninen NF-KB-transkriptiotekijän, p65, sitoo kohde- geenejä, jotka saattavat liittyä surkastumista sääntelyä, suoritimme ChIP-sekvensointi lihasten kontrollista ja kasvain hiirille yhdessä mittauksessa globaalin geenin ilmentymisen toiminnallisena mittana kuihtuminen välittämän geeniekspression.

Tämä on ensimmäinen perusteellinen tutkimus roolista NF-KB signalointi ja NF-KB transkriptiotekijöitä säätelyssä lihassurkastumatilaan johtuu syövästä. Vaikka esto IκBα, ja erityisesti IKKβ toimintaa merkittävästi päinvastainen lihasten kuihtumista, ei ollut vaikutusta kuidun kuihtumista estämällä IKKα tai NIK. Yllättäen yliekspressio hallitseva negatiivinen p65 tai c-Rel osoitti vähän tai ei lainkaan vaikutusta lihassyyn kuihtumista. Lisäksi ei ollut mitään muutosta NF-KB transkriptiotekijän sitova geelin siirtyminen määritys tai NF-KB-reportterin aktiivisuutta. Tärkeää on, että säätelyä surkastuminen tai sytokiinigeenien saapuvat geeniekspressiota mikrosiruja ei välittämä p65 sisältävien transkriptiotekijöiden arvioituna chip seq. Meidän havainnot ovat yhtäpitäviä Cai et al. [5] esittää roolia IκBα syövän vievää, ja ensimmäistä kertaa osoitetaan, että IKKβ vaaditaan syövän kehittymiseen kuihtuminen, mutta IKKα ja NIK ei ole. Meidän syvällinen analyysi NF-KB: n signalointia ja transkription aikana syöpäkakeksialle osoittaa, että IKKβ säätelee geeniekspressiota transkriptiotekijät muut kuin NF-KB, ainakin luustolihasten aikana C26 syöpäkakeksialle. Nämä tulokset paljastavat odottamattoman mutta tärkeä osatekijä sääntelyn syövän aiheuttamaa lihasten kuihtumista.

Methods

Ethics lausunto

Tutkimus toteutettiin tiukasti suositusten mukaisesti oppaasta Care ja käyttö Laboratory Animals of National Institutes of Health. Protokolla hyväksyttiin Charles River Campus Boston University Institutional Animal Care ja Käytä komitea (protokolla numero: 12-016). Kaikki Leikkaus suoritettiin ketamiini /ksylatsiinia anestesia, ja yritettiin minimoida kärsimyksen. Kaikki työskentelevien Eläimet ovat olleet pakollisia IACUC koulutusta ja vuoden välein: https://www.bu.edu/orctraining/animal/lacf/.

Solut

C26 adenokarsinoomasoluil- (National Cancer Institute, Frederick, MD), maljattiin ja pidettiin 37 ° C: ssa, 5% CO

2 Dulbeccon Modified Eagle Medium, korkea glukoosi (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia (Invitrogen), 1% penisilliini-streptomysiiniä (Invitrogen), ja 1% L-glutamiinia (Invitrogen). Ennen pistämistä hiiriin, C26 solut trypsinoitiin ja pestiin kahdesti fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella ja sitten uudelleen suspendoitiin 01:01 liuokseen, jossa oli 1 x PBS ja matrigeeliä (BD Biosciences, San Jose, CA, USA).

