Krooninen sairaus

tiivistelmä

Hypoksia on haitallinen tekijä kohdunkaulan syöpä, ja hypoksia liittyvien geenien ilmentyminen voi olla tehokas biomarkkereiden tunnistamiseen aggressiivista hypoksinen kasvaimia. Käänteinen transkriptio kvantitatiivinen PCR (RT-qPCR) on arvokas menetelmä geeniekspression tutkimuksissa, mutta soveltuu viittaus geenit datan normalisointi jotka ovat riippumattomia hypoksia aseman ja kliinisen parametrin kohdunkaulan kasvaimia puuttuvat. Tässä työssä, pyrittiin tunnistamaan viittaus geenit RT-qPCR tutkimuksia hypoksia squamous kohdunkaulan syöpä. Vuodesta 422 ehdokas viittaus geenit valitaan kirjallisuudesta, käytimme Illumina array-pohjainen ekspressioprofiileja tunnistaa 182 geenejä ei vaikuta hypoksia kohdunkaulan syövän eli geenit säätelevät hypoksia kahdeksassa kohdunkaulan syövän solulinjoja tai korreloi hypoksian liittyvä dynaaminen kontrasti -enhanced magneettikuvaus parametrin å

Brix 42 potilaalla, jätettiin pois. Niistä 182 geenit, yhdeksän ehdokasta (

CHCHD1

,

GNB2L1

,

IPO8

,

LASP1

,

RPL27A

,

RPS12

,

SOD1

,

SRSF9

,

TMBIM6

), jotka eivät liittyneet kasvaimen tilavuus, vaiheessa imusolmukemetastaaseja taudin etenemistä array tiedot 150 potilasta, valittiin lisätestausta RT-qPCR. geNorm ja NormFinder analyysit RT-qPCR tietoja 74 potilaista tunnistettu

CHCHD1

,

SRSF9

ja

TMBIM6

kuin optimaalinen joukko viite geenejä, vakaa ilmaisu kokonaismäärä ja kaikissa potilasalaryhmissä eri hypoksian tila (A

Brix) ja kliiniset parametrit. Soveltuvuus kolmen viitevuoden geenit validoitu tutkimuksia hypoksian aiheuttaman geenien

DDIT3

,

ERO1A

, ja

STC2

. Normalisoinnin jälkeen, RT-qPCR tiedot näiden geenien osoittivat merkittävää korrelaatiota Illumina ilmentymisen (P 0,001, n = 74) ja A

Brix (P 0,05, n = 32), ja

STC2

tiedot liittyivät kliinisten tutkimusten tulosten kanssa, mukaisesti Illumina tiedot. Siten

CHCHD1

,

SRSF9

ja

TMBIM6

vaikuttavat sopivan viittaus geenien tutkimiseen hypoksia liittyvän geenin ilmentymistä levyepiteelikarsinooma kohdunkaulan syövän näytteiden RT-qPCR. Lisäksi

STC2

on lupaava ennustetekijöiden hypoksia biomarkkereiden kohdunkaulan syövän.

Citation: Fjeldbo CS, Aarnes EK, Malinen E, Kristensen GB, Lyng H (2016) tunnistaminen ja validointi Reference Genes RT-qPCR Tutkimukset Hypoksia vuonna Squamous kohdunkaulan syövän Potilaat. PLoS ONE 11 (5): e0156259. doi: 10,1371 /journal.pone.0156259

Editor: Christian Schönbach, Nazarbajev University, KAZAKHSTAN

vastaanotettu: 23 marraskuu 2015; Hyväksytty: 11. toukokuuta 2016 Julkaistu: May 31, 2016

Copyright: © 2016 Fjeldbo et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi- ja sen tukeminen Information tiedostoja. Kaikki Illumina geenien ilmentyminen tiedostot ovat saatavilla GEO tietokannasta (GSE75034).

Rahoitus: Tätä työtä tukivat Norjan tutkimusneuvosto, Grant numero 226120 /O30, (https://www.forskningsradet.no /fi /HOME_PAGE /1177315753906). Rahoittaja ei ollut roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

kasvain hypoksia on merkittävä tekijä, joka johtaa sädehoidon vastarintaa, etäpesäke ja huono ennuste monien pahanlaatuisten sairauksien kuten kohdunkaulan syöpiä [1-5]. Mittaamiseksi hypoksia liittyvien geenien ilmentymisen vaihtelua potilaiden näytteistä, käänteistranskriptio kvantitatiivinen polymeraasiketjureaktio (RT-qPCR) on arvokas menetelmä, koska sen korkea herkkyys, joustavuus, alhaiset kustannukset ja helppokäyttöisyys [6-8]. RT-qPCR analyysi, on tärkeää valita optimaalinen viittaus geenejä tietojen normalisointi poistamaan ei-biologinen, kokeellisesti aiheutettua vaihtelu tiedoista. Tarkkoja ja luotettavia normalisointi, useita viittaus geenit suositellaan [6,7,9]. Määrittäminen viite geenien Kliinisissä tutkimuksissa on erityisen haastavaa, koska geenien stabiilisuuden on tarkastettava kudoksissa tutkittavana ja koko kasvain fenotyyppien ja kliinisten parametrien.

