Krooninen sairaus

tiivistelmä

Uusi aineita tarvitaan hoitoon haimasyöpä, joka on yksi kaikkein vaarallisin ihmisen syöpäsairauksia. Me syntetisoitiin fosfo-valproaatti, uusi valproiinihappo johdannainen, (P-V, MDC-1112) ja arvioitiin sen tehoa valvonnassa haimasyövän. P-V esti kasvua ihmisen haimasyövän hiirissä 60% -97%, ja 100% yhdistettynä simetidiinin. Hallitseva molekyylitasolla P-V oli STAT3. P-V inhiboi fosforylaatiota JAK2: n ja Src, ja Hsp90-STAT3 yhdistys, tukahduttaa aktivoivan fosforylaation STAT3, mikä puolestaan ​​vähentää ilmentymistä STAT3-riippuvaisten proteiinien Bcl-x

L, Mcl-1 ja surviviinin. P-V pienenee myös STAT3 tasoilla mitokondrioissa estämällä sen translokaation päässä sytosoliin, ja parantaa mitokondrioiden tasolla reaktiivisen hapen, mikä johti apoptoosiin. Esto mitokondrioiden STAT3 P-V vaadittiin sen syövän vastainen vaikutus; mitokondrioiden STAT3 yliekspressio pelasti eläimiä kasvaimen kasvun estäminen P-V. Tuloksemme osoittavat, että PV on lupaava lääke vastaan ​​haimasyöpä ja luoda mitokondrioiden STAT3 olevan sen keskeisiä molekyylikohteena.

Citation: Mackenzie GG, Huang L, Alston N, Ouyang N Vrankova K, Mattheolabakis G, et al. (2013) kohdistaminen mitokondrioiden STAT3 kanssa Novel Phospho-Valproiinihappo (MDC-1112) Estää Haimasyöpä kasvu hiirissä. PLoS ONE 8 (5): e61532. doi: 10,1371 /journal.pone.0061532

Editor: Guenter Schneider, Technische Universität München, Saksa

vastaanotettu: 14 joulukuu 2012; Hyväksytty: 11 maaliskuu 2013; Julkaistu: 01 toukokuu 2013

Copyright: © 2013 Mackenzie et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustuksia NIH 2R01 CA92423 ja R01 CA10101902 BR ja Stony Brook University-Sisätautien siemen-avustuksen GGM. Tätä työtä myös tukee osittain apurahan R01 CA154172 (BR), jonka National Cancer Institute (NCI), National Institutes of Health. Tutkimuksessa sponsorit ollut roolia tutkimuksen suunnittelu, keräämiseen, analysointiin ja tulkintaan tietojen kirjoittamisessa käsikirjoituksen, eikä päätös jättää käsikirjoituksen julkaistavaksi.

Kilpailevat edut: BR on oman pääoman asema Medicon Pharmaceuticals, Inc., yhtiö, joka toimitti testiyhdiste; PPC ja NO sidoksissa samalla. Kaikki muut Kirjoittajat julistaa ole eturistiriitoja. Ei ole muita patentteja, tuotteiden kehittämiseen tai kaupan tuotteiden julistaa. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamiseen ja materiaaleja, yksityiskohtaisena online-oppaassa tekijöille.

Johdanto

Haimasyöpä (PC), viitataan kun ”synkkä tauti”, koska sen aggressiivinen luonne ja korkea kuolleisuus, on yksi kaikkein tuhoisia maligniteetteja maailmanlaajuisesti, on usein kohtalokas 6 kuukauden kuluessa [1]. Korkea kuolleisuus PC katsoneet myöhäinen diagnosointi, nopea taudin etenemistä ja kestävyys kemoterapiaa. Koska suorituskyky on heikko nykyiset hoidot, on kiireellinen tarve tunnistaa uusia aineita sen hoitoon.