Eläimet

Kahdeksan viikkoa vanhoja, uros CDF1 hiiriä ostettiin Charles River Laboratories (Wilmington, MA, USA) käytettiin kaikissa kokeissa. Hiiriä käsiteltiin tiukasti mukaisesti suosituksia Opas hoito ja käyttö Laboratory Animals of National Institutes of Health. Eläimet pidettiin 12:12 L /D sykli, sijoitettiin yksittäin, ja niille annettiin pääsy ruokaan ja veteen

halun

. Kolmen päivän totuttamistiedot, eläimet satunnaistettiin ei- kasvain kontrolliryhmä tai C26 kasvain ryhmä. Kontrollieläimet saivat inokulaatti 150 ui 1 x PBS /matrigeeliä (01:01) subkutaanisesti oikean ja vasemman sivun. Kasvain eläimet saivat inokulaatti 5,0 × 10

5 C26 solut suspendoitiin 150 ul PBS /matrigeelin (01:01) ihonalaisesti oikeaan ja vasempaan kyljet; tämä tehtiin kevyesti nukutettiin hiiriä (40 mg /kg ketamiinia +5 mg /kg ksylatsiinia).

Plasmidi-DNA injektio lihakseen

Plasmidi-DNA eristettiin käyttäen QIAGEN endotoksiinivapaalla Mega Kit kohti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Plasmidi-DNA lihakseen 10 päivää sen jälkeen, kun kasvaimen rokotteita, kuten aiemmin on kuvattu [11]. Lyhyesti, plasmidi-DNA saostettiin etanolilla ja suspendoitiin uudelleen 0,45% steriiliä suolaliuosta /DDH

2O. Kaikki hiiret, jotka saivat leikkausta annettiin ennaltaehkäisevää hoitoa 0,1 mg /kg Buprenorfiini injektio ennen leikkausta. Hiiret nukutettiin ketamiinin (80 mg /kg) ja ksylatsiinia (10 mg /kg). Tibialis anterior (TA) lihakset kustakin eläimestä injektoitiin 35 ug ekspressioplasmidia 25 ui 0,45% steriiliä suolaliuosta käyttäen 29 gaugen insuliiniruiskua. Sen jälkeen plasmidi injektion, lihakset stimuloitiin matalan jännitteen sähkövirtaa käyttäen kahden päitsinelektrodit [12], että toimitettu 6 pulsseja 86 V /cm 20 ms kanssa interpulse välein 200 ms (Electro Square Porator ECM 830, BTX) . Tämä on pieniannoksinen elektroporaatioprotokollaa joka ei indusoi vaurioita [13], [14], [15]. Päivänä 25 inokulaation, TA lihakset poistettiin sekä ohjaus ja C26 on kasvain, punnittiin ja joko pikajäädytettiin nestemäisessä typessä biokemiallisia analyysi tai asennettuna puulastoja, upotettu kudokseen jäädyttämistä keskipitkällä ja jäädytetyt nestemäistä typpeä jäähdytetty isopentaanin histokemiallista analyysiä. Injektio NF-KB-reportteriplasmidi tehtiin samana päivänä kuin tuumorisoluinokulaation. Injektio d.n.p65-EGFP tehtiin 6. päivänä tuumorin istuttamisen jälkeen.

Plasmidit

plasmideja käytettiin olivat: D.N. IKKα-EGFP, D.N. IKKβ-EGFP, IκBαSR-EGFP, D.N. NIK-GFP, D.N. p65-EGFP, ja D.N. c-Rel-EGFP. D.N. IKKα-EGFP (K44M) ja D.N. IKKβ-EGFP (K44M) ekspressointiplasmideja koodaavat EGFP fuusioproteiineja kinaasi-dead muotoja IKKα ja IKKβ että olemme kuvattu yksityiskohtaisesti [11]. Olemme myös rakennettu IκBαSR-EGFP fuusio plasmidin että olemme kuvattu yksityiskohtaisesti [16]. D.N. p65 (313) on typistetty muoto p65 puuttuu C-pään transaktivointidomainien ja oli lahja D. Guttridge [17]. Olemme luoneet D.N. p65-EGFP fuusio plasmidi kloonaamalla N-terminaalinen 313 aminohapon-koodaavan DNA-sekvenssin p65 osaksi HindIII-SalI-kohtiin pEGFP-N1 (313 + 238 = 551 aminohapot). Varmistimme kloonaus sekvensoimalla plasmidi ja testattu vallitsevan negatiivisen toiminto C2C12 lihasputkia, jossa D.N. p65-EGFP pystyi estämään TNFa aktivoimalla NF-KB toimittaja by 90% (kuvio S1A). Sillä luodaan D.N. c-Rel-EGFP-plasmidi, käytimme hiiren c-Rel malli, lahja T. Gilmore, kopioimalla nukleiinihapposekvenssin Rel-homologiadomeeni geenin sisältävät aminohapot 1-288 (puuttuu kaksi N-terminaalista transaktivointidomainien) ja lisäämällä restriktiokohdat kloonata fragmentti-kehyksen EcoRI-Kpnl-kohtiin pEGFP-N1. Saatu D.N. c-Rel-EGFP insertti tarkistettiin sekvensoimalla ja toiminut hallitseva negatiivinen Rel koska sen ilmentyminen pienentää NF-KB toimittaja tasoilla C2C12 lihasputkia (kuvio S1B). D.N. NIK-GFP-ekspressioplasmidin, lahja A. Kumar, koodaa kinaasia kuollut muoto NIK ja EGFP erilliseltä kistroniin [18].