Aiempi työ viite geenien kohdunkaulan on keskityttiin eri vaiheissa kohdunkaulan syövän synnyn arvioimalla kandidaattigeenit poikki ihmisen papilloomaviruksen (HPV) negatiiviset ja positiiviset vaurioiden [10], ja yli normaalin, precancerous ja syöpä- näytteissä [11-13]. Tietääksemme sopiva viittaus geenien tutkimiseen hypoksia liittyvän geenin ilmentymistä kohdunkaulan syövän koepaloja ei ole raportoitu. Monet ehdokkaat on ehdotettu tähän tarkoitukseen kokeellisten tutkimusten jossa solulinjoja viljellään pienessä hapen pitoisuudet [9,14-17], mutta vain yksi tutkimus pään ja kaulan alueen syöpä ovat hyödyntäneet hypoksian aseman kliinisten näytteiden validointi tällaisten ehdokkaita [18]. Kasvain-site erityisen arvioinnin vaaditaan [9,15] säädettyä yhdistysten kliinisiä piirteitä ja lopputulos lisäksi hypoksia tila.

Useimmat tutkimukset etsivät viite geenien aloittaa rajoitettu paneeli on noin 8-25 ehdokkaista valitaan sen perusteella, geenien, joita käytetään yleisesti kirjallisuudessa, jotka eivät välttämättä ole kaikkein ekspressoivat stabiilisti geenejä. Hyödyntämällä koko genomin ekspressiotietojen alustavan arvioinnin ehdokkaita voi olla hyötyä tunnistaa lupaavimmat paneeli geenien testata RT-qPCR määritys [19-24]. Esillä olevassa tutkimuksessa tämä lähestymistapa on käytetty tunnistaa sopivia viittaus geeneistä hypoksia tutkimuksissa kohdunkaulan syövän koepaloja. Perusteellinen tarkastelu kirjallisuudessa todettu 422 potentiaali viittaus geenejä, joista 410 ehdokasta olivat läsnä meidän tietomääriä ja tehtiin alustava arviointi käyttäen geeniekspressioprofiilien 150 kohdunkaulan syövän potilaiden ja kahdeksan kohdunkaulan syövän solulinjoissa. Yhdeksän geenit, jotka eivät liity hypoksiaa tai kliinisten parametrien, arvioitiin edelleen RT-qPCR, ja kolme niistä valittiin optimaalinen joukko viite geenejä. Sopivuus viitteen geenien datan normalisointia vahvistettiin tutkimuksissa kolme tunnettua hypoksian aiheuttaman geenien suhteessa kasvaimen hypoksia tilan ja kliinisen tuloksen.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics selvitys

Tutkimus hyväksyttiin Aluekomitean Lääketieteen ja Health Research Ethics Kaakkois Norjan (REC S-01129), ja kirjallinen suostumus saavutettiin kaikista potilaista.

Patient kohortteja ja Tuumorinäytteet

Totally 160 potilaalla oli paikallisesti levinnyt okasolusyöpää kohdunkaulan, takautuvasti rekrytoidaan meidän kemosädehoito protokollan klo Norja Radium Hospital 2001-2012, olivat mukana (taulukko 1). Illumina geeniekspressioprofiilien olemassa 150 potilasta (Illumina kohortti, taulukko 1) ja käytettiin valita ehdokas viittaus geenien testaukseen RT-qPCR (kuvio 1). 42 näistä potilaista, hypoksian liittyvä dynaaminen varjoainetta (DCE) -magnetic resonanssi (MR) Parametri

Brix [25] oli saatavilla ja käytetään mittana kasvaimen hypoksia tila. Kymmenen itsenäistä potilaat (RT-qPCR kohortti 1) käytettiin ennakkoarvioinnin yhdeksän kandidaattigeenejä. Lisäksi 74 150 potilasta Illumina kohortti (RT-qPCR kohortti 2) käytettiin lisäarviointia ja validointi ehdokkaita. Lisäksi, 22 koepalat kahdeksan itsenäistä potilaista (2-4 koepaloja kunkin potilaan) käytettiin arvioimaan sisäisen kasvaimen heterogeenisuus (epäyhtenäisyys kohortti).

Kasvaimen tilavuus ja läsnä patologisen imusolmukkeiden solmut arvioitiin osalta esikäsittelyn MR kuvia. Yhdestä neljään tuumoribiopsioissa (noin 5 x 5 x 5 mm) otettiin diagnoosi välittömästi jäädytettiin ja säilytettiin -80 ° C: ssa. Kaikki potilaat saivat ulkoisen säteilyn 50 Gy primaarikasvaimen ja valinnaisia ​​alueilla, 45 Gy jäljellä lantion, ja vielä 14 Gy patologisten imusolmukkeisiin. Tätä seurasi brakyhoidoksi 25 Gy. Samanaikainen sisplatiinin (40 mg /m

2) annettiin viikottain enintään 6 kurssia mukaan toleranssi. Potilaita seurattiin jopa standardimenetelmän mukaisesti, kuten on kuvattu [25].

Soluviljely

Kahdeksan ihmisen kohdunkaulan syövän solulinjat American Type Culture Collection arviointiin käytettiin hypoksia-reagoiva geenien ; HeLa, SW756, C-33, C-4I, ME-180, HT-3, SiHa ja CaSki. Solulinjoja todistaa oikeaksi STR /DNA-profilointi käyttäen PowerPlex 21 (Promega, Madison, WI) mukaan Eurofinsille Genomics (Ebersberg, Saksa). Soluja viljeltiin 37 ° C: ssa kosteutetussa 5% CO

2-inkubaattorissa Dulbeccon muokatussa Eaglen elatusaineessa (DMEM), jossa GlutaMAX (Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA), johon oli lisätty 100 U /ml penisilliiniä /streptomysiiniä (Sigma , St. Louis, MO) ja 10% naudan sikiön seerumia (FBS, Gibco). Solut testattiin rutiininomaisesti

Mycoplasma

infektio. Soluja kasvatettiin 24 tuntia 10 cm muovi astiat (1-1,8 x 10

6 solua saada ~ 4 x 10

6 solua 48 tunnin kuluttua inkubaation) ennen altistumista hypoksinen (0,2% O

2, 5% CO

2) tai normoxic (95% ilmaa, 5% CO

2) olosuhteissa 24 tunnin ajan 37 ° C: ssa. Invivo2200 kammio (Ruskinn Technology Ltd, Bridgend, UK) käytettiin hypoksian hoitoon.

Geenien ilmentyminen analyysi

RNA: n eristämistä.

Kokonais-RNA eristettiin solusta riviä käyttäen RNeasy MiniKit (Qiagen, Germantown, MD) ja jäädytetyistä näytteistä käyttämällä Trizol-reagenssia (Life Technologies) (Illumina kohortti, RT-qPCR kohortti 2) tai miRNeasy MiniKit (Qiagen) (RT-qPCR kohortti 1, heterogeenisyys kohortti). Kaikki kliiniset näytteet oli yli 50% tuumorisolujen hematoksyliinillä ja eosiinilla leikkeitä, johdettu keskiosassa koepala. Lisäksi heterogeenisyys kohortin, RNA eri koepaloja saman kasvaimen yhdistettiin ja RNA-pitoisuus mitattiin käyttäen NanoDrop 2000 spektrofotometrillä (Thermo Scientific, Waltham, MA). RNA eheys varmistettiin Bioanalyzer (Agilent Technologies, Palo Alto, CA). Kaikki näytteet olivat RNA eheyden numero (RIN) alueella 3,6-9,0 mediaani RIN 7,1.

geeniekspressiota Illumina helmi paneelit.

Koko genomin geeniekspressioprofilointi, Illumina 48K helmi paneelit, noin 48000 transkriptien käytetty; HumanWG-6 v3 (potilaat, solulinjat) ja HumanHT-12 v4 (solulinjat) (Illumina Inc., San Diego, CA). Potilas tiedot ovat osa aineistoja käytettiin edellisissä työssä [25]. cRNA syntetisoitiin, merkitty, ja hybridisoitiin paneelit. Signal louhinta ja quantile normalisointi suoritettiin käyttäen ohjelmistoa valmistajan toimittamat (Illumina Inc.), ja log 2-muunnetun datan käytettiin analyyseissä. Tiedot talletettiin geeniekspression omnibus (GEO) tietokanta (GSE75034).

Geenien ilmentyminen RT-qPCR.

RT-qPCR analyysejä, 7900HT Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA) on sovellettu, ja monistuskäyriä analysoitiin käyttämällä SDS-ohjelmisto v2.3 (Applied Biosystems). DNA-free

™ Kit (# AM1906, Ambion, Austin, TX) käytettiin poistamaan genominen DNA, mukaan valmistajan kuvauksen. Käänteinen transkriptio suoritettiin High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems), joka sisältää satunnaisia ​​alukkeita käyttäen 2000 ng DNaasi-käsitellyn RNA 20 ul reaktio. 1 ui cDNA monistettiin käyttäen TaqMan Fast Universal PCR Master Mix (2 x) ja Custom TaqMan Array 96-Well Fast Levyt kuivattuja alas TaqMan Gene Expression Analyysit (Applied Biosystems), tai yhden putken Taqman ja 96 kuopan Fast levyille . Lämpöjaksotusta parametrit olivat kuvattu Custom Array protokollaa, tai yksiletkuinen määritykset: 20 s 95 ° C: ssa (entsyymi aktivointi), 40 lämpösyklilaitteet 1 s 95 ° C: ssa (denaturointi) ja 20 s 60 ° C: ssa ( hehkutus ja laajennus). TaqMan määritykset ehdokas viite geenien ja kolme hypoksian aiheuttaman geenien arvioitu tässä tutkimuksessa on esitetty taulukossa 2. Ainoastaan ​​erikseen kehitetty inventaarioluettelossa TaqMan määritykset valittiin. Arviointiin TaqMan määrityksissä, koot PCR-tuotteet määritettiin geelielektroforeesilla käyttäen D1000 ScreenTape

® Station (Agilent Technologies). Kolmen valitun viite geenit (katso jäljempänä) ja kolme hypoksian aiheuttaman geenien PCR-tehokkuus määritettiin cDNA laimennus käyrät ja oli lineaarinen reaktion tehokkuutta (S1 Kuva).

Kaikki näytteet ajettiin kahtena kappaleena, ja keskimääräinen kvantifiointiin sykli (C

q) jokaisesta näytteestä käytettiin analyyseissä. Näytteet, joissa keskimääräinen C

q 37 tai keskihajonta 0.4 suljettiin pois. Miinus käänteiskopioijaentsyymin valvonta testattiin jäljellä genomista DNA kaikille TaqMan määrityksissä, ja saastuminen arvioitiin ei-templaattikontrollien ilman RNA cDNA synteesi. Kaikki negatiiviset kontrollit oli määrittelemätön C

q. Ilmaisu taso kohdegeenin analysoitiin käyttämällä vertailevan C

q-menetelmä [26], normalisoi C

Q-arvot kohdegeenin on normalisointitekijän laskettu keskiarvona C

q- referenssin arvoihin geenien; ACk

q, geeni = C

q, geeni- (C

q,

CHCHD1

+ C

q,

SRSF9

+ C

q

TMBIM6

) /3 viitteen geenien tunnistettu tässä tutkimuksessa (katso alla).

tilastot

geNorm [6] ja NormFinder [7] algoritmeja käytettiin arvioida vakautta ehdokas viite geenejä. GeNorm algoritmi perustuu periaatteeseen, että ilmaisu suhde kaksi ihanteellinen viite geenejä on sama kaikissa näytteissä. Kunkin ehdokkaan, vakauteen toimenpide M lasketaan keskiarvo pareittain vaihtelu geenin kaikkien muiden ehdokkaiden; eli keskimääräinen keskihajonta log2-transformoitujen ilmaisu suhdelukua geenejä. Geenit alhaisimman M-arvot pidetään kaikkein vakain. Geenit paremmuusjärjestykseen vaiheittain syrjäytymisen vähiten vakaa ehdokas ja uudelleenlaskenta M-arvojen jäljellä geenien suoritetaan kunnes kaksi vakain geenit jäävät. Voit selvittää lukumäärällä geenejä sisältävät luotettavia normalisoinnin, pareittain vaihtelu kahden peräkkäisen normalisointikertoimia (V

n /n + 1) laskettiin kaikki näytteet, ja cut-off-arvo sisältyy uusi geeni oli asetettu 0,15 [6]. NormFinder on ANOVA mallipohjaisuus, ja käytettiin arviointiin yleisen vaihtelun kunkin ehdokkaan geenin ja sen vaihtelua potilasalaryhmissä ottamalla huomioon sekä sisäisen ja ryhmien välisten muunnelmia. Arvioidut vaihtelut yhdistetään vakautta arvon kullekin geeniä, jossa pieni arvo osoittaa vakaampi ilmaisun [7].

Spearmanin listalla korrelaatio käytettiin arviointiin assosiaatioita jatkuvia muuttujia, U-testi käytettiin vertailla eroja geeniekspressiotasot ryhmien välillä, ja COX suhteellinen vaara (PH) yhden muuttujan analyysiä käytettiin suhteen arvioimiseksi ehdokas viittaus geenien kliiniseen tulokseen. Kliiniset päätepiste oli ilman taudin etenemistä (PFS) seurantaan asti 5 vuotta. PFS määriteltiin diagnoosista tautiin liittyvä kuolema tai ensimmäinen tapahtuma uusiutumisen. Kuolemat 2 vuotta sisällyttämisen jälkeen pidettiin sairauteen liittyvien ellei toinen syy dokumentoitiin. Potilaat sensuroitiin heidän viimeisen tapaamisen tai 5 vuotta, ja tila arvioitiin 3. lokakuuta 2014. Kilpaileva riski mallia käytettiin laskemiseen kumulatiivinen ilmaantuvuus taudin etenemisen, joissa muista syistä johtuvat kuolemat kuin kohdunkaulan syövän kuin kilpailevat tapahtuma. Yksitoista ulos 160 potilaista kuoli muista syistä kokematta uusiutumista seurannan aikana. Koska noin 1/3 potilaista koki toistuminen, kumulatiivinen ilmaantuvuus käyrät verrattiin välillä 1/3 kohortin korkein geenien ilmentyminen ja 2/3 alhaisimman ilme. Gray: n testiä käytettiin arvioimaan eroja käyrien. Merkitsevyystaso oli 5%, ellei toisin ole ilmoitettu, ja kaikki P-arvot olivat kaksipuolisia.

Kaikki analyysit suoritettiin käyttäen R [27] versio 3.1.1. Sillä geNorm analyysejä, read.qPCR () ja selectHKs () toimintoja ReadqPCR ja NormqPCR paketteja [28] sovellettiin. Sillä NormFinder analysoi Normfinder () funktio, jonka Molecular Diagnostic Laboratory, Molekyylilääketieteen osasto, Aarhus University Hospital Skejby, Tanska käytettiin, ja kilpailevien riskianalyysit tehtiin kanssa cuminc () funktio cmprsk paketti [29].

tulokset ja keskustelu

valinta ehdokas viittaus geenien array-pohjainen ekspressioprofiileja

tunnistamiseksi ekspressoida pysyvästi geenien kohdunkaulan syövän näytteissä, ehdokkaiden valinta rajoittui geeneihin jotka on aiemmin raportoitu referenssinä geenien kirjallisuudessa [10,11,13,18,30-35], uusina viittaus ehdokkaita perustuvat meta-analyysi laajamittainen mikrosirujen tai RNA sekvensoinnilla tietokokonaisuuksien [19-23], tai läsnä TaqMan Express Human Endogeeniset ohjauslevy (Applied Biosystems). Tämä johti luettelo 422 eri geeniä, joille 410 olivat läsnä Illumina array käytetään esillä olevassa tutkimuksessa (kuvio 1, S1 taulukko), jota edustaa 631 eri antureista.

Todennäköisin ehdokkaat keskuudessa 410 geenit tunnistettiin käyttämällä Illumina array-pohjainen ilmentymisen profiilit 150 kohdunkaulan syövän potilaiden ja kahdeksan kohdunkaulan syövän solulinjoja kasvatettu normoksia ja hypoksiaa. Ensin ehdokkaat jätettiin perustuen niiden yhdistyksen kanssa hypoksiavaste kohdunkaulan syövän tai kliinisten parametrien potilaan kohortissa. Geenit joille ilmentymistä vähintään yhden koetin kliiniset tiedot joukko korreloi hypoksia liittyvän DCE-MRI-parametrin

Brix (n = 42) poistettiin, sekä geenit, jotka olivat yli 1,5 kertaisesti ylä- tai vaimentua alle hypoksia ainakin yksi solulinjojen (S1 taulukko). Lisäksi ehdokkaat osoittaa yhdistyksen välillä ekspressiotasot ja kasvaimen tilavuus, vaihe, imusolmuke tilan tai kliinistä tulosta 150 potilasta (S1 taulukko) jätettiin pois. Poistettu geenit sisältyvät

GAPDH

,

HMBS

,

EEF1A1

,

ACTB

,

PGK1-

,

RPLP0

, ja

TBP

, joka on tunnistettu mukaan viittaus geenejä aiemmissa tutkimuksissa kohdunkaulan syövän synnyn [10-13,36,37], ja

B2M

,

HPRT1

,

RPL11

,

RPL37A

,

ACTR3

, ja

NDFIP1

, joiden on havaittu olevan sopivia hypoksia tutkimukset pään ja kaulan alueen syöpä [18,30]. Kaikkiaan 99 eri geenejä edustaa 117 antureista pysyi referenssinä ehdokkaita tässä vaiheessa. Varmistaakseen havaitsemisen viitteen geenien RT-qPCR määrityksissä muita poikkeuksia geenien perustuu erittäin matala ekspressiotaso (keskiarvo log2 ilmaus 150 potilasta 7) tehtiin, vähentää tätä määrää 89 ehdokasta edustaa 101 antureista.

lisäksi vakaa ilmaisu, viittaus geeni tulisi mieluiten olla transkriptio runsaasti samanlaisia ​​geenejä tutkittavana lisätä herkkyyttä havaita pieniä geeniekspression muutokset [24]. Huomasimme, että ehdokkaat alin variaatiokerroin (CV) on yleensä ekspressoidaan korkeilla tasoilla havainto myös muiden nähtävillä [24], kun taas suurin osa hypoksian geenien aikaisemmista työstä [25] oli suhteellisen pieni ekspressiotason ( dataa ei esitetty). Lopullinen paneeli geenejä voidaan arvioida RT-qPCR oli siis valittu edustamaan eri ekspressiotasoja lisäksi pitää CV niin alhainen kuin mahdollista. Ehdokkaat olivat myös valittu siten, että ne edustivat eri reittejä tai toiminnallisia luokkia, jotta minimoida valitsemalla co geenien [6]. Lopuksi, että käytettävissä on sopiva ennalta suunniteltu ja validoitu TaqMan-määritys käytettiin valintaperusteena. Paneeli yhdeksän ehdokkaita testataan RT-qPCR määrityksissä on lueteltu taulukossa 1, ja oli ansioluetteloita välillä 0,01-0,09 ja keskimääräinen log2 ekspressiotasot on välillä 7,4-14,0 kliinisessä datajoukon. Näistä geeneistä,

GNB2L1

on aiemmin käytetty vertailukohtana geeni hypoksian tutkimuksissa pään ja kaulan alueen syöpä [18].

Pre-evaluation of 9 ehdokas viite geenien RT-qPCR

sen varmistamiseksi, että ehdokkaat voidaan asianmukaisesti havaita TaqMan-määritys ja mahdollisesti edelleen rajoittaa paneelin ennalta arviointi yhdeksän geenien suoritettiin 10 potilaalla (RT-qPCR kohortti 1, taulukko 1, kuvio 1) . TaqMan-määrityksissä arvioitiin ensin geelielektroforeesilla PCR-tuotteita yhdestä potilaasta (kuvio 2A). Kaikkien määrityksissä, vahva bändi odotetun koon nähtiin. Kuitenkin

SOD1

vielä heikompi kaista pienempiä, mistä voi alukedimeereistä myös ilmi, mikä osoittaa, että määritys ei toimi parhaalla mahdollisella tavalla.

SOD1

jätettiin siis myöhemmissä analyyseissä.

(A) geelielektroforesointi PCR-tuotteiden yhdeksän ehdokasta viite geenit yhdelle potilaalle. Alempi (25 bp) ja ylemmän (1500 bp) markkereita näkyvät kunkin kaistan. Gene symbolit on merkitty. Luku on yhdistetty kuva, jossa

CHCHD1

on erillisestä kuvan ja tikkaiden jokainen kuva näytetään. Pystysuorat viivat osoittavat rajaus kuvan tai erilaisia ​​kuvia. (B) Rasiakuvaajat on aritmeettinen keskiarvo kahtena C

q-arvoja kahdeksan ehdokasta viite geenejä 10 potilaalla. Laatikot osoittavat kvartiiliväli (IQR) kanssa mediaanin kuin musta keskus baarissa. Laajennettu pystypalkit edustaa 1,5 x IQR alapuolella ensimmäiseen neljännekseen ja 1,5 x IQR yläpuolelle kolmannen neljännekseen, ja ympyröitä merkitse epäillään poikkeavia havaintoja. (C) geNorm analyysi kahdeksan ehdokkaan viite geenejä. Keskimääräinen ilmentyminen vakaus (M) jäljellä ehdokasta vaiheittain poistamisen vähiten stabiilin geeni on esitetty. Vähiten vakaa geeni kussakin vaiheessa on merkitty alla. (D) Stability arvo jokaisen kahdeksan ehdokkaan viittaus geenit NormFinder analyysin, jossa pieni arvo osoittaa vakaampi ilmaisua.

Loput kahdeksan ehdokasta ei havaittu C

q-arvot vaihtelevat 19,1-31,1, jossa

GNB2L1

ja

TMBIM6

olivat yleisin ja

RPL27A

vähiten runsas transkripti (kuvio 2B). geNorm ja NormFinder analyysit tehtiin listalla geenit mukaan yleistä vakautta koko kymmenen potilasta (kuvio 2C ja 2D). Keskimääräinen ilme vakaus M päässä geNorm analyysi vaihteli 0,72 käyttämällä kaikkia kahdeksaa geenejä 0,4 kahta vakain ehdokasta (kuvio 2C). Sijoitusta geenien NormFinder analyysi oli lähes identtinen geNorm ranking (kuvio 2D). Perusteellisempaa vakautta analyysi, mukaan lukien arviointi vakauden kaikissa potilasalaryhmissä, ja määritys optimaalinen määrä viittaus geenejä sisällyttää normalisoinnin, viisi eniten pysyvästi ilmensivät geenien määritetään kahdella menetelmällä, eli

CHCHD1

,

GNB2L1

,

IPO8

,

SRSF9

ja

TMBIM6

, tutkittiin edelleen.

määrittäminen RT-qPCR normalisointitekijä

viisi jäljellä ehdokasta arvioitiin RT-qPCR analyysi 74 potilaalla (RT-qPCR kohortti 2, taulukko 1, kuvio 1), jolloin C

q-arvot välillä 17,9 ja 25,4 ( kuvio 3A). geNorm ja NormFinder analyysit osoittivat samanlaisia ​​sijoitusta geenien mukaan vakautta koko potilaista (kuvio 3B ja 3C). Vuodesta geNorm analyysin keskimääräinen ilmaisun vakautta M vaihteli 0,57 käyttäen kaikkia viittä geenejä 0,45 käyttäen kahta vakain ehdokasta.

(A) Rasiakuvaajat on aritmeettinen keskiarvo kahtena C

q-arvot viisi ehdokasta viite geenejä 74 potilaalla. Laatikot osoittavat kvartiiliväli (IQR) kanssa mediaanin kuin musta keskus baarissa. Laajennettu pystypalkit edustavat 1,5 x IQR alapuolella ensimmäiseen neljännekseen ja 1,5 x IQR yläpuolelle kolmannen neljännekseen, ja ympyröitä merkitse epäillään poikkeavia havaintoja. (B) geNorm analyysi viiden ehdokkaan viite geenejä. Keskimääräinen ilmentyminen vakaus (M) jäljellä ehdokasta vaiheittain poistamisen vähiten stabiilin geeni on esitetty. Vähiten vakaa geeni kussakin vaiheessa on merkitty alla. (C) Stability arvo kunkin viiden ehdokkaan viittaus geenit NormFinder analyysi, jossa pieni arvo osoittaa enemmän stabiilia ekspressiota. (D) geNorm pairwise vaihtelu (V) analyysi määrittää riittävästi viite geenien normalisointi tekijä. Pairwise vaihtelu kahden peräkkäisen normalisointikertoimia (V

n /n + 1) kahdesta vakain geenejä kaikki viisi geenejä. Vaakasuora viiva osoittaa raja-arvo (V = 0,15), joille sisällyttäminen lisää geenejä ei ole merkittävää vaikutusta normalisointitekijä.

arvioimiseksi riittävä määrä geenejä tarvitaan luotettavaa normalisoinnin vaiheittaista menetelmää käytettiin sisällyttämällä geenit peräkkäin osaksi normalisointikertoimeen mukaan niiden yhä M-arvoja enintään mitään merkittävää panosta saavutettiin. Pareittain vaihtelu normalisointikertoimia kolme ja neljä geenit olivat alle raja-arvo (V

3/4 0,15), mikä osoittaa, että kolme ehdokasta alhaisimman M-arvo,

CHCHD1

SRSF9

ja

TMBIM6

, riittävät normalisointi (kuvio 3D). Nämä ehdokkaat todettiin myös olevan kolme vakain geenien NormFinder analyysi (kuvio 3C). Lisäksi niiden keskimääräinen M-arvo oli 0,49 (kuvio 3B), ja alapuolella joukko 0,5-1 että olisi vaadittava arvioitaessa viitataan geenien syövän koepaloja [38].

arvioidaan edelleen vakautta viisi ehdokasta kaikissa potilasalaryhmissä käyttäen NormFinder algoritmia (kuvio 4). Tässä analyysissä

CHCHD1

,

SRSF9

ja

TMBIM6

esiintyi myös optimaalisen viittaus geenejä. He olivat vakain ehdokkaat poikki potilailla, joilla on matala ja korkea kasvaimen vaiheesta tai tilavuuden ja ja ilman toistumisen, ja potilaille, joilla on ilman imusolmuke osallistumista diagnoosin kolme ehdokasta olivat neljä vakain geenejä. Lisäksi analyysi kasvaimen hypoksia tila,

CHCHD1

,

SRSF9

ja

TMBIM6

olivat vakain ehdokkaat poikki potilailla, joilla on korkea ja alhainen

Brix ( kuvio 4). Edelleen vahvistaa vakautta näiden kolmen geenin, geNorm analyysi RT-qPCR tietoja normoxic ja hypoksinen näytteitä kahdeksasta kohdunkaulan syövän solulinjoissa suoritettiin. Keskimääräinen M-arvo kolme geeniä olivat 0,79, mikä osoittaa vakaa ilmaisu poikki normoxic ja hypoksinen viljelyolosuhteet [38]. Siten

CHCHD1

,

SRSF9

ja

TMBIM6

näytti olevan hyvin laskemiseksi normalisointitekijän ja valittiin validointia tutkimuksissa hypoksian indusoiman geenin ilmentymistä (Fig 1).

NormFinder analyysit vakautta viiden ehdokkaan viite geenien kaikissa potilasalaryhmissä. Alaryhmiin arvioi olivat: alhainen (n = 49) ja korkea (n = 25) kasvain vaiheessa (FIGO 1B-2B vs. 3A-4A), jossa (n = 32) ja ilman (n = 42) imusolmukkeesta (LN) osallistuminen diagnoosin, alle (n = 36) ja edellä (n = 36) mediaani tuumorin tilavuus 44,6 cm

3, jossa (n = 32) tai ilman (n = 42) käsittely toistuminen viisi vuotta, ja eri hypoksia tilaa kuvaavat alle (n = 16) ja edellä (n = 16) mediaani

Brix.

validointi

CHCHD1

,

SRSF9

ja

TMBIM6

referenssinä geenien hypoksia tutkimuksissa

RT-qPCR analyysit tehtiin kolme geeniä, jotka olemme aikaisemmin raportoitu indusoituvan hypoksia kohdunkaulan syövän solulinjoissa ja liittyy

Brix kohdunkaulan syövän [25], eli

DDIT3

,

ERO1A

ja

STC2

. RT-qPCR kohortti 2 74 potilasta, joille meillä oli Illumina ekspressiotietojen, käytettiin. Geelielektroforeesi PCR-tuotteiden osoitti, että TaqMan määritykset toiminut kunnolla, tuottaa yhden tietyn tuotteen odotettua kokoa kullekin kolmen geenin (kuvio 5A). Ilmaisu tasot

DDIT3

,

ERO1A

ja

STC2

laskettiin normalisoimalla C

q-arvot keskimäärin C

Q-arvo

CHCHD1

,

SRSF9

ja

TMBIM

6. -ΔC

q-arvon osoitettiin korreloivan kanssa Illumina tiedot kaikkien kolmen geenit (P 0,001; ρ 0,78-0,83). Edelleen merkittävä negatiivinen korrelaatioita -ΔC

q ja A

Brix todettiin, yhteisymmärryksessä korrelaatiot saatu Illumina (taulukko 3). Tunnistettu viite geenien vuoksi vaikuttaa sopiva mittaus hypoksian aiheuttamat muutokset kohdunkaulan syöpä.

(A) geelielektroforesointi PCR-tuotteiden kolmen hypoksian indusoima geenien

DDIT3

,

ERO1A

, ja

STC2

. Alempi (25 bp) ja ylemmän (1500 bp) markkereita näkyvät kunkin kaistan. Luku on peräisin yhdestä kuvasta, ja pystyviivat osoittavat rajaus kuvan. Kumulatiivinen ilmaantuvuus taudin etenemisen 74 potilasta jaetaan alhainen (alle 67% prosenttipiste) ja korkea (≥ 67% persentiili)

STC2

ilme perustuu (B) Illumina ilmaisun tiedot ja (C) RT-qPCR data normalisoitu

CHCHD1

,

SRSF9

ja

TMBIM

6 (-ΔC

q). 60 kuukautta uusiutumisen todennäköisyys, P-arvot Grayn testi ja potilaiden lukumäärä vaarassa osoitetaan. Muista syistä johtuvat kuolemat kuin kohdunkaulan syövän sisällytettiin kilpailevan tapahtuman (n = 5). (D) sisäinen kasvain vaihtelua

STC2

ekspressiotasot mitattiin RT-qPCR poikki kahdeksan itsenäistä kasvaimista 2-4 biopsiat kasvain, eli yhteensä 22 koepaloja. Mittaus

STC2

epäonnistui yhdelle koepaloja kasvaimien 4.

STC2

tiedot olivat normalisoitu

CHCHD1

,

SRSF9

ja

TMBIM

6. Näytteet luokiteltiin osaksi korkea ja matala ilme ryhmä käyttäen samaa cut-off, kuten kuviossa 5C (ts -ΔC

q = -4,46). Eri koepaloja samasta kasvain on piirretty kanssa samaa väriä helpottaa tulkintaa kuvion.

Koska hypoksia tiedetään liittyvän aggressiivisuutta kohdunkaulan syövän [3-5] , arvioimme ennustetekijöiden arvo

DDIT3

,

ERO1A

ja

STC2

ilmaisun Illumina ja RT-qPCR aineistoja. Perustuen Illumina tietoihin 150 potilaasta, tilastollisesti merkitsevä kohonnut taudin etenemisen todettiin potilailla, joilla on korkein ilmentymä

DDIT3

tai

STC2

muihin verrattuna (P = 0,047 ja P = 0,015, vastaavasti, Gray testi; tietoja ei esitetä), kun taas

ERO1A

ilmentyminen ei liittynyt tulokset (tuloksia ei ole esitetty). RT-qPCR kohortti 2 74 potilasta, vahvin yhdistyksen tulos havaittiin

STC2

molemmissa aineistoja, ja RT-qPCR data suhde oli tilastollisesti merkitsevä (kuvio 5B ja 5C). Tämä edelleen validoitu sopivuutta

CHCHD1

,

SRSF9

ja

TMBIM

6 referenssinä geenien hypoksia tutkimuksissa, ja ehdotti, että korkea

STC2

ilme on liittyvä kemosädehoito epäonnistumisen mukaisesti aiemman tutkimuksen kohdunkaulan syöpää [39].