Krooninen sairaus

tiivistelmä

Maksansiirto varten maksasolusyövän (HCC) johtaa tiettyyn tilaan, jossa immuunivaste on mahdollisesti kohdistuu Sekä allogeenisen ja syöpäantigeenejä. Olemme tutkineet tason syövän immuniteetin aikana allogeenisen immuunivasteen. Tumma Agouti-to-Lewis ja Lewis-to-Lewis rotan maksan elinsiirroissa suoritettiin ja vastaanottajien syövän immuniteetti analysoitiin aikaan alloimmuunitrombosyto- aktivoinnin. Esiintyminen hylkääminen allogeeniseen vastaanottajille vahvistettiin lyhyempi elinaika (

p

0,01), lisääntynyt maksa-arvot (

p

0,01), läsnäolo hyljinnän merkkejä histologian, ja luovuttajan-erityinen

ex vivo

sekalymfosyyttireaktiossa. Tuolloin alloimmuunitrombosyto- aktivoinnin, veren mononukleaariset solut allogeenisen ryhmän havaittu olevan anti-cancer sytotoksisuus (

p

0,005), joka liittyy lisääntyneeseen luonnollisen tappaja (NK) solun taajuuden (

p

0,05) ja korkeampi monosyyttien /makrofagien aktivoitumisen taso (

p

0,01). Samoin maksan NK-solujen syöpälääkkeen sytotoksisuus (

p

0,005), ja maksan monosyyttien /makrofagien aktivoitumisen tasot (

p

0,01) on myös lisääntynyt. Alloimmuunitrombosyto- liittyvä sytotoksisuus välittyi läpi NKG2D reseptorin, jonka ekspressio lisääntyi hylätyt siirteen (

p

0,05) ja NK-solujen ja monosyyttien /makrofagien. NKG2D ligandit ilmentyvät rotan HCC-soluissa, ja sen estäminen esti alloimmuunitrombosyto- liittyvää sytotoksisuutta. Vaikka odottaa

in vivo

validointi, alloimmuunitrombosyto- liittyvä sytotoksisuus jälkeen rotan maksansiirron näyttää liittyvän lisääntyneeseen taajuuksia ja tasoja aktivaation NK-solujen ja monosyyttien /makrofagien ja on ainakin osittain kautta välittyvää NKG2D reseptoriin.

Citation: Lacotte S, Oldani G, Slits F, Orci LA, Rubbia-Brandt L, Morel P, et al. (2014) alloimmuunitrombosyto- Activation Edistää Anti-Cancer sytotoksisuus jälkeen Rat maksansiirron. PLoS ONE 9 (3): e91515. doi: 10,1371 /journal.pone.0091515

Editor: Jacques Zimmer, Centre de Recherche Julkinen de la Santé (CRP-Santé), Luxemburg

vastaanotettu: 06 joulukuu 2013; Hyväksytty: 11 helmikuu 2014; Julkaistu: 20 maaliskuu 2014

Copyright: © 2014 Lacotte et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat avustusta Swiss National Science Foundation (PP00P3_139021), The Artères Foundation, Astellas Euroopan elin- ja Boninchi säätiö, Elsie ja Carlos de Reuter, ja Marie-France ja Francis Minkoff Foundation. Christian Toso tukivat professuurin Sveitsin National Science Foundation (PP00P3_139021). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Maksansiirto on tehokkain hoito potilailla, joilla varhaisessa leikkaushoitoon maksasolusyövän (HCC) [1], [2]. Kuitenkin 15% vastaanottajien kokemusta elinsiirron jälkeen HCC toistuminen, mikä johtaa nopeasti kuolemaan lähes kaikilla potilailla [3]. Erilaisia ​​strategioita on ehdotettu laskevan tämän riskin, kuten parannettu elinsiirtoa valintakriteerien kohdentaminen verenkierrossa HCC-solujen, käyttö adjuvanttia syöpälääkkeet ja edistänyt syöpälääkkeen immuniteetti [4].

Elinsiirrot HCC on ainutlaatuinen kunnossa, immuuniaktivaatiota suunnattu sekä allogeenisen luovuttajan ja syöpäantigeenejä. Tämä kaksijakoinen aktivointi on harvoin tutkittu. Alloimmuunitrombosyto- aktivointi saa kohdistuu erityisiä allogeenisiä antigeenejä tai kytkeä laajempi aktivointi myös edistää ei-spesifinen syövän immuunivasteen. Jälkimmäinen olettamus on ehdottanut useita tutkimuksia, jotka osoittavat suurempi riski elinsiirron HCC uusiutumista potilailla, joiden syvällisempi immuuni esto; Esimerkiksi käytön jälkeen anti-lymfosyyttien vasta-aineita tai kun kyseessä on liialliselta kalsineuriinin estäjä [5] – [8]. Lisäksi, vähentynyt ilmentyminen yhden NKG2D ligandin HCC kasvaimia, neutrofiili–lymfosyyttien veri-suhteet ja kasvaimeen liittyvien makrofagien määrä on myös liitetty HCC toistumisen [9] – [12].

Ihannetapauksessa allogeeninen koskemattomuus olisi estettävä ja syövän vastaisen immuniteetin edistettävä. Parempi ymmärrys cross-talk välillä on siis toivottavaa, jotta voitaisiin paremmin määritellä välittäjinä ja mekanismeja kunkin immuniteetin. Lopulta tällaiset tiedot auttavat määrittelemään ihanteellisen immunosuppressio yhdistelmä maksansiirron jälkeen HCC.

Tässä tutkimuksessa arvioidaan tasoa syöpälääkkeen sytotoksisuus maksassa, pernassa ja veri jälkeen allogeenisen rotan maksansiirron. Siinä määritellään rooli tiettyjen immuunijärjestelmän solutyyppien, mukaan lukien luonnolliset tappaja (NK) solujen ja monosyyttien /makrofagien eikä toiminnan avain NK-solun reseptorien.

Materiaalit ja menetelmät

Eläimet, maksansiirtoa ja etiikka lausunto

Kokeet suoritettiin urosten Lewis ja Tumma Agouti (DA) rottia, jotka painoivat 200-250 g (7-8 viikkoa vanhoja, Janvier). Ne tehtiin ortotooppisille maksansiirtoa protokollan mukaisesti aiemmin kuvattu [13]. DA-to-Lewis transplantations (allogeeninen malli) katsottiin valmisteluryhmän, ja Lewis-to-Lewis transplantations käytettiin syngeneeisissä valvontaa (kuusi eläintä kussakin ryhmässä eloonjäämisen arviointi). Kaikki eläimet hoidettiin mukaan kansainvälinen suuntaviivoja Animal Care, ja eettinen hyväksyntä saatiin eettisen komitean yliopistossa Geneve ja Geneven eläinlääkintäviranomaisten (nro 1052/3653 /3).

Rat HCC solulinjat

JM-1-solut ystävällisesti George Michalopoulos (University of Pittsburg) [14]. MCA-RH7777-solut hankittiin ATCC (Molsheim, Ranska). Molemmat solulinjat viljeltiin DMEM korkealla glukoosipitoisuuden (Gibco).

maksa-arvot Assessment, Maksa histologia ja immunoleimaus

merkkien havaitsemiseksi maksan hylkäämistä, seerumin maksa-arvot, mukaan lukien aspartaattiaminotransferaasi (ASAT), alaniiniaminotransferaasin (ALT) ja bilirubiini arvioitiin yksi päivä, kolme ja kymmenen elinsiirron jälkeen. Seerumitasot mitattiin yhteistyössä Keski kliinisen sairaalan laboratorion (Synchron LX20). Näytteitä yhdeksän eläintä kussakin ryhmässä analysoitiin.

Läsnäolo hylkääminen myös arvioitiin histologiaa hematoxin /eosiinivärjäykset maksan näytteet haettu päivänä kymmenen siirron jälkeen. Taso hylkääminen oli sokeasti luokiteltava asiantuntijan maksan patologi mukaan Banff luokitusta [15]. NK-solut leimattiin on kryoleikkeet anti-NKRP1 (CD161, 10/78, Biolegend) ja sen jälkeen Alexa Fluor®555 aasin anti-hiiri-IgG (Invitrogen). Makrofagit leimattiin parafiiniin upotetut leikkeet polyklonaalisilla kanin anti-Iba1 (Wako) ja sen jälkeen Alexa Fluor®555 aasin anti-kani-IgG (Invitrogen).

ääreisveren, pernassa ja maksassa mononukleaaristen solujen eristäminen

häntälaskimoon verinäytteitä (500 ui) kerättiin 150 ui happositraattidekstroosiin. Maksan ja pernan haettiin keskilinjan vatsan aukaisu jälkeen 10 U IV hepariinia injektiona. Maksa perfusoitiin HBSS, joka sisälsi 0,5 mg /ml kollagenaasi D (Sigma). Se leikattiin pieniksi paloiksi, suspendoitiin uudelleen HBSS /kollagenaasin liuosta, inkuboidaan 37 ° C: ssa 20 min. Solususpensio pestiin ja suodatettiin nailonverkon. Perna oli paloiteltu, murskattu ja suodatetaan nylon mesh. Perifeerisen veren, maksan ja pernan solut puhdistettiin Ficoll PAQUE (GE Healthcare) tiheys kaltevuus. Eristetty mononukleaarisia soluja pestiin ja laskettiin.

sekalymfosyyttireaktiomää- ja ELISA

Oheislaitteet ja perna allogeenisen immuuni aktivoinnit testattiin sekalymfosyyttireaktiot. Cell inkubaatiot suoritettiin 96-kuoppaisilla-levyille 200 ui RPMI 1640 (Gibco), 10% FCS: ää (Invitrogen), 1 M HEPES (Invitrogen) ja 1 U /ml /1 ug /ml penisilliiniä-streptomysiiniä ja 0,29 mg /ml L -glutamine (Gibco). Responder Lewis soluja (2,5 x 10

5) neljästä allogeenisten ja neljä syngeenisen vastaanottajat inkuboitiin 2,5 x 10

5 säteilytettyä stimulaattori DA (tai kolmas osa) pernasolua (5000 rad) 37 ° C: ssa /5% CO

2: ssa 24 tuntia.

taso interferoni-gamma (IFNy), kvantitoitiin ELISA-menetelmällä. Polystyreeni (Costar) päällystettiin yön yli 4 ° C: ssa puhdistetulla rotan anti-γIFN (1:500, klooni DB-1, Biolegend) karbonaattipuskurissa. Levyt pestiin ja kyllästettiin 30 minuutin ajan täydennettyä RPMI 1640-väliaine. Soluviljelmän supernatantit lisättiin kahden tunnin ajan, minkä jälkeen biotiini anti-rotta-IFNy (1:1000, Poly5109, Biolegend), streptavidiini-piparjuuriperoksidaasi (1:1000, Biolegend) ja substraattiliuosta (TMB reagenssi, R Dsystem). Taso IFNy saatiin mukaisesti laimennuskäyrästä.

virtaussytometria Vasta-aineet ja Sytotoksisuusmääritys

fenotyyppi veren, maksan ja pernan mononukleaarisia immuunisolujen arvioitiin virtaussytometrialla. Leimaus suoritettiin käyttäen vasta-aineita CD3: a vastaan ​​(1F4) (BD Pharmingen), CD4 (W3 /25) (Biolegend), CD8 (OX-8), CD172a (OX-41) monosyyttien /makrofagien ja NKRP1 (CD161, 10/78 ) NK-solujen. Solun fenotyyppi arvioitiin yhdeksän eläintä ryhmää kohti.

NK-solujen reseptorit arvioitiin käyttäen anti-NKG2D (11D5F4) (eBiosciences) ja anti-NKp30 (sc-33647) (SantaCruz) vasta-aineita. Läsnäolo NKG2D-ligandien testattiin JM-1 ja MCA-RH7777 solulinjoja inkubaation jälkeen hiiren rekombinantti NKG2D-Fc-kimeeran (139-NK-050, R 0,05.

Tulokset

Arvio Alloimmunity ja hylkääminen

Läsnäolo alloreactivity oli nimenomaan tarkasteltiin koska jotkut allogeenista rotta-to-rotan maksansiirtoa mallit johtavan vain vähäistä alloimmunity ilman akuuttia solujen hylkäämiseen [16]. Kuten kirjallisuudessa on kuvattu, tutkittujen DA-to-Lewis ortotooppisille rotan maksan elinsiirroissa liittyivät lyhyempi eloonjääneiden verrattuna syngeenisiin transplantaatioita (elinajan mediaani: 13 vs. 60 päivää, p = 0,0037, tuloksia ei ole esitetty). Seerumin maksa-arvot (ASAT ja ALAT) lisättiin jälkeen päivä kolme allogeeniseen vastaanottajille (kaikki p 0,01 vs. syngeneeisissä valvontaa, Fig. 1A). Bilirubiini taso nostettiin 10 päivän jälkeen allogeeniseen vastaanottajia (p = 0,026 vs. syngeneeisissä valvontaa, Fig. 1 B).

(A) Seerumin aspartaattiaminotransferaasi (ASAT) ja alaniiniaminotransferaasin (ALAT) tasot jälkeen allogeenisen Tumma agouti-to-Lewis (musta) ja syngeenistä Lewis-to-Lewis (valkoinen) rotan maksan transplantations. (B) bilirubiiniarvoja tasot jälkeen allogeenisen (musta) ja syngeenisiä (valkoinen) elinsiirtoja. (C) edustaja hematoxilin-eosiini värjättyä koepaloja päivänä 10 allogeenisen (oikealla) ja syngeenisiä (vasemmalla) rotan maksansiirto. (D) Elinsiirron jälkeinen veren CD4 /CD8-suhteet päivänä 7 (D7) ja 11 (D11). (E) IFNy erityksen jälkeen perifeerisen veren mononukleaarisia soluja (PBMC) sekalymfosyttireaktion päivänä kymmenen elinsiirron luovutetulla (DA) ja kolmas osa stimulaatiota. * P 0,05, ** 0,01.

läsnäolo solun Hylkääminen vahvistettiin päivänä 10 histologia ja sai arvosanan Banff 8 kaikissa tutkituissa allogeenistä vastaanottajille. Syngeeninen ohjaus vastaanottajat luokiteltiin Banff 0 (Fig. 1 C). Lisäksi reuna CD4 /CD8-suhde 11. päivänä oli huomattavasti alhaisempi allogeeniseen vastaanottajat verrattuna syngeneeisissä vastaanottajille (2,9

vs

. 3.6, p = 0,0051, Fig. 1 D). Lopuksi alloimmunity oli nimenomaan suunnattu luovuttajan antigeenejä osoituksena päivä 10 sekalymfosyyttireaktiot vastaan ​​DA pernasolua (supernatantti IFNy pitoisuus: 410 pg /ml

vs

. Huomaamaton) ja puuttuminen vastaan ​​kolmannen osapuolen Fisher rotta antigeenejä (Fig. 1 E).

Alloimmunity-Associated Peripheral sytotoksisuus

Kun pyritään arvioimaan hylkäämistä syöpälääkkeen immuniteetti, sytotoksista aktiivisuutta perifeeristen immuunisolujen testattiin

ex vivo

syöpää Yac-1-soluissa. Tuolloin alloimmuunitrombosyto- aktivointi (päivä 10), tason reuna-sytotoksisuuden nostettiin allogeeniseen vastaanottajat verrattuna Geneettisesti valvonnan ja naiivi rottia (efektori /kohde 40/1: 25,2%

vs

. 14,7% ja 9,4%, p = 0,0025, Fig. 2A). Tämä malli havaittiin kaikilla testatuilla laimennoksina (4/1, 10/1, 40/1).

(A)

Ex vivo

PBMC syöpälääkkeen sytotoksisuus päivänä kymmenen jälkeen allogeenisen ja syngeeniset elinsiirroissa ja naiivi verrokkirotissa eri efektori /kohde-suhde (E /T). (B) tiheys NKRP1

korkea solujen (NK-solujen) joukossa PBMC päivänä 7 (D7) ja 10 (D10) elinsiirron jälkeen. Virtaussytometria dot-plot arvioi gating strategiaa. (C) Virtaussytometria dot-juoni ja histogrammi arvioidaan gating strategian monosyyttien /makrofagien (CD172 +) ja NKRP1 ilmaisun tasolla CD172 + soluihin. (D) Taajuus monosyytti /makrofagi (CD172 + solut) keskuudessa PBMC. (E) Aktivointitaso monosyytti /makrofagien (NKRP1 ekspressiotaso (fluoresenssin voimakkuuden keskiarvo (MFI)) kesken CD172a + solut). * P 0,05, ** 0,01.

Sen arvioimiseksi, täyttääkö muutettu sytotoksisuus liittyi vaihtelua solualaryhmiä, virtaussytometria analyysit suoritettiin PBMC. NKRP1 (CD161), joka on C-tyypin lektiini kalvo glykoproteiini, ilmentyy voimakkaasti NK-solujen ja käytettiin merkkiaineena rotan NK-soluja [17]. Päivänä seitsemän, NK-solun taajuuden (CD3

– NKRP1

korkea) pieneni merkitsevästi allogeeniseen vastaanottajat verrattuna syngeenistä kontrolleihin (2,1%

vs

. 3,4%, p = 0,028, kuva 2B). Tämä vähentynyt taajuus reuna-NK-solujen on linjassa aiemmin havaittu migraation NK-solujen maksaan varhain allogeenisen elinsiirron [18]. Päivänä 10, havaitut lisääntynyt reuna-sytotoksisuutta liittyi suurentunut veren NK-solujen frekvenssi (10,79% allogeenisilta

vs

. 4,9% syngeenisissä, p = 0,048).

monosyyttien /makrofagien voi myös olla mukana sytotoksinen tapahtumiin syöpäsoluja vastaan. Päivä 10 monosyytti väestöstä (CD172a

+) lisääntyi sekä allogeenisia ja syngeenisen vastaanottajat verrattuna naiivi kuin siirrettyjen valvontaa, johtui todennäköisesti jonkin verran epäspesifistä perioperatiivisena immuuniaktivaatiota (16,6%

vs

. 10,7%

vs

. 5,58%, tässä järjestyksessä; p = 0,1 Allogeenisiin

vs

. naiivi; p = 0,023 syngeenisille

vs

. naiivi, Fig. 2D). Tämä sanoi, korkein taajuus havaittiin allogeenisten vastaanottajia (vielä oli tilastollisesti merkityksetöntä, p = 0,455 Allogeenisiin

vs

. Syngeenisiä). Lisäksi taajuus aktivoidut monosyytit ilmentävien NKRP1 (CD161) oli suurempi allogeeniseen vastaanottajat verrattuna Geneettisesti valvontaa ja naiivi kuin siirrettyjen eläinten (fluoresenssin voimakkuuden keskiarvo 1282

vs

. 568

vs

. 438, p = 0,0004, Fig. 2E) [19].

puuttuminen Alloimmunity-Associated Perna sytotoksisuus

jotta paremmin luonnehtia havaittu reuna-sytotoksisuus, arvioimme allogeenistä ja anti-syövän immuuni tapahtumia perna. Päivä 10 pernasoluja allogeenisten rottien stimuloidaan luovuttajan solut (DA) erittyy enemmän IFNy kuin pernasolut syngeenistä rottien, läsnäolon vahvistamiseksi luovuttajan-erityinen allogeenisen vasteen pernassa (684

vs

. 99 pg /ml, p = 0,028, Fig. 3A). Kääntäen, lajiteltu pernan NK-solut osoittivat mitään eroa sytotoksisuuden välillä allogeenisten ja syngeenisen vastaanottajia (efektori /kohde-suhde 10/1: 42,2 vs. 48,3%, p = 0,30, Fig. 3B). Vastaavasti mitään muutoksia lukumäärän ja fenotyypin pernasolujen voitiin havaita (tuloksia ei ole esitetty).

(A) IFNy erityksen jälkeen pemasolu sekalymfosyttireaktion päivänä kymmenen elinsiirron kanssa luovuttajan ja kolmannen osan stimulaatio . (B)

Ex vivo

perna NK-solujen syöpälääkkeen sytotoksisuus päivänä kymmenen jälkeen allogeenisen ja syngeenistä elinsiirtoja.

Alloimmunity-Associated Maksa mononukleaarisolun Activation

immuunivaste maksan mononukleaaristen solujen testattiin 10. päivänä siirron jälkeen. Eristyksen jälkeen määrä maksan mononukleaaristen solujen nostettiin allogeeniseen rotilla verrattuna niiden syngeneeisissä kollegansa (16 x 10

6

vs

. 5,35 x 10

6 solua /maksa, p = 0,004 ).

Tämä nousu mononukleaaristen solujen määrä liittyi lisääntynyt määrä NK solujen allogeeninen siirre (19,5

vs

. 3 Geneettisesti siirteen, p = 0,006, Kuva. 4A) ja lisääntyneeseen makrofagien määrä (131

vs

. 34,5 syngeenisessä siirteen, p = 0,0034, Fig. 4B). Nämä kaksi solua osajoukot havaittiin sekä maksan parenchyma ja solujen infiltraatit Allogeeni- siirteen. Havaittu muutos solujen määrä oli yhteydessä lisääntyneeseen aktivointia. Lajiteltu maksan NK-solujen osoitettiin lisääntynyt syöpälääkkeen sytotoksisuus allogeeniseen vastaanottajia (efektori /kohde-suhde 10/1: 58.8%

vs

. 32%, p = 0,030, Fig. 4C). Huomattavaa on, että allogeeninen rotan maksansiirtopotilailla osoitti suuntaus kohti suurempaa sytotoksisuutta maksan-lajiteltu NK verrattuna perna-lajiteltu NK-solut (efektori /kohde-suhde 10/1: 58.8% vs. 42,2%, p = 0,101). Tämä korkeampi maksan NK-solujen toiminta todennäköisesti liittyy allogeenisen hylkäämiseen sijaitsevat pääasiassa maksassa siirteen [20].

(A) Kuvat ovat osuuksien allogeenisten (vasemmalla) ja syngeenisiä (oikealla) maksan siirteen leimattu anti-NKRP1 vasta-aineita (punainen). Tumat värjättiin Hoechst (sininen). Lukumäärä leimattuja-NK-solujen kuvaa kohden laskettiin useita maksa osissa. (B) edustavat kuvat osien allogeenisten (vasemmalla) ja syngeenisiä (oikealla) maksan siirteen leimattiin anti-Iba1 vasta-aineita (punainen). Lukumäärä leimattuja makrofagien kuvaa kohden laskettuna useita maksa osissa. (C)

Ex vivo

maksan NK-solujen syöpälääkkeen sytotoksisuus päivänä kymmenen jälkeen allogeenisen ja syngeenistä elinsiirtoja. Kaksi efektori /kohde-suhde (E /T) testattiin. (D) Aktivointitaso Maksan monosyytti /makrofageja (NKRP1 ekspressiotaso (MFI) joukossa CD172a + solut). * P 0,05, ** 0,01.

taso maksan monosyyttiaktivaatiomäärityksessä nostettiin allogeeniseen vastaanottajat (MFI: 1232

vs

. 590, p = 0,005, kuva 4D).

Alloimmunity-Associated sytotoksisuus kautta NKG2D reseptorin

jotta voitaisiin määrittää mahdollisia reseptori /ligandi reittejä mukana havaitun sytotoksisuuden, qPCR tehtiin päivänä yhdeksän maksabiopsiat. Samanlainen kuin edellisen raportin ilmentyminen

nkg2d

, yksi parhaiten karakterisoitu kasvaimeen liittyvät NK-reseptorin, oli 6,9 kertaa suurempi allogeeniseen maksassa köynnöksen verrattuna syngeenisiin (p = 0,028, Fig. 5A ) [21]. Kuten NKG2D reseptori ilmentyy NK-soluja kohtaan, tämä tulos olisi voitu liittyy suurempi määrä NK-solujen allogeeniseen maksassa. Kuitenkin ekspressiotasoja NKG2D veren NK-solut (mediaani MFI: 7694 vs. 4636, Fig. 5B, vasemmalla) ja monosyyttien (mediaani MFI: 1180 vs. 666, Fig. 4B, oikealla) olivat myös korkeampia allogeenisilta vastaanottajat.

(A) maksa ilmentymä

nkg2d

päivänä kymmenen maksansiirron jälkeen. (B) edustaja NKG2D ekspressiotasot veren NK-solut (vasemmalla) ja monosyyttejä (oikealla) allogeenisten (musta) ja syngeenisiä (harmaa) vastaanottajat. Isotyyppi käytettiin kontrollina (katkoviivat). (C) Lajittele veren NK-solun sytotoksisuuden inhibitio anti-NKG2D vasta-ainetta tai anti-NKp30 vasta-aine. (D) tasot NKG2D ligandin (

rae1l, rrlt

ja

irp94

) ilmentymistä maksassa päivänä kymmenen siirron jälkeen. (E) tasot NKG2D ligandin (

rae1l

,

rrlt

ja

irp94

) ilmentymistä rotan HCC solulinjoissa. (F) edustaja taso yhdistelmä-NKG2D-Fc sitoutuminen rotan HCC-solujen linjat. * P 0,05, ** 0,01.

Niiden tarkoitus NKG2D reseptorin sytotoksisuus testattiin käyttämällä anti-NKG2D vasta-aine. Lajiteltu veren NK-solut osoittivat, korkeampi sytotoksinen tasoja allogeeniseen eläimissä, ja tämä vaikutus estyi lisäämällä anti-NKG2D-vasta-ainetta (30,1

vs

. 10,1, Fig. 5C). Tämä inhibitio oli reseptori-spesifinen, koska mitään laskua ei voitu havaita käyttämällä anti-NKp30-vasta-aine.

ilmentyminen NKG2D ligandien edelleen arvioi qPCR päivänä yhdeksän maksabiopsiat. Rotilla, kolme NKG2D ligandit kuvailtiin: Rae1l, Rrlt (retinoiinihappo varhainen transkriptio perhe) ja Irp94 (iskemia reagoivat 94 kDa proteiini, lämpöshokkiproteiiniperheen) [21], [22].

rrlt

geeniekspressio lisääntyi merkitsevästi allogeeniseen maksassa köynnöksen verrattuna syngeneeisissä maksan siirteitä (2,93-kertainen kasvu, p = 0,028, Kuva. 5D).

Kun pyritään määrittämään, miten lisääntynyt NKG2D sytotoksisuus osaltaan HCC solun tila, ilmentyminen NKG2D ligandien arvioitiin myös kahdella rotan HCC-solulinjoissa, JM-1 ja MCA.

Rrlt

ilmaistiin JM-1-solulinja (21,4-kertainen kasvu verrattuna ensisijainen splenosyyttien), mutta ei MCA soluissa.

Rae1l

ei ilmaistu HCC-soluissa ja

irp94

ilmentyi eri tasoilla kahdessa solulinjassa (JM-1: 2,63, MCA: 3,68-kertainen kasvu, Fig. 5E). Lopuksi läsnä NKG2D ligandien pinnalla HCC solulinjojen varmistettiin käyttämällä kimeerisiä NKG2D-Fc. Sekä JM-1 ja MCA ilmaisi korkea tunnettujen ja mahdollisesti vielä tuntematon NKG2D ligandeja (rahalaitos, JM1: 3.53.10

4

vs

. 02.01.10

4, MCA: 9.4.10

4

vs

1.83.10

4, kuva. 5F).

kaiken NKG2D-ligandit ilmaistiin kaikissa HCC solulinjoissa tukee ajatusta, että aktivoitu NKG2D ilmentävien NK-solujen ja monosyyttien edistää HCC soluun puhdistumaan.

keskustelu

tutkimus tarjoaa uusia oivalluksia kysymys tasapainoisen immuuniaktivaatiota jälkeen allogeenisen maksansiirron läsnäollessa HCC, osoittamalla läsnäolo sellaisen alloimmuunitrombosyto- riippuvan syövän vastaisen sytotoksisen aktiivisuuden jälkeen rotan maksansiirron. Tämä sytotoksisuus liittyy lisääntynyt taajuuksia ja tasot NK-solujen aktivaation ja monosyyttien /makrofagien, ja on ainakin osittain välittämien NKG2D reseptorin.

tutkittu Tumma Agouti-to-Lewis rotan maksansiirtoa malli indusoi vahva alloimmuunitrombosyto- aktivointi spesifisesti luovuttajan antigeenejä [23]. Tämä immuuni profiili liittyi lisääntynyt fenotyyppi ja aktiivisuustason NK-solujen ja monosyyttien /makrofagien. Tämä on sopusoinnussa aikaisempien tutkimusten osoittavat haitallista vaikutusta makrofagien aikana rotan munuaisen hyljinnän ja suojaava vaikutus NK-soluja tuhoavan jälkeen allogeenisen rotan maksansiirron [18], [24].

ylikuuluminen välillä allogeenisten ja syövän vapaudet on heikosti tutkittu tähän mennessä, ja esillä oleva tiedot osoittavat parannetun maksan ja perifeeristen (mutta ei pernassa) syövän sytotoksisuutta aikaan maksan siirteen hyljinnän. Ihmisen elinsiirrot, NK-solut olivat läsnä Sydänlihasbiopsiat soluinfiltraat- mutta nämä solut vrk, mutta o näy merkittäviä toimijoita maksan siirteen hylkiminen [25], [26]. Itse asiassa, lisääntynyt alloreactivity NK-solujen maksansiirron jälkeen on raportoitu, ja tämä aktiivisuus ei korreloi hyljinnän [26]. Kuitenkin ihmisen maksan ja toissijainen imukudokseen NK-solut ovat osoittaneet vahvaa sytotoksisuudesta stimulaation jälkeen IL-2 tai läsnä ollessa aktivoidun APC: iden [27], [28].

odotellessa

vuonna vivo

ja /tai kliinisten tietojen perusteella, tämä havainto tukee käyttöä lievempi tasojen immunosuppression potilaiden siirrettyjen HCC, säilyttämiseksi syövän sytotoksisuuteen. Huomattavaa on, että monet allogeeninen rotta-to-rotan maksansiirtoa mallit indusoi mitään akuuttia solujen hylkäämisen, ja täydellinen malli syngeenisellä -recipient tyyppi- HCC-soluissa ja akuutti allogeenisen immuniteetti on tällä hetkellä puuttuu (no Lewis HCC solulinja saatavilla), mikä estää

in vivo

validointi esitetyt tiedot. Myös kuvataan syövän vastainen vaikutus havaittiin sen jälkeen, kun pitkälle hylkäämisen tapahtumia, jotka harvoin kliinisesti. Kuitenkin oletamme, että lievempi tasot hylkäämistä myös edistää syöpäsolujen puhdistumaan.

sijaan vähenee immunosuppressio kokonaisuutena, huolellinen lääkkeen valinta voidaan myös yrittänyt säästää NK-solujen ja monosyyttien /makrofagien ottaen paremmin HCC solu puhdistumaan. Käyttö heikentävien anti-lymfosyyttien vasta-on liittynyt lisääntyneeseen riski elinsiirron HCC toistumisen [8]. Ei-heikentävien anti-IL2-R-vasta-aineet voivat myös olla vaikutusta, koska ne muuttavat fenotyyppiä ja toiminta olevien uusien NK-solujen [29] – [31]. Sirolimuusi ja mykofenolaattimofetiilin on osoitettu muuttavan NK-solun fenotyyppiä ja toiminta

in vitro

, vaikka siklosporiini ei näytä olevan vaikutusta [32].

In vivo

, kaikki huolto lääkkeet vaikuttavat eri immuunijärjestelmän solujen alaryhmiä ja ihanteellinen immunosuppressio yhdistelmä on määriteltävä niiden asettaessa maksansiirtoa HCC [33], [34].

Euroopan NKG2D reseptori /NKG2D ligandeja reitin esiintyi keskeinen toimija alloimmuunitrombosyto- liittyvää sytotoksisuutta. Se oli jo julkaistu, että NKG2D ilmaisu nostetaan maksassa allogeeninen siirre [21]. Tässä olemme osoittaneet, että ilmentyminen NKG2D on erityisesti lisääntynyt reuna-NK-solujen ja makrofagien aikaan hylkäämisen, ja

ex vivo

sytotoksisuutta maksan NK-solujen estetään estämällä NKG2D reseptorin (mutta ei NKp30 reseptori). Lisäksi, NKG2D ligandit voidaan löytää rotan HCC-soluissa, mikä vahvistaa ihmisen tietoja ilmentymisen UL16-sitovan proteiinin (ULBP) 1, ihmisen NKG2D ligandi, on HCC kasvaimia [10]. Tämä polku on aiemmin tutkittu muissa onkologian asetuksia, kuten peräsuolen syöpä, ja taso kasvaimen NKG2D ligandin ilmentyminen on liittyvät HCC vasteen ja potilaan eloonjääminen [10], [35]. NKG2D ilme veren NK-solujen on lisääntynyt sen jälkeen radiotaajuisen HCC ablaatio, ja liittyy suurempi tautivapaan elinajan hinnat [36]. Tämä nousu NKG2D ilmentymistä on myös havaittu jälkeen transarterial chemoembolization ja korreloi lasku NKG2D-ligandin irtoaminen (liukeneva MICA) [37]. NKG2D ilme maksansiirron jälkeen voisi auttaa HCC-soluissa puhdistumaan. Lopuksi, NKG2D on äskettäin mukana makrofagin-NK-solujen ylikuulumista johtaa korkeamman NK-solun aktivaation ja kasvaimen sytotoksisuuteen [38]. Havaittu lisääntyneen ilmentymisen NKG2D makrofageissa aikaan allogeenisen maksan siirteen hyljinnän voi edistää epäsuorasti sytotoksi- edistämällä NK-solun aktivaation ja sytotoksisuutta.

Beyond NKG2D, laaja paneeli aktivoimaan ja estävä reseptoreita ilmentyy NK solut, jotka ilmentymiskuvio voi moduloida tason NK-solujen aktivaation [39]. Kuvaamaan, inhiboiva reseptorit voivat tunnistaa luokan I major histocompatibility complex, ja inhiboivat NK-solujen sytotoksisuutta [40]. Reseptori profiili vaihtelee elinspesifiseen NK-solut, samoin kuin niiden toiminta [41], ja muutokset tasapaino aktivoivan ja estävä reseptorit voivat selittää ainakin joitakin tässä kuvattuja fenotyyppiset ja toiminnalliset NK-solujen eroja sivustoja syngeenisissä ja allogeenistä vastaanottajat. Edelleen tutkimus on ansaittu.

Tämä tiedot osoittavat, että esiintyminen rotan hylkimisreaktioon edistää syöpälääkkeen sytotoksisuus kautta NKG2D reseptorin.