immunohistokemia

TA lihassyyrakenne poikkipinta-alat plasmidin-transfektoitujen kuidut (ilmentävät vihreän fluoresenssin fuusioproteiineja) verrattiin kuitu alueille samoilla aloilla, jotka eivät vievät plasmidia sekä kasvain ja ohjaus hiirillä. Kuten aiemmin on kuvattu [11], Jääleikkeiden otettiin puolivälissä vatsa TA (7,5 pm paksu), joka on asennettu Tissue Tack mikroskoopin (Polysciences, Inc., Warrington, PA, USA) ja kiinnitettiin 4% paraformaldehydi. Poikkileikkaukset pestiin, salvattiin 10% BSA ja inkuboitiin kanin anti-laminiini 1:200 (L9393; Sigma-Aldrich) 1% BSA: ta, jota seuraa Texas Red-X vuohen anti-kani-IgG fluoresoivaa väriainetta-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineen 1 :200 (T-6391; Invitrogen). Leikkeet kiinnitettiin peitelevy kanssa Vectashield kiinnitysväliaine (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA). Kuvat visualisoitiin klo 20X suurennus käyttäen käänteisvalomikroskoopilla (Nikon Eclipse TS 100). Kaikki kuvat otettiin kiinni kanssa SPOT RT kamera (Diagnostic Instruments, Sterling Heights, MI, USA). Fiber poikkipinta-ala laskettiin käyttäen Meta-Morph Imaging System (Universal Imaging, Glendale, WI, USA). Keskimäärin kuitujen mitattu lihasta kohden oli 200.

eristäminen raakaa tumauutteiden

Raakaöljy ydin- otteita takajalkojen lihakset 13-23 päivää C26-ympätty CD2F1 uroshiirillä ja ikä verrokeilla eristettiin mukaan Kumar ja Boriek [19] joitakin muutoksia. Kaikki eristäminen vaiheet ja pyörii suoritettiin 4 ° C: ssa käyttäen jäähdytettyä puskureita. Flash pakastetut lihakset suspendoitiin 1 mg lihaksen paino per 18 ui puskuria (10 mM HEPES [pH 7,9], 10 mM KCI, 3 mM MgCI2, 0,1 mM EDTA [pH 8], 0,1 mM EGTA: ta, 0,1% Triton X-100 , 1 mM ditiotreitolia, 0,5 mM fenyylimetyylisulfonyylifluoridia, ja proteaasiestäjäseostabletit) ja homogenisoitiin välittömästi jäihin. Homogenoitu lihakset inkuboitiin jäillä 5 min, jota seurasi 20 s voimakkaan pyörteen. Tumat sentrifugoitiin 3000 x

g

10 minuuttia. Supernatantti poistettiin ja säilytettiin -80 ° C: ssa. Tumapelletit pestiin 1 ml: lla modifioitua sytoplasminen uute puskurilla ilman Triton X-100 ja sentrifugoitiin 3000 x

g

3 min. Pelletit resuspendoitiin 4 ul: aan tumauutetta-puskuria (20 mM HEPES [pH 7,9], 420 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA: ta, 25% glyserolia, 1 mM ditiotreitolia, 0,5 mM fenyylimetyylisulfonyylifluoridia, ja proteaasiestäjäseostabletit) per mg alkuperäinen lihasten painoa. Suspendoitiin uudelleen tumapelletit inkuboitiin jäissä 30 min 15 s vorteksoitiin voimakkaasti 10 minuutin välein. Näytteet sentrifugoitiin 16000 x

g

20 minuuttia ja tumauute (supernatantti) poistettiin ja säilytettiin -80 ° C: ssa.

Elektroforeettisen liikkuvuuden siirtymän määrityksellä (EMSA) B

Proteiinipitoisuus raakaa lihaksen tumauutteiden määritettiin käyttämällä Bradford-määritystä (Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA). Kaksijuosteiset NF-KB IRDye 700 infrapunaväri end-leimatun oligonukleotidin 5′-AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC-3 ’(alleviivaus ilmaisee NF-KB sitoutumiskohta), ostettiin LI-COR Biosciences (Lincoln, NE, USA). Konsensus leimaamaton kilpailija NF-KB oligonukleotidi hankittiin Integrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, IA, USA). EMSA sitova reaktio suoritettiin käyttäen Odyssey EMSA Buffer Kit (LI-COR Biosciences) tietyin muutoksin. Reaktion kokonaistilavuus oli valmistettiin 20 ul: aan. Sitova reaktio reagenssit lisättiin puhdistettuun veteen seuraavassa järjestyksessä: 2 ui sitomispuskuria (100 mM Tris, 500 mM KCI, 10 mM DTT, pH 7,5), 2 ui 25 mM DTT: tä /2,5% Tween-20, 1 ug /ul poly dI • dC 10 mM Tris, 1 mM EDTA; pH 7,5, 50 fmol NF-KB IRDye 700 infrapunaväri end-leimatun oligonukleotidin, ja 15-20 ug tumauutteesta. Reaktioissa leimaamattoman NF-KB: n kilpailijana, leimaamaton ja leimattujen oligonukleotidien sekoitettiin ennen lisäämistä sitova reaktio. Sitovat reaktiot sekoitettiin varovasti ja inkuboitiin 25 min huoneenlämpötilassa, pimeässä. Ennen lastausta näytteitä, 2 ui Orange Loading Dye (65% w /v sakkaroosia, 10 mM Tris-HCI, pH 7,5, 10 mM EDTA, 0,3% w /v Orange G) lisättiin 20 ui reaktioseosta ja sekoitettiin varovasti.

DNA-proteiini-kompleksit erotettiin vapaa oligonukleotidi ei-denaturoivalla 5% Tris-boraatti-EDTA, PAGE Ready Geelit (Bio-Rad Laboratories, Inc.). Näytteet ajettiin elektroforeesissa 76 V: ssa 2 tuntia huoneen lämpötilassa pimeässä. Proteiini sitoutuu leimattu oligonukleotidikompleksit visualisoitiin käyttämällä Odyssey lämpökamera (LI-COR Biosciences).

NF-KB-riippuvaista reportteriaktiivisuutta

Tällä ilmoitettuina ajankohtina, TA lihakset transfektoitu NF-KB-riippuvaisia ​​lusiferaasireportteri kerättiin ja homogenisoitiin sitten 1 ml: ssa Passive Lysis Buffer (Promega, Madison, WI), jossa proteaasi ja fosfataasi-inhibiittorit (Roche Applied Science, Indianapolis, iN). Homogenaatteja sentrifugoitiin 5000 x

g

4 ° C: ssa 20 minuutin ajan. Supernatantti kerättiin ja sekoitettiin Luciferase Assay Reagent (Promega) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Lusiferaasiaktiivisuus mitattiin TD-20/20 luminometrillä (Turner Designs, Sunnyvale, CA, USA).

