Krooninen sairaus

tiivistelmä

aikana etenemistä pahanlaatuinen vatsakalvon syöpää (MPEM), kasvaimen kyhmyjä levittää hajanaisesti sisällä vatsan ja kasvaimet ovat ominaista selvä fenotyypin sub-tyyppejä. Viimeaikaiset tutkimukset kiinteässä kasvainten syöpä ovat osoittaneet, että syöpä kantasolut (CSCS) on keskeinen rooli taudin alkamisen ja etenemisen kasvaimia. Ei kuitenkaan ole tiedossa, ovatko tuumorigeenisia kantasolut ovat olemassa ja ne edistävät kasvaimen kasvua MPEM. Tässä tutkimuksessa kehitimme ja tunnettu CSC malli MPEM käyttämällä stabiilisti laajennettavissa tuumorigeenisia kantasolut ovat peräisin potilaasta kasvaimia. Löysimme morfologisesti erilliset populaatiot CSCS jotka jakavat epäsymmetrisesti tai symmetrisesti MPEM

in vitro

soluviljelmässä. MPEM kantasolut (MPeMSCs) nimenomainen kantasolujen merkkiaineita c-MYC, NES ja VEGFR2 ja läsnä ollessa matriisin komponenttien solut muodostavat pesäkkeitä aloilla. MPeMSCs ovat multipotentteina, erilaistua hermosolujen, verisuonten ja rasvakudoksen jälkeläiset kun määritellään induktion ja erottamaan solut ilmentävät linjaa-markkereita, kuten TUBB3, varhainen hermosolujen merkki; vWF, VEGFA, VEGFC ja IL-8, endoteelimerkkiaineita; ja PPARy ja FABP4, rasvakudoksen markkereita. Ksenotransplantaatio kokeellisesti MPeMSCs osoitti aikaisin kasvaimen kasvua verrattuna vanhempien soluihin. Rajoittavan laimennuksen kokeet, joissa käytetään MPeMSCs ja endoteelisolujen linjan aiheuttamaa solujen, jotka ovat peräisin yhdestä MPeMSC johti alussa kasvaimen kasvua jälkimmäinen ryhmä, joka osoittaa, että endoteelisolujen erilaistumista MPeMSCs on tärkeää MPEM kasvaimen aloittamista. Havaintomme että MPEM kasvaimet sisältävät kantasolut kanssa Tuumorigeenisuustutkimuksissa on merkittäviä vaikutuksia ymmärtämiseksi solujen alkuperä ja syövän etenemisen MPEM ja siten kohdistaminen CSCS voi olla hyödyllinen strategia estää pahanlaatuinen etenemistä.

Citation: Varghese S , Whipple R, Martin SS, Alexander HR (2012) Multipotentit Syöpä kantasolut ovat peräisin ihmisen pahanlaatuiset peritoneaalisille mesoteliooma altistaa syövän synnylle. PLoS ONE 7 (12): e52825. doi: 10,1371 /journal.pone.0052825

Editor: Joseph Najbauer, City of Hope National Medical Center ja Beckman tutkimuslaitos, Yhdysvallat

vastaanotettu: 13 elokuu 2012; Hyväksytty: 23 marraskuu 2012; Julkaistu: 28 joulukuu 2012

Copyright: © 2012 Varghese et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Kirjoittajat ei ole tukea tai rahoitusta raportoida.

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Cancer Stern- (kuten) -solujen kanssa self -renewal ja kasvaimen aloittamista mahdollisten on tunnistettu eri kasvaintyypeissä [1] – [3] ja viime näyttöä siitä, että nämä solut on keskeinen rooli etenemistä pahanlaatuisia kasvaimia. CSC: n malli kuvaa, että on olemassa pieni alapopulaation muovista solujen transdifferentiation potentiaalia kasvaimia. Kuitenkin viimeaikaiset tutkimukset viittaavat siihen, että suuri osa soluista kasvainten ylläpitää kantasolu- ominaisuudet ja vielä erilaistuneet solut voidaan muuntaa kantasolujen kaltaisia ​​soluja [4], [5]. Jos näin on, poistamista CSCS ehkä ole käyttökelpoinen strategia, joilla vähennetään kasvaimen kasvua. Siksi on tärkeää kehittää malleja ymmärtää CSC biologian ja tunnistaa uusia keinoja estää pahanlaatuisen kasvaimen etenemistä. Mekanismeja, jotka säätelevät itseuudistumisen sekä CSCS ja normaalit kantasolujen uskotaan olevan samanlainen [6]. Tällä hetkellä, tunnistamisen ja eristämisen CSCS on suurelta osin riippuvainen spesifisten solun pinnan merkkiaineiden [7], [8], vaikka ilmentymisen tällaisten merkkiaineiden riippuu eri tekijöistä, kuten erilaistumista tilan solujen ja kapealla tekijät. CD133 on käytetty otaksutun kantasolujen markkerina glioblastooma [9] ja paksusuolen syöpä [10], CD34 ilmentävä kasvain epiteelisolut kuten CSCS on ihosyöpäsoluja [11], CD44 ilmentävien solujen rintasyövän [12], CD26-positiiviset solut ovat mukana prosessissa etäpesäkkeiden, invasiivisuus ja chemoresistance paksusuolen syöpä [13], CD271-positiiviset solut aloittaa melanooman etenemisen ja etäpesäkkeiden [14] ja ominaisuuksia CSCS havaittiin CD24 positiivisia keuhkopussin mesoteliooma soluja [15]. Kuitenkin, ei ole ollut mitään todisteita olemassaolosta kantasolujen kaltaisia ​​soluja, jotka aloittavat kasvaimen kasvua MPEM. Siksi tutkimme läsnäolo tuumorigeenisen mesoteliooma solujen ominaisuuksia CSCS pysyvissä solulinjoissa, jotka ovat peräisin MPEM potilaan kasvaimia.

