Krooninen sairaus

tiivistelmä

Vaikka saarto androgeenireseptorin (AR) signalointi edustaa tärkein hoito edenneen eturauhassyövän (PRCA), monet potilaat edetä tappavan fenotyyppi ”kastraatio hylkivät” eturauhassyöpä (CR-PRCA ). Hypoteesia, jonka varhainen PRCA hautoisi asukkaan androgeenista välinpitämättömiä syöpäsolujen lähtöaineina CR-uusiutuva sairaus, me sitoutui leviämistä androgeenista riippumaton soluja PRCA-prostatektomia näytteitä aikaisin, paikallinen (vaihe-I) tapauksissa. Kokoelma 120 kirurgisten yksilöitä eturauhasen tapauksissa perustettiin, joista 54 oli adenokarsinooman. Hormoni-free Soluviljelyolosuhteiden kehitettiin mahdollistaa rutiini eteneminen ilmentävien solujen eturauhasen tyvisolusyöpä merkkiaineiden ja varsi /kantasolujen markkereita, ja joka lisääntyneet palloina /rakeita suspensioviljelmissä. Pesäkkeet androgeenista riippumattoman epiteelisolujen kasvoi ulos 30/43 (70%) ja adenokarsinooma tapauksista tutkittu yksityiskohtaisesti. Fluoresenssimikroskopia ja virtaussytometrialla osoitti, että CR-punasoluaplasiassa solut olivat positiivisia CD44, CD133, CK5 /14, c-kit, integriinin α2β1, SSEA4, E-kadheriinin ja Aldehydi (ALDH). Kaikki 30 CR-punasoluaplasiassa soluviljelmissä olivat myös tert- positiivisia, mutta negatiivisia TMPRSS2-ERG. Lisäksi osajoukko 22 Näiden CR-punasoluaplasiassa soluviljelmissä tutkittiin potilaalle tehdä ksenografti kokonaisissa ja kastroitu SCID-hiiriin, tuottaa histologisesti tyypillinen paikallisesti invasiivisia ihmisen punasoluaplasiassa tai erilaistumaton syöpiä, vastaavasti, 6-8 viikkoa. Viljellyt PRCA solut ja ortotooppisesti aiheuttama

in vivo

syövissä puuttui PSA ilme. Raportoimme tässä etenemiselle Cancer aloittaminen Cells (CIC) suoraan Vaihe I ihmisen PRCA kudoksen ilman valintaa tai geneettistä manipulointia. Eteneminen varsi /kantaisä-, kuten CR-punasoluaplasiassa soluja, jotka ovat peräisin ihmisen varhaisessa eturauhasen karsinoomien viittaa siihen, että on olemassa solujen alapopulaation resistenttejä androgeenipuutteen hoitoon ja jotka voivat johtaa myöhemmin syntymistä levitetään CR-punasoluaplasian.

Citation: Fiñones RR, Yeargin J, Lee M, Kaur AP, Cheng C, Sun P, et al. (2013) Early Human Prostate adenokarsinooman Harbor androgeenin Independent Cancer Cells. PLoS ONE 8 (9): e74438. doi: 10,1371 /journal.pone.0074438

Editor: Zoran Culig, Innsbruck Medical University, Itävalta

vastaanotettu: 03 toukokuu 2013; Hyväksytty: 01 elokuu 2013; Julkaistu: 25 syyskuu 2013

Copyright: © 2013 Fiñones et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Kaikki varat oli avokätisesti läpi UC San Diego Foundation. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

piirityksen androgeenireseptorin (AR) signalointi edustaa tärkein hoito edenneen eturauhassyövän [1]. Tästä huolimatta monet potilaat edetä kohtalokas fenotyyppi ”kastraatio hylkivät” eturauhassyöpä (CR-PRCA). Kuten punasoluaplasia heterogeeninen [2], [3], me arveltu, että varhainen PRCA voi sisältää populaation androgeenista välinpitämättömiä syöpäsoluja joka toimii esiasteita CR-uusiutuva sairaus. Ryhdyimme tunnistamiseen androgeenista riippumaton soluja PRCA-prostatektomia näytteitä aikaisin, paikallinen (vaihe-I) tapauksessa sisällä eturauhanen.

olemassaolo epiteelisolujen eturauhasen kantasoluja on laajalti hyväksytty perustuu ylimääräinen uudistumiskyky eturauhasen [4] – [6]. Vaikka androgeenireseptorin peruuttaminen aiheuttaa apoptoosia Ontelonsisäisen epiteelisolujen tyvisolut säilyvät, mahdollistaa nopean uudistamisen yhteydessä androgeenireseptorin vaihto ja viittaa siihen, että eturauhasen kantasoluja asuvat tyvisolukerroksessa. Eturauhasen luminaaliseen solujen on osoitettu aiheuttavan ihmisen punasoluaplasia seuraavat yli-ilmentyminen spesifisten geenien [7]. Huomattavaa on, että varsi /esisolut ei ole lisättyjä ole muuttunut alkaen alkuvaiheessa CR-punasoluaplasiassa [8], [9]. Läsnäolosta huolimatta Cancer aloittaminen Cells (CIC) in kuolematon PRCA johdetut solulinjat metastaattinen PRCA [10], rooli epiteelin kantasolujen /kantasolujen sukupolven eturauhasen CIC edelleen heikko [11].

Nykyinen mallit viittaavat siihen, että punasoluaplasian alkaa kehittämiseen eturauhasen intraepiteelinen neoplasia (PIN), tulee paikallisesti invasiivisia adenokarsinooma, jonka jälkeen metastaattisen androgeeniriippuvaisissa ja lopuksi, androgeenistä riippumaton syöpä [4], [12], [13]. Käyttämällä solun pinnan markkereita, eristäminen eturauhasen CIC on raportoitu [14] – [16]. Hiirillä, käyttöönotto konstitutiivisesti aktiivisen AKT-kinaasi Sca-1-rikastettu eturauhasen epiteelisolujen johti kasvaimen aloittamista [17], ja ihmisen soluissa, yli-ilmentyminen AKT, ERG ja AR onteloerityssolut syntyy eturauhassyöpä [7] . Yksilöiden ihmisen vaiheen I eturauhasen syöpiä, 0,1% soluista ilmaistuna eturauhassyövän varsi /kantaisä kaltainen solumarkkerien, kuten CD44, CD133, CK5 /14 ja integriini α2β1 [18], [19]. Tärkeää on, ensisijainen PRCA solut voidaan tehdä kuolemattomiksi hTERT geenien siirtyminen, ja ne osoittavat suurta itseuudistumisen potentiaali [9], [20].

Tässä raportoidaan leviämistä CIC suoraan I vaihe ihmisen PRCA kudoksen ilman valinnan tai geenimanipulaation. Kokoelma 120 kirurgisen eturauhasen yksilöitä perustettiin, joista 54 näytteet olivat adenokarsinooman. Hormoneja ja seerumitonta Soluviljelyolosuhteiden kehitettiin, jotta rutiini perustaminen ilmentävien solujen eturauhasen tyvisolusyöpä merkkiaineiden ja varsi /kantasolujen markkereita, ja joka lisääntyneet palloina /rakeita suspensioviljelmissä. Lisäksi karsinooma johdettuja punasoluaplasiassa solut onnistuneesti kasvatetaan 30/43 näistä adenokarsinooma tapauksista. Näistä PRCA soluviljelmissä peräisin 22 adenokarsinooman näytteistä tutkittiin edelleen potilaalle tehdä ksenografti ja todettu tuottaa tyypillinen eturauhasen syöpiä, tai erilaistumaton kasvaimia, vastaavasti, potilaalle tehdä ksenograftimalleissa vuonna hormonaalisesti ehjä ja kastroitu SCID hiirillä. Viljellyt solut ovat ”kastraatio hylkivät” ja androgeenista riippumaton syöpäsoluja ja siten tyydyttää

in vitro

ja

in vivo

kriteerit CIC. CR-PRCA solujen lisätty julkaisussa täällä voi nyt voidaan analysoida mekanismeja itseuudistumisen [21] – [23], muutoksia geenien ilmentyminen, valinta uusille mutaatioita, metastasointiin, ja terapeuttisen vaikutuksen.

menetelmät

Kokeelliset menetelmät on esitetty menetelmiä S1.

Ethics lausunto

Kaikki ihmisen näytteet anonyymisti koodattu ja saatu mukaan UCSD IRB # 130397. Kaikki toimenpiteet suoritettiin kuvatusta työstä oli huolellisesti kuvattu UCSD-IRB ja esiteltiin, tarkistetaan ja luvan koko UCSD Institutional Review Board. Yksityiskohtainen kemikaaleja ja torjunta-paketti, joka oli erityisesti kirjoitettu tätä tutkimusta laajasti selitetty kullekin potilaalle lahjoittamalla kudosta, ennen kliiniset toimenpiteet ja kun ymmärtää ja sopivat kunkin potilaan asianmukaisesti allekirjoittanut kunkin potilaan. Nämä tiedot ovat tallessa vastaavissa kliinisissä osastot. Koko prosessi oli täysin dokumentoitu paperilla ja digitaalisesti osana kliinistä potilastietoja; nämä tiedot tallennetaan. Tutkimusryhmä ei ole saanut tutustua, ei tällä hetkellä ole pääsyä ja tulevaisuudessa ei ole pääsyä mihinkään tunnistamiseen tai kliinisiä tietoja eikä seurantatietoja potilaista. Ei ollut henkilökuntaa päällekkäisiä välillä kliinisen ja tutkimusryhmien, toimet, jotka tehdään erillisissä rakennuksissa UCSD Campus La Jolla. Suostunut potilasta tuli tutkimukseen peräkkäin ilman luokittelua, joko sosioekonomisia, rotuun, uskontoon, ravitsevaa, ympäristötekijät tai vastaavia emäksiä. Kaikki kudosnäytteet tutkittavalla lahjoitti päätteeksi kliinisen eturauhasen menettelyjä. Nämä menettelyt ovat, ja on huolellisesti noudatettu ja on valtuuttanut UCSD-IRB eettisen komitean. Menettely protokollat ​​ovat, ja ovat uudelleen vieraili ja uudelleen luvan UCSD-IRB komitea vuosittain. Potilaan yksityisyyden ja suostumukset otetaan hyvin vakavasti UCSD.

Eettinen käyttö immuunijärjestelmän hiirissä kudosten-rekombinaatio elinsiirron ja potilaalle tehdä elinsiirron ER saatua ihmisen eturauhasen syöpäsolujen on tutkinut ja luvan UCSD IACUC viranomaisten avulla eläimen protokollan # S07410. IACUC komiteat on esitelty kaikilla kokeissa, mukaan lukien lähde ihmisen solujen siirrettyjen tietoisen suostumuksensa, jne ja valtuuttaneet työn eettisistä eläinten oikeuksista ja humanitaarisista emäksiä.

Tulokset

kasvu ensisijainen eturauhasen epiteelisolujen kulttuureissa

kun seulonta lukuisia median, kasvutekijöitä, soluväliaineen ja ympäristön yhdistelmiä, PRCA soluja kasvatetaan ihmisen I vaihe eturauhasen karsinoomat kuten on kuvattu (katso Methods S1), käyttäen synteettiset josta puuttui seerumi tai androgeenien. Yhden epiteelisolujen pesäkkeitä havaittiin vajaan 3 d kuluttua pinnoituksen osaksi kasvualustaan ​​( ”Medium 6

+++”), ja 7-9 d pesäkkeiden lukumäärä oli vakaa. Nämä viljelmät lisätyistä muodostavat epiteelin, hunajakennon kaltaisia ​​soluja, mikä läheiset solu-solu kosketuksiin (kuvio 1A), ja jolla oli pieni, tiivis ryhmä soluja väliaikaisesti nimetty Cancer Cell Cluster (CCC) (kuvio 1 B-D) . PRCA solun pesäkkeet aluksi jaettu kaksinkertaistaminen ajan -20 h (kuvio 1 E). Viljelmät siirrostettiin vasta noin 8

th kulkua tai -30 populaation kaksinkertaistumista, missä pisteessä solujen alkoi hyväksyy suuren, litistetty morfologia ja olivat positiivisia vanhenemista liittyvän β-galaktosidaasi (kuvio 1 F). Tulokset 43 ulos 54 tapausta diagnosoitu eturauhasen adenokarsinooman Gleason Pisteet vaihtelevat 6-9 esitetään yhteenvetona (taulukko S1). Taulukko S1 luetellaan myös useissa epiteeli- pesäkettä saatu kustakin 30 adenokarsinooma näytteiden tuotti epiteelin pesäkkeitä. Loput 13 adenokarsinoomaa näytteistä ei tuottanut pesäkettä ja niitä ei tarkasteltu.

(A) Tyypillinen solun morfologiassa on esitetty, jossa suurin osa soluista tuotetaan ensisijainen PRCA näytteistä näyttämällä tiukka, hunajakenno morfologia. (B-D) Esimerkkejä on esitetty (katso nuolet) osittain kiinnittynyt klustereita, kutsutaan Cancer Cell Clusters (CCCS), peräisin yksittäiset pesäkkeet. Mittatikku = 100 um. (E) kasvu PRCA solujen yhdestä CCC 3 ajankohtina jälkeen ensimmäinen havainto siirtokunta: 0, 24, ja 48 h, määrällisesti kuva-analyysillä. (F) Vanheneminen määrityksessä soluja 8

th passage, joka osoittaa positiivista värjäytymistä varten vanhenemista liittyvän β-galaktosidaasi. Mittatikku = 50 pm.

Koska valvonta, näytteiden saadaan höyläysleikkaus ja diagnosoitu eturauhasen hyvänlaatuisen liikakasvun (BPH) käsiteltiin ja kasvatettiin identtisesti adenokarsinooma näytteitä. Vain 2 50 näytteen diagnosoitu BPH tapauksissa syntyy pieniä määriä (3-10) huonosti kasvava epiteelin pesäkkeitä.

Tässä esitetyt tiedot osoittavat, että on olemassa soluja, jotka voivat olla suoraan levitä vaihe-I eturauhassyöpä määritellyillä media puuttuu seerumi tai androgeenien. Eteneminen androgen riippumaton ja syöpää aiheuttavaa solujen alussa (vaihe I) ihmisen eturauhasen adenokarsinooma ei ole aiemmin kuvattu.

Cell-merkki ilmentyminen PRCA solut

Early-passage PRCA soluissa laajeni yksittäisiä pesäkkeitä analysoitiin epäsuoralla immunofluoresenssilla eturauhasen kantasolujen merkkiaineita integriinin α2β1, CK5 /14, CD44 ja CD133. Varhainen passage viljelmät sisälsivät sekä näkyvää soluklusterien ja laajeneva halo epiteelisolujen jälkeläisten ilmentävät integriinin α2β1, CK5 /14 ja CD44 (kuvio 2A-C). CD133 ilmentyminen rajoittui soluihin tiukka klustereita (kuvio 2D), mutta katosi pian sen jälkeen johtamisella.

Eturauhasen CCC ja ympäröivän eturauhasen epiteelisolujen PRCA solut ilmensivät: (A) integriini α2β1 (punainen); (B) molekyylipaino on korkea sytokeratiini (CK5 /14) (punainen); (C) CD44 (vihreä); ja (D) CD133 (vihreä). Nuclei havaita DAPI (sininen). Virtaussytometrialla saman markkereita on esitetty yhdistetään PRCA solujen ja CCCS: (E) integriinin α2β1 (~99% positiivinen); (F) CK5 /14 (~48% positiivinen); (G) CD44 (~98% positiivinen); ja (H) CD133 (~38% positiivinen). Expression of CD133 väheni nopeasti myöhemmin siirtomaa siirtoja, mikä korreloi etenevä laimentamiseen CD133

+ CCCS suhteessa enemmän nopeasti lisääntyvissä CD133

lo /- punasoluaplasian soluja.

virtaussytometrialla , PRCA solut ilmensivät integriini α2β1 (kuvio 2E), korkean molekyylipainon (tyvisolusyöpä) sytokeratiini CK5 /14 (kuvio 2F), ja CD44 (kuvio 2G). CD133 ilmentyi varhainen passage kulttuureissa (kuvio 2 H), mutta ilmentyminen katoavat outgrowth levyiksi epiteelisolujen. Näin ollen erilaisia ​​CD133 ilmaisun meidän PRCA soluviljelmät laski nopeasti noin 50%: in juuri irrotetut pesäkkeet havaittavissa tasolle kulttuuri passage 2 ja edellä.

PRCA solun pesäkkeet tutkittiin myös eturauhasen varsi /kantaisä ja erilaistumisen markkereita. Double-värjäys p63, CK8 /18, ja c-kit, yhdessä CD44, suoritettiin. Tyvisolukerroksessa markkeri p63 oli enimmäkseen tumassa on punasoluaplasia /CCC-solut (Fig. S1A), kuten on yleisesti todettu normaalissa eturauhasessa tyvisoluissa. Vaikka p63 taipumus ali-ilmentynyt in adenokarsinoomat [24], jotkin viljellyt eturauhassyöpä solulinjat on osoitettu ilmentävän ydin- p63 [25]. Lisäksi sytoplasminen p63 on liittynyt eturauhassyövän kuolleisuus [26]. Viljellyt PRCA /CCC soluissa ilmaisivat myös eturauhasen erilaistumista (luminal solu) markkeri CK8 /18 (Fig. S1B), ja c-kit (Fig. S1C), joka yhteistyössä paikallistaa CD44. Viljellyt PRCA solut ilmensivät ole kromograniinilla A eikä PSA. Yllättävä puute PSA-ekspressio varmistettiin käyttäen 8 eri PSA-spesifisiä vasta-aineita on 22 eri punasoluaplasia soluviljelmissä (tietoja ei esitetty).

ilmentäminen aldehydidehydrogenaasi (ALDH) kantasolujen-spesifisen entsyymin

ALDH, myrkkyjä entsyymi, joka vastaa hapettamalla aldehydien karboksyylihapot, on toiminut funktionaalisia [27], [28]: n läsnäolo kantasolujen ja CIC monenlaisia ​​syöpiä [29] – [31]. Rintasyövän CIC, The ALDH1A3 isotyyppi on vallitseva ja ennustaa etäpesäke [32], kun taas eturauhasen syövän ALDH7A1 isotyyppi on vallitseva [33]. Meidän viljellyt punasoluaplasia soluja, ALDH oli ilmentyy voimakkaasti (90,0% Pr # 109), mutta aleni 9,8%: n läsnä ollessa ALDH-spesifinen estäjä diethylaminobenzaldehyde (DEAB) (kuvio 3). MCF7-soluja käytettiin ALDH-negatiivisena kontrollina näissä kokeissa (tietoja ei ole esitetty). Yhä siirrostusjärjestysluku, ALDH ilmentyminen PRCA soluissa laski saavuttaen alle 1% sen jälkeen kun 6 kohtia (tuloksia ei ole esitetty).

PRCA # 109 solua, tr.1 trypsinoitiin, reagoimaan ALDH1A1 alustan BODIPY- aminoasetalde- (BAAA). ALDH-inhibiittoria DEAB lisättiin säätöputken saman solujen spesifisyyden osoittamiseksi ALDH1 aktivoitu BODIPY-fluoresoiva tunnistus. Mediaani fluoresoiva ALDH1-signaali 3 x 10

5 yksikköä estyi -200 × jonka DEAB estäjä. 90,0% ALDH1 kirkas soluja (A ja C) vähenivät 9,8% läsnä ollessa ALDH DEAB inhibiittoria (B ja D). Asiaa dot-käyrää näkyy oikealla, ja käyrästö verrataan ALDH-aktivoitua fluoresenssi- ja että solujen jossa reaktio estyi DEAB on esitetty alla (E).

Lisäksi ekspressio ALDH7A1 isotyypin osoitettiin epäsuoralla immunofluoresenssilla 12 eri viljellyissä punasoluaplasia soluviljelmissä testattu (Fig. S2). Expression of isotyypin ALDH7A1 vuonna PRCA soluissa viljelty täällä on johdonmukainen sen raportoitu ilmentymistä ihmisen PRCA ja immunohistologialla osissa ihmisen PRCA ja niiden etäpesäkkeiden [33].

Viljellyt PRCA solujen helposti tuottaa kiinnittymisestä riippumaton palloja /pallosia vuonna Matrigel kulttuureissa

Päinvastoin kuin erilaistuneita soluja, normaali ja syöpää aloittamista varsi /progenitorisolujen lisääntyä muodostaa palloja /pallosia alle kiinnittymisestä riippumaton viljelyolosuhteet [34]. Kiinnittyneet PRCA solut trypsinoitiin yhden soluihin, läpi 40 um siivilä, ja 10

4 solut levytettiin matrigeeliin suspensioviljelmissä. Tämä johti sukupolven kasvaa pallojen Matrigel by 90% keskeytetty yksittäisten solujen (kuvio 4), joka on itsenäinen suhteessa Gleason Score (6-9) syöpä luovuttajia. Värjäyksen jälkeen solujen tumat DAPI (4 ’, 6-diamino-2-fenyyli), solujen lukumäärä kohden kasvava ala kvantitoitiin kuten 88 ± 9,7 solua per pesäke (kuvio 4A). Esimerkkejä aloilla, Matrigel suspensioviljelmässä esitetään (kuvio 4B), jotka ovat pallojen kerrostettu lasin mikroskooppiobjektilaseille mukaan cytocentrifuge (kuvio 4C). Kuulat itsepintaisesti ilmaus ALDH1, CD44, Integriini α2β1, SSEA4 ja TERT (ei kuvassa). Peräkkäisillä siirrot kiinnittyneiden PRCA soluihin 01:03 alakulttuuri suhde, vähenevä jakeeseen Matrigel aloilla, 0,1% pitämistä kapasiteettia kulku 7.

Low passage, kiinnittynyt PRCA soluja (# 76 , tr 2) trypsinoitiin ja suspendoitiin Matrigel väliaineessa 6

+++. Jousitus viljelmiä kasvatettiin 14 päivää ja pallojen rinnakkaisten viljelmät kerättiin päivinä 1, 4, 7, 9, 11 ja 14. Cultures pilkottiin dispaasilla, pelletoitiin objektilaseille mukaan solusentrifugoinnin ja kiinteiden metanolilla. (A) koko pallojen määritettiin laskemalla solujen 200 värjättyä aloilla toteutettuja kerta-pisteen. (B) Aikainen ja myöhäinen aika pisteen palloset valokuvattiin käännettyä mikroskooppia. (C) edustaja korjattu aloilla kasvaa 1, 4, 7, 11 ja 14 päivää Matrigel kulttuureissa, ja talletettu mikroskoopin kuvantaminen, laskenta ja vasta värjäystä.

CR-punasoluaplasiassa solut ilmentävät telomeraasia käänteinen transkriptaasia (TERT) ja normaalin ihmisen eturauhasen epiteelisolut ovat tert-negatiivisia

TERT ilmentymistä punasoluaplasia solut tässä kuvattua määritettiin käänteistranskriptaasi-polymeraasiketjureaktio (RT-PCR) (kuvio 5A). Kaikki 30 adenokarsinomia että saatiin CR-punasoluaplasiassa viljeltyjen solujen esitetty taulukossa S1 ilmaistu TERT RNA. RNA uutettiin ihmisen teratoma solulinja NTERA toimi tert-positiivinen kontrolli, kun taas normaalin ihmisen eturauhasen epiteelisolut (NPrEp) johdettu nuoret luovuttajien oli tert-negatiivinen (n = 3).

(A) TERT . RT-PCR-monistus mRNA eristettiin punasoluaplasian ilmentymistä varten, että telomeraasi käänteistranskriptaasi (TERT) entsyymi. Kaikki 30 PrCaCell viljelmät testattiin ilmaisi TERT kun NPrEp soluja kasvatettiin kolme nuorta luovuttajien ei ilmaissut tert-geeniä. Kuolematon NTERA (normaali ihmisen teratooma) solulinjaa käytettiin tert-positiivisena kontrollina. (B) TMPRSSG-ERG. RT-PCR tulokset PrCaCell kulttuureissa ei osoita todisteita TMPRSS2-ERG fuusio-mRNA, kun taas solut ihmisen selkärangasta etäpesäkkeitä eturauhassyövän solulinjaa VCAP tehdä ilmaista fuusio mRNA.

viljellyissä CR-PRCA solut eivät ilmennä havaittavia tasoja TMPRSS2-ERG fuusio-RNA

on epäselvää, onko ilmentymisen TMPRSS2-ERG fuusio mRNA eturauhasen syöpäsolun toimii merkittävä voima sen tuumorigeenisia ominaisuuksia [33], tai onko fuusio tapahtuma

seurauksena

androgen-reagoiva kasvainsolujen tilassa, ehdottivat induktio fuusio tapahtuman normaalissa eturauhasessa epiteelisolujen vasteena androgen [35], [36]. Riippumatta, 30 riippumattoman punasoluaplasia näytteitä viljeltiin, kaikki olivat negatiivisia ekspression TMPRSS2-ERG fuusio-mRNA: n RT-PCR: llä (kuvio 5B). Koska TMPRSS2-ERG fuusion RNA voi olla vaikea havaita [37], käytettiin useita vahvistusta oligo laskee ja erittäin herkkä MyTaq vahvistusta kit (BioLine USA, Taunton, MA) (taulukko S2). Ihmisen solulinja Vcap, joka ilmentää TMPRSS2-ERG fuusio-mRNA: n, vahvistettiin ilmentävät fuusio transkriptio käyttämällä vain 1 ng eristettyjen solujen RNA: sta (taulukko S2). Monistettu fuusio mRNA Vcap solujen varmistettiin sekvensoimalla monistustuotteen DNA-tuotteen [38] (ei esitetty). Yhteenvetona CR-punasoluaplasiassa solut viljeltiin täällä eivät ilmennä havaittavissa TMPRSS2-ERG fuusio-RNA.

Orthotopic siirteen punasoluaplasiaa solujen

Vähentämällä määriä PRCA soluja Siirto tehty suoraan etummaisen eturauhanen vastaanottajan SCID /Beige hiirillä ja hiiriin kirurgisesti ja kemiallisesti kastroitu. Joissakin kokeissa punasoluaplasia solut ensin leimattiin EGFP infektoimalla viljeltyjä soluja, joiden MSCV retrovirus, joka koodaa EGFP [39].

In vivo

kuvantamiseen SCID ksenosiirrettyjä EGFP-leimattuja soluja syntyy selkeä fluoresoivan signaalin kahden viikon kuluttua siirteen etummaisessa eturauhasen siirteen päällä (kuvio 6A). Nämä PRCA solut kehittynyt paikallisesti invasiivisia, seulamaisessa (rauhanen-in-rauhasen) yhtäpitävä alhainen Gleason Grade PRCA (kuvio 6B ja 6C). Lisääntynyt cellularity stroomamääriin vieressä monimutkaisia ​​rauhaset havaittiin yhdessä keskeinen nekroosiin lumenia ja epätavanomaista sekoitus perus ja cuboidal epiteelisolujen (kuvio 6D-G). Mielenkiintoista, yksinkertainen kasvain rauhaset ilmaisivat p63 niiden tyvisolukerroksessa (kuvio 6D), kun taas histologisesti monimutkaisempi rauhaset, p63 ilmentymistä tyvisoluihin vähennettiin ja häiriökäyttäytymistä (kuvio 6E).

(A)

in vivo

kuvantamiseen EGFP-leimatun punasoluaplasiassa /CCC solujen Siirto tehty etummaisessa prostates vastaanottajan SCID osoittaa lokalisoinnin köynnöksen kahden viikon kuluttua varttaminen osaksi anterior eturauhasen kapseleita. (B) värjäys hematoksyliini-eosiinilla kasvaimen kasvua eturauhasen ja virtsa- ja sukupuolielinten. (C) Korkeampi suurennos seulamaisessa rauhaset viittaa alkukehityksestä invasiivisen eturauhassyövän. Sekä yksinkertaisempia ja monimutkaisempia rauhaset havaittu. (D) leviämisen merkki p63-värjätty tyvisolukerroksessa monimutkaisten rauhaset. (E) p63 ilmaus näkyy häiriökäyttäytymistä histologisesti korkeamman asteen rauhaset. (F) Yksinkertaisempi rauhaset ilmentävät markkeri CK5 /14, kun taas (G) rauhaset, jotka näyttävät olevan etenee seulamaisessa eturauhassyövän vain satunnaisesti ilmaista suuren molekyylipainon sytokeratiinia.

Histologisesti paikallinen syöpä indusoidaan SCID hiiri ortotooppisesti ksenotransplantaatio 200 PRCA solujen verrataan luovuttajan vaiheen I syöpä kudosnäyte (Fig. S3). Molemmat kasvaimia koostuu pienistä rauhaset, jossa solut merkittävässä nucleoli ovat yleisiä. Gland rakenteet usein back-to-back tai rauhanen-alueella-rauhanen kokoonpanoissa. PRCA cell aiheuttamien syöpien koskemattomassa SCID saajahiiret esitti histologinen ulkonäkö, joka oli mahdoton erottaa syöpä on peräisin. Vuonna kastroitu hiirillä, huonosti eriytetty ja jakautumista kasvaimia johti. Sitä vastoin jopa 10

5 normaalin ihmisen eturauhasen epiteelisolujen (n = 3), jotka kasvatettiin identtisesti ja siirrettyjen ortotooppisesti etummaisessa prostates SCID ja kastroitu SCID ei tuottanut kasvaimen kasvua jopa 30 viikon ajan.

keskustelu

tällä hetkellä Stage I eturauhasen adenokarsinooma pidetään hormoniriippuvaisen ja hormoni-reagoiva; tyypillisesti, näitä syöpiä hoidetaan androgeenipuutteen hoitoja (ADT). Monet potilaat edetä tappava fenotyyppi kastraatiotason vastustuskykyisten (CR) PRCA, mahdollisesti joka merkitsee ”kytkentää” syöpäsolujen hormoneilla riippuvuudesta hormonia itsenäisyyttä. Vaihtoehtoisesti pienet populaatiot solut voivat olla ominaisuuksia, joiden avulla ne hengissä ADT kanssa mahdollisuuksia etenevän toistuvan CR-ensisijainen tai etäpesäkkeitä.

Tässä tutkimuksessa olemme lisätyistä ”kastraatio Kestää” epiteelisolujen suoraan Stage -I ihmisen eturauhassyövän kudoksen Gleason Scores vaihtelee 6-9 (taulukko S1). Kuvatuissa olosuhteissa, pesäkkeitä androgeenista riippumattoman epiteelisolujen kasvoi ulos 30/43 tapauksessa (70%) adenokarsinoomien, joista 22 tutkittiin potilaalle tehdä xenotransplanation SCID-hiirissä. PRCA solujen pesäkemäärät tyypillisesti vaihteli -40 500 per 10

7 tulo soluja (50 mg alkaa syövän kudosta), taajuudella 0,0004-,005%, vaikka osa pesäkkeitä tuottavat karsinoomien syntyy harvoja pesäkkeitä (taulukko S1).

Colonies tarttuvien PRCA solut lisääntyivät puuttuessa androgen ja seerumin, mutta ei vaadi bFGF, EGF ja aivolisäkeuutteella. Epiteelin PRCA pesäkkeet olivat peräisin tiukka keskuksista 10-30 soluja, nimetty Cancer Cell Clusters (CCC) (kuvio 1), joka menetti CD133 mutta ilmaisi c-kit, p63, ja E-kadheriinin, markkereita pohjapinta eturauhasen solujen [40 ]. Markkerit ilmaistaan ​​punasoluaplasia /CCC-solut – CD44, CD133, CK5 /14, c-kit, integriinin α2β1, ALDH, SSEA4 ja E-kadheriini – ovat tunnusomaisia ​​tyvisolujen ja eturauhasen kantasolujen /esisolujen [14], [41 ] – [43], mikä viittaa siihen, että CCC muistuttaa epiteelin eturauhasen kantasolun kapealla.

ilmaisu CR-punasoluaplasiassa viljellyistä soluista p63 ja sen osittaiseen menettämiseen sukupolven monimutkaisempi

in vivo

rauhaset seuraavat ksenotransplantaatio (kuvio 6E) esittää, että viljellyt CR-PRCA solut voivat poiketa vain kohtalaisesti normaalia kollegansa ihmisen eturauhasen. Kuitenkin merkittävä

in vivo

kasvainten muodostumiseen solujen ja niiden yksiselitteinen ilmaus TERT viittaa siihen, että nämä CR-punasoluaplasiassa soluja viljeltiin Stage-I eturauhassyöpä ovat varhaisessa ilmentymä karsinogeeninen prosessin. Itse asiassa se on suurta kiinnostusta tulevaisuudessa kokeita vertailla ilmaisua syöpää asiaa geenien välillä Kr-punasoluaplasiassa solut tässä kuvattua ja ihmisen NPrEp soluja.

Orthotopic ksenografti punasoluaplasiaa soluja (kuvio 6) ja tuloksena kasvaimen induktio vahvistettiin perustavanlaatuinen syöpä fenotyyppi viljeltyjen PRCA soluja. Siitä huolimatta,

in vivo

elinsiirron pieniä määriä kulttuuriin eristetty punasoluaplasiassa soluja SCID hiiriin eri olosuhteissa johtivat eri tuloksiin. Ensinnäkin, PRCA solut istutetaan kollageenin tai Matrigel osaksi etummainen eturauhanen SCID-hiirten tuotetun monimutkainen, back-to-back seulamaisessa kuvio-rauhaset, jotka tunkeutuneet ympäröivään strooman ominainen alhainen Gleason Grade eturauhassyöpää. Aikana 12 viikon seurantajakso varten othotopic vierassiirrekokeissa, etäpesäkkeitä ei havaittu. Ksenotransplantaatio kaikista 22 viljeltyjen CR-punasoluaplasiassa soluviljelmissä johtivat yksinkertaisia ​​tai monimutkaisempia syöpä rauhaset (kuvio 6E /F). Kuitenkin mahdollinen korrelaatio Gleason Pisteet alkuperäisen syövän (taulukko S1) ja monimutkaisuus ksenotransplantaatio kasvaimia SCID vastaanottajat tehdään tulevien tutkinnan. Ihonalainen elinsiirrot peräti 5 x 10

5 PRCA solut ehjiä tai kastroitu SCID ei johda sukupolven kasvaimet (tuloksia ei esitetty), korostetaan microenvironment riippuvaa luonnetta PRCA kasvatettujen solujen varhaisesta eturauhasen karsinoomat .

Toiseksi, elinsiirrot käyttäen virtsa- mesenchyme (UGM) rekombinaatio ksenograftimalli [44], [45] mukaisesti munuaiskapselin SCID-hiirten (kuvio S4) johti yksinkertainen rauhasten koostuu pääasiassa cuboidal soluja, jotka esitetään tyvisolut ilmentävät p63 ja E-kadheriinin. Osa rauhasten kehitetty toinen kerros onteloerityssolut, jolta puuttui p63 ilmentymistä, mutta säilyttää E-kadheriinin, joka on samanlainen normaalissa eturauhasessa kehittämiseen [46], [47]. Nämä tulokset viittaavat siihen, että sikiön UGM kudoksessa-rekombinaatio ksenografti käyttöön normaalin lisääntymiskyvyn signaalien vaiheen-I-johdettu punasoluaplasiassa soluihin [48], [49].

puute PSA ilmentymisen viljellyissä PRCA soluja on kuvattu täällä ja niiden ortotooppisesti ksenotransplantaatio aiheuttamien syöpien oli odottamaton. Toinen yllätys oli, että nämä viljellyt PRCA solut lopulta senesced huolimatta ilmaus TERT. PRCA solut poikkeuksetta eriytetty ja senesced jälkeen ~8 siirtojen kulttuurin, mikä viittaa siihen, että ilman asianmukaista mikroympäristön /kapealla nämä solut olivat kuolevaisia. Kuitenkin nämä samat solut olivat ilmeisesti kuolemattomia

in vivo

läsnäollessa niiden eturauhasen mikroympäristön, osoituksena potilaalle tehdä xenotransplantion on -200 PRCA soluja, mikä johtaa syövän taakkaa 20 gm, vastaa ~ 25 solujen kahdentumista. Näin ollen itse uusiminen CR-punasoluaplasiassa solun CIC näyttää olevan ehdollinen, jotka vaativat sopivan mikroympäristön. Itse asiassa yhteinen määritelmä CIC kattaa kuolematon fenotyyppi [50], kuten CIC on yleisesti eristetty täysin edennyt ja /tai metastaattinen syöpien [51] – [53]. Lisäksi, kastroitu hiirillä joitakin viljeltiin CR-punasoluaplasiassa soluja, jotka oli ortotooppisesti ksenotransplantaatio osaksi etuosan eturauhasen SCID-hiirten ovat kasvaneet jatkuvasti, kunnes hiiret oli uhrattu, koska ne suoritetaan vatsan tuumorimassa yhtä paino hiirtä (tietoja ei ole esitetty ).

läsnäolo CR-eturauhassyöpäsolujen jolla kantasolujen fenotyyppi varhaisvaiheen eturauhassyöpä on yhdenmukainen viimeaikaisten havaintojen [54], että asiakirja systemaattista kasvua PRCA varsi /esisolujen aikana ADT punasoluaplasiaa potilaita, selitetään, miten nykyinen ADT voi johtaa ei-toivotun laajentamiseen PRCA varsi /progenitorisolupopulaatioon kanssa hoidon epäonnistumisen. Tuloksemme viittaavat siihen, että CR-punasoluaplasiassa solu CIC jotka ovat läsnä enemmän kuin puolet Stage-I potilas kohortti tutkinut voivat koskea hoidon epäonnistumisen kuvannut muiden [54].

Muut tutkijat ovat eristetty otaksuttu PRCA varsi solut käyttäen muunneltua Hoechst 33342 väriaine ulosvirtaus määritys eristää side-populaatiot rikastettua otaksutun kantasolujen pahanlaatuista eturauhasessa [55] – [58]. Toinen lähestymistapa on tutkinut olemassaolon androgeenista riippumaton kantasolu, joka voi aiheuttaa androgeeniriippuvaisissa, täysin eriytetty onteloerityssolut kautta kauttakulku voimistamalla väestön positiivinen ilmaus CK5 /14, CK18, CD44, ABCG2, CD133, ja integriini α2β1 [14], [59], [60]. Kolmas lähestymistapa on tutkinut kuolemattomaksi eturauhasen kantasolujen avulla pakko ilmaus ihmisen telomeraasin (hTERT) [9], [20], [41], [61]. Lopuksi ihmisen eturauhasen kasvaimen aloittamista soluja on kuvattu, että näyttö varsi-kohteiden lisääntynyt NF-kappaB toimintaa [62]. Suhde PRCA solujen raportoitu täällä, ja solupopulaatioiden kuvattu toiset tutkijat, vaatii lisää kokeellista tutkimusta.

Yhteenvetona Tutkimustulokset osoittavat läsnäolo syöpäsolut, vuonna alkuvaiheista ihmisen eturauhasen adenokarsinoomien , joka voidaan lisätä in määriteltävä media puuttuu androgeenien. Ainutlaatuinen viljelyolosuhteet esitetään tässä, ja on suhteellisen helppo etenemisen androgeenista riippumattoman proliferatiivinen solupopulaatioiden voidaan odotetaan stimuloivan lisätutkimuksia. Merkittävää on, että näitä menetelmiä voidaan soveltaa pieniin koepalojen, jolloin luonnehdinta oletetun CR-eturauhasen syöpäsolujen ja helpottaa näyttöön perustuvaa kliinisen hoidon aikaisessa vaiheessa sairautta.