Western blot-analyysi

Proteiinipitoisuus lihaksen lysaatit passiivista hajotuspuskuria määritettiin käyttämällä Bradfordin menetelmällä (Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Viisikymmentä 75 mikrogrammaa proteiinia denaturoitiin ja fraktioitiin koon on 4-15% SDS-polyakryyliamidigeeleillä. Proteiinit siirrettiin Immobilon-FL polyvinylideenifluoridia (Millipore, Bedford, PA, USA), estetty Odyssey estopuskurilla (Licor Biotechnology, Lincoln, NE, USA) ja inkuboitiin sopivan primaarisen vasta-aineen mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Vasta-aineet olivat: anti-IKKα /IKK1 (IMG-5477, IMGENEX, San Diego, CA, USA), IKKβ /IKK2 (# 2684), NF-κB2 (P100 /p52; # 4882), ja p-IκBα (# 9246 ) (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA), IκBα (sc-371), NF-KB: n p65: n (sc-7151), c-Rel (sc-6363), ja NIK (sc-7211) (Santa Cruz Biotechnology , Santa Cruz, CA, USA). Anti-GAPDH (G-9545) käytettiin latauskontrollina (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). Alexa Fluor 680 fluoresoivalla-konjugoitua sekundaarista vasta-ainetta (Invitrogen) käytettiin visualisoinnin kanssa Li-Cor Odyssey infrapuna Imaging System aiemmin on kuvattu [20].

RNA: n eristämistä

Gastrocnemius ja plantaris lihakset olivat korjattu nukutetuista ohjaus ja jolla on kasvain (25 päivää inokulaation jälkeen), pikajäädytettiin nestemäisessä typessä ja säilytettiin -80 ° C: ssa, kunnes se jatkokäsiteltiin. Kokonais-RNA uutettiin käyttäen Trizol-reagenssia (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Uutettu kokonais-RNA puhdistettiin edelleen käyttäen RNase-free DNase I (Qiagen, Valencia, CA, USA) ja RNeasy Mini Kit (Qiagen) kuten aiemmin on kuvattu [21]. Uutettu RNA kvantitoitiin UV-spektrofotometrialla ja laatu tarkistetaan 1% denaturoivalla agaroosigeelillä. Näytteet myös varmistettiin Bioanalyzer 2100 analyysi ja oli minimaalinen RIN useita 8,0 (Agilent, Palo Alto, CA, USA).

mikrosiruanalyysi

mikrosiruanalyysi, RNA näytteitä edellä kuvattujen lähetettiin Boston University Medical Center Microarray Core Facility monistamista, merkintöjä, ja hybridisaatio on hiiren Affymetrix Gene 1.0 ST array (Santa Clara, CA, USA) kohti valmistajan ohjeiden mitata ilmentymisen 28132 hyvin selityksin geenejä. Kaikkiaan 6 array kuvia (3 ohjaus lihasnäytteet ja 3 C26 lihasnäytteet) hankittiin GeneChip- Scanner 3000 TG ja laatu arvioidaan Affymetrix Expression Console (Santa Clara, CA, USA). Geenien ilmentyminen signaali arvot tuottama Expression File Luoja moduuli GenePattern alustan (Broad Institute, Cambridge, MA) ja vankka multi-array analyysin algoritmi (RMA) käytettiin datan esikäsittely [22]. Brainarray MoGene 1.0 ST mukautetun CDF tiedosto V.13 käytettiin koetin huomautus [23]. Molemmat.

cel

tiedostoja ja ilmaisun arvot talletetaan MIAME yhteensopiva NCBI Gene Expression Omnibus kanssa hakunumero: GSE48363 (link: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc. cgi? token = rnupvmqqyocggpk acc = GSE48363). Differential geenin ilmentyminen oli laskettu käyttämällä vertailuesimerkin Marker valinta moduulin GenePattern, joka vertaa keskimääräisen erot ohjaus ja C26 ryhmien kaksisuuntainen parametriset t-testejä. Käytetyt parametrit geenien tunnistamiseksi, jotka ilmentyvät differentiaalisesti lihaksen kasvain hiiret olivat:

P

-value≤0.05,

q

-value≤0.05, ja taita muuttaa suurempi kuin 1,5-kertainen . Ylä- tai alassäädetty geeni luettelot ladataan DAVID Bioinformatics tietokannan toiminnallinen huomautusta ja geenien ontologiaa toimeksianto perustuu biologisen prosessin geenien verrattuna

mus musculus

genomin, jossa kynnys EASE pisteet (modifioitu Fisher Exact P-arvo) asetettiin 0,01 vähintään geeni lasken 2.

ChIP-sekvensointi

Gastrocnemius ja plantaris lihakset eristettiin ohjaus (eli ei-kasvain vie- ras) ja C26 on kasvain päivänä 25 post tuumorin istuttamisen. Tuore dissektoitujen lihas jauhettiin ja silloitettu 1% formaldehydiä 15 minuuttia, reaktio lopetettiin glysiinillä ja sitten jäädytettiin nestetypessä. Jokaisen ehto (eli ohjaus- tai C26) plantarflexor lihaksen neljä jalkaa yhdistettiin, homogenisoitiin, ja chromatin eristettiin kuten olemme aiemmin yksityiskohtaisesti [21]. Tämä aine käsiteltiin ultraäänellä, jolloin saatiin chromatin fragmentteja, jotka olivat keskimäärin 250 emäsparia. Alikvootti Sonikoitujen kromatiini syrjään käytettäväksi tulo murto siru-PCR. Loput kromatiinin laimennettiin IP-puskurissa ja jaettu ryhmän inkuboida p65-aineella (Santa Cruz SC-372X) ja ryhmä ilman primaarista vasta-ainetta; tämä tehtiin chromatin sekä ohjaus ja C26 ryhmiä. Näytteet kanssa ja ilman primaarista vasta-ainetta inkuboitiin 16 tunnin ajan 4 ° C: ssa jatkuvasti alhaisella nopeudella sekoittamalla, ja sitten vasta-aine-chromatin-kompleksit, jotka on otettu proteiini G magneettisia helmiä. Kromatiinin eluoitiin helmistä ja siltojen päinvastaiseksi, minkä jälkeen pronaasia /RNaasi käsittely ja saostamalla DNA: ta. Yksi kymmenesosa materiaalia käytettiin PCR geenin jo osoitettu olevan vankka p65 sitova testaamiseksi p65 siru. Kolme erilaista DNA-kirjastot tehtiin: ohjaus p65 siru, C26 p65 siru, ja siru ilman primaarisen vasta-aineen. Kirjastot valmisteltiin suurikapasiteettisten sekvensointi käyttäen Illumina chip seuraavissa Library kit. Alikvootti kunkin kirjaston tutkittiin akryyliamidin elektroforeesilla ja SYBR-kulta värjäys arvioida laadun koon ja voimakkuuden tuotetta, joka näkyy kokeena, joiden keskimääräinen koko on 350 bp. Koko menettely, jolloin kolme kirjastoa toistettiin toisen kerran uuden lihaksen näytteitä, jotta on kaksi ChIP-seuraavissa kirjastoja kunkin kolmen ryhmän. Kirjastot lähetettiin Whitehead Institute (Cambridge, MA), missä ne puhdistetaan adapterin dimeerien käyttäen Ampure XL helmiä. Puhdistetut kirjastot testattiin Bioanalyzer ja qPCR laadunvalvonta suoritettiin, jotta voitaisiin määrittää, kuinka paljon kunkin kirjaston käyttöä. Kirjastot sekvensoitiin Illumina Solexa sekvensointia on GA II sekvensserin. Tuloksena sekvenssit ohjaus ja C26 näytteitä linjattu hiiren genomin (mm9 versio) käyttämällä ELAND. Sekvenssit lähetettiin meidän lab on ELAND muodossa.

linjauksia varten kaksi erillistä ohjausjärjestelmää näytettä yhdistettiin ja samalla tehtiin kahden C26 näytettä. Kussakin tapauksessa tämä tehtiin yhdistämällä .bam muotojen rinnastuksia Galaxy verkkosivuilla. Sekvenssit arvioitiin sitten kanssa FastQC paketin laadunvalvontatestien, joka saatiin itsenäisenä ohjelma Brabaham Institute (https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/). Kun ensimmäinen FastQ analyysin kaksi operaatiota tehtiin siru-seq tiedot: 1. poistimme PCR kaksoiskappaleet ohjelman samtools rmdup kautta Galaxy, ja 2. käyttämällä jälleen samtools, me käytti kartoituksen tarrat ELAND tiedot eristämään vain lukee kartoitettu at ainutlaatuinen sivustoja hiiren genomissa. Sequence lukee oli 35 tai 36 emäsparia. Kolme tiedostoa Hakkeen-seuraavissa tiedot olivat: ohjaus p65 sirulla (10,7 milj lukee), C26 p65 sirulla (11,1 milj lukee), ja tiedosto edustaa tausta järjestyksessä lukee (8,5 miljoonaa) saadaan yhdistämällä ohjaus ja C26 sonikoitiin kromatiinin joka ajettiin kautta siru ilman primaarista vasta-ainetta (ei vasta-ryhmä). Nämä kolme post-QC sekvenssin .bam tiedostot ovat saatavilla verkossa osoitteessa: (https://drive.google.com/folderview?id=0B0Ph0YwXvamQektEaTFkcElSLTQ usp=sharing) Kohdistettu sekvenssit muunnettiin .sam muotoon ja sen jälkeen ladata huippu Finder ohjelma ChIPseeqer [24] kanssa seuraavat parametrit: 1. kynnys = 5, 2. kertainen muutos = 2 tai suurempi (verrattuna tausta), 3. fragmentti pituus = 250 emäsparia, 4. huippu pituus on vähintään 100 bp ja 5 . piikin erottaminen vähintään 100 emäsparia. Sen lisäksi, että tunnistamisen ohjaus ja C26 p65 huiput suhteessa taustaan ​​(ei vasta-ainetta), ChIPseeqer tunnistettu geeni alueen p65 sitovan huiput (ts genominen sijainti huiput).

asettaa valvonta- ja C26 p65 piikit ajettiin PeakAnalyzer [25] (https://www.ebi.ac.uk/research/bertone/software#peakanalyzer), jotta löydettäisiin geeni lähin TSS jokaisen piikin. Tämä luo luettelon geenien kanssa piikkien alle 100 kb päässä TSS. Luettelot verrattiin sitten luettelot lisääntyy tai vähenee mRNA lausekkeen ohjaus vs. C26 microarray data käyttäen Perl algoritmia sijaitsee sivun kehittämä Jim Lundin yliopistossa Kentucky (https://nemates.org/MA /progs /Compare.html).

Positive Control siru

vahvista oikea sitoutuminen p65-vasta tutkittiin siru, jossa PCR kahden peräkkäisen erittäin tutkittu ja todennettu NF-KB promoottori sitoutumiskohdat hiiren IP-10 (CXCL10) geenin [26]. Tämä siru koe käyttää myös vasta-ainetta p50 (Santa Cruz SC-1190X). Positiivinen kontrolli siru tehtiin chromatin välillä C2C12 lihasputkia jotka oli käsitelty 4 tunnin ajan 10 ng /ml hiiren TNFa. Olemme aiemmin osoittaneet, että tämä hoito voimakkaasti indusoi NF-KB: n lusiferaasireportteri ja lisääntynyt IP-10-mRNA-tasot, jotka molemmat ovat riippuvaisia ​​p65 [27]. Testiä varten kokeilu käytimme menetelmiä kuvattu edellisessä työssä [21]. Lyhyesti, formaldehydin kiinteä chromatin käsittelemättömistä ja TNFa-käsitelty C2C12 lihasputkia immunosaostettiin p65-vasta-p50-vasta-ainetta, tai ei vasta-aine ja proteiini G-jää sakat jalostetaan DNA, joka testattiin PCR: llä käyttäen alukkeita, jotka reunustavat kaksi peräkkäistä NF -κB sivustoja IP-10-geeni. Lisäksi olemme myös arvioida p65 ja p50 sitoutumista IP-10-promoottorin avulla chromatin kontrollista ja C26 lihaksia.

ChIP-PCR Fbxo6

ChIP-PCR suoritettiin alkaen lihaskudosta kiinteä, homogenoitiin ja sonikoitiin kuten ChIP-kohdat, sillä poikkeuksella, että p65-vasta-aine oli kiinnitetty proteiini G magneettiset helmet esi-inkuboimalla (yön yli 4 ° C) ennen inkubaation kromatiinin ja DNA: n tuotteita käytettiin templaattina PCR jossa alukkeita, jotka reunustavat tavoite sitoutumiskohtaan Fbxo6 geenin, joka määritetään ChIP-seq. Kohdesivusto sirun-seq oli ensimmäinen intronin Fbxo6 geenin, 2 kb alavirtaan transkription aloituskohdasta. Sekvenssit käytetyt alukkeet PCR olivat agctcgttgatgtggaccat (vasen-aluke) ja cctcctgctttaggctcctt (oikea aluke) ja tuotti PCR-tuotteen 302 ep: n.

Tilastot

ANOVA tai

t

-testi käytettiin analyysiin, riippuen ryhmien lukumäärä on verrattuna. Tiedot ilmaistaan ​​keskiarvoina ± SE, ja merkitys vahvistettiin

P

0,05. Statistics for microarray data kuvataan microarray osiossa.

Tulokset

karakterisointi C26 kasvaimen kantavien hiirten

Characterization tämän kasvaimen mallia meidän lab mukana rokottaminen CDF1 hiirten C26 kasvainsolujen PBS /Matrigel (n = 164) tai PBS /matrigeelin vain (n = 142). Hiiret lopetettiin 12, 13, 14, 17, 18, 19, 21, 22, 23, 24, 25, ja 26 päivää kasvaimen inokuloinnin. Vaikeissa kakeksia (päivinä 23-26 inokulaation) on kasvain hävisi 22,1% ± 0,8% alkuperäisestä painoindeksi kun taas ei-kasvain valvonnan sai 12,3% ± 0,7% alkuperäisestä painoindeksi (kuvio S2A). Koska syöpäkasvain kasvoi tibialis anterior (TA) lihasmassan vähentynyt (kuviot S2B). TA lihasmassa vakavasti kakektisissa hiirillä oli 40,4 ± 0,3 mg verrattuna 51,1 ± 0,3 mg samanikäisillä ohjaus hiirillä. Kasvain hiirillä vakavia kuihtuminen oli 214 ± 8,7 mg lisäkiveksen rasva pad massa kun ohjaus hiirillä oli 465 ± 10 mg (kuva S2C). Perna massa on kasvain oli 205 ± 4,6 mg: lla verrattuna 75,5 ± 0,7 mg ei-kasvain-hiirissä (kuvio S2D). Syöpäkasvain lisääntyi ajan funktiona inokulaation (Kuva S2E).

vaikutus vallitsevan negatiivisen NF-KB signalointi proteiineja lihassyyrakenne surkastumista C26 on kasvain

Keskimääräinen kuidun