Pahanlaatuinen vatsakalvon syöpää peräisin diffuusisti sisällä herakalvon limakalvon vatsakalvon se on aggressiivinen syöpä, jossa on merkitty taipumus alueellisia etäpesäkkeitä. Diagnoosin, tämä syöpä on yleensä löytyy vaiheessa diffuusin pahanlaatuisten etenemisen kanssa useita vaihtelevasti kokoinen kasvain kyhmyt. Yleensä kasvaimet ovat huonosti vascularized paksu sisempi ydin, jota ympäröi ulompi neovaskulaarisessa alueella. Hoitovaihtoehdot kuten kirurginen cytoreduction ja systeemistä kemoterapiaa voi ohjata syövän etenemisen joillakin potilailla, mutta potilas kuolema johtuu pääasiassa progressiivinen kasvaimen uusiutumisen. Me raportoi äskettäin, että aktivointi fosfatidyyli 3-kinaasi (PI3K) ja nisäkkään rapamysiinin kohde signaloinnin MPEM liittyy lyhennetään elossaololuku [16]; näistä reiteistä ovat mukana kantasolujen aktivoitumista ja lisääntymistä [17], [18]. PI3K signalointi on myös tärkeää, että ylläpito solun polariteetti syöpäsoluissa [19].

Vaikka johdettu MPEM solulinjat hengissä loputtomiin siirtojen aikana, tässä tutkimuksessa käytimme varhaisen läpikulun soluja, jotka ovat peräisin potilaan kasvainten välttää tietyn osajoukko aggressiivinen kasvain aloittamista solujen säilymisen pitkäaikaisen johtamisella. Täällä tunnistimme, että pääosan takautuvasti syntyy vakaa MPEM soluviljelytutkimuksista tuottavat kelluva solujen ominaisuuksia alkion kantasolujen kuten epäsymmetrinen solunjakautumisen itseuudistumisen ja multipotenttisuus. Satunnaisesti valittua yhden MPeMSCs osoitti klonaalinen etenemistä, fenotyyppinen monimuotoisuus määrätyissä olosuhteissa ja transdifferentiation potentiaaleja. Näin ollen huomattava plastisuus MPeMSCs voivat edistää muodostumista kehityksellisesti erilaisia ​​solupopulaation löytyy kasvaimet ja aggressiivisuutta kasvainten aikana patologisen etenemistä. Yhdessä meidän tutkimus osoittaa, että MPEM satama CSCS ja syövän etenemistä johtuu itseuudistumisen ja erilaistumista CSCS.

Tulokset

Morfologi- Distinct populaatiot MPeMSCs että Jaetaan epäsymmetrisesti tai Symmetrically ja Express Stem Solumerkkiaineet

Yksi vakaa MPEM solulinjat syntyy, Meso-CL1 oli PTEN negatiivinen

(neg) taas Meso-CL2 ja Meso-CL3 oli PTEN ilmentämissolulinjat (Fig. S1). Vaikka kaikki kolme MPEM solulinjat syntyy kantasolujen itseuudistumiseen joka irrottaa ja leijuvan kulttuuri ennen kiinnittynyt kasvu, Meso-CL1 on taipumus tuottaa tuumoriksenografteja kun ihon alle tai vatsaonteloon istutettavien immunosuppressoiduilla hiirillä ja käytettiin tuottamaan MPEM CSC malli . Yleensä nisäkkäiden CSCS muodostavat useita aggregaatteja pallomaisten pesäkkeiden kulttuuri [20]; pesäkkeenmuodostus rajoittui kun MPeMSCs viljeltiin tavanomaisissa kiinnittyvä soluviljelmässä olosuhteissa. Kuitenkin klonaalisia pallo muodostuminen aktivoituu, kun soluja viljeltiin Matrigel levy. Valomikroskoopilla tutkimuksissa on todettu kaksi morfologisesti erilliset populaatiot CSCS vuonna MPEM kulttuuri; soluja tai ilman ulompi kapselointi- peite, sekä näytteille epäsymmetrinen tai symmetrinen jako. Sen osoittamiseksi, että eristettyjä soluja ylläpitää kantasolujen ominaisuuksia, ensin suoritetaan nopeutus tutkimuksia eläviä soluja viljelmässä ja immunofluoresenssitutkimukset formaldehydiä kiinnitettyjä soluja ja totesi, että solut jakautuvat sekä epäsymmetrisesti ja symmetrisesti (Fig. 1A, B). Vuonna epäsymmetrinen jako solut jakautuvat epätasaisesti tuottaa suuren kantasolujen ja pieni solu yleensä ilmaisua kuin kantasolujen. Pulsechase kokeita käyttäen tymidiinianalogi BrdU ovat osoittaneet, että aikana epäsymmetrinen solunjakautumisen templaatti-DNA leimataan BrdU, kun pitkä pulssi, yksinomaan erillisiä uudessa kantasolu, kun taas juuri syntetisoidun DNA tiivistetään erilaistuvia solussa. Lisäksi meillä on myös havaittu, että aikana symmetrinen solunjakautumisen molemmat tytärsoluiksi jaettu templaatti-DNA (Kuva. 1 C). Toinen morfologisesti erilliset populaatio CSCS tunnistettiin MPEM kulttuurin kanssa kapselointi ulkokuori joka muodostuu vanhempien soluista tummina kuplamainen ulokkeita. Juuri muodostunut solut irrotettiin emosolulinjassa ja kellui kulttuuriin ja solujen hatched’-pois ulkokuori aloittaa kasvua. Koska kelluvan luonteen näiden solujen, nopeutus tutkimukset epäonnistuivat; kuitenkin, valo ja fluoresenssimikroskopialla todisteita viittaa siihen, että solut myös jaettu epäsymmetrisesti tai symmetrisesti (Fig. 2A). Kuten myös muissa syöpäsolulinjoissa, olemme myös tunnistettu suuri multi-tumallisten tarttuvien solujen soluviljelmässä, jotka tuottavat yhden tai useampia kantasoluja tyypillisesti peräisin ytimen ilman täydellistä sytokineesiin parentaalisen solun (Fig. 2B).

(A) Aikaväli kuvia epäsymmetrinen ja symmetrinen solunjakautumisen MPeMSCs. Epäsymmetrinen solunjakautumisen (nuolet) muodostaa kaksi epätasainen soluja (ylempi paneeli); symmetrinen solunjakautumisen (nuolet) tuottaa kaksi identtistä solua (alempi kuva). Solukoko esitetään uM. Aika (tunti: minuutti) merkitään vasempaan alakulmaan. Mittaviivat: 20 uM. (B) Fluoresenssikuvia epäsymmetrisen (yläpaneeli) ja symmetrinen (alempi paneeli) solunjakautumisen MPeMSCs. Hoechst tumavärjäystä osoittaa epäsymmetrinen ja symmetrinen jako soluja. (C) DNA erillisiä epäsymmetrisesti solunjakautumisen aikana (ylempi paneeli). Soluja kasvatetaan BrdU useita kohtia (pulssin aikana) ja sen jälkeen pitkän pulssin BrdU poistetaan soluviljelmästä (Chase); BrdU kertyminen jakautuvat solut tutkittiin anti-BrdU-vasta. Vuonna epäsymmetrinen solunjakautumisen templaatti DNA leimataan BrdU erillisiä uudessa tytär kantasolu taas juuri syntetisoidun DNA ilman BrdU etiketti tiivistetään erilaistuvia solussa. Aikana symmetrinen solunjakautumisen BrdU leimattua DNA erillisiä satunnaisesti tytär soluissa (alempi kuva).

(A) muodostus MPeMSCs kanssa Kapselipolysakkaridiantigeenin kattaa sekä mahdolliset epäsymmetrinen ja symmetrinen kantasolujen jako. a, b, CSCS peräisin emosoluilta tummina kupla ulkonemia (nuolet). Solut irrota ja kellumaan kulttuurin ja MPeMSCs ”luukku-out” kapselin (nuolet). c, Epäsymmetrinen solunjakautumisen kapselimainen kantasoluja. Epäsymmetrisesti jakautuvien solujen peräisin kapselin (ylempi paneeli, nuolet) tai solujen jakautuessa epätasaisesti yhdessä kapselin tuottavan kaksi ei-identtisten solujen (alempi kuva). d, Symmetric solunjakautumisen kapselin kantasolujen. Mittaviivat: 100 px. e, f, Fluoresenssikuvia epäsymmetrinen (e) ja symmetrinen (f) solunjakautumisen kapseloidut solut. Nuolet osoittavat ulompi capsular kuorien solu (B), MPeMSCs peräisin tuma monitumaisten solujen; äskettäin muodostettu solu liikkuu sytoplasmassa ja vapautuu emosolulinjassa. b, alkuperä useita CSCS peräisin monitumaisiksi solusta. c Fluoresenssikuvia on monitumaisiksi solun.

Seuraavaksi määritetään, eristetyt MPeMSCs olivat todella peräisin vanhempien pahanlaatuisia mesothelial soluja. Olemme arvioineet ilmaus tunnetaan mesoteliooma markkeri, MSLN, ja sen on todettu vankka geenin ilmentymistä sekä MPeMSCs ja vanhempien MPEM solut (Fig. 3A). Kantasolu ominaisuudet eristetty MPeMSCs lisättiin edelleen määritettiin ilmentymistä tunnettu kantasolujen merkkiaineita, kuten Nanog, Sox2, Oct4, c-MYC ja Klf4 (Fig. 3B). Mielenkiintoista on, että malli ekspression varhaisessa kantasolujen merkkiaineita oli samankaltainen molemmissa emosoluista ja MPeMSCs ottaa huomioon, että c-MYC: n ilmentyminen oli huomattavasti korkeampi MPeMSCs verrattuna vanhempien soluja. Päinvastoin, pluripotenttien kantasolujen markkeri, CD133 ja endoteelisolujen kantasolujen merkkiaineita, CD31 ja CD144 olivat havaittavissa in MPeMSCs (Fig. 3C).

(A) Suhteellinen mRNA: n ilmentymisen on Mesothelin (MSLN) ja (B) kantasolu markkerigeeneihin vanhempien MPEM soluissa ja MPeMSCs. c-MYC ilmentyminen oli merkitsevästi korkeampi (*

p

0,05) MPeMSCs taas muissa kantasolujen merkkiaineita osoittivat verrattain samanlaisen ilmaisun molemmissa ryhmissä. (C) Virtaussytometria arviointi ihmisen CD133, CD31 ja CD144 osoittivat, että proteiinit eivät ilmenny MPeMSCs. Bar kaaviot ilmaistaan ​​keskiarvona ± SEM.

Useita Lineage Induktio MPeMSCs

multipotenttisuus on tunnusomaista kantasolujen. Kuitenkin se ei ole lopullisesti osoitettu, että CSCS voi saavuttaa useita kohtalot upon linjaa induktion. Sen osoittamiseksi, kyky MPeMSCs saavuttaa useita kohtalot, CSCS viljeltiin hermosolujen, verisuonten ja rasvakudoksen erilaistumisen olosuhteissa. Kun subkonfluentteja kiinnittyneet MPeMSCs käsiteltiin trans-retinoiinihapon, minkä jälkeen lisättiin hermo erilaistumisen väliaineen, solut erilaistuvat neuroni-kaltaisia ​​soluja, joilla on tyypillinen hermosolujen morfologia. Fluoresoiva kuvantamisen ja qPCR tutkimukset mRNA ilmaisun osoittivat, että hermosolujen sukua aiheuttama solut ilmensivät hermostoputken kantasolujen markkeri NES ja varhaisessa hermosolujen merkki TUBB3; kuitenkin, BEX1 ei osoittanut mitään merkitsevää eroa MPeMSCs ja hermoston erilaistuneet solut (Fig. 4A). Kelluva hermo kantasoluja, jotka ovat peräisin hermosolujen erilaistuneet solut otettiin talteen ja viljeltiin useiden sukupolvien osoittaa itseuudistumista ja monet näiden solujen näkyy tyypillinen hermosolujen morfologioita.

(A) eriyttäminen MPeMSCs osaksi neuroni kaltaisia ​​soluja hermo erilaistumiseen väliaine (nuoli). Immunofluoresenssi ja suhteellinen mRNA: n ilmentymisen tutkimukset osoittavat, että eriytetty hermosoluissa ilmentävät hermo kantasolujen nestiiniä ja varhaisessa hermosolujen markkeri βIII-tubuliinia (*

p

0,01). (B) endoteelisolujen erilaistumista MPeMSCs on Matrigel pinnalla muotoon putkimainen verkot (nuolet). Fluoresoiva kuvantaminen osoittaa, että solut ilmentävät endoteelisolujen kantasolujen markkeri, VEGFR2 ja ottoa Dil-AcLDL by eriytetty endoteelisolujen. Suhteellinen mRNA ilmaisun tutkimukset osoittavat, että aikana endoteelin erilaistumisen VEGFR2 ja VEGFR3 ilmaisun väheni huomattavasti (*

p

0,05), kun taas ilmaisuja endoteelisolujen markkereita, vWF, VEGFA, VEGFC ja IL-8 huomattavasti (*

p

0,001). (C) Yksi MPeMSC muodostaa pesäke pallo on Matrigel pinnalle seurasi laaja leviäminen MPeMSCs. Mittaviivat 100 px. (D) MPeMSCs erilaistuneet rasvasolut (Oil Red) ja (F) esittää adiposyyttien markkereita PPARy ja FABP4 (*

p

0,01) rasva- erilaistuneita soluja kontrolleihin verrattuna. Bar kaaviot ilmaistaan ​​keskiarvona ± SEM; ND, ei havaittavissa.

vieressä arvioitiin kyky MPeMSCs muodostaa endoteelisoluissa. MPeMSCs ilmaista VEGFR2- endoteliaalinen kantasolujen merkkiaine. Alkion kantasolujen positiivisia VEGFR2 muodostavat verisuonten esisolujen ja muuntua kypsä verisuoniin [21]. Tutkia erilaistumista MPeMSCs osaksi endoteelisolujen linjaa, soluja kasvatettiin viljelmässä ruokia päällystetty kellarissa-kalvo matriisikomponenteista (Matrigel). Matrigelillä, indusoiman endoteelisolujen erilaistumista ja muodostunut putkimainen verkoissa. Geeniekspressiotutkimuksissa endoteelin linjaa aiheuttamaa solujen verrattuna MPeMSCs paljasti, että VEGFR2 ja VEGFR3 ilmaisun vähensi merkittävästi solujen aikana endoteelin erilaistumisen taas ilmaus vWF, VEGFA ja VEGFC ilmentyivät erottamaan soluissa. Vastaavasti, pro-angiogeeninen tekijä, IL-8 osoitti 10-kertaisen kasvun aikana endoteelisolujen erilaistumista verrattuna MPeMSCs. Edelleen vahvistaa endoteelisolujen erilaistumista, soluja inkuboitiin low-density lipoprotein, Dil-AcLDL, ja sen on todettu otto lipoproteiinien endoteelisolujen erilaistuneita soluja (Fig. 4B). Vuonna Matrigel MPeMSCs myös muodostaa pesäkkeitä palloja, jota seuraa laaja solujen lisääntymistä (Fig. 4C). Lisääntyvien solujen tuottaa useita klonaalisia piireissä

in vitro

soluviljelmässä helpottaa nopeaa lisääntymistä endoteelisolujen esisolut.

onko MPeMSCs erilaistumaan rasvasolut, solut altistettiin trans-retinoiinihappo jonka jälkeen rasvakudoksen erilaistumiseen keskipitkän ja testattiin solunsisäisen neutraalien lipidien kertymistä. Lipid talletukset tunnistettiin rasva- erilaistuneita soluja. Ohjaus ja erilaistuneet solut analysoitiin edelleen tunnettujen adiposyytin merkkiaineiden avulla qPCR ja löysi huomattavan säätelyä PPARy ja FABP4 (Fig. 4D, F).

kasvainmuodostusta Single Cell MPeMSCs

Meidän ensimmäinen -tutkimukset MPEM vanhempien soluja ovat osoittaneet, että injektiot 3 x 10

6 Meso-CL1 solut pystyivät tuottamaan sekä ihonalainen ja vatsaonteloon kasvaimia immuunipuutteisilla hiirillä taas Meso-CL2 ja Meso-CL3 olivat ei-tuumorigeenisiä. Vuonna ihon alle injektoidaan hiiriin, Meso-CL1 solut jatkuvasti syntyy ensimmäinen palpoitavissa kasvain päivänä 30 kasvainsolujen transplantaation taas samanlainen injektioita MPeMSCs kesti vain 15 päivää kehittää ensimmäinen kouraantuntuva kasvain. Kääntäen, transplantaatio hermo sukua aiheuttaman solut osoittivat kasvaimen tunnustelu päivänä 35 osoittavat, että sekä vanhempien solut ja hermoston erilaistuneet solut oli samanlaisia ​​Tuumorigeenisuustutkimuksissa. Tutkimukset ovat osoittaneet, että injektiot kasvainsolujen suspendoitu Matrigel on korkeammilla taajuuksilla kasvainten muodostumisen [22]. Meidän

in vitro

tutkimukset osoittivat, että matrigeelin edistetään endoteelin erilaistumisen ja aktivaation angiogeenisten tekijöiden endoteelisolujen erilaistuneita soluja. Näin ollen, on mahdollista, että pieni määrä MPeMSCs voi luoda kasvaimia endoteelin kapealla. Testata merkitys endoteelisolujen erilaistumista MPeMSCs kasvaimen kasvua, suoritimme rajoittavan laimennuksen kokeissa. Viisisataa solut, jotka ovat peräisin yhdestä valitsematta MPeMSC ruiskutetaan matrigeeliin syntyy palpoitavissa hiirissä päivänä 59 sen jälkeen, kun kasvainsolujen transplantaation kun taas hiiret saivat saman määrän soluja suspendoitiin PBS: ään ei kasvanut kasvaimia aikana kaksi kuukautta ajan (Fig. 5A) mikä osoittaa, että endoteelin erilaistumista CSCS on keskeinen kasvaimen kasvua. Testata

in vivo

transdifferentiation endoteelisolujen peräisin MPeMSCs, varhainen kasvaimia, jotka ovat peräisin endoteelin linjan ohjaama solujen yhteistyötä injektoitu matrigeeliä analysoitiin ekspressiota NES ja TUBB3 ja todennut, että solut ekspressoivat sekä hermosolujen proteiinien ( kuva 5B).

(A) Lapsen soluja, joista MPeMSCs johdettu injektoitiin subkutaanisesti (n = 8) oikeaan kylkeen Kateenkorvattomien nude-hiirten (nu /nu). Ensimmäinen palpoitavissa kasvaimen esiintyi päivänä 30 sen jälkeen, kun kasvainsolujen injektion jälkeen. Variantit injektiot MPeMSCs (n = 8) syntyy palpoitavissa kasvaimia 15. päivänä (end-stage kasvaimet esitetty). Rajoittamalla laimennusta kokeissa soluja, jotka ovat peräisin yhdestä MPeMSC jaettiin ja kasvatettiin joko Matrigel levyn indusoimaan endoteelin erilaistumista tai säännöllisesti soluviljelylevy LIF sisältävässä väliaineessa. Viisisataa solut erottaa ensimmäisen ryhmän suspendoitiin uudelleen Matrigel, ja injektoidaan subkutaanisesti (n = 8). Kasvaimia ensin saapuvat tunnustelu päivänä 59 (hiiret, joilla 60 päivää kasvaimen kasvun jälkeen kasvaimen tunnustelu on esitetty), kun taas samanlaiset injektiot MPeMSCs (n = 10), suspendoitiin uudelleen PBS: ään, eivät tuottaneet kasvaimia. (B) hematoksyliinillä ja eosiinilla (H NES ja TUBB3.

Keskustelu

tärkeä havainto tässä tutkimuksessa on tunnistaa CSCS ominaisella epäsymmetrinen kantasolujen jako ja tuumorigeenisyystesti ihmisen MPEM kasvaimissa. Tähän mennessä CSC merkkiaineita on käytetty laajasti tunnistamiseksi ja eristämiseksi kantasoluja kasvaimia. Ei kuitenkaan kantasolujen markkeri on osoittautunut yleinen merkkiaine CSCS. Määritellään kulttuurin MPeMSCs peräisin potilaasta kasvaimista edistänyt itseuudistumisen, pesäkkeiden muodostumisen ja multilineage erilaistumista vahvistaa kantasolujen fenotyyppiä. Tunnusmerkkinä MPeMSCs muihin CSCS on, että solut harvoin muodostavat klonaalinen palloja varsinaisella kiinnittyvä soluviljelmässä ja siksi yksittäisten solunjakautumisen mallia voidaan visualisoida käyttämällä mikroskopia, joka auttaa tunnistamaan ja eristämään CSCS. Epäsymmetrinen solunjakautumisen on ominaista Alkion kantasolujen ja meidän nopeutus tutkimukset osoittivat, että MPeMSCs jakavat epäsymmetrisesti ja tytär solujen periä erillistä sytoplasmista osia [23] muodostaa kantasoluja ja erottamaan soluja. Tämä havainto tuki lisäksi Pulsechase BrdU merkintöjä menettelyn ja totesi, että templaatti-DNA säilyy sisällä tytär kantasolu. Lisäksi löysimme symmetrinen solunjakautumisen MPeMSCs tuottavien solujen likimain samansuuruisia. Näiden lisäksi ominainen kantasolujen rajapintojen MPeMSCs näyttää eri mekanismi kantasolujen lisääntymistä tuottamalla solut kapseloidaan kalvo ulkokuoren. Nämä solut yleensä kellumaan kulttuuriin, ja näyttää sekä epäsymmetrinen ja symmetrinen jako. Merkitys Kapselipolysakkaridiantigeenin kantasolujen muodostumista on tutkittava tarkemmin. On mahdollista, että muodostavat tällaisia ​​kapseloidut solut on kapealla homeostaasin riippuvainen ja jonka avulla CSCS lisääntyä nopeasti ja selviytyä epäsuotuisissa kapealla olosuhteissa. Ainutlaatuisia morfologisia ominaisuuksia näitä soluja voidaan käyttää myös tunnistamaan CSCS

in vitro

. Johdettujen MPeMSCs osoittavat merkittävää ilmentymistä MSLN, näkyvä merkki mesoteliooma [24] osoittaa, että CSCS peräisin vanhempien mesoteliooma soluja. Kantasolujen merkkiaineita testattava kummassakin vanhempien soluissa ja MPeMSCs osoittavat yhtäläisyyksiä niiden ilmaisun, paitsi MYC onkogeeni, ja tämä johdonmukaisuus geeniekspression osoittaa, että vanhempien solut myös potentiaalia erilaistamattomuuden [5]. Myc onkoproteiinia joka aktivoituu useissa kasvaintyypeissä [25] on merkittävästi yliaktiivista MPeMSCs; MYC geeni on tärkeä kantasolujen lisääntymistä ja ylläpitoa varten pluripotenttien ominaisuuksien kantasolujen [26], [27].

Viimeaikaiset raportit kantasolujen kaltaisia ​​soluja, jotka ovat peräisin glioblastooma mukaan CSCS erilaistuvat endoteelisolujen aikana kasvaimen kasvua [28], [29]. Edelleen vahvistaa läsnäoloa kantasolujen fenotyyppiä MPEM, testasimme multipotenttisuus on MPeMSCs kasvattamalla niitä useita erilaistumisen olosuhteissa. Soluja ensimmäinen viljeltiin seerumittomassa minimoidaan hermosolujen erilaistumiseen olosuhteet ja totesi, että MPeMSCs erilaistuneet solut tyypillinen hermo morfologia ja ilmaisi hermosolujen markkereita. Havaitsimme NES tärkeä neuronaalinen kantasolu markkerin MPeMSCs ja sen ilmentyminen havaittiin myös ksenograftikasvaimissa osoittaa, että neuronaalista erilaistumista endoteelisolujen on mahdollista kasvaimen kasvun aikana. Samoin endoteelisolujen kantasolujen markkeri VEGFR2 ilme oli myös selvästi korkea MPeMSCs; matriisissa kapealla soluja erilaistuneet endoteelisolut [9] tyypillisiä putkimainen verkot viittaa MPeMSCs kiinteästi ohjelmoitu endoteelin erilaistumista. Tämä suora osuus MPeMSCs kasvaimeen verisuonistoon saattavat olla tärkeitä nopeasti ja hajanainen kasvaimen kasvua löytyy MPEM potilailla. Neural kantasolut ovat ektodermaalinen alkuperältään taas endoteelisoluissa peräisin Mesodermi. Kuitenkin, endoteelisolujen kaltaisia ​​soluja voidaan johtaa hermo kantasoluja [30]. Meidän tutkimuksissa (julkaisemattomia tuloksia), kun hermo erilaistuneet solut ympättiin Matrigel levy, solut erilaistuvat endoteelisolujen tyypillinen putkien verkostoja osoittaa transdifferentiation solulinjasuuntautuneita soluja. On raportoitu, että endoteelisolut transdifferentiate osaksi mesenkyymisolujen aiheuttaa varren kaltaisia ​​ominaisuuksia [31]. Kliiniset tutkimukset ovat osoittaneet, että hyöty antiangiogeeninen terapiassa syövän ovat rajalliset, ja monissa tapauksissa antiangiogeenisestä hoitojen seurauksena ensimmäinen vastaus seuraa kasvaimen uusiutumisen [32]. Tässä yhteydessä verisuonten erilaistumista CSCS alueella asuville kasvaimia voi olla keskeinen rooli nopeasti täydennystä endoteelisoluissa.

o tutkimus on tähän mennessä osoitettu, että tietyssä solutyypissä käynnistää kasvaimen kasvua potilailla. Meidän alustava ksenotransplantaatio -tutkimukset leukemiaestotekijä (LIF) käsiteltiin erilaistumaton MPeMSCs osoittivat kasvaimen varhaiseen induktio hiirissä osoittavat, että MPeMSCs ovat tuumorigeenisiä. Vaikka MPeMSCs eivät muodosta pesäkkeitä pallojen kiinnittyvä soluviljelmässä, yksittäinen soluviljelmässä matriisissa levy luotu siirtomaa aloilla osoittavat kantasolujen fenotyyppiä johdettujen solujen. Tässä tutkimuksessa olemme tuottaneet CSC kasvaimen malliin käyttäen rajoitettua määrää solut lisääntyivät yhdestä MPeMSC. Tämän tutkimuksen tulokset, kun niitä tarkastellaan yhdessä

in vitro

todisteita tukevat sitä mallia, jossa MPeMSCs uudelleensuspendoitiin Matrigel edistää aggressiivinen kasvaimen kasvua pääasiassa johtuen endoteelin erilaistumista CSCS koska kaikki pistetään hiirille kehittyi palpoitavissa kasvaimia noin 60 päivän kuluessa kasvaimen solun injektio. Kääntäen, kasvain tunnustelu ei ilmennyt hiirillä ruiskutetaan erilaistumattomilla MPeMSCs uudelleensuspendoidaan PBS. Vaikka solujen Tuumorigeenisuustutkimuksissa tasaisin kahteen ryhmään, matriisin komponenttien edistänyt pesäkkeiden muodostumista ja nopea induktio endoteelisolujen linjaa. Kasvaimissa endoteelisolujen dedifferentiate tai transdifferentiate muodostaa enemmän varsi kaltaisten solujen tai muiden erillisten solutyyppien, jotka saattavat edistää varhaista kasvaimen kasvua. On osoitettu, että mikroympäristö ympäröivän uudissuonittumisen kasvaimia on erittäin proliferatiivinen ja CSCS on havaittu lähellä endoteelisoluihin [33]. Yhdessä meidän tietojen mukaan multipotenttisuus ja plastisuus MPeMSCs voi olla osasyynä varten MPEM kasvaimen kasvua potilailla. Tarkempi tarkastelu liittyvien tekijöiden CSC lisääntymistä ja sukua eriyttäminen voi tarjota tärkeitä oivalluksia kehittämistä MPEM ja voi tarjota perustan kehittämistä tehokkaampia hoitointerventioiden.

Materiaalit ja menetelmät

Cell Lines, Cell Culture ja eristäminen MPeMSCs

MPEM solulinjoja (Meso-CL1, Meso-CL2 ja Meso-CL3) olivat peräisin ihmisen MPEM kasvaimista kerätään laitos Review board hyväksyttyjen käytäntöjen National Cancer Institute ja tiedotetaan suostumus saatiin kaikilta potilailta käytöstä kasvaimen näytteet, mukaan lukien solu- linjat [15]. Soluja viljeltiin RPMI-1640 (RPMI; Gibco), jota oli täydennetty 10% v /v FBS (Atlanta Biologicals) tavanomaisissa soluviljelyolosuhteissa kosteutetussa 5% CO2-inkubaattorissa 37 ° C: ssa. Solut vahvistettiin mesoteliooma immunohistokemiallisesti tunnettujen mesoteliooma markkereita ja elektronimikroskoopilla ja karakterisoitiin

in vitro

kasvuominaisuudet ja

in vivo

ksenograftin kasvua. Vaikka kaikki kolme MPEM solulinjoissa syntyy kelluva kantasoluja, Meso-CL1, PTEN

(neg) solulinja, jolla on mahdollisuudet tuottaa sekä ihonalainen ja vatsaonteloon kasvaimia kateenkorvattomissa nude (nu /nu) hiirissä käytettiin tutkimuksessa. Olemme aktivoitu kantasolujen sukupolven MPEM soluissa ymppäämällä ne subkonfluentteja tiheys minimoida solu-solu kiinnityspisteen 5% v /v FBS-RPMI (seerumin vähennetty väliaine). Näissä olosuhteissa MPeMSCs läsnä vanhempien solupopulaation tuottavat kelluva kantasoluja, jotka kerättiin sitten ja viljeltiin LIF säilyttää ne eriyttämätön tilassa. Kelluva MPeMSCs kerätään LIF käsitelty soluviljelmää käytettiin myöhemmissä kokeissa. Kaikkien kokeiden MPeMSCs viljeltiin ilman LIF ellei toisin ole ilmoitettu.

Short-Time solujen kuvaamiseen ja Immunofluoresenssikoe

Voit selvittää, että eristetty kelluvat solut olivat CSCS, ensin tutkittu kantasolujen jako elävissä soluissa time-lapse -tutkimukset mikroskoopilla (Olympus IX71); kuvat otettiin käyttäen CellSens ohjelmistoa. Immunofluoresenssi-, solut kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä 10 min ajan huoneenlämpötilassa, ja sitten sitä käsiteltiin 0,2% Triton X-100 (Sigma) PBS: ssä 10 minuutin ajan, paitsi havaitsemiseksi solun pinnan proteiineja. Solut pestiin PBS: llä, ja blokattiin 5% BSA: ta PBS: ssä, joka sisältää 0,25% NP-40: ssa 30 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Soluja inkuboitiin sitten jokin seuraavista primaaristen vasta-aineiden: Alexa Fluor konjugoitu monoklonaalinen anti-α-tubuliinin (1:1000, Millipore), Alexa Fluor konjugoitu falloidiinia (1:1000; Invitrogen), Hoechst 33342 (1:5000; Sigma) , anti-nestiinin (anti-NES, 1:250, Millipore), anti-βIII-tubuliinia (anti-TUBB3, 1:1000, Covance), anti-verisuonen endoteelin kasvutekijän reseptori (anti-VEGFR) 2 (1:200 ; Cell Signaling), anti-CD133 /1-allofykosyaniinin (APC, 1:100; Miltenyi Biotech). Seuraavat toissijainen vasta Molecular Probes (Invitrogen) käytettiin: Alexa Fluor konjugoidut hiiren tai kanin anti-IgG (1:1000). Toissijainen vasta yksin tai hiiren IgG1 toimi kontrollina epäspesifinen sitoutuminen. Kuvat otettiin käyttäen joko Olympus CKX41 fluoresenssimikroskoopilla varustettu F-View II CCD digitaalisen kameran tai käyttämällä Olympus 1 × 81 mikroskoopilla Fluoview-1000 konfokaali laserskannerin.

BrdU Labeling ja Chase

täsmentämiseksi epäsymmetrinen solunjakautumisen MPeMSCs, etsimme testata erottelun templaatti-DNA aikana mitoosissa käyttäen 5-bromi-2-deoksiuridiinia (BrdU) Pulsechase [34]. Lyhyesti, MPeMSCs käsiteltiin 1 uM BrdU (Sigma) useiden kohtien varmistamiseksi DNA säikeet leimattiin BrdU in valtaosa soluista. Kun pitkä pulssi BrdU poistettiin soluviljelmästä ja tutkittiin BrdU merkintöjä kuvio solunjakautumisen aikana. Solut kiinnitettiin 70% etanolissa ja inkuboitiin 2 N HCI, joka sisältää 0,5% Triton X-100: ssa 1 tunti. ja blokattiin 5% BSA: ta, joka sisältää 0,25% NP-40. Solut pestiin ja inkuboitiin anti-BrdU-FITC-vasta-ainetta (BD Biosciences), yön yli 4 ° C: ssa, pestiin ja vastavärjättiin DAPI. BrdU merkinnät kuvio solut katsella esimerkiksi Olympus 1 × 81 mikroskoopilla Fluoview-1000 konfokaali laserskannerin.

RNA valmistelu, reaaliaikainen kvantitatiivinen PCR ja Western-blottaus

Yhteensä RNA eristettiin -soluissa käyttämällä Trizol (Invitrogen) ja esikäsitelty DNaasi. Yhteensä 1 ug RNA: ta käänteiskopioitiin cDNA: Reverse Transcriptase III (Invitrogen) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti.