Krooninen sairaus

tiivistelmä

syöpäsoluinvaasiota on kriittinen ensimmäinen askel etäpesäkkeiden, vielä vähän tiedetään miten syöpäsolut tunkeutuvat ja aloittaa etäpesäke monimutkaisessa soluväliaineen. Käyttäen solulinja luumetastaasipotilailla eturauhassyövän (PC3), analysoimme miten syöpäsolujen vaeltavat fysiologisesti relevantti 3D Matrigel. Huomasimme, että PC3-solut vaelsivat tehokkaammin kuin monisoluisten klusterit kuin eristetyt yksittäiset solut, mikä viittaa siihen, että läsnäolo solu-soluadheesion parantaa 3D solujen vaeltamiseen. Häiriön N-kadheriinin toiminto transfektoimalla joko N-kadheriinin sytoplasmadomeenissa tai shRNA spesifinen N-kadheriinin lakkautetaan kollektiivinen solujen vaeltamiseen. Mielenkiintoista on, PC3-solut eivät ilmennä α-kateniinin, joka on aktiinia sitova proteiini on kadheriinin monimutkainen. Kun täyspitkä α-kateniinin otettiin uudelleen käyttöön, fenotyyppi PC3-solujen palanneet entistä epiteelin ilmiasuun alentuneeseen solun maahanmuuttoluku 3D Matrigel. Kiinnostavaa kyllä, havaittiin, että N-terminaalinen puoli on α-kateniinin oli riittävä tukahduttaa invasiivisen fenotyypin. Yhdessä nämä tiedot viittaavat siihen, että muodostuu N-kadheriinin liittymissä edistää 3D solujen migraatiota eturauhassyöpäsolujen, ja tämä johtuu osittain poikkeava säätely N-kadheriinin kompleksin puuttuessa α-kateniinin.

Citation: Cui Y, Yamada S (2013) N-kadheriinin Dependent Collective Cell Invasion eturauhassyöpäsolujen säätelee N-päässä on α-kateniinin. PLoS ONE 8 (1): e55069. doi: 10,1371 /journal.pone.0055069

Editor: Chih-Xin Tang, Kiina Medical University, Taiwan

vastaanotettu: 12 lokakuu 2012; Hyväksytty: 24 joulukuu 2012; Julkaistu: 24 tammikuu 2013

Copyright: © 2013 Cui, Yamada. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Beckman Young Investigator Award, joka on Hellman perhe New Faculty Award, NIH EUREKA GM094798, ja varoja Kalifornian yliopistossa Cancer Research koordinointikomitea. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

syöpäsoluinvaasiota on kriittinen ensimmäinen vaihe metastaasin ja fenotyyppisen siirtyminen hyvänlaatuinen kasvain invasiivisen syövän edellyttää muutoksia geeniekspressioprofiili. Sillä epiteelin johdettuja syövät, tämä epiteelin-to-mesenkymaalitransitioon aloitetaan transkriptiotekijät että alas-säädellä tuumorisuppressoreilla ja säätää ylös onkogeenien, ja sen ajatellaan hallita syövän etäpesäkkeiden [1]. Avain epiteelin ja mesenkymaaliset markkereita, jotka määrittävät kunkin fenotyypit ovat epiteelin (E) ja hermosolujen (N) kadheriinit, ja tämä kadheriinin kytkin usein sama siirtymistä hyvänlaatuinen aggressiiviseen syöpiä [2].

Eri syöpää solujen epänormaali ilmentyminen N-kadheriinin korreloi induktion solun liikkuvuus. Esimerkiksi ekspressio N-kadheriinin indusoi solumigraation rintasyöpäsoluissa [3] – [7], melanooma [8], eturauhassyöpä [9], mahasyöpä [10] ja suomuinen karsinooma [11]. Mielenkiintoista on, että yli-ilmentyminen N-kadheriinin tehostaa solun motiliteettia ja invaasiota heikentämättä E-kadheriinin tasolla [4], mikä viittaa siihen, että lisääntynyt solun liikkuvuus on ilmentymisen vuoksi on N-kadheriinin sijaan ei ole E-kadheriinin. Siksi tiukka sääntely N-kadheriiniekspressiota on välttämätön normaalissa epiteelisolujen toiminto. Yhdenmukainen tätä käsitystä, sääntely N-kadheriinin by microRNA-145 on osoitettu tukahduttaa hyökkäyksen ja etäpesäkkeiden mahasyövän [10].

Vaikka kanoninen toiminta N-kadheriinin on luoda solu-solu tarttuvuus, kun läsnä on N-kadheriinin myös indusoi pro-muuttavien signalointia. Solunulkoisen domeenin N-kadheriinin vuorovaikutuksessa FGF-reseptori 1 [12], ja tämä vuorovaikutus minimoi reseptorin sisäistämisen, mikä pitkittää MAPK-ERK aktivointi [5], [6]. Lisäksi N-kadheriinin aiheuttama solumigraatio riippuu alennetaan Akt3 tasolla ja aktivoinnin rintasyövän soluissa [7]. Sen sijaan, rooli N-kadheriinin välittämä solu-solu-adheesion syöpäsolun siirto on epäselvä. Jos N-kadheriinin liittymissä toimivat samalla tavalla E-kadheriinin risteyksiin vakauttaa solu-vuorovaikutuksiin ja estämään solujen vaeltaminen (kontakti esto), sitten N-kadheriinin risteyksissä estäisi syöpäsolun muuttoliikettä. Siksi tällaiset solujen liittymät olisi vastoin tarkoitusta N-kadheriinin aiheuttama pro-muuttavien signaaleja.

Käyttäen eturauhassyövän solulinjoissa mallina järjestelmä, pyrimme analysoimaan, miten N-kadheriinin säätelee syöpäsoluinvaasiota. Eturauhassyövän, N-kadheriiniekspressiota on säädelty ja E-kadheriinin ilmentyminen säätyy alas [13], [14]. Samanlainen kadheriinin kytkin liittyy myös kliininen uusiutuminen [15], ja tunnistettiin etäpesäkeleesioita [16]. Lisäksi N-kadheriinin pinta nousi kastraatio kestävä kasvaimia potilailla, joilla on etäpesäkkeitä [17]. Lisäksi kohonneet N-kadheriinin havaittiin korkealaatuista eturauhasen kasvaimissa verrattuna huono laatu kasvaimia [18]. Käsittely N-kadheriinin-spesifisellä monoklonaalisella vasta-aineella vähensi lisääntymistä, tarttuvuus ja invaasio eturauhassyöpäsolujen

in vitro

, ja hidasti useiden perustettu ksenograftien, tukossa paikallista invaasiota ja etäpesäkkeiden ja suuremmilla annoksilla johti täydellinen regressio [9]. Yhdessä nämä tutkimukset osoittavat suhde N-kadheriiniekspressiota ja eturauhassyövän etenemiseen kuitenkin erityinen rooli N-kadheriinin risteyksissä aikana syöpäsoluinvaasiota ei tunneta.

Aikaisemmat tutkimukset keskittyivät syöpäsolujen maastamuuttoon kaksiulotteinen (2D) substraatti, kun taas vähän tiedetään siitä, miten syöpäsolujen siirtyä entistä fysiologisesti asiaan kolmiulotteisia (3D) matriisi. Käyttämällä aika-raukeavat mikroskopia, huomasimme, että 3D Matrigel, eturauhassyöpä (PC3) solut vaeltavat monisoluisten klustereita, ja tämä kollektiivinen solujen migraation PC3 solujen tuotanto lisääntyy läsnäollessa solu-soluadheesion. Eturauhassyöpä solut yli-ilmentävät N-kadheriinin sytoplasminen domeeni tai N-kadheriinin pudotus solut eivät muuttaneet 3D-matriisiin. Lisäksi, kuten PC3 soluista puuttuu endogeeninen α-kateniinin, uudelleen ilmentäminen α-kateniinin edistänyt epiteelin fenotyypin 3D matriisiin. Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että N-kadheriinin risteyksissä edistää 3D kollektiivinen solujen migraatio eturauhassyöpäsolujen johtuu osittain puuttuminen α-kateniinin.

Tulokset

Collective solujen vaeltamiseen on ainutlaatuinen omaisuutta PC3 solujen 3D matriisissa

Toisin kuin jäykät 2D peitelaseja usein tutkia syövän solujen vaeltamiseen, 3D matrigeelin tarjoaa pehmeän matriisin, joka paremmin jäljittelee kasvain microenvironment. Vertasimme vaeltavien fenotyypin eturauhassyöpäsolulinjoissa (PC3, 22Rv1, LNCaP, RWPE-1 ja RWPE-2) 3D-matriisiin. Vain PC3-solut tunkeutuneet ympäröivään matriisiin tehokkaasti, kun taas 22Rv1, LNCaP, RWPE-1 ja RWPE-2-solut pysyivät pyöreä ja muodostaa pallomainen soluklusterien ilman selvää kalvo laajennuksia (kuvio 1A). Mielenkiintoista on, että 3D-matriisi, PC3-solut siirtää vain, kun ne joutuvat kosketuksiin viereisissä soluissa (kuvio 1A, valkoinen nuolenpää osoittaa yhden ei-muuttavien solut). Lisäksi PC3-solut olivat erittäin vaeltavia pinnalla Matrigel päällystetyn peitelaseille (kuvio 1 B, elokuva S1), mutta solut eivät yllä solu-solu kontakteja 2D pinnalla ja vaeltavat solut ohittaneet toisensa muodostamatta vakaa solu- solun kiinnikkeistä (kuvio 1 B).

(A) morfologia eturauhassyöpäsolulinjoissa 3D Matrigel. PC3-solut muodostavat monisoluisten invasiivisia klusterin mutta 22Rv1, LNCaP, RWPE-1 ja RWPE-2 solut muodostavat monisoluisten palloset ja eivät ole invasiivisia. Arrowheads osoittavat yhdessä ei-muuttavien PC3-soluissa. Oikea paneeli esittää immunoblot-N-kadheriinin (Ncad), E-kadheriinin (Ecad), α-kateniinin (α-cat) ja tubuliinin (kylpyamme) eturauhassyövän solulinjoissa. (B) Cell muuttoliikkeen 2D pinnalla. Punainen tähti ja musta nuoli erikseen merkitä ja seurata kahden vierekkäisen solua ohimennen toisiaan muodostamatta ja ylläpitää solu-solu yhteyttä. Aika minuutteina. (C) Aikaväli kuvia kollektiivisen solujen migraation PC3 solujen 3D Matrigel. Tunteina. (D) edustaja liikeradat (vasemmalla), keskinopeus (keskellä) ja päästä-päähän siirtymä (oikealla) yksittäisten solujen (N = 33) ja monisoluisten klusterit (N = 43) 3D Matrigel (**, p 0,01 ). (E) EDTA lisäksi häiritsee solu-solu-vuorovaikutuksia. EDTA lisättiin loppukonsentraatioon 1,4 mM. Aika minuutteina. (F) immuunivärjäytyminen N-kadheriinin PC3-soluissa kylvetään 3D Matrigel. N-kadheriinin (klooni 6G11) lokalisoituu aktiini (phalloidin) at solu-solu kontakteja. Nuoli osoittaa solu-solu yhteyttä. Kaikki mittakaavassa palkit ovat 10 pm.

3D Matrigel, pitkänomainen PC3 soluklusterien siirtynyt pysyvään suuntaan (kuvio 1 C, D, elokuva S2), kun taas yksittäiset solut vaelsivat satunnaisesti alemmalla keskinopeuden ja net siirtymä kuin yksittäisten solujen sisällä soluklustereita (kuvio 1 D). Nämä tiedot viittaavat siihen, että kollektiivinen solujen migraatio PC3 solut ovat ainutlaatuisia vaeltavien solujen 3D Matrigel, ja läsnäolo solu-vuorovaikutuksiin voidaan edistää tehokasta solumigraatio (solun nopeus ja pysyvyys) 3D matrigeeliin.

kadheriineja ovat potentiaali sääntelyviranomaisten kollektiivisen solumigraation

Koska monet solu-soluadheesion proteiinit ovat kalsiumista riippuvan, analysoimme kollektiivinen soluvaelluksen 3D Matrigel alhaisissa kalsiumia olosuhteissa. Kun kelatoivan kalsiumia EDTA, PC3 solut pitkänomainen klustereissa erottaa viereisistä soluista aikana 30 minuuttia (kuvio 1 E, elokuva S3). Tämä viittaa siihen, että kalsium-riippuvaisen adheesion proteiineja (esim kadheriineja) todennäköisesti vastuussa PC3 solu-solu-vuorovaikutuksia. Mielenkiintoista on, PC3-solut ekspressoivat korkeampia N-kadheriinin ja alempi E-kadheriinin tasot verrattuna 22Rv1, LNCaP, RWPE-1 ja RWPE-2 eturauhassyövän solulinjoissa (kuvio 1A). Lisäksi vain PC3-solut tunkeutuneet 3D matriisi taas toinen eturauhassyövän solulinjoissa ei (kuvio 1A). 3D Matrigel, N-kadheriinin lokalisoitu solu-solu-kontaktien PC3-solujen (kuvio 1F), mikä viittaa siihen, että N-kadheriinin välittää solu-solu-vuorovaikutuksia 3D matriisissa.

immunoleimaus N ja E-kadheriinin paljasti että useimmat PC3-solut olivat N-kadheriinin positiivisia (kuvio 2A), mutta hyvin harvat PC3-soluja E-kadheriinin positiivisia (kuvio 2A). Kiinnostavaa kyllä, havaitsimme, että vaikka suurin osa PC3-solujen yhdessä vaelsivat 3D Matrigel, muutamia soluja pysyivät pallomainen soluklusterien. Olemme epäillään, että ei-muuttavien PC3-soluja voidaan ilmentävät E-kadheriinin. Tarkasti arvioida rooli molempien kadheriineja 3D solujen vaeltamiseen, PC3-solut subkloonattiin eristämiseksi E-kadheriinin ilmentävien PC3-soluissa. Kaksikymmentäyksi PC3 alakloonit syntyy, useimmat subkloonia oli suurempi tai vastaava taso N-kadheriinin parentaalikantaan soluihin (katso kuva S1). Kaksi osa-kloonia valittiin (PC3e ja PC3n) niiden ominaisuuden kadheriiniekspressiota. PC3e oli suurempi E-kadheriinin ilmentymisen tason kuin sekä vanhempien PC3 ja PC3n, vaikka PC3n oli korkeampi ilmentymistaso N-kadheriinin (kuvio 2B, C, S1). E ja N kadheriinilla paikantuvat proteiinit solu-kontaktien PC3e ja PC3n kloonit vastaavasti (kuvio 2C). Lisäksi kadheriiniekspressiota analyysi paljasti, että vanhempien ja PC3n klooni ilmaisi korkeatasoinen kadheriinin 11, kun taas PC3e ilmentyvät ensisijaisesti E ja P-kadheriinin (kuvio 2E). 3D Matrigel, PC3e solut eivät muuttaneet ja pysyi pallomainen klustereita (kuva 2D, elokuva S4). Sen sijaan, PC3n oli pitkänomainen morfologia ja muuttivat pysyvään suuntaan samalla tavalla vanhempien PC3-solut (kuvio 2D, elokuva S5). Nämä tiedot viittaavat siihen, että ekspressiotasot E /P ja N /11-kadheriinien vastaa pallomaisen ja pitkänomaisen fenotyypin 3D matriisin, vastaavasti.

(A) immunovärjäys N-kadheriinin kanssa phalloidin (yläpaneeli) ja E-kadheriinin kanssa phalloidin (alapaneeli) vanhempien PC3-solujen päällystetty peitinlaseil-. (B) Kaksi edustavaa subkloonin vanhempien PC3 soluista, PC3e ja PC3n, immunoblotattiin E-kadheriinin ja N-kadheriinin. Tubuliinia on esitetty lastaus ohjaus. Alkuperäinen blotit esitetään Täydennyskuvio S1. (C) Immuno-värjäys PC3 Subkloonien E-kadheriinin ja N-kadheriinin (klooni 32). (D) Cell morfologit, solu nopeus ja suunta pysyvyys sekä PC3e (N = 19) ja PC3n (N = 20) klooneja 3D Matrigel (**, P 0,01; N = 11-42). Kaikki mittakaavassa palkit ovat 20 pm. (E) Heat kartta mikrosiruanalyysi kaikilla kadheriiniekspressiota tasoilla vanhempien PC3, PC3e ja PC3n soluja.

Expression of N-kadheriinin sytoplasmadomeenissa poistetaan kollektiivisen solujen vaeltamiseen

analysoida rooli N-kadheriinin in kollektiivinen solujen vaeltamiseen, transfektoimme N-kadheriinin sytoplasmisen domeenin (N-cyto), ja subkloonattiin vakaa transfektanttien yhä N-cyto tasoja (kuvio 3A). Kun läsnä on N-cyto, endogeenisen N-kadheriinin ilmentyminen alassäädetty, kun taas endogeeniset E-kadheriinin oli säädelty (kuvio 3B). Microarray-analyysi vahvisti väheni N-kadheriinin ja lisääntynyt E-kadheriinin ilmentymisen profiili N-cyto soluja (kuvio 3C), ja edelleen paljasti up-regulation of P-kadheriinin (kuvio 3C). Sekä E ja P-kadheriinin olivat myös säädellään ylöspäin ei-muuttavien PC3e klooni (kuvio 2E). Yhdessä nämä tiedot osoittavat, että alas-säätely N-kadheriinin johtaa ylössäätöä sekä E ja P-kadheriineja in PC3-soluissa. Mielenkiintoista, kadheriinin 11 oli alassäädetty yhdessä N-cyto ilmentävien solujen (# 1), mutta ei toisissa (# 4, kuvio 3C).

(A) Kaaviokuva täyspitkän N -cadherin ja sytoplasminen N-kadheriinin (N-cyto) rakentaa. N-kadheriinin sytoplasminen domeeni on fuusioitu kalvon kohdistamista verkkotunnuksen Lyn kinaasin (musta) N-terminaalissa ja tandem-dimeeriä tomaatti (punainen): n C-terminaalissa. (B) Immunoblotit N-kadheriinin ekstrasellulaarisen domeenin (klooni 8C11), N-kadheriinin sytoplasmisen domeenin (klooni 32), ja E-kadheriinin (klooni 36), N-cyto ilmentävät PC3 solujen subklooneja. # 1, # 2, # 3, # 4 ovat neljän populaatioita N-cyto solujen vähitellen N-cyto tasoilla. (C) Lämpö kartta mikrosiruanalyysi kaikilla kadheriinin tasoilla PC3, N-cyto # 1 ja N-cyto # 4 soluja. (D) Immuno-värjäys solunulkoisen domeenin N-kadheriinin (klooni 8C11), jossa phalloidin vanhempien PC3-soluissa (ylempi paneeli) ja N-cyto # 4-soluja (alempi paneeli). N-cyto lokalisointi havaittiin tandem-tomaatti-signaalin (alapaneeli). Mittakaava 10 pm. (E) tilastollinen analyysi N-cyto ilmentävien PC3 solujen 3D muuttoliikettä. Keskinopeus ja päästä päähän etäisyys näytetään (**, P 0,01; N = 42 vanhempien soluja ja N = 11 N-cyto solut). Virhepylväät ovat vakiona keskivirhe. Mittakaava, 40 pm.

Sen sijaan, että löyhästi järjestäytynyt ja elongatged morfologia on 2D pinnalla, N-cyto ilmentävien solujen oli tiukempi solu-solu kosketuksiin kuin vanhempien soluja. Immunovärjäys solunulkoisen domeenin N-kadheriinin havaitsimme alhaisen endogeenisen N-kadheriinin, joita ei paikallistaa solu-solu-kontaktien (kuvio 3D). 3D Matrigel, sekä N-cyto # 1 ja # 4 solut muodostivat pallomainen klustereita ja ei invasiivisia (kuvio 3E, Elokuva S6). Vaikka nämä kaksi N-cyto ilmentävien kloonien oli samat ei-invasiivisen fenotyypin 3D Matrigel, heillä on erilaiset kadheriinin 11 tasoa, mikä viittaa siihen, että kadheriinin 11 ilmaisu on riippumaton PC3 solujen vaeltamiseen fenotyyppi ja käyttäytymisestä 3D matrigeeliin.

hiljentäminen N-kadheriinin kumoaa soluvaelluksen 3D Matrigel

määrittelee myöhemmin, onko N-kadheriinin on ensisijainen säätelijä 3D solujen vaeltamiseen, me vakaasti vaiennetaan N-kadheriinin in PC3-soluissa. Kolmen N-kadheriinin erityinen shRNA sekvenssit testattu ja 44 transfektoidut kloonit analysoidaan, kaksi kloonia 50% (KD1) ja 99% (Kd2) vähentäminen endogeenisen N-kadheriinin näkyvät. Kontrolliryhmä vastaavien salattu sekvenssit (SCR1, SCR2) osoittivat samanlaisia ​​N-kadheriinin tasoilla vanhempien PC3-solut (kuvio 4A, B). Haima N-kadheriinin havaittiin KD1-soluissa, mutta ei Kd2-soluissa (kuvio 4B). Lisäksi hiljentäminen N-kadheriinin ei muuta E-kadheriinin ja kadheriinin 11 tasoilla KD1 ja Kd2-soluja (kuvio 4A).

(A) Immunoblotit N-kadheriinin, E-kadheriinin ja kadheriinin 11 N -cadherin knockdown-soluja ja soluja, jotka on transfektoitu salattu sekvenssit. Tubuliinia on esitetty lastaus ohjaus. KD1, Kd2 kaksi knockdown klooneja. SCR1, SCR2 ovat kaksi kloonia transfektoituja vastaavien salattu sekvenssit. (B) immunoväriäys N-kadheriinin kontrollisoluissa (yläpaneeli) ja taintumisen soluja (alapaneeli). (C) Cell aggregaatin muodostumista pudotus solujen ja kontrollisolujen yli 3 tuntia suspension. Tällä tunti 0, 1, 2, 3 suspensiossa, numerot solun aggregaattien analysoidaan olivat 144, 101, 133, 62 vanhempien PC3-solut, 147, 117, 107, 81 KD1 soluja, 142, 121, 107, 73 Kd2 soluja, 146, 115, 87, 88 SCR1 soluja, 131, 147, 107, 68 SCR2 soluja, tässä järjestyksessä. (D) 3D solumigraation analyysit vanhempien (N = 17), scramble shRNA (N = 17 SCR1, N = 20 SCR2) ja taintumisen soluja (N = 37 KD1, N = 33 Kd2). Tilastollinen analyysi keskinopeus näytetään (**, P 0,01). Kaikki virhe palkit ovat vakiona keskivirhe. Kaikki mittakaavassa palkit ovat 20 pm.

Huolimatta alentunut taso N-kadheriinin, The knockdown solut vielä muodostunut solu aggregaatit samankokoiset kuin vanhempien PC3-solujen suspensiossa (kuvio 4C), mikä viittaa siihen, että läsnäolo muiden kadheriinien, esim kadheriinin 11, voi olla riittävä solu-solu-kontakti muodostumista. Kuitenkin 3D Matrigel, osittain knockdown (KD1) solut pitkänomainen samoin kuin vanhempien soluihin, mutta muodostunut paljon löysempää soluklusterien (kuvio 4D). Täydellinen taintumisen (Kd2) solut pysyivät pyöreä pienellä kalvon laajennuksia 3D Matrigel (kuvio 4D). Toisin kuin vanhempien tai salattu shRNA transfektoituja soluja, nämä solut eivät kehittyneet suuri pitkänomainen soluklusterien (kuvio 4D).

3D Matrigel, molemmat knockdown solulinjat eivät muuttaneet niin nopeasti kuin vanhempien tai muokkaamalla shRNA transfektoitujen solut. Vaikka KD1 solut kulkeutuivat 50% vähennys nopeus, Kd2 solut olivat lähes liikkumaton (kuvio 4D, elokuva S7). Nämä tiedot viittaavat siihen, että 3D Matrigel, N-kadheriinin säätelee sekä pitkänomainen morfologia ja kehittäminen solun klustereiden lisäksi solujen vaeltamiseen.

Expression of α-kateniinin palaa PC3-solujen normaalin epiteelin fenotyyppi

kadheriineja ratkaiseva rooli muodostettaessa ja ylläpitää vahvaa solu-solu kiinnikkeistä ja vaativat tukea taustalla aktiinitukiranka ylläpitää solu-kontakteja. Yksi keskeinen jäsen kadheriinin monimutkainen, α-kateniinin, sisältää aktiinin sitovan domeenin C-terminaaliseen päähän. Mielenkiintoista, toisin 22Rv1 tai LNCaP, PC3-solut eivät ilmennä α-kateniinin (kuvio 1A, 5A). Ymmärtää, miten α-kateniinin ilmaisu vaikuttaa N-kadheriinin riippuvainen kollektiivinen solujen vaeltamiseen, me vakaasti transfektoitu GFP-tagged α-kateniinin osaksi PC3 soluihin (kuvio 5A, B). GFP- α-kateniinin ilmentäviä soluja oli lievä nousu N-kadheriinin tason ja lievää laskua E-kadheriinin tason verrattuna vanhempien soluihin (kuvio 5A). Mielenkiintoista on, että α-kateniinin ilmentävät solut muodostivat tiukempi solu-solu-kontaktien kompaktimpi soluklusterit verrattuna löyhästi järjestäytynyt, pitkänomainen emosoluilta 2D pinnalle (kuvio 5B). Lisäksi GFP merkitty α-kateniinin lokalisoitu solu-kontaktien (kuvio 5B), ja yhteistyö paikallistaa N-kadheriinin (kuvio 5C).

(A) Immunoblotit varten α-kateniinin, N-kadheriinin ja E-kadheriinin in α-kateniinin ilmentävien solujen. Tubuliinia on esitetty lastaus ohjaus. LNCaP käytettiin positiivisena kontrollina α-kateniinin ja E-kadheriinin. (B) lokalisaatio α-kateniinin vanhempien PC3-soluissa ja GFP-tagged α-kateniinin ilmentävien solujen Pohjapaneeleihin. (C) Co-paikallistaminen GFP-tagged α-kateniinin N-kadheriinin. (D) Cell yhdistäminen analyysi vanhempien ja α-kateniinin ilmentäviä soluja suspensiossa. Upotus: laajentuneen näkymät soluklusterien. GFP-signaali overlayed päälle kirkas-kenttä kuvaa GFP-tagged α kateniinin ilmentävien solujen. Keskimäärin yhdistäminen koot kussakin ajankohtina esitetään pylväskaavio. (E) Cell muuttoliikkeen analysoi 3D Matrigel. GFP kanava GFP-tagged α-kateniinin ilmentävien solujen valkoisen laatikon (alhaalla vasemmalla paneeli) näkyy alhaalla oikeassa paneelissa. Tilastollinen analyysi solumigraation nopeus esitetään (**, P 0,01; N = 35 vanhempien soluja, N = 31 GFP-α-kateniinin ilmentävien solujen). Kaikki mittakaavassa palkit ovat 20 pm.

jousitus, α-kateniinin ilmentävän solun aggregaattien olivat kooltaan verrattavissa vanhempien PC3-solut (kuvio 5D). Kuitenkin solu-solu kontaktien α-kateniinin ilmentäviä soluja oli paljon tiukempi ilman selvää solu-solu rajoja kuin löysemmin vanhempien PC3 soluaggregaatteja (kuvio 5D). Tiivistyminen solun aggregaattien α-kateniinin ilmentävien solujen viittaa siihen, että N-kadheriinivälitteistä solu-solu-adheesio on todennäköisesti vahvistaa läsnäolo α-kateniinin.

Vaikka kyky muodostaa solu-solu-adheesion suspensiossa ( Kuvio 5D), α-kateniinin ilmentävien PC3-solut eivät venyttää muodostavat suuria soluklusterien 3D Matrigel vanhempainlomia PC3-solujen teki. Nämä solut pysyivät yksittäisinä soluina tai pieni klustereiden entistä pyöreä morfologia (kuvio 5E). 3D Matrigel, α-kateniinin lokalisoitu solu-kontaktien pienisoluisen klustereita (kuva 5E). Tämän mukaisesti morfologia, α-kateniinin solut eivät liikkuvia 3D Matrigel (kuvio 5E, elokuva S8). Nämä tulokset viittaavat siihen, että α-kateniinin ilmaisu vahvisti N-kadheriinivälitteistä solu-soluadheesion ja esti soluvaelluksen 3D Matrigel, ja että alas-säätely α-kateniinin voi olla tärkeä askel eturauhassyövän etäpesäkkeiden.

N-terminaalinen puoli on α-kateniinin on riittävä tukahduttamaan invasiivisen fenotyypin

testaamiseksi roolit α-kateniinin säätelevä solu-solu-adheesion, me asteittain katkaistun α-kateniinin konstrukti (kuvio 6A) ja stabiilisti transfektoitu PC3-soluja. C-pään α-kateniinin koostuu vinkuliinin sitovan inhiboiva domeeni (AA 509-633), ja aktiinin sitovan domeenin (AA 697-906), joka vaatii lyhyen C-terminaaliseen päähän (AA 848-906) aktiinin sitovia [ ,,,0],19]. Täyspitkä α-kateniinin ja katkaistun mutantit olivat vertailukelpoisia niiden ekspressiotasot (kuvio 6B, S2), ja ilmaisu katkaistun mutantit eivät muuta kadheriiniekspressiota profiili (kuvio 6B). Vaikka kaikki katkaistu mutantit sijoittunut kohteisiin solu-solu-adheesion (kuvio 6C), typistetty mutantti ilmentävät solut muodostivat löysempi soluklustereita kuin täyspitkä α-kateniinin ilmentävien solujen 2D pinnalla (kuvio 6C). Mielenkiintoista, katkaisu mutantit α-kateniinin 1-509 ja α-kateniinin 1-848 ilmentävät solut muodostivat suhteellisen pienikokoinen klustereita kuin a-kateniinin 1-670 ilmentävien solujen 2D pinnalla (kuvio 6C).

(A ) Kaavio täyspitkän α-kateniinin ja sen C-terminaalista katkaistu mutantteja. GFP tag, vinkuliini sitova (Vin), sen estävä (esto), F-aktiini sitova (Actin) verkkotunnuksia näkyvät. (B) Immunoblotit varten α-kateniinin, N-kadheriinin ja E-kadheriinin eri α-kateniinin ilmentävien solujen. Tubuliinia on esitetty lastaus ohjaus. 22Rv1 käytettiin positiivisena kontrollina α-kateniinin ja E-kadheriinin. Alkuperäinen blotit esitetään täydentäviä kuvassa S2. (C) Cell morfologia (yläpaneeli) ja paikallistaminen α-kateniinin (alapaneeli) eri α-kateniinin ilmentävien PC3-soluissa. (D) Cell yhdistäminen analyysi vanhempien, erilaisten α-kateniinin ilmentävien solujen ja 10pM sytokalasiini D (CD) käsiteltyjen solujen. Upotus: laajentuneen näkymät soluklusterien. GFP-signaali overlayed päälle kirkas-kenttä kuvaa GFP-tagged α-kateniinin /katkaisu mutantti ilmentävien solujen. Aggregation solujen koon kulloinkin pistettä esitetään keskiarvona ± keskivirhe keskiarvon; ANOVA yhdistettynä posthoc testi Tukey HSD käytettiin ryhmien välillä klo aikapisteessä tunti 3 (**, P 0,01). (E) solumigraation analyysit 3D Matrigel vanhempien (N = 35), täyspitkä α-kateniinin (N = 31), α-kateniinin 1-509 (N = 73), α-kateniinin 1-670 (N = 39), ja α-kateniinin 1-848 (N = 52) ilmentävien solujen. Keskinopeus ja päätepisteen etäisyys muuttoliikkeen esitetään keskiarvo ± keskivirhe keskiarvon; ANOVA ja posthoc testi Tukey HSD käytettiin (***, P 0,001). Kaikki mittakaavassa palkit ovat 20 pm.

Morfologiset fenotyypit on 2D pinnalla olivat yhdenmukaisia ​​tulosten kanssa soluaggregaation analyysin suspensiossa. Vaikka katkaistu mutantti ilmentävät solut muodostivat soluaggregaatteja verrattavissa kooltaan että vanhempien ja täyspitkän α-kateniinin ilmentävien solujen, solujen aggregaatteja osoittivat eri fenotyyppejä (kuvio 6D). Samanlainen täyspitkän α-kateniinin ilmentäviä soluja, α-kateniinin 1-509 ilmentävät solut muodostivat tiukka solu-solu-kontakti ilman selvää solun rajoja (kuvio 6D), mikä viittaa siihen, että N-pää α-kateniinin on olennaista tämän tiukka solu-solu-adheesion. Tämä on sopusoinnussa α-kateniinin mutantin, joka ei ole C-terminaalisessa päässä välttämättömiä aktiinin sitoutumiseen (1-848) kykenivät myös indusoimaan tiukka solun klustereita, vaikkakin väljempi klustereita kuin täyspitkä α-kateniinin ilmentäviä soluja (kuvio 6D ). Huomaa, että aktiini organisaatio on edelleen olennaista muodostumista solu-solu-adheesio kuin sytokalasiini hoito poistetaan solujen aggregaation muodostuminen (kuvio 6D). Yllättäen kuitenkin, α-kateniinin 1-670 ilmentävät solut muodostivat löysä solun aggregaatit samanlainen kuin vanhempien soluja (kuvio 6D).

Koska α-kateniinin mutantin, joka ei ole C-terminaalisessa päässä olennaisen aktiinin sitovia (1-848) lomakkeet suhteellisen tiukka soluklusterien (kuvio 6D), suora aktiini sitova α-kateniinin on vain vähäinen rooli sääntelyn solusta soluadheesion. Lisäksi meidän tiedot viittaavat siihen, että puuttuminen aktiini-sitovan domeenin (AA 697-906), The vinkuliinin sitova inhiboiva domeeni estää kyky muodostaa tiukka solu-liittymissä, joka on yhdenmukainen sen havainnon kanssa, että vinkuliinin tarvitaan vahvistamiseksi solu-soluadheesion [20], [21]. Tämän tueksi mallin, minimaalinen vinkuliini rekrytointi havaittiin pitkin solu-solu kontaktien α-kateniinin 1-670 ilmentävien solujen (kuva S3).

Huolimatta eri fenotyyppejä suspensiossa, kaikki typistetty mutantti ilmentävien solujen saatu samankaltaisia epiteelin morfologia kuin täyspitkä α-kateniinin ilmentävien solujen 3D Matrigel (kuvio 6E). Α-kateniinin mutantti ilmentävien solujen pysyi yksittäisinä soluina tai muodostivat pieniä klustereita pienellä kalvo laajennuksia, ja eivät olleet liikkuvia 3D Matrigel (kuvio 6E). Vaikka nämä a-kateniinin mutantti-ilmentäviä soluja on eri solu-solu-kiinnikkeistä (kuvio 6D), ekspressio N-terminaalinen puoli on α-kateniinin oli riittävä minimoimaan solujen invaasiota 3D Matrigel, viittaa siihen, että solu invasiivisuus määritetään proteiini vuorovaikutusten N-terminaalista puolta α-kateniinin (esim ß-kateniinin).

keskustelu

Aiemmat tutkimukset osoittivat, että N-kadheriinin indusoi pro-muuttavien signalointi suoraan vuorovaikutuksessa FGF reseptoreihin on solunulkoinen domeeni [5], aktivoi MAPK /ERK-signalointireitin [5], [6], ja estää Akt3 merkinanto [7]. Silti rooli N-kadheriinin välittämä solu-solu-adheesion eturauhasen syöpäsolujen invaasiota ei ole tutkittu. Tuloksemme viittaavat siihen, että läsnä on N-kadheriinin välittämiä solun-soluadheesion edistää tehokasta solumigraatio lisäämällä solu nopeudella jatkuvasti vaellusreitillä 3D matrigeeliin.

Tämä kollektiivinen solujen migraation PC3-solujen on ainutlaatuinen muuttoliike fenotyyppi vain esitetään 3D-matriisiin. Vaikka N-kadheriinin lokalisoitu solu-solu-kontakti PC3-solujen levitettiin 2D pinnalla (kuvio 2A, 3D ja 4B), nämä solut eivät vakaan solu-solu kontakteja ja siirtyä yksittäisinä soluja (kuvio 1 B). Koska ilmentymisen avaimen signalointimolekyylejä ovat erilaisia ​​2D vs 3D-ympäristössä [22], tällaiset tekijät voivat muuttaa solu-solu-adheesion ja muuttoliike fenotyypin. Vaihtoehtoisesti ero 2D vs 3D solu-solu-adheesio voi olla tulokset matriisin elastisuus. Esimerkiksi, toisin kuin 3D-matriisiin, kaksi yhteyttä solut liikkuvat vastakkaiseen suuntaan voi usein mekaanisesti häiritä solu-solu-tarttumisessa 2D pinnalla. Tämä johtuu siitä, että jäykkä 2D alustan tarjoaa paremman pidon kuin pehmeä 3D matriisi. Erillinen muuttoliike fenotyypin 3D matriisi viittaa siihen, että N-kadheriinin liittymissä voi olla tärkeä rooli eturauhassyövän soluinvaasiota

in vivo

.

Toisin E-kadheriinin välittämä solu-solu kiinnikkeistä, jotka estävät solujen vaeltamiseen (kontakti-inhibitio, katso 22Rv1, LNCaP ja RWPE kuviossa 1A), N-kadheriinin välittämä solu-solu kiinnikkeistä edistää kollektiivisen solujen vaeltamiseen. Yksi ainutlaatuinen piirre N-kadheriinin tarttuvuus on tukahduttaa satunnainen kalvon ulkonemat seuraaja soluja niin, että vain johtava solut voidaan laajentaa etureunat. Tämä paikallinen kosketus esto ylläpitää solun polariteetin selvä etureunan solun kulkua; Siksi, varmistaa pysyvyyden kollektiivisen solujen vaeltamiseen. Kadheriinin välittämä solu-solu-adheesio on osoitettu tuottamaan polarisoidun solujen morfologia sisään Xenopus mesendoderm soluihin [23] ja transformoitiin epiteelisolujen 3D-matriisiin [24]. N-kadheriinin risteyksen epiteelin johdettujen syöpäsoluissa tarjota polarisaation vihje välttämätön suuntaava soluvaelluksen 3D matriisissa.

Mielenkiintoista, kadheriinin 11, tyypin II kadheriinin, on myös säädellään ylöspäin erittäin invasiivisia klooni PC3-solut (PC3n, kuvio 2E), ja se voi olla vastuussa muodostumista solu-solu-kiinnikkeistä N-kadheriinin vajaiden solujen (kuvio 4C). Tämä kadheriinin 11 ylössäätöä ajatellaan edistää solujen vuorovaikutuksia syöpäsoluja ja kadheriinia 11 ilmaisemalla osteoblastien, joka on tyypillinen luumetastaasin [25] – [27]. Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että ilmaus kadheriinin 11 shRNA vähentää solujen migraatio PC3-solujen [26]. Kuitenkin läsnäolo kadheriinin 11 yksinään ei riitä 3D solujen vaeltamiseen. Esimerkiksi, N-kadheriinin puutteellisia mutta kadheriinia 11 ilmentävät solut eivät ole vaeltavia 3D-matriisiin (katso kuvio 4). Siten ilmaisu sekä N-kadheriinin ja kadheriinin 11 tai mahdolliset vuorovaikutukset näiden kahden erillisen kadheriineja voi olla välttämätöntä eturauhassyövän solujen vaeltamiseen.

E-to-N kadheriinin kytkin havaittu PC3-soluissa on yleisesti havaittu eri syövissä [2]. Usein syöpäsolujen alas-säädellä normaalisti ilmaistaan ​​kadheriineja (E-kadheriinin ollessa kyseessä eturauhasen), ja ajan säädellä mesenkymaaliset kadheriineja (esim. N-kadheriinin, kadheriinin 11 jne).