Signaalin muuntimet ja Activator of Transcription 3 (STST3) transkriptiotekijä on merkittävä rooli patogeneesissä PC Se on yhteydessä pahanlaatuinen kasvain aloittamista transformaatio ja etenemiseen [2], [3]. Sen lisäksi perustettu ydin- transkription rooli, STST3 näyttelee selvä rooli mitokondrioissa jossa se tukee Ras pahanlaatuinen muutos [4], ja varmistaa optimaalinen toiminta elektroninsiirtoketju [5]. Koska se säätelee useita reittejä tärkeitä kasvainten synnyssä [6], STST3 on havaittu olevan mahdollinen lääke kohde PC [7].

Rational huumeiden kehitys edellyttää muun muassa hyödyntämällä ominaisuuksia otaksuttu molekyyli tavoitteita. Olemme tunnistaneet fosfo-valproiinihappo (P-V, MDC-1112; Fig. 1A), uusi valproiinihappo (VPA) johdannainen, kuten voimakas STST3 estäjä. Tämä aine on syntetisoitu perustuvat yleiseen lähestymistapaan, jossa tietty kemiallinen muuntaminen tunnettujen lääkkeiden parantaa niiden halutut syövän vastaisia ​​ominaisuuksia, ennen kaikkea niiden tehoa. Anticancer ominaisuudet VPA, joka on haarautunut lyhytketjuinen rasvahappo käytetään laajalti epilepsialääke, tutkitaan parhaillaan, varsinkin kun se on tunnistettu histoni deasetylointi (HDAC) estäjä [8] – [10]. Meneillään tutkimuksissa VPA osoittavat rohkaisevia tuloksia useiden ihmisen maligniteettien [11].

(A) kemiallinen rakenne P-V (MDC-1112). (B) BxPC-3 kasvaimen kasvun hallinnan (▴) ja P-V 50 mg /kg /d (▪) käsiteltyihin hiiriin. *

p

0,01

vs

. kontrolliryhmään. (C) Kuvia edustajan kasvainten ohjaus ja P-V-käsitellyistä hiiristä. (D) MIA PaCa-2 kasvaimen kasvun hallinnan (•), 100 mg /kg (▪) ja 150 mg /kg (▴) P-V-käsitellyistä hiiristä. *

p

0,01

vs

. ohjaus. (E) BxPC-3 kasvaimen kasvun hallinnan, P-V 50 mg /kg /d ja VPA 250 mg /kg /vrk käsitellyillä hiirillä. *

p

0,01

vs

. P-V ja VPA ryhmiä;

#

p

0,01

vs

. VPA ryhmä. (F) Simetidiini (CIM) synergistisesti P-V kasvun estämiseksi ihmisen PC ksenografteja. Kantavien nude-hiirten MIA PaCa-2 (

vasemmalle

) tai BxPC-3 (

oikea

) -ksenografteja käsiteltiin P-V 50 mg /kg, CIM 100 mg /kg, tai molempia. *

p

0,01

vs

. ohjaus;

#

p

0,05

vs

. PV tai CIM ryhmiä.

Tässä loimme PV tehokkaana aineena PC ohjaus, jonka tunnuksena simetidiini koska vahva yhdistelmä kumppani ja esitteli sen vaikutusmekanismi, johon liittyi esto STAT3 at mitokondrion tasolla.

Materiaalit ja menetelmät

Reagenssit – Soluviljely

PV ja fosfo-aspiriini (MDC-43) olivat lahja Medicon Pharmaceuticals Inc. (Stony Brook, NY ). Simetidiini ja VPA hankittiin Sigmalta (St. Louis, MO). Dihydroethidium (DHE), 2 ’, 7’-dichlorodihydrofluorecein diasetaatti (DCFDA), MitoSOX Red ja anneksiini V ostettiin Invitrogen. Kaikki yleiset liuottimet ja reagenssit olivat HPLC-laatua tai korkein arvosana kaupallisesti saatavilla.

Ihmisen haiman (AsPC-1, BxPC-3, Capan-2, CFPAC-1, HPAF-II, Panc-1 ja MIA PaCa-2), rinta (MCF-7 ja MDA-MB 231) ja paksusuolen (HT-29, ja SW-480) soluja kasvatettiin ehdottivat ATCC (Manassas, VA). Kaikki solulinjat siirrostettiin laboratorioomme alle 6 kuukauden kuluttua. Mitokondriot vähemmän (ρ

0) johdannaisia ​​BxPC-3-soluja saatiin inkuboimalla soluja 200 ng /ml etidiumbromidia ja 50 ug /ml uridiinia 8viikko [12].

Solukasvu määritettiin käyttäen MTT-määritystä. Solujen lisäkasvua tutkittiin 5-bromi-2′-deoksiuridiinin (BrdU) sisällyttäminen; apoptoosin ja nekroosin värjäämällä anneksiini V-FITC ja propidiumjodidilla (PI) ja analysoimalla fluoresenssivoimakkuuksien mukaan FACScaliber (BD Bioscience); ja solusyklin virtaussytometrialla, kaikki kuten on kuvattu [13].

Vasta microarray

KINEX Vasta Microarray analyysit suoritettiin proteiinin lysaatit saatu BxPC-3-soluja käsiteltiin tai ilman PV 2 h jälkeen ohjeita Kinexus (www.kinexus.ca).

määritys ROS tasoilla

Soluja käsiteltiin testiaineilla 1 h, värjättiin 10 uM DCFDA, 10 uM DHE tai 10 uM MitoSOX Red 30 min ajan 37 ° C: ssa, ja fluoresenssi-intensiteetti analysoitiin FACScaliber.

määritys mitokondrioiden O

2

– fluoresenssimikroskopialla

Solut ympättiin yön yli lasi pohjaviljely astiat (MatTek, Ashland, MA) käsiteltiin PV ja määritettiin fluoresenssimikroskopiaan [14].

määritys mitokondrion kalvon potentiaalia

mitokondrion kalvon potentiaali (ΔΨm) oli määritetään virtaussytometrialla käyttäen JC-1 kationinen väriaine [13].

määrittäminen mitokondrioiden elektroninsiirtoketju monimutkainen I aktiviteetti

aktiivisuus mitokondrioiden elektroninsiirtoketju kompleksi I määritettiin mitokondrioiden otteita MIA PaCa-2 soluja inkuboitiin PV 1,5 × IC

50 1 h, seuraten valmistajan ohjeita (MitoSciences, Eugene, OR).

mitokondrioiden tuonti määritys

in vitro

mitokondrioiden tuonti määritykset suoritettiin, kuten on kuvattu [15] (yksityiskohtia Methods S1).

määritys HDAC

HDAC-aktiivisuus määritettiin käyttämällä colorimetric- määrityksessä. Lyhyesti, Panc-1-soluja käsiteltiin PV, VPA tai HDAC-inhibiittori trikostatiini A 3 h, ja HDAC-aktiivisuus arvioitiin sitten noudattamalla valmistajan ohjeita (BioVision, Milpitas, CA).

Western blot-analyysi

Koko solun fraktiot saatiin, kuten on kuvattu [13]. Sytosolisia ja mitokondrioiden fraktiot saatiin käyttäen mitokondrioissa fraktion eristäminen Kit (Pierce, Rockford, IL). Western blotit suoritettiin, kuten on kuvattu [13].

STAT3-geenin hiljentäminen

Solut transfektoitiin 100 nmol /l STAT3 pieni häiritsevä RNA (siRNA) tai epäspesifinen kontrolli siRNA (yksityiskohdat Methods S1) .

STAT3 yliekspressio

Soluja ohimenevästi tai stabiilisti transfektoitu STAT3 ekspressioplasmidin (STAT3-cDNA; Origene, Rockville, MD; yksityiskohtia Methods S1). Sillä

in vivo

tutkimuksissa, MIA PaCa-2 solujen vaiennetaan STAT3, transfektoitiin STST3 Y705F Flag pRc /CMV plasmidi [16], lahja James Darnell (Rockefeller University, NY) (Addgene plasmidi # 8709). Toisaalta, AsPC-1-solut, joissa vaiennetaan STAT3, transfektoitiin MLS-STAT3 plasmidista [17], lahja tohtori Andrew Larner.

Eläinkokeet

Kaikki eläin kokeet hyväksynyt meidän Institutional Animal Care ja käyttö komitean Stony Brook University.

nude hiiret ksenografti tutkimukset

Kemoterapia protokollaa.

BALB /c-nude-hiiriin (5- 6 viikkoa vanha, Charles River, Wilmington, MA) injektoitiin subkutaanisti 1,5 x 10

6 BxPC-3 tai MIA PaCa-2 solua 100 ul: ssa PBS: ää kuhunkin kylki. Kun kasvaimet olivat saavuttaneet 200 mm

3, hiiret (n = 10 /ryhmä) satunnaistetaan saamaan maissiöljy (kontrolli), tai PV (50, 100 tai 150 mg /kg) maissiöljyyn annettiin suun kautta 5 x /wk.

chemopreventive protokollaa.

Yksi viikko ennen istuttamalla BxPC-3-solut, hiiret jaettiin kolmeen ryhmään (ohjaus, PV, ja VPA; n = 7 /ryhmä) ja alkoi PV 50 mg /kg /vrk tai VPA 250 mg /kg /d suullisesti letkulla 7 viikon ajan; nämä annokset vastaavat 25% niiden suurinta siedettyä annosta (MTD).

Yhdistelmä tutkimus.

Nainen NCR-nude-hiiriin (5-6 viikkoa vanhoja, Taconic, Hudson, NY) olivat ihonalaisesti ympättiin kuhunkin kylkeen 1,5 × 10

6 BxPC-3 tai MIA PaCa-2 solua 100 ui PBS: ää ja satunnaistettiin neljään ryhmään (n = 7 /ryhmä) sai 5 x /vko 58 päivältä: ajoneuvo (maissi öljy); 50 mg /kg P-V maissiöljy suun kautta letkuruokinnalla; 100 mg /kg simetidiiniä PBS i.p .; ja PV plus simetidiini kuten edellä.

Orthotopic haiman ksenografti tutkimus

Parent, STAT3-yliekspressoivassa tai STAT3

Y705F yliekspressoivia MIA PaCa-2-soluissa, tai vanhempi ja MLS-STAT3 yliekspressoivia AsPC -1-soluja (1 x 10

6 30 ui PBS) injektoitiin parenkyymiin haima, joissa on 27-gaugen injektioneulalla. Viisi päivää myöhemmin hiiret jaettiin satunnaisesti kahteen ryhmään (n = 8 /ryhmä) ja vehikkeliä (maissiöljyä) tai PV 150 mg /kg 5 x /vko suullisesti letkulla 18 tai 38 päivää.

immunohistokemia

Värjäys Ki-67, amylaasi, STAT3, p-STAT3

Ser727, p-STAT3

Tyr705, Mcl-1: n ja Bcl-2: ta suoritettiin, kuten on kuvattu [18]. Apoptoosi oli määräytyy immunohistokemiallisesti terminaalin deoksinukleotidyylitransferaasin välittämää deoksiuridiinista trifosfaatti-biotiini nick end-merkintöjä (TUNEL) määritys [14]. Katso lisätietoja.

Tilastolliset analyysit

tulokset vähintään kolmen erillisen kokeen ilmaistiin

tarkoittaa

±

SEM

ja analysoitiin yhden tekijän varianssianalyysi seurasi Tukey testi useita vertailuja.

P

0,05 oli tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

PV estää niiden kasvun ihmisen PC hiirissä: Synergy simetidiinin

arvioimiseksi kemoterapeuttiset potentiaalia PV käytimme sekä potilaalle tehdä ja heterotooppista (ihonalainen) PC ksenograftimalleja nude-hiirissä käyttäen kahta ihmisen PC solulinjojen eroavat niiden

Kras

tila, BxPC-3 (villityypin

Kras

) ja MIA PaCa-2 (mutantti

Kras

) (Fig. 1 B-D). P-V 50 mg /kg /d esti kasvua BxPC-3 ihonalainen ksenografteja, vähentää päivänä 17 tuumorin tilavuuden mukaan 75,4% kontrolliin verrattuna (p 0,01). Annoksilla 100 ja 150 mg /kg /x25d, P-V inhiboi kasvua ihon alle MIA PaCa-2-ksenografteissa mukaan 76,6% ja 96,9%, vastaavasti (p 0,01). Hieman pienempi estävää vaikutusta todettiin potilaalle tehdä MIA PaCa-2 hiirissä hoidettiin PV 150 mg /kg /vrk alkaen 5 päivää implantaation jälkeen ja jatkuvat 38 päivän (60%: n esto lopetuksen; p 0,001; Kuva. S1 ).

Vertasimme myös syöpää ehkäisevistä vaikutuksista PV ja VPA, sen lähtöyhdiste, käsittelemällä kantavissa nude ihonalaista BxPC-3 ksenografteissa PV 50 mg /kg /vrk ja VPA 250 mg /kg /vrk; nämä annokset vastaavat 25% niiden Mtds. Seurasimme ehkäisykäytäntö, eli hoito aloitettu 1 viikko ennen BxPC-3 istutusta. Päivänä 38 implantaation jälkeen, verrattuna kontrolleihin PV pienentää ksenograftin kasvaimen tilavuutta 68%, kun taas VPA vähensi sitä 34% (p 0,01 molemmille), jossa ero kahden ollessa merkitsevä (p 0,05; Fig. 1 E) .

Koska aggressiivinen luonne PC, tutkimme, PV voitaisiin onnistuneesti yhdistää muiden aineiden kanssa. Seuloimme useita yhdisteitä in vitro. Isobologrammit perustettu synergiaa P-V: n ja 5-FU, GABA, arseenitrioksidi ja simetidiini (Fig. S2); kaikki on raportoitu olevan jonkin verran vaikutusta vastaan ​​PC [19] – [22]. Vaikka 5-FU epäonnistui synergoida P-V in vivo (Fig. S3), simetidiini, histamiinia-2-estäjä, oli dramaattinen vaikutus kasvuun PC ksenograftien yhdistettynä P-V (kuvio. 1 F). Hallittiin hoito protokollaa hiirten MIA PaCa-2 ksenografteissa yhdistelmä tuotti pääasiallisesti kasvain pysähtymiseen; kutakin yhdistettä yksin oli vain osittaista vaikutusta ( 45%: n inhibitio lopussa tutkimuksen). Hallittiin ennaltaehkäisy protokollaa hiiriä BxPC-3 ksenografteissa, simetidiini plus PV eliminoidaan kaikki kasvaimia kaikissa eläimissä päivällä 58, toisin kuin kunkin yhdisteen yksinään (31% simetidiini estää ja 68% PV).

PV vähensi kasvainten kasvua sen cytokinetic vaikutus. Esimerkiksi tutkimuksessa heterotooppisen BxPC-3-ksenografteissa, P-V inhiboi solujen lisääntymistä 49%: lla ja kasvoi apoptoosin 78% kontrolleihin verrattuna (kuvio. S4). Huomattavaa on, että tutkimuksissa näiden kahden PC soluja (ja yhdeksän muun haiman ja ei-PC solulinjoja), P-V, joka esti niiden in vitro kasvua voimakkaammin kuin VPA, näytetään kolminkertaisen cytokinetic vaikutus: a) lisäkasvun estäminen; b) lohko G

2 /M → G

1 solusyklin siirtyminen, liittyy parannettu p21 ilme; ja c) apoptoosin induktion (kuvio. S5), jossa oli selektiivinen, säästäen normaalin haiman asinaarisoluissa (Fig. S6).

PV oli hyvin siedetty hiiret kaikissa tutkimuksissa (Fig. S1C), ja osoittanut mitään genotoksisuus on Ames-testi eikä akuuttia myrkyllisyyttä hiirissä (tulokset S1).

PV estää STST3 signalointi PC: Sytosoliset /ydinvoiman vaikutus

tunnistaminen molekyylikohteena (t) on uusi aine on olennainen osa sen kehitystä. Koska VPA inhiboi histonien deasetylaatiolla, me aluksi tutki P-V voisi myös estää histoni deasetylaatiolla. Tätä tarkoitusta varten, mittasimme HDAC aktiivisuus Panc-1 soluissa, sen jälkeen 3 tunnin inkuboinnin ja P-V vastaavina pitoisuuksina 1 × ja 1,5 × IC

50 solun kasvua. P-V esti HDAC 23 ja 29%: lla kun taas VPA sen IC

50 esti sitä 56%. Kuten odotettua, trikostatiini Vahvasti inhiboi HDAC 89% (Fig. S7A) B

Koska NF-KB: n konstitutiivisesti aktivoitu 70% ihmisen haiman syöpien ja ihmisen haiman solulinjoissa [23] – [25] , tutkimme myös, jos PV estyy sen aktivoinnin. Kuten on esitetty kuviossa. S7b, P-V vain hieman inhiboi NF-KB: n aktivaation BxPC-3-soluissa.

Käyttäen vasta-aineen microarray-analyysi (Kinexus, Vancouver, Kanada), olemme määritelleet STAT3 mahdollisena kohteena P-V. Sen jälkeen 2 h hoito ihmisen PC solujen P-V 15 uM, voimakkain vaikutus oli esto STAT3 fosforylaation. Edellä esitetyn selvitimme STST3 reitin edelleen.

PC solulinjoissa, PV esti sekä konstitutiivista että IL-6-stimuloidun STAT3 aktivointi, (mutta ei Stat5: n, kuvio 2A), vähentämällä STST3 fosforylaatiota ja estämällä sen DNA: han sitoutumisen. Tämän seurauksena, ekspressio STAT3-riippuvaisten proteiinien, kuten Bcl-x

L, Mcl-1 ja surviviinista, jotka edistävät vastustuskyvyn apoptoosin tukahdutettiin (Fig. 2A-B, kuvio. S8). P-V inhiboi myös tapahtumia ylävirtaan STAT3 fosforylaation, mukaan lukien sekä JAK2: n ja Src-fosforylaation (kuvio. 2B). Kuten on esitetty kuviossa. 2C, P-V häiritsi yhdistyksen välillä STAT3 ja Hsp90 vaikuttamatta sen tasoja (kuvio. S9); saattaja proteiini Hsp90 helpottaa STST3 fosforylaatio optimoimalla konformaatiota fosforylaatioon [26]. Immunohistokemialliset tutkimukset potilaalle tehdä PC ksenograftien paljasti, että P-V esti p-STAT3 ja yhteensä STST3 ilmentymistä in vivo samoin (Fig. 2D). Hiirissä BxPC-3-ksenografteissa käsiteltiin P-V, STAT3 ilmentyminen väheni 81%, verrattuna kontrolliin (p 0,01; Fig. S10). Immunobloteista proteiinin teissa ksenografteista vahvisti nämä havainnot. PV tukahdutti ilmaus STAT3 riippuvaisten proteiinien Bcl-x

L ja Mcl-1 näissä kasvaimissa (kuvio. 2E).

(A) immunobloteista STAT3, fosforyloidun STAT3 (p-STAT3), Stat5: n ja p-Stat5: n päässä BxPC-3-soluja käsiteltiin PV 1 h ja stimuloitiin IL-6: ssa 30 min. (B) JAK2 ja Src immunosaostettiin ohjaus ja P-V-käsitellyn MIA PaCa-2-soluissa ja sakat immunoblotattiin. (C) Hsp90 immunosaostettiin ohjaus ja P-V-käsitellyn BxPC-3-soluja, ja sakka immunoblotattiin varten STAT3. IgG = Kuormituksen valvonta. (D) immuunivärjäytyminen STST3 ja fosforyloidun STAT3 (p-STAT3) ilme kudosleikkeissä of MIA PaCa-2 potilaalle tehdä kasvaimia kontrollista ja P-V-hoidetut hiiret (x40). Tulokset ilmaistaan ​​prosenttia positiivisia soluja p-STAT3 ja kirkkaus indeksin per 40 × kentän STST3. Arvot ovat keskiarvo ± SEM (n = 7); *

p

0,05 vs.

. ohjaus. (E) Protein lysaatit BxPC-3 -ksenografteja immunoblotattiin varten STAT3, Bcl-x

L ja Mcl-1-proteiineja. Kukin kaista edustaa eri kasvaimen näyte. Kuormituksen valvonta: β-aktiini. Kvantitoitiin ja tulokset ilmaistiin prosenttia käyttölukituksen proteiinia. Arvot ovat keskiarvo ± SEM (n = 7); *

p

0,01 vs.

. ohjaus. (F) (

Ylä

) Simetidiini (CIM) tehostaa P-V: n estävä vaikutus STST3 in vivo. Proteiini lysaatit MIA PaCa-2 ksenograftit analysoitiin STAT3, Bcl-2 ja Mcl-1 proteiinien immunoblottauksella. Kukin kaista edustaa eri kasvaimen näyte. Kuormituksen valvonta: β-aktiini. (

Ala

) CIM parantaa P-V: n häiriöitä STAT3-Hsp90 -alueella. Hsp90 immunosaostettiin MIA PaCa-2-solujen käsiteltyjen tai ilman P-V, CIM tai molempia. Sen jälkeen immunosaostus, immunoblottaus STST3 suoritettiin.

Yhdistettynä simetidiinin, P-V tukahdutti myös ilmaus STAT3, Bcl-2 ja Mcl-1 in heterotooppi- MIA PaCa-2 ksenografteissa (Kuva. 2F). Kiinnostaa, simetidiini parannettu kyky P-V häiritä Hsp90-STAT3 yhdistys MIA PaCa-2-solut (Fig. 2F). Lisäksi esikäsittely PC solujen ranitidiinin, toinen H-2 esto, ei moduloida kasvua estävää vaikutusta simetidiinin (Fig. S11), viittaa siihen, että simetidiini ei voi toimia pelkästään estämällä H-2-reseptoreihin.

PV estää STST3 signalointi PC: mitokondrio vaikutus

mitokondrioissa STAT3 tukee Ras pahanlaatuinen muutos, jota tarvitaan optimaalisen toiminnan vuoksi elektroninsiirtoketju [4], [5]. PC-soluissa, P-V laskivat tasot STAT3 mitokondrioissa vaikuttamatta sen soluliman tasoilla (Fig. 3A ja kuvio. S12). Mielenkiintoista, VPA ei ollut vaikutusta mitokondrioiden STST3 tasoilla. Sen sijaan, fosfo-aspiriini, joka yhdessä P-V sama aromaattinen linkkeri [13], vähentää mitokondrioiden STAT3 tasoilla (Fig. 3B), mikä viittaa siihen, että liitosyksikkö voivat osallistua tähän vaikutusta. Mikään näistä kolmesta yhdisteiden vaikuttaa mitokondrioiden tasot Hsp90 ja Hsp60 proteiineja, sekä tuoda mitokondriot, mikä osoittaa, että muutokset STAT3 tