Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

collagen11A1 (COL11A1) geeni on yli-ilmentynyt haimasyövän. Ilmentyminen COL11A1 proteiinin voisi olla mukana desmoplastic tapahtumien haimasyövän, mutta vasta-aine, joka spesifisesti värjää COL11A1 proteiini ei ole tällä hetkellä saatavilla.

menetelmät ja havainnot

Yhteensä 54 haimatiehyen adenokarsinoomat (PDAC), 23 krooninen haimatulehdus (CP) näytteet, ja viljellyt peritumoraalista stroomasolut of PDAC (kohdat 3-6) tutkittiin. Normaalit ihmisen haima otettiin kudosnäytteet läpi kuolleelta elinluovutuksista ohjelma.

1) validointi COL11A1 geenin yli-ilmentymisen Q-RT-PCR. Havainnot: ekspressiota COL11A1 geenin lisääntyy merkittävästi PDAC näytteiden vs. normaali ja CP näytteitä.

2) analyysi COL11A1 immunohistokemiallisesti käyttämällä erittäin spesifisiä anti-proCOL11A1 vasta-aineita. Havainnot: anti-proCOL11A1 tahrat stroomasolujen /syöpään liittyvän fibroblasteissa (valuuttalisiin) ja PDAC, mutta se ei tahraa krooninen hyvänlaatuinen kunnossa (krooninen haimatulehdus) stroomasolut, epiteelisolut, tai normaalien fibroblastien.

3) arviointi syrjintä kyky vasta-aineen. Havainnot: anti-proCOL11A1 immunovärjäyty- tarkasti erottelee PDAC ja CP (AUC 0,936, 95% CI 0,851, 0,981).

4) fenotyyppinen karakterisointi proCOL11A1 + stroomasolujen yhteistyössä värjäyksen mesenkymaalisten, epiteelin ja stellate solun markkereita haiman kudosnäytteitä ja viljeltyjä peritumoraalista haimasyövän stroomasoluihin. Havainnot: ProCOL11A1 + solujen läsnä yhteistyössä värjäyksen mesenkymaalisten, stellate ja epiteelin markkereita (EMT fenotyyppi) eri suhteissa.

Johtopäätökset /merkitys

Detection of proCOL11A1 läpi Immunovärjäyksen tämän vastikään kehitetty vasta-aine mahdollistaa sillä erittäin tarkan eron PDAC ja CP. Toisin kuin muut käytettävissä vasta yleisesti käytetään havaitsemaan valuuttalisiin, anti-proCOL11A1 on negatiivinen stroomasolujen normaalin haiman ja melkein poissa hyvänlaatuinen tulehduksen. Nämä tulokset viittaavat vahvasti siihen, että proCOL11A1 on spesifinen markkeri valuuttalisiin, ja näin ollen, anti-proCOL11A1 on tehokas uusi työkalu syövän tutkimus- ja kliinisessä diagnostiikassa.

Citation: Garcia-Pravia C, Galván JA, Gutiérrez-Corral N, Solar-García L, García-Pérez E, García-Ocaña M, et al. (2013) yli-ilmentyminen COL11A1 Cancer-Associated Sidekudosmuodostussolujen: kliinistä merkitystä stroomakasvaimet Marker in Haimasyöpä. PLoS ONE 8 (10): e78327. doi: 10,1371 /journal.pone.0078327

Editor: Francisco X. Real, Centro Nacional de Investigaciones Oncológicas (CNIO), Espanja

vastaanotettu: 28 huhtikuu 2013; Hyväksytty: 11 syyskuu 2013; Julkaistu: 23 lokakuu 2013

Copyright: © 2013 García-Pravia et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus on osarahoitusta EAKR päässä Euroopan Unioni; by INNPACTO-ONCOPAN IPT-010000-2010-31 Project; by FISS-09- PS09 /01911 Project, tiede- ja innovaatio, Espanja; FC-11-PC10-23 Project, FICYT, Axe 1 vuosien 2007-2013 EAKR puiteohjelman Asturian, Espanja; ja Progenika Biopharma, S.A. ja Oncomatrix, S.L. Derio, Espanja. ProCOL11A1 mAb on patentoi Oncomatrix, S.L. (PCT /ES2012 /070616, WO 2013/021088 A2). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: vasta-yksityiskohtaisesti tässä tutkimuksessa on alle patentti arkistoi Drs. Luis Barneo, Carmen Garcia-Pravia, Juan R. de los Toyos, Marcos García-Ocaña, Jokin Del Amo-Iribarren, Laureano Simón-Buela ym otsikolla: menetelmien ja tuotteiden in vitro -analyysissa, IN VITRO ennustetta ja kehitetään lääkkeitä invasiiviselta karsinoomat (PCT /ES2012 /070616, WO 2013/021088 A2). Jokin Del Amo-Iribarren toimii Progenika Biopharma, S.A. ja Laureano Simón-Buela toimii Oncomatrix, S.L. Tutkimus rahoitettiin osittain Progenika Biopharma, S.A. ja Oncomatrix, S.L. Ei ole muita patentteja, tuotteiden kehittämiseen tai kaupan tuotteiden julistaa. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

Haiman adenokarsinooma (PDAC) edustaa neljänneksi yleisin kuolinsyy syöpään miehillä ja naiset. 5 vuoden eloonjäämisaste on alle 5% ja keskimääräinen elinaika on 6 kuukauden kuluttua alustavan diagnoosin. Jopa potilailla, joille tehdään resektio, pitkäaikainen eloonjäämisprosentti edelleen erittäin huono [1]. Tällä hetkellä ei ole olemassa varhaisen diagnoosin menetelmiä tai tehokkaita hoitoja vastaan ​​käytettäväksi tämän tyyppisen kasvaimen. Vaikka edistystä ollut tapahtunut sen diagnosointiin ja hoitoon, haimasyöpä on edelleen pahin ennuste kaikkien kiinteiden pahanlaatuisia kasvaimia. Haimasyöpä on paradigma kehittyneiden kasvainsairaus: riippumatta TNM, suurin osa potilaista esiintyy levitetään taudin alkuvaiheessa [2]. Lisäksi haiman syöpä on vastustuskykyinen kemo- ja sädehoidon [3].

Haiman karsinooma on tunnusomaista desmoplastic reaktion, jossa solu- ja soluton komponentteja, kuten fibroblasteissa (aktivoitu tai lepää), myofibroblasteissa perisyyteissä, haiman stellate solut, immuunijärjestelmän solut, verisuonet, soluväliaineen ja liukoiset proteiinit, kuten sytokiinien ja kasvutekijöiden [4,5]. Tämä heterogeeninen strooman vaikuttaa useita näkökohtia PDAC ja näyttää edistää kasvaimen kasvua, invaasio, ja kestävyys kemoterapiaa [6-9].

Krooninen haimatulehdus on tulehduksellinen sairaus, peruuttamaton ja etenevä tuhoutuminen elimen, jolloin exocrine ja hormonaaliset vajaatoiminta. Kadonnut parenchyma korvataan tiheä sidekudos soluttautua leukosyyttejä ja ductular liikakasvu. Krooninen haimatulehdus merkittävästi riskiä sairastua haimasyövän [10-12], mikä viittaa siihen, että krooninen tulehdus sisällä haima voi olla altistava tekijä syövän kehittymiseen. Aiheuttava yhteyden kroonisen tulehduksen ja syövän kuvattiin kahden vuosisadan sitten Marjolin [13], mutta inflammatoristen välittäjien, jotka johtavat syövän kehittymisen jäävät määrittämättä.

joukossa kasvaimeen liittyvän matriisin kollageenien, fibrillar kollageenit ovat näkyvin. Kollageenit syntetisoidaan prokollageenien sidekudosmuodostussolut. Nämä prokollageenien on tärkein keskeinen kolmoishelikaalisen domain, nimetty α1, α2, ja α3, ja koodattu erityisillä geenisekvenssejä. Kun erittyy solunulkoiseen ympäristöön, nämä prokollageenien pilkotaan, ja sitten kypsä kollageenin molekyylejä koota solunulkoisesti fibrillien. Normaaleissa kudoksissa, kollageeni tyyppi I, II ja III ovat tärkeimmät suuria säikeisen kollageeneja, mutta kollageenien V ja XI ovat vähemmän runsaasti pieniä säikeisen kollageenien [14]. Kollageenit V ja XI jakaa 75%: n homologia niiden aminohapposekvenssin tasolla. Prokollageenien α1 tyyppejä V ja XI on koodattu COL5A1 ja COL11A1 geenit, vastaavasti.

Tutkimukset fibroblastit läheisyydessä kasvain, ns syöpään liittyvän fibroblasteissa (CAF), ovat osoittaneet niiden rooli herättämään kasvaimen etenemistä [15-20]. Ominaisuudet valuuttalisiin on tutkittu perusteellisesti, mikä osoittaa, että niiden genotyypin ilmentyminen, kasvumalli, muuttavien käyttäytyminen ja erittymisen kasvutekijöiden eroavat normaalien fibroblastien [15,21]. Kuitenkin tutkijat ei ole erityisiä välineitä erottamaan valuuttalisiin tulehduksellinen fibroblasteissa. Vimentiinista (VIM) ja alfa-sileän lihaksen aktiini (αSMA) käytetään usein tunnistamaan valuuttalisiin, mutta nämä biologiset merkkiaineet eivät ole erityisiä, koska ne värjäytyvät tulehduksellinen fibroblastit ja muut solut samoin. Olemme aikaisemmin tunnistettu 116 geenejä, jotka yli-ilmennetään PDAC käyttämällä DNA mikrosiruja [22] (ks File S2). Olemme löytäneet geenit soluväliaineen, jonka ilmentyminen on lisääntynyt verrattuna tavanomaisiin ja krooninen haimatulehdus (CP) kudoksiin. Yksi merkittävästi ja johdonmukaisesti yliekspressoituvan geenit oli COL11A1 (taulukko S1 File S1). Koska ei ole luotettava kaupallinen vasta-aine, me tuotti kanin polyklonaalista antiseerumia erittäin spesifinen aminohappo venyttää ihmisen proCOL11A1 voidakseen arvioida proteiinin taso ilmaistaan ​​haimasyövän [23]. Myöhemmin olemme kehittäneet monoklonaalinen vasta-aine [24], erittäin spesifinen ihmisen proCOL11A1, mikä selvästi merkitsee nämä peritumoraalista stroomasolut.

Tässä tutkimuksessa yritimme vahvistaa yliekspressio COL11A1 geenin PDAC. Lisäksi arvioimme kliininen hyöty immuunidetektio proCOL11A1 vuonna PDAC ja CP kudoksiin. Lopuksi selvitimme ilmiasun COL11A1 ilmentävien solujen haiman strooman.

Materiaalit ja menetelmät

Potilaan ominaisuuksista ja kudosten näytteenotto

Immunohistokemiatutkimukset anti-proCOL11A1 pAb suoritettiin 54 PDAC ja 23 CP (20 alkoholi-, 2 autoimmuunisairaus, 1 sappi) historiallinen parafinoidut näytteestä saatujen kirurgisista näytteistä potilailta, joille tehtiin leikkaus sairaalassa Universitario Central de Asturias, Oviedo, Espanja. Keskimääräinen ikä potilaiden PDAC oli 65 ± 9 vuotta (46-81 vuotta vanha) ja 56 ± 12 vuotta (25-73 vuotta vanha) niistä potilaista, joilla CP. Sukupuoli- (M /F) oli 37/17 varten PDAC potilaille, kun taas miesten hallitseva oli jopa korkeampi CP potilailla (22/1). Jakauma PDAC kasvaimen vaiheen mukaan TNM luokittelu (AJCC Cancer Staging Manual. 7th ed. 2010) oli: IA, 13%; IB, 17%; IIA, 19%; IIB, 37%; III, 6%; IV, 9%. Neoplastiset arvosteluasteikko oli: G1, 20%; G2, 66%; G3, 12%; G4, 2%. Anti-proCOL11A1 mAb levitettiin 69 (51 PDAC ja 18 CP) aiemmissa tapauksissa. Tuore poistettu PDAC, CP ja normaali haima kudosnäytteet välittömästi snap-jäädytettiin nestetypessä leikkaussalissa ja säilytettiin -80 ° C: ssa, kunnes käsittely. Ihmisen normaali haima otettiin kudosnäytteet läpi kuolleelta elinluovutuksista ohjelman (6 tapausta, kaikki 41-76 vuotta vuotiaat miehet) ja käytettiin q-RT-PCR: llä. Tuore näytteitä käytettiin eristämään ja kulttuuriin fibroblastien. Q-RT-PCR tutkimuksia sovellettu jäädytetty PDAC ja CP näytteitä. Tämä tutkimus noudattaa Helsingin julistuksen ja hyväksyi Hospital Universitario Central de Asturias eettinen komitea (Project nro 42/12). Kaikki potilaat allekirjoitettu suostumuslomakkeet ilmaisee halukkuutensa osallistua ja niiden ymmärtää toimenpide ja yleinen Tutkimuksen tavoitteena.

kvantitatiivinen RT-PCR COL11A1

Yhteensä-RNA eristettiin haimasta koepaloja käyttäen TRIzol -reagenssia (Life Technologies), ja cDNA syntetisoitiin käänteistranskriptaasin entsyymin SuperScript II RNaasi (Life Technologies). Kaikki PCR-reaktiot ajettiin kahtena rinnakkaisena LightCycler 2,0 (Roche) käyttäen Fast Start DNA Master SYBR Green I kit (Roche). Alukesekvenssit olivat seuraavat: COL11A1 (kohdegeenin): eteenpäin 5 ’TGGTGAT CAGAATCAGAAGTTCG 3’, reverse 5 ’AGGAGAGTTGAGAATTGGGAATC 3’; Ribosomaalinen proteiini L10 (viite geeni): eteenpäin 5 ’TGCGATGGCTGCACACA 3’, reverse 5 ’TCCCTTAGAGCAACCCATACAAC 3’. Tehokkuutta PCR-reaktioiden laskettiin käyttäen viite käyrät sarjalaimennoksia cDNA. Suhteet normalisoitiin geeniekspression-arvot määritettiin käyttämällä suhteellisen kvantifioinnin yhtälö, joka korjaa eroja PCR tehokkuutta [25]. Lopuksi, geenien ilmentyminen tietoja verrattiin kasvaimen ja kontrollinäytteiden käyttäen Mann-Whitneyn U-testi.

Kanin polyklonaalista antiseerumia, että vaihtelevan alueen ihmisen prokollageenin 11A1 (anti-proCOL11A1 pAb) B

ovat aikaisemmin kuvanneet sukupolvi tämän antiseerumin [23]. Lyhyesti, sen jälkeen, kun rekombinantti-COL11A1-TGST fuusioproteiinia rakennettiin ilmaistuna, ja puhdistettu, Uusi-Seelanti valkoinen kani lihakseen 2 viikon välein 2 ml: n immunogeenin emulsiona puhdistettua COL11A1-T-GST-fuusioproteiinia (katso File S2). Antiseerumi saatu sydänpunktiolla oli köyhdytettyä on anti_GST reaktiivisuus. IgG-fraktio puhdistettiin käyttämällä Protein ASepharose.

Hiiren monoklonaalinen vasta-aine ihmisen prokollageenin 11A1 (anti-proCOL11A1 mAb) B

menetelmät tuottaa anti-ihmisen proCOL11A1 monoklonaalinen vasta-aine ja karakterisointiin sen on julkaistu [24]. Yhteenvetona, puhdistettiin COL11A1-T-GST-fuusioproteiinia käytettiin hyperimmunize BALB /c-hiirissä. Käyttäen Sp2 /0-myeloomasolujen, kuten fuusio-osapuoli, B-solujen hybridoomia tuotettiin standardimenetelmillä. Vasta-aine, DMTX1, toimitti Oncomatrix, SL, Derio, Espanja (Ref # P0002, erä # 200212).

perustaminen soluviljelmissä

Näytteet saatiin tuumorin alueella, peritumoraalista alue ja normaali alueella käyttäen erilaisia ​​kirurgisia teriä saastumisen välttämiseksi. Edustavia alikvootit histologisesti tutkittiin. Näytteet kuljetettiin RPMI-1640 Medium (Gibco, Invitrogen) täydennettynä Amikasiinin ja vankomysiinin (Normon Laboratories, Madrid, Espanja, sekä 40 ug /ml) ja kulttuuriin laboratorioon, jossa ne leikattiin pienemmiksi palasiksi käyttäen kirurgisia sakset. Saadut fragmentit digestoitiin entsymaattisesti kollagenaasilla (tyyppi I 2 mg /ml, Sigma) 1-2 tunnin ajan. Keittoprosessin jälkeen, kollagenaasiliuos sentrifugoitiin 400 g 10 minuuttia. Pelletti suspendoitiin uudelleen fibroblastien viljelyväliaineessa (Dulbeccon modifioidussa Eaglen elatusaineessa (Gibco, Invitrogen), johon oli lisätty 10% vasikan sikiön seerumia (FCS, Gibco, Invitrogen), amikasiini ja vankomysiini (sekä 40 ug /ml). Kudos-fragmentit, jotka ei ollut pilkottu kollagenaasilla tehtiin toinen hajotus 0,05% trypsiiniä ja 0,02% EDTA: ta (T /E, Gibco, Invitrogen, Barcelona, ​​Espanja) 30-60 minuutin ajan. Poistetut T /E inaktivoitiin seerumia sisältävällä viljelyalustaan (DMEM + 10% FCS) ja sentrifugoitiin 400 g 10 minuuttia. pelletti suspendoitiin uudelleen fibroblastien viljelyväliaineessa. Solut saadaan Kollagenaasikäsittelyn ja trypsiinihajotuksen ympättiin kuuden kuoppalevyillä käyttäen fibroblastien viljelyväliaineessa ja pidettiin 37 ° C: ssa 5% CO 2-inkubaattorissa. elatusaine vaihdettiin joka 3 päivä. Kun ensisijainen viljelmä yhtenäisiksi, solut pestiin kahdesti PBS: llä ja käsiteltiin T /E, kunnes ne irrotetaan. Sitten T /E neutraloitiin kulttuuriin keskipitkän ja sentrifugoitiin 400 g: ssä 10 minuuttia solujen ottamiseksi talteen. Kaikki stromasoluja käytettiin varhaisessa kohtia (kohdat 3-6). Solu puhtaus stroomasolujen arvioitiin morfologia ja immunovärjäyksellä varten vimentiinista.

immunohistokemia ja immunohistokemiallisen haimakudoksessa resektio

Kudos saatu haima näytteistä kiinnitettiin 10% formaldehydiä liuos, parafiiniin, leikattiin 3 um: n paksuinen ja värjättiin H SLR: 7).

Kaikki PDAC näytteet testattiin anti-proCOL11A1 mAb ja jossa antiproCOL11A1 pAb osoitti vahvaa intracytoplasmatic merkintöjä kasvaimeen ympäröivän desmoplastic strooman valuuttalisiin (kuvio 2E, kuvio S1D File S1). Värjäytyminen ei ollut laajaa vaan lokalisoitu rajoitettua peritumoraalista alueilla, vaikka kasvainsoluja ei havaittu. Morfologiset piirteet näiden fibroblastien kaltaisten stromasoluja olivat vastaavat kuin myofibroblasteja (kuva SLE, F File S1). Solunulkoista värjäytyminen ei koskaan havaittu. Sitä vastoin ilmaus proCOL11A1 krooninen haimatulehdus näytteissä oli joko läsnä (kuvio 2A, kuvio S1B File S1) tai hyvin pieni ja rajoitettu muutaman stroomasoluissa. CP strooman osoitti fibroottisia ja tulehdusmuutoksia ilman merkittäviä myofibroblastic väestöstä. Normaali haima ja epiteelikasvainsolut, toisaalta, eivät osoittaneet mitään värjäytymistä lainkaan anti-proCol11A1 (Kuva S2 File S1). Normaali haima osoittivat värjäyksen VIM ja αSMA, mutta ei tahraa kanssa GFAP. Suurin osa CP (kuviot 2C, D) ja PDAC (kuviot 2G, H) stroomasolut osoitti vahvaa solunsisäistä värjäyksen VIM ja αSMA. Värjäyksen desmiinille oli voimakasta PDAC (kuvio 2F) näytteet, mutta olematon CP (kuvio 2B) näytteitä. Kuva S3 File S1 osoittaa positiivista värjäytymistä anti-proCOL11A1 mAb (pisteet 4) ja desmiinille joka tapauksessa autoimmuunipankreatiitti; Lisäksi voimakas positiivisuus kanssa VIM ja αSMA, ja negatiivisuus kanssa GFAP havaitaan.

stroomakasvaimet solujen CP olivat negatiivisia anti-proCOL11A1 mAb (A) ja desmiinille (B), kun taas huomattavan määrän strooman solujen PDAC ilmaisi anti-proCOL11A1 mAb (E) ja desmiinin (F). CP ja PDAC tahra peruskudoksen solujen αSMA (C ja G, vastaavasti) ja VIM (D ja H, vastaavasti) oli hajanainen ja ei-selektiivisiä. Anti-proCOL11A1 mAb (A ja E), desmiinille (B ja F), αSMA (C ja G) ja VIM (D ja H) (kaikki mikrovalokuvia × 400, Mittakaava 50 pm).

karakterisointi haiman valuuttalisiin

luonnehtia valuuttalisiin, haiman kudosleikkeet kaksinkertainen värjättiin proCOL11A1 /desmiinin, proCOL11A1 /αSMA, proCOL11A1 /VIM, proCOL11A1 /GFAP, proCOL11A1 /CK7 ja CK7 /VIM (kuva 3 ). Erittäin suuri määrä mesenkymaalisten soluja voimakkaasti leimattiin VIM ja αSMA. Immunovärjäämällä GFAP oli negatiivinen. Osuus pieni määrä soluja proCOL11A1 + ja desmiini +. Co-värjäys VIM tai CK7 kanssa proCOL11A1 tunnistettu osajoukko valuuttalisiin kanssa mesenkymaaliset fenotyyppi (proCOL11A1 + /VIM +) ja hyvin harvat solut epiteelin fenotyyppi (proCOL11A1 + /CK7 +) (kuviot 3 ja E, vastaavasti). Jotkut desmiiniä tai αSMA solujen yhteistyötä värjättiin proCOL11A1 (kuvio 3 A ja B, vastaavasti). Kuitenkin CP strooman näytteet eivät osoittaneet värjäyksen proCOL11A1, desmiini tai GFAP, eikä ollut mitään co-värjäytymistä (kuva 4).

, anti-proCOL11A1 (ruskea)

vs

. desmiinille (magenta); B, anti-proCOL11A1 (ruskea)

vs

. αSMA (magenta); C, anti-proCOL11A1 (ruskea)

vs

. VIM (magenta); D, anti-proCOL11A1 (ruskea)

vs

. GFAP (ei värjäystä); E, anti-proCOL11A1 (ruskea) vs. CK7 (magenta); F, CK7 (epiteelikasvainsolut:

ruskea

) vs. VIM (magenta) (kaikki mikrovalokuvia × 200, Mittakaava 200 mikrometriä; upotettavat X1000).

, anti-proCOL11A1 (ruskea)

vs

. desmiinille (magenta); B, Anti-proCOL11A1 (ruskea)

vs

. αSMA (magenta); C, anti-proCOL11A1 (ruskea)

vs

. VIM (magenta); D, anti-proCOL11A1 (ruskea)

vs

. GFAP (ei värjäystä); E, anti-proCOL11A1 (ruskea) vs. CK7 (magenta); F, CK7 (epiteelikasvainsolut:

ruskea

) vs. VIM (magenta). (Kaikki mikrovalokuvia × 200, Mittakaava 200 um). .

Kenno jakauma viljelty valuuttalisiin analysoitiin rinnakkaispaikantumisen kanssa immunocytofluorescence. Saatu data on kuvattu taulukossa 2 (kuvio 5). Tulkinta taulukko on seuraava: kun kaksinkertainen värjäys levitettiin viljellyt haiman valuuttalisiin, esimerkiksi proCOL11A1 ja CK7, yhteensä 188 solut värjättiin; Näiden 82-solut leimattiin anti-proCOL11A1, 60 solut olivat CK7 positiivisia, ja 46 solut värjättiin sekä vasta-aineita. Sama logiikka pätee muun värjäykset. Tietojen mukaan on esitetty taulukossa 2, muun proCOL11A1 soluja, 36% ovat CK7 +, 49% ovat VIM + ja 48% on αSMA +; solujen joukossa kanssa VIM fenotyyppi, 21% ovat proCOL11A1 + ja vain 8% on CK7 +; 33% of αSMA soluista jakavat proCOL11A1 fenotyyppi; ja lopuksi 45% CK7 soluilla on VIM + fenotyyppiä ja 43% on proCOL11A1 fenotyyppi. Jakauman proCOL11A1, CK7 ja desmiinille fenotyyppejä kudosnäytteistä on esitetty taulukossa S2 File S1. Se ei ollut mahdollista analysoida niillä aloilla, jossa solut ovat VIM + ja αSMA + koska suuri määrä värjäytyneiden solujen, mikä tekee siitä monimutkaista yksilöllisiä ja laskea niitä. Tietojen mukaan taulukon S2 File S1 18% proCOl11A1 solut ovat CK7 +, ja 21% on desmiinille +; 45% näiden solujen värjäystä desmiiniä on proCOL11A1 fenotyyppi, ja 50% CK7 solut ovat proCOL11A1.

ProCOL11A1 /CK7 (DI) B proCOL11A1 /VIM (DI) B proCOL11A1 /αSMA (DI)

VIM /CK7 (DI) B proCOL11A1 + vain 82 (43%) proCOL11A1 + vain 106 (18%) proCOL11A1 + vain 73 (23%) VIM + vain 364 (85%) CK7 + vain 60 (32%) VIM + vain 370 ( 64%) αSMA + vain 138 (50%) CK7 + vain 36 (8%) proCOL11A1 + /CK7 + 46 (25%) proCOL11A1 + /VIM + 101 (18%) proCOL11A1 + /αSMA + 67 (24%) VIM + /CK7 + 30 (7%) Yhteensä 188 (100%) yhteensä 577 (100%) yhteensä 278 (100%) yhteensä 430 (100%) Taulukko 2. kvantitatiivinen analyysi solun jakautuminen kasvatetuissa peritumoraalista haimasyövän fibroblasteja (passage 3)

*.

* yksi potilas näyte, arvostus on viisi kenttää jokaista immunohistokemiallisen (DI) koe. Solut värjätään molemmat Ab lihavoitu. CSV Lataa CSV

Double fluoresenssi tahra havainnollistaa läsnäolo solujen proCOL11A1 + /CK7 +, proCOL11A1 + /αSMA + ja proCOL11A1 + /VIM +.

punainen

: proCOL11A1;

vihreä

: CK7, αSMA ja VIM, vastaavasti;

sininen

: ytimiä. Upotteet otetaan satunnaisesti suuritehoiset kulttuurin. Mittakaava 100 pm (X200) ja 20 um (X630).

PDAC vs. CP

ominaisuuksia kunkin potilaan ja hänen /hänen patologi n proCOL11A1 immuunivärjäysmenetelmällä pisteet on esitetty taulukossa S3 File S1. Oli tilastollisesti merkitsevä ero PDAC ja krooninen haimatulehdus, että mAb pisteet (keskiarvo ± SD: 7,33 ± 4,04 vs. 0,61 ± 1,33; P 0,0001). Tiedot esitetään kuviossa 6. AUC ROC käyrät PDAC vs. CP oli 0,936 (0,851-0,981), P 0,0001 (kuvio 7). Immunovärjäyksen osoitti herkkyys 92% ja spesifisyys 83% vuonna erotteleva PDAC CP, joiden tarkkuus on 90%. Käyttö pAb oli samanlainen tulos erotteleva PDAC CP (taulukko S4 File S1). Observational välistä yhdenmukaisuutta patologia oli 90%. Värjäytyminen pisteet eivät korreloi potilaan ikä, sukupuoli, kasvaimen vaiheessa tai arvosana. Yhdistys potilaan eloonjäämiseen ei tutkittu, koska määrä PDAC potilaita, joilla on alhainen tilanne oli hyvin alhainen (4/51 tapausta).

Bars: ± 1 SD.

μ osoittaa rajakohta parasta erottaminen (minimaalinen vääriä negatiivisia ja vääriä positiivisia tuloksia) näiden kahden ryhmän välillä.

immunovärjäys arvioitiin myös käyttämällä QWin kuva-analyysi-ohjelmisto. Tulokset on esitetty taulukossa S5 File S1. On tilastollinen ero PDAC ja CP määrän positiivisten solujen värjätään pinnan ja ohjealueelta. Samassa sarjassa, oli suuri välistä yhdenmukaisuutta patologi pisteet ja QWin tietoja, kuten pinta-ala värjättyjen solujen ja useita positiivisia soluja (spearmanin järjestyskorrelaatiokerroin = 0,825 ja 0,825, tässä järjestyksessä). ROC-käyrä AUC tulokset saatiin kuusi kuva-analyysin parametrit (taulukko S6 File S1). Kaikki parametrit sallivat syrjiä PDAC ja krooninen haimatulehdus. Tärkeimmät parametrit olivat positiivisten solujen määrän ja pinta-ala värjättyjen solujen.

Keskustelu

DNA mikrosiruja sallivat samanaikaisen analyysi ekspressiotason tuhansien geenien ja voi selventää mekanismeja haiman syövän synnyn [26-31]. Ensimmäinen tutkimus soveltaa tätä tekniikkaa haimasyövän onnistuneesti tunnistettu joukko geenejä, jotka ilmentyy differentiaalisesti haimasyövän [32]. Muut tutkimukset johtivat tunnistamiseen sekä aiemmin kuvattu ja uusia kandidaattigeenit [33-39,50]. Useimmat identifioitujen geenien ei voi vahvistaa muilla tarkempia tekniikoita joko mRNA: n tai proteiinin tasolla. Olemme keskittäneet tutkimukset niihin geenejä mahdollisten edun markkereita ja /tai terapeuttisina kohteina [23], joista yksi on COL11A1.

Tässä raportissa tarkistaa immunohistokemiallinen ilmaus COL11A1 in PDAC. Edellinen huomioita ilmaus COL11A1 muissa syövissä [40-44] rajoittuivat porrastetun geeniekspression analyysit validoitu kvantitatiivinen RT-PCR, Northern blotit ja /tai in situ mRNA hybridisaatio. Äskettäin ilmaisu kollageenin XI sekä normaaleissa että pahanlaatuisten ihmisen paksusuolen kudos on arvioitu immunohistokemiallisesti [45].

laskennallinen analyysi geenin ilmentymisen useissa syövissä [46] osoittaa, että yli-ilmentyminen COL11A1 ja muiden geenien on korkean spesifisyyden biomarkkereiden syövän invaasio ja ennustaa vastetta neoadjuvant hoitoa. Vaimennussäätely COL11A1 in vitro yhteisviljelmissä haimasyövän ja stroomasolujen [47] on raportoitu. Nämä in vitro havainnot eivät tue ex vivo; keinotekoinen in vitro olosuhteissa ei täytä kaikkia vaatimuksia eikä varaa kaikki paikalliset tekijät edistävät korkea COL11A1 ilme.

Tietääksemme mitään erityistä markkeri valuuttalisiin on raportoitu. Perinteiset värjäystä ei havaittu eroja valuuttalisiin ja normaalien fibroblastien. V: CP (H A, anti-proCOL11A1 mAb, positiivinen kontrolli (upotus): solulinjaa A204; B, desmiini, positiivinen kontrolli (upotus): liite; C, alfa-Smooth Muscle Actin, positiivinen kontrolli (upotus): liite; D, vimentiinistä, positiivinen kontrolli (upotus): liite); E, GFAP, positiivinen kontrolli (upotus): astrosytooma). Serial kohdat (kaikki mikrovalokuvia × 200, Mittakaava 200 um). A, anti-proCOL11A1 mAb, positiivinen kontrolli (upotus): solulinja A204); B, desmiini, positiivinen kontrolli (upotus): liite); C, alfa-Smooth Muscle Actin, positiivinen kontrolli (upotus): liite); D, vimentiinistä, positiivinen kontrolli (upotus): liite); E, GFAP, positiivinen kontrolli (upotus): astrosytooma). Serial kohdat (kaikki mikrovalokuvia × 200, Mittakaava 200 um).