Krooninen sairaus

tiivistelmä

Kantasolujen pluripotenttisuus, angiogeneesi ja epiteelin-mesenkymaalitransitioon (EMT) on osoitettu merkittävästi yliaktiivista haimatiehyen (PDAC) ja monia muita aggressiivisia syöpiä. Dysregulation Näiden prosessien uskotaan avainasemassa kasvaimen aloittamista etenemisen ja etäpesäkkeiden, ja on vaikuttavista PDAC ollen neljäs johtava syy syövän liittyvät kuolemat Yhdysvalloissa. Kasvain vaimennin miRNA

miR 145

downregulates kriittisiä pluripotenttisuus tekijät ja onkogeenit ja johtaa tukahdutettu metastaattista potentiaalia PDAC. Lisäksi

miR-200

perheen säätelee useiden angiogeenisten tekijöiden, jotka on yhdistetty etäpesäkkeiden monia kiinteitä kasvaimia. Olemme aiemmin osoittaneet, että downregulation DCLK1 voi ylössäätää kriittinen miRNA sekä

in vitro

ja

in vivo

syövän malleja ja tuloksia downregulation c-MYC, KRAS, Notch1 ja EMT liittyvät transkription tekijät. Tuoreessa raportissa on myös osoittanut, että Dclk1 voi erottaa normaalin ja kasvaimen kantasolujen

APC

min /+

hiirillä ja että ablaatio Dclk1

+ solut johti regressioon suoliston polyypit vaikuttamatta homeostaasiin. Tässä osoitamme, että pudotus on DCLK1 käyttämällä poly (laktidi-ko-glykolidi) -encapsulated-DCLK1-siRNA johtaa AsPC1 kasvaimen kasvun pysähtyminen. Tutkiminen ksenograftikasvaimissa paljasti, (a) lisääntynyt

miR 145

mikä johtaa alentuneeseen pluripotenttisuus ylläpito tekijät Oct4, Sox2, Nanog, Klf4 sekä KRAS ja RREB1; (B) lisääntynyt kirjeet

7 a

mikä johtaa alentuneeseen pluripotenttisuus tekijä LIN28B; ja (c) lisätä

miR-200

, mikä johtaa alentuneeseen VEGFR1, VEGFR2 ja EMT liittyvien transkriptiotekijöiden ZEB1, ZEB2, SNAIL ja SLUG. Erityisyys DCLK1 transkription jälkeisen sääntelyn loppupään tavoitteiden

miR 145

,

miR-200

ja kirjaimien

7 a

suoritettiin käyttäen lusiferaasin perustuvan reportterianalyysi . Olemme päätellä, että DCLK1 on merkittävä master säätelevä rooli haiman kasvainten synnyssä kautta sääntelyn monituumorisuppressori miRNA ja niiden loppupään pro-syntyreitit. Tämä uusi käsite kohdistaminen DCLK1 yksin on useita etuja verrattuna kohdistamista vain yhtä oikeaa tai miRNA-pohjainen hoitoja PDAC.

Citation: Sureban SM, May R, Qu D, Weygant N, Chandrakesan P, Ali N, et al . (2013) DCLK1 Säätelee pluripotenttisuus ja angiogeenisten tekijöiden

kautta

microRNA-riippuvainen mekanismeja in Haimasyöpä. PLoS ONE 8 (9): e73940. doi: 10,1371 /journal.pone.0073940

Editor: Chunming Liu, University of Kentucky, Yhdysvallat

vastaanotettu: 22 huhtikuu 2013; Hyväksytty: 23 heinäkuu 2013; Julkaistu: 09 syyskuu 2013

Copyright: © 2013 Sureban et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat National Institutes of Health ja National Cancer Institute apurahat: CA-137482 (CWH); Oklahoma Center for Advancement of Science and Technology, ja Oklahoma Center for Aikuisen kantasolujen Research (CWH). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: CWH on cofounder COARE Biotechnology Inc., ja tämä ei muuta kirjoittajat ”noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan ja tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

Haiman adenokarsinooma (PDAC) on neljänneksi suurin syy syöpään liittyvien kuolemien Yhdysvalloissa vuosittain 5 % 5 vuoden pysyvyys. Huolimatta yli 10 vuotta FDA-hyväksyttyjä terapeuttisia hoito ja parantunut huomattavasti sairaanhoito ja kirurginen hoito, ei ole merkittävää vaikutusta PDAC elossaololuku on havaittu [1]. Äskettäin osajoukko solujen syövän kantasoluja (CSC) ominaisuudet on tunnistettu PDAC [2], jotka kykenevät rajoittamaton itseuudistumisen ja aiheuttavat enemmän eriyttämättömään ja enemmän aggressiivinen jälkeläisiä, jotka ovat usein resistenttejä tavanomaisille kemoterapiaa ja sädehoitoa [2,3]. Kyvyttömyys hävittää nämä CSCS oletetaan olevan syy kasvaimen uusiutumisen, etäpesäke ja kuolema seuraavat alustavat hoitovaste [4]. Toinen kriittinen este torjunnassa kiinteän kasvaimen syövät yleensä on heterogeenisyys solutyyppien alueella kasvain microenvironment [5] sekä erittäin desmoplastic kasvain kapealla [6]. Tämä heterogeenisuus vaikeuttaa lisäksi epiteelin ja mesenkymaalitransitioon (EMT), prosessi, joka on avainasemassa syövän eteneminen ja metastaasit [7,8]. Monet EMT-indusoivan transkription tekijöitä, kuten SNAI1 (SNAIL), SNAI2 (SLUG), ZEB1, ZEB2, TWIST1, FOXC2 ja Goosecoid on yhdistetty tuumorin invaasiota ja etäpesäkkeiden [9]. Viime aikoina useita raportteja ovat tunnistaneet microRNA (miRNA)

miR-200

perheen perustavaa laatua markkereita ja säätelijöinä EMT [10-12]. miRNA ovat pieniä, 19-22 nukleotidiä pitkiä, ei-koodaavat RNA: t, jotka estävät geenin ilmentymistä on posttranskriptionaalisella tasolla [13]. Vahva yhteys miRNA säätelyhäiriötä ja ihmisen syövän on vahvistettu [14]. Näin ollen miRNA on osoitettu toimimaan joko onkogeenien (esim

miR-155

,

miR-17-5p

ja

miR-21

) [15,16] tai tuumorisuppressorien (esim

miR-34

,

miR-15a

,

miR-16-1

ja kirjaimien

7

) [17 -20]. Kuitenkin tarkka sääntely ominaisuuksia, jotka muuttaa tasapainoa kohti syövän fenotyypin suhteen tuumorisuppressorigeenin vastaan ​​onkogeenistä miRNA ilmaisu huonosti.

pluripotenttisuuden on kyky solun erilaistumisen tahansa solutyypin, ja on ainutlaatuinen ominaisuus alkion kantasolut (ESC). Pluripotenttisuus transkriptiotekijöiden kuten Oct4, Sox2, Nanog ja Klf4 muodostavat säätelyverkkoja ja vaikuttaa laaja kirjo loppupään geenejä. Yliekspressio nämä tekijät voivat dedifferentiate ihmisen ja hiiren somaattisten solujen aiheuttama pluripotenttien kantasolujen (iPSCs) [21]. Uudelleenohjelmointi tekijät Oct4, Sox2, Nanog, Klf4, c-MYC, ja LIN28 on myös ehdotettu olevan onkogeenien ja voi kohdistua kehittämiseen useita syöpiä [21-26]. Useita raportit ovat osoittaneet, että nämä transkriptiotekijät säätelevät ainakin osittain miRNA [21,27,28].

miR 145

nimenomaan estää edellä mainitut pluripotenttisuuden tekijät sitomalla 3’alue (UTR) mRNA, joka johtaa esto talous- ja sosiaalineuvostojen, itseuudistumisen, ja erilaistumisen induktion. Lisäksi menetys

miR 145

heikentää erilaistumista ja nostaa Oct4, Sox2, ja Klf4 [21]. Lisäksi on osoitettu, että

miR-145

promoottori sitoo ja tukahduttaa Oct4 vuonna talous- ja sosiaalineuvostot. Tämä osoittaa (a) olemassaolo välillä on suora yhteys ytimen uudelleenohjelmointi tekijät ja

miR-145

, ja (b) läsnäolo kaksinkertaisen negatiivinen kierre, johon Oct4, Sox2, Klf4, ja

miR-145

[21]. Syövän,

miR-145

on vaimentua ja on osoitettu olevan kasvaimia estävä ominaisuuksia. Menetys

miR-145

(

miR-143/145

cluster) havaitaan KRAS muuntunut haimasyöpä, ja terapeuttinen ennallistamiselle miRNA kumoaa tumorigeneesin [29,30]. Lisäksi Ras vastaava elementti sitova proteiini 1 (RREB1) tukahduttaa

miR-143 Twitter /

miR 145

promoottorin aktiivisuutta, mikä osoittaa, että tukahduttamisen on varhainen tapahtuma haimasyövän aloittamista ja etenemiseen [ ,,,0],29]. Lisäksi KRAS ja RREB1 ovat tavoitteita

miR-143/145

, mikä osoittaa myötäkytkentärakenne mekanismi, joka tehostaa RAS signalointi välittämää PDAC syövän etenemistä [29]. Äskettäin on osoitettu, että ektooppinen ilmentyminen

miR-143/145

tuloksia tukahdutettua etäpesäkkeitä ja lisääntynyt adheesio haimasyöpäsoluissa [30]. Nämä tiedot yhdessä viittaavat siihen, että

miR-145

on päällikön säätelijä iPSCs tekijöitä talous- ja sosiaalineuvostojen ja CSCS ja se voi olla tärkeä rooli eston haimasyövän aloittamista, etenemistä ja EMT.

Vascular endoteelikasvutekijä (VEGF) signaloinnin tärkeä rooli tuumorin angiogeneesiä. VEGF-perheen jäsenet välittävät kriittisiä signalointi sitoutumalla kaksi tyrosiinikinaasireseptorit, VEGFR1 ja VEGFR2. VEGFR1 tarvitaan endoteelisolujen selviytymisen; katsoo, VEGFR2 vaaditaan reseptorivälitteisen angiogeeninen ja verisuonten läpäisevyyttä aktiivisuus [31-33]. Äskettäin on osoitettu, että nämä angiogeenisten tekijöiden (VEGFR1 ja 2) ovat mukana kasvaimen etäpesäke munuaisten ja paksusuolen karsinoomasoluja [34]. VEGF signaloinnin tiedetään edistävän kasvaimen verisuonistoon ja endoteelisolujen proliferaation PDAC. Tutkimukset käyttäen liukoista VEGFR1 ja VEGFR2 (inhibitio VEGFR-välitteisen signaloinnin määräävän-negatiivinen tavalla) tai VEGFR-tyrosiinikinaasin estäjät johti tuumorin angiogeneesiä, kasvua ja etäpesäkkeiden PDAC hiiren malleissa [35-38].

DCLK1 (aiemmin tunnettu nimellä DCAMKL-1) on otaksuttu suoliston ja haiman kantasolujen markkeri ja ylössäädellään stroomassa ja epiteelin PDAC. Se on myös äskettäin kuvattu markkerina suhteellisen määrittelemätön tupsu /harja solu haimassa ja suolistossa [39,40]. Se säätelee negatiivisesti useita tuumorisuppressoriproteiinia miRNA ja todennäköisesti on keskeinen rooli taudin alkamisen ja etenemisen kiinteän kasvaimen syövät [11,41]. Lisäksi se säätelee useita keskeisiä onkogeenien (c-MYC, KRAS ja Notch1) ja EMT. Lisäksi yliekspressio pluripotenttisuuden tekijöiden maksasyövän soluissa johti lisääntyneen ilmentymisen DCLK1 [42]. Äskettäin Nakanishi et al. [43], ovat käyttäneet elegantti Dclk1-Cre hiirimallissa osoittaa, että Dclk1 merkitsee suoliston kasvain kantasoluja. Ablaatio Dclk1 ilmentävien solujen

APC

min /+

hiirille aiheutti regression polyyppien ilman vaurioita normaalin suolen epiteelin. Tässä raportissa jälkeen knockdovvn DCLK1 käyttää nanohiukkasten kapseloitu siRNA (NPsiDCLK1) kasvaimen ksenosiirrettyjä hiirillä, havaitsimme merkittävän kasvun: (A)

miR-143/145

klusteri, joka johti downregulation of key pluripotenttisuus markkereita (Oct4, Sox2, Klf4 ja Nanog); (B) kirjeet

7a

, mikä johti laskenut pluripotenttisuus tekijä LIN28B; ja (C)

miR-200a b

ja

c

, mikä johti downregulation EMT ja angiogeenisten tekijöiden. Anto NPsiDCLK1 ei aiheuttanut ilmeistä toksisuutta hiirillä. Nämä tiedot yhdessä osoittavat, keskeinen säätelevän roolin DCLK1 haiman kasvainten synnyssä.

Materiaalit ja menetelmät

pienet häiritsevät RNA: t,

DCLK1 siRNA (siDCLK1) sekvenssin kohdistaminen koodausalueen DCLK1 (liittymistä nro NM_004734) (GGGAGUGAGAACAAUCUACtt) ja salattu siRNA (si-SCR) ei vastaa mitään ihmisen geenien saatiin (Ambion Inc, Austin, TX).

synteesi ja karakterisointi DCLK1 siRNA NP:

Poly (laktidi-ko-glykolidi) happo nanohiukkasten (PLGA NP) syntetisoitiin käyttäen kahden emulsion haihduttamalla liuotin tekniikalla kuten aiemmin on kuvattu [11,44]. Lyhyesti, siRNA (DCLK1 tai salattu) kondensoitiin on kationinen polymeeri poly (etyleeni) (PEI) muodostamiseksi siRNA-PEI monimutkainen. Tämä kompleksi lisättiin PLGA kloroformiin ja sekoitettiin Vortex: illa ja siirrettiin 2% polyvinyylialkoholia. Tämä emulsio käsiteltiin ultraäänellä ja sen annettiin haihtua yön yli. Koko, polydispersiteetti-indeksi, ja zeta-potentiaali mittaukset synteettisesti siRNA NP määritettiin diffraktio valonsironta (DLS) käyttäen Zeta PALS (Brookhaven Instruments, Holtsville, NY).

Vieraslajisiirteen kasvainmuoto

NOD /SCID-hiiriä hankittiin Jackson Laboratory (Bar Harbor, Maine) ja sijoitettu patogeenivapaissa olosuhteissa. Ne hoidettiin mukaisesti ohjearvojen American Association for Accreditation of Laboratory Animal Care ja US Public Health Service Tilaaja Corps ” valiokunnalle Human Care ja käyttö Laboratory Animals. ”Kaikki tutkimukset hyväksymä ja valvoma yliopisto Oklahoma Health Sciences Center Institutional Animal Care ja Käytä komitea (IACUC). AsPC-1-soluja (1 x 10

7) injektoitiin subkutaanisesti kylkiin 4- 6-wK-ikäisten hiirten (n = 3). kasvaimet mitattiin käyttäen paksuus ja tilavuus laskettiin (pituus x leveys

2) x 0,5. kasvaimet olivat palpoitavissa 30 päivää injektion jälkeen soluja. NP rekonstituoitiin steriilissä normaalissa suolaliuoksessa ja injektoidaan suoraan kasvaimia. Jokainen eläinten, joissa kasvain injektoitiin päivinä 30, 33, 36, 39, ja 42, joissa yksi seuraavista valmisteiden -50 ui (5 uM) siRNA-NP valmisteen [NP yksinään (kontrolli), NP-siScrambled (NPsiSCR), tai NPsiDCLK1]. Kaikki hiiret tapettiin päivänä 45.

immunohistokemia, Western blot, reaaliaikainen käänteistranskriptio-PCR, miRNA-analyysi, Invasion määritys ja lusiferaasireportterigeenillä määrityksessä

Nämä analyysit olivat suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [11,41]. Yksityiskohtaiset kuvaukset annetaan täydentävän osassa Materiaalit ja menetelmät (Text S1).

Tulokset

RNA vaiennettu DCLK1 estää haimasyövän ksenografti- kasvu

AsPC-1 ihmisen haiman syöpäsolut injektoitiin subkutaanisesti kyljissä NOD /SCID ja kasvainten annettiin kehittyä 30 päivää. NP kapseloitu siRNA: t (NPsiDCLK1 ja NPsiSCR) injektoitiin kasvaimen. Nanohiukkasten kapselointi suoritettiin voittaa teoreettinen rajoitukset siRNA perustuva jakelu [45]. Tehoa tätä lähestymistapaa on aiemmin testattu kolorektaalisyövässä ksenografteissa [11]. Päivänä 30, kun tuumorit olivat palpoitavissa, hoidot aloitettiin ja sitä jatkettiin joka kolmas päivä yhteensä viisi injektiota. Kasvaimet leikattiin päivänä 45 ja kasvaimen volyymit ovat edustettuina kuviossa 1. hallinto NPsiDCLK1 johti merkittävään (~ 85%) vähennys (

p

0,01) kasvaimen tilavuuden verrattuna joko Ohjaus (NP-alone) tai NPsiSCR-käsitellyt tuumorit (kuvio 1A ja 1 B). mRNA-analyysi osoitti merkittävän downregulation (

p

0,01) on DCLK1 mRNA verrattuna kontrolliin tai NPsiSCR käsitelty kasvain (kuvio 1 C). Nämä tiedot yhdessä osoittavat, että inhibitio DCLK1 tuloksia AsPC-1 -tuumoriksenografti kasvun pysähtymistä.

A, AsPC-1 ihmisen haimasyövän soluja injektoitiin ihonalaisesti kylkiin NOD /SCID-hiirten tuottamiseksi kasvaimia. Päivänä 30, PLGA NP kapseloitu siRNA: t (siDCLK1 ja siSCR) injektoitiin suoraan kasvaimia, ja sen jälkeen injektiot joka kolmas päivä. Kun 5 injektiot, kasvaimet irrotettiin päivänä 45 ja ovat edustettuina edellä. Kasvaimen tilavuus mitattiin joka 3 päivä. B, edustaja valokuva hiirille, joilla on kasvaimia, kunkin ryhmän on esitetty. C, ilmentyminen DCLK1 mRNA: n kasvaimia kvantitoitiin reaaliaikainen RT-PCR: llä. Arvot annetaan keskiarvo ± SEM, ja

tähdellä

merkitsevät tilastollisesti merkitseviä eroja (*

p

0,01) verrattuna valvonta (NP yksin).

knockdovvn DCLK1 johtaa downregulation pluripotenttisuuden tekijöistä haiman tuumoriksenografteja kautta miR 145

on osoitettu, että Oct4, Sox2, c-MYC, LIN28, Nanog ja Klf4 tarvitaan ESC itseuudistumisen ja pluripotenttisuus ja ovat yläreguloituja joissakin aggressiivinen syöpien ja CSCS [23-26,28]. Yliekspressio nämä tekijät voivat ohjelmoida tai dedifferentiate ihmisen ja hiiren somaattisten solujen iPSCs. Tässä havaitsimme merkittävää (

p

0,01) downregulation ( 40%) mRNA ilmaisun pluripotenttisuuden merkkiaineiden Nanog ja Klf4 (kuvio 2A ja 2B) reaaliaikaisella RT-PCR jälkeen knockdown of DCLK1. Similarly Nanog ja Klf4 proteiinit myös vaimentua analysoitiin immunohistokemiallinen analyysi (kuvio 2C ja 2D). Lisäksi meillä on myös havaittu merkittäviä ( 40%) downregulation Oct4 (kuvio 2E) ja Sox2 (kuvio 2F) mRNA-tasolla jälkeen knockdovvn DCLK1 in AsPC-1 tuumoriksenografteja.

siRNA- välitteisen knockdovvn DCLK1 johti downregulation pluripotenttisuuden tekijöistä: Nanog mRNA (A); Klf4 mRNA (B); Nanog-proteiini (C); Klf4 proteiini (D); Oct4 mRNA (E) ja SOX-2 mRNA (F). mRNA analysoitiin reaaliaikaisella RT-PCR: llä ja proteiini immunohistokemiallisella analyysejä. Sillä pylväsdiagrammi A, B, E ja F, arvot ilmoitetaan keskiarvo ± SEM, ja

tähdellä

merkitsevät tilastollisesti merkitseviä eroja (*

p

0,01) verrattuna valvonta (NP yksin).

DCLK1 transkription jälkeen säätelee miR 145 haimasyövän

miR-145

on osoitettu tukahduttaa Oct4, Sox2, ja Klf4 mikä tukahduttaa pluripotenttisuus ja ohjaamalla eriyttäminen [21].

miR-145

on vaimentua eri syöpien ja on osoitettu olevan kasvaimia estävä ja etäpesäkkeiden estäviä ominaisuuksia [29,30]. Aiemmin raportit [11,28,41] ja tiedot osassa osoittavat, että DCLK1 säätelee negatiivisesti tuumorisuppressoriproteiinia miRNA kuten kirjeet

7 a

,

miR-144

ja

miR-200a

. Samoin tässä havaitsimme merkittävän induktion (1,5-kertainen)

pri-miR-143/145

cluster miRNA (kuvio 3A) ja

pri-miR-145

miRNA (kuvio 3B) jälkeen knockdovvn DCLK1 in AsPC-1 tuumoriksenograftien. Lisäksi olemme suorittaneet lusiferaasireportterigeenin määritys kvantitatiivisesti mitata vaikutusta DCLK1 pudotus on

miR-145

miRNA. AsPC-1-solut transfektoitiin plasmidilla, joka sisälsi tulikärpäsen lusiferaasi-geenin komplementaarisen

miR-145

sitoutumiskohdan 3 ’UTR. Transfektion jälkeen solut käsiteltiin NP yksin, NPsiSCR tai NPsiDCLK1 ja alistettiin lusiferaasin aktiivisuuden mittaus. Vähentäminen lusiferaasiaktiivisuuden havaittiin soluissa, joita käsiteltiin NPsiDCLK1 kontrolliin verrattuna tai NPsiSCR (kuvio 3C). Nämä tiedot viittaavat siihen, että knockdovvn DCLK1 johtaa downregulation on

miR 145

miRNA loppupään tavoitteita haiman syöpäsoluja. Aiemmin on osoitettu, että takaisinkytkentäsilmukan mekanismi välillä

miR-143/145

ja KRAS ja RREB1. RREB1 tiedetään tukahduttaa transkriptio

miR-143/145

sitoutumalla sen promoottorialueen. Lisäksi KRAS ja RREB1 ovat alavirtaan tavoitteita

miR-143/145

[29]. Knockdovvn DCLK1 lisännyt ilmentyminen

miR-143/145

klusterin ja downregulation sen loppupään kohde KRAS (kuvio 3D). Lisäksi olemme havainneet, että ilmaus RREB1 merkittävästi vaimentua annon jälkeen siRNA vastaan ​​DCLK1 (kuvio 3E). Näiden tietojen, me spekuloida, että DCLK1 on rooli transkription jälkeinen säätely

miR-143/145

klusteri ja siten downregulates KRAS ja RREB1 haiman tuumoriksenografteja.

jälkeen knockdovvn DCLK1 in AsPC-1 tuumoriksenografteja merkittävä säätelyä

miR-143/145

klusteri (A) ja

miR 145

miRNA (B) reaaliaikaisella RT-PCR. C, väheneminen lusiferaasiaktiivisuudessa (lusiferaasiyksiköt) transfektion jälkeen plasmidin-lusiferaasia koodaava sisältävä

miR 145

sitoutumiskohta havaittiin jälkeen knockdovvn DCLK1 in AsPC-1 ihmisen haimasyövän soluja. Knockdovvn DCLK1 myös johti downregulation of KRAS (D) ja RREB1 (E) mRNA, alavirtaan tavoitteet

miR-143/145

miRNA klusterin, analysoitiin käyttäen reaaliaikaista RT-PCR. Arvot annetaan keskiarvo ± SEM, ja

tähdellä

merkitsevät tilastollisesti merkitseviä eroja (*

p

0,01) verrattuna valvonta (NP yksin).

Kaiken kaikkiaan nämä tiedot yhdessä osoittavat mahdollisen sääntelyn rooli DCLK1 ilmaisemisessa iPSC tekijöitä haimasyöpä kautta

miR 145

miRNA.

DCLK1 säätelee let-7a ja sen loppupään tavoite LIN28B haimasyövän

haima- ja peräsuolen syövän soluja, olemme aiemmin osoittaneet, että DCLK1 säätelee negatiivisesti miRNA kirjeet

7 a

. siRNA-välitteisen knockdovvn DCLK1 johti downregulation of kirjeet

7 a

alavirtaan tavoitteet c-MYC ja KRAS. Haiman tuumoriksenografteja käsiteltiin NPsiDCLK1, havaitsimme merkittävää voimistumista kir-

7

(kuvio 4A) ja sen jälkeen downregulation sen alavirrassa oleva kohde c-MYC (mRNA ja proteiini) (kuvio S1). Raportit osoittavat, että LIN28B, pluripotenttisuuden pysyvyyskerroin säätelee miRNA kirjeet

7

ja vuorostaan ​​kirjaimien

7

säätelee LIN28B (johtuen läsnäolo sitoutumiskohta 3 ’UTR: LIN28B) , mikä viittaa kaksinkertainen negatiivinen kierre välillä LIN28 ja kirjaimien

7

[46,47]. Täällä halusimme nähdä onko NPsiDCLK1 säätelee alavirtaan tavoitteet kirjeet

7 a

miRNA. AsPC-1-solut transfektoitiin plasmidilla, joka koodaa tulikärpäsen lusiferaasi-geenin valvonnassa 3 ’UTR, joka sisältää sitoutumiskohdan kir-

7

. Transfektion jälkeen solut käsiteltiin NPsiDCLK1 ja altistettiin lusiferaasin mittaus. Sen jälkeen, kun pudotus on DCLK1, havaitsimme merkittävää downregulation

let-7

-riippuvaista lusiferaasiaktiivisuutta (kuvio 4B), joka ilmaisee, että NPsiDCLK1 säätelee alavirtaan tavoitteet kir-

7

haiman syöpäsoluissa. Perustuu reaaliaikainen RT-PCR-analyysi käsitellyt kasvaimet NPsiDCLK1, havaitsimme merkittävää downregulation LIN28B mRNA verrattuna NPsiSCR tai kontrolli-käsitellyt tuumorit (kuvio 4C). Nämä tiedot osoittavat, että DCLK1 säätelee LIN28B kautta

let-7

: sta riippuva mekanismi.

A, siRNA-välitteisen knockdovvn DCLK1 in ksenograftien johtaa lisääntyneeseen ekspressioon

pri-kir- 7 a

miRNA. B, jälkeen knockdovvn DCLK1, lasku

miR-let7a

riippuvaista lusiferaasin aktiivisuuden havaittiin AsPC-1-soluissa. C, LIN28B mRNA myötävirtaan kohde kirjeet

7 a

säädeltiin vähentävästi vuonna käsitellyt kasvaimet NPsiDCLK1. Arvot pylväsnäyttöä annetaan keskiarvo ± SEM, ja tähdet merkitsevät tilastollisesti merkitseviä eroja (*

P

0,01) verrattuna valvonta (NP yksin).

DCLK1 säätelee miR-200 perheen geenien ja EMT haimasyövän

EMT on erittäin konservoitunut prosessi, tunnettu siitä, että fenotyyppinen muuntaminen epiteelisolujen mesenkyymisolujen [7]. EMT on olennaista eri prosessissa kuten elin morphogenesis, haavan paranemista, syövän etäpesäkkeiden ja kudoksen uudelleen alkion kehitykseen. Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että

miR-200a b

ja

c

(

miR-200

) tiedetään säännellä EMT ja angiogeneesiä [48]. Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että DCLK1 yli-ilmennetään ihmisen haimasyövän kudosten ja lokalisoituu SNAIL ja SLUG. Sen jälkeen, kun pudotus on DCLK1 merkittävä downregulation ZEB1, ZEB2, SNAIL ja SLUG havaittiin seuraavat lisääntyneen ilmentymisen

pri-miR-200a

in AsPC-1 syöpäsoluja [11]. Samoin AsPC-1 tuumoriksenografteja, 2-kertainen induktio

pri-miR

-200

(

p

0,01) (kuvio 5A) havaittiin . Lisäksi halusimme tutkia vaikutusta DCLK1 knockdown ekspressioon

miR-200B

ja

c

in AsPC-1 tuumoriksenograftien. Samanlainen

miR-200a

, havaitsimme merkittävää voimistumista

miR-200b

(1,5-kertainen) (kuvio 5A) ja

miR-200c

(2-kertainen ) (kuvio 5A) jälkeen pudotus on DCLK1. Seuraavaksi halusimme tutkia DCLK1 säätelee alavirtaan tavoitteet

miR-200

. Suoritimme lusiferaasireport- määritys

miR-200

. AsPC-1-solut transfektoitiin erikseen koodaavilla plasmideilla lusiferaasigeenin säätelyn alaisuudessa miRNA sitoutumiskohtia (kolme plasmideja, joista kukin sisältää sitoutumiskohtia

miR-200a b

tai

c

) sen 3 ’UTR. Sen jälkeen transfektion, käsittelimme solut NP-siDCLK1. Solulysaatit altistettiin lusiferaasi mittaus. Sen jälkeen knockdovvn DCLK1, oli merkittävä downregulation

miR-200a

,

miR-200B

ja

miR-200c

(kuvio 5B) välittämää lusiferaasiaktiivisuus. Nämä tiedot osoittavat, että DCLK1 säätelee

miR-200

ja sen loppupään tavoitteet PDAC. Havaitsimme myös myöhemmin vähentäminen

miR-200

loppupään tavoitteet ZEB1 ja ZEB2 (kuvio 5C), SNAIL ja SLUG (kuvio 5D) jälkeen knockdovvn DCLK1 haiman tuumoriksenograftien. Lisäksi AsPC-1-soluja käsiteltiin NPsiSCR tai NPsiDCLK1 ja saatettiin invaasiomääritys käyttäen BD Biosciences Matrigel invaasiota kammioiden (BD BioCoat

TM). Havaitsimme merkitsevän eston invaasion jälkeen knockdovvn DCLK1 (kuvio 5E ja F). Nämä tiedot yhdessä osoittavat, että knockdovvn DCLK1 estää EMT ja invaasio säätelemällä

miR-200

ihmisen haiman tuumoriksenografteja ja syöpäsoluja. Samoin meidän aikaisempien tutkimusten jälkeen knockdovvn DCLK1, myös havaittu estyminen Notch1 kautta

miR-144

(kuva S2) in AsPC-1 tuumoriksenografteja.

, siRNA-välitteisen knockdovvn DCLK1 johtaa lisääntyneeseen ekspressioon

pri-miR-200a

,

pri-miR-200B

ja

pri-miR-200c

reaaliaikaisella RT-PCR . B, jälkeen knockdovvn DCLK1, lasku

miR-200a

,

miR-200B

ja

miR-200c

riippuvaista lusiferaasin aktiivisuuden havaittiin AsPC-1-soluissa . Tuumoriksenografteja käsitelty NPsiDCLK1 osoitti downregulation EMT transkriptiofaktoreiden ZEB1 ja ZEB2 mRNA (C), väheni SNAIL ja SLUG mRNA: n ilmentymisen (D). E, siRNA estoa DCLK1 johtaa inhibitioon hyökkäyksen AsPC-1-soluissa. Valkoinen nuolet osoittavat solujen hyökkäsi läpi Matrigel matriisin. F, Bar kuvaaja kvantifiointiin tunkeutuneet solujen seuraavan hoidon. Solut laskettiin 5 eri alojen kunkin insertin. Arvot pylväsnäyttöä annetaan keskiarvo ± SEM, ja tähdet merkitsevät tilastollisesti merkitseviä eroja (*

P

0,01) verrattuna valvonta (NP yksin).

DCLK1 säätelee angiogeenisten tekijöiden in PDAC

on osoitettu, että

miR-200

estää keuhkoadenokarsinooma invaasiota ja etäpesäkkeiden kohdistamalla VEGFR1. Oletettu sitoutumiskohdan

miR-200

havaittiin 3 ’UTR: VEGFR1, ja on osoitettu, että

miR-200

säätelee negatiivisesti VEGFR1 [48]. Lisäksi tuoreessa tutkimuksessa osoitettiin, että VEGFR1 ja VEGFR2 on sitoutumiskohta

miR-200B

ja perustuvat lusiferaasia perustuva reportterianalyysi

miR-200B

säätelee näiden angiogeenisten tekijöiden [49]. Nämä tiedot osoittavat, että VEGFR1 ja VEGFR2 ovat alavirtaan tavoitteita

miR-200

. Täällä, löysimme DCLK1 säännellä

miR-200

ja sen loppupään tavoitteita. Halusimme edelleen vaikutuksen tutkimiseksi DCLK1 Knockdown on angiogeenisten tekijöiden VEGFR1 ja VEGFR2. Havaitsimme merkittävän downregulation VEGFR1 mRNA: ta (kuvio 6A), proteiinia (kuvio 6B ja C – vasen paneeli) on käsitellyt kasvaimet NPsiDCLK1 verrattuna kontrolliin ja NPsiSCR käsiteltiin-kasvaimia. Havaitsimme myös downregulation VEGFR2 mRNA (kuvio 6E) ja proteiini (kuvio 6C – oikea paneeli) haiman tuumoriksenografteja käsitelty NPsiDCLK1. Lisäksi suoritimme lusiferaasi-pohjainen toimittaja määrityksissä VEGFR1 ja VEGFR2. AsPC-1-solut transfektoitiin lusiferaasigeenin kanssa VEGFR1 tai VEGFR2 3 ’UTR, käsiteltiin NPsiDCLK1 ja alistettiin lusiferaasin aktiivisuuden mittaus. Sen jälkeen, kun pudotus on DCLK1, havaitsimme merkittävää downregulation VEGFR1 (kuvio 6D) ja VEGFR2 (kuvio 6F) 3 ’UTR-välitteisen lusiferaasiaktiivisuus. Nämä tiedot yhdessä osoittavat, että DCLK1 säätelee VEGFR1 ja VEGFR2

kautta miR-200

in PDAC.

, siRNA-välitteisen knockdovvn DCLK1 johtaa vähentynyt ilmentyminen VEGFR1 mRNA NPsiDCLK1 käsitelty tuumoriksenografteja . Väheneminen VEGFR1 proteiinia havaittiin NPsiDCLK1 käsitellyt tuumorit (B – Western blot; C – Immunofluoresenssikoe – vasemman paneelin VEGFR1 punainen). D, jälkeen knockdovvn DCLK1, väheneminen VEGFR1-3’UTR riippuva lusiferaasin aktiivisuuden havaittiin AsPC-1-soluissa. E, knockdovvn DCLK1 johtaa vähentynyt ilmentyminen VEGFR2 mRNA NPsiDCLK1 käsitelty tuumoriksenograftien. F, väheneminen VEGFR2-3’UTR riippuva lusiferaasin aktiivisuuden havaittiin AsPC-1-soluissa. NPsiDCLK1 välittämää knockdovvn DCLK1 alensivat ilmentyminen VEGFR2 proteiinin arvioitiin käyttämällä immuunifluoresenssivasta analyysi (C – oikea paneeli, VEGFR2 punainen). Arvot Pylväiden A, B, D ja E, on annettu keskimääräinen ± SEM, ja tähdet merkitsevät tilastollisesti merkitseviä eroja (*

P

0,01) verrattuna valvonta (NP yksin).

keskustelu

miRNA ovat nopeasti kehittymässä kriittisiksi säätelijöinä lähes kaikkien keskeisten solun prosesseja. Häiriöstä miRNA ovat melko yleisiä monissa ihmisen syövissä kuten PDAC. Monissa kasvaimissa on joko yli-ilmentyminen ns onkogeenisiä miRNA (esim

miR-155

,

miR-17-5p

ja

miR-21

) [ ,,,0],15,16] tai alisäätely tuumorisuppressorin miRNA (esim

miR-34

,

miR-15a

,

miR-16-1

ja kirjaimien

7

) [17-20]. Painetusta kirjaimesta

7

ja

miR-200

perheet ovat tunnettuja sääntelyviranomaisten keskeisten erilaistumisen ohjelmien kehityksen aikana. Menetys kirjeet

7

syövän aiheuttaa etenemistä ja erilaistamattomuuden, sekä

miR-200

perhe on osoitettu olevan keskeinen säätelijä EMT. Lisäksi viimeaikaiset tutkimukset ovat sidoksissa kirjeet

7

kantasolujen ylläpitoon ja EMT. Siten on täysin mahdollista, että kasvaimen etenemisen voivat edustaa prosessia, joka johtaa asteittain erilaistamattomuuden (EMT) kohti solun tyyppi, joka on kantasolun kaltainen fenotyyppi. Lisäksi tämä prosessi näyttää tiukasti säätelevän miRNA-riippuvainen mekanismeja [10,11,27,30]. DCLK1 säätelee EMT ihmisen haimasyövän soluja

kautta

miR-200a

riippuvainen mekanismi [11], ja on myös säätelijä kirjeet

7 a

haiman ja peräsuolen syöpä soluja, mikä tukee ajatusta, että nämä miRNA ovat asianmukaisia ​​ja uusia tavoitteita useissa kiinteän kasvaimen syövät [10,11,27,30,41]. DCLK1 on otaksuttu markkeri suoliston ja haiman kantasoluja ja ylössäädellään useissa kiinteiden kasvainten tarjoavat lisänäyttöä sen mahdollisen keskeinen rooli kasvaimia prosessissa. Tässä raportissa, olemme osoittaneet, että sen lisäksi säännellä useita tuumorisuppressoriproteiinia miRNA ja loppupään onkogeeniset tavoitteet, DCLK1 esto johtaa ylösajon miRNA että negatiivisesti säätelevät useat keskeiset pluripotenttisuus ja pro-angiogeenisten tekijöiden. Nämä tulokset tukevat käsitystä, että DCLK1 on keskeinen säätelijä kasvaimen prosessin.

tukahduttaminen

miR-143

ja

miR 145

, kahden yhteistyössä puhtaaksi miRNA joka sijaitsee ihmisen kromosomissa 5q, on raportoitu haimasyöpä. Kertyvät tiedot viittaavat siihen, että niillä tuumorisuppressoriproteiinia aktiivisuus [50,51]. Alennettu

miR-143/145

ilme on yhteinen piirre monissa kasvaintyypeissä lukien peräsuolen syöpä ja PDAC [29,50,51]. Lisäksi ilmaus näistä miRNA estää proliferaatiota ja aktivoi apoptoosia syöpäsolujen

in vitro

ja

in vivo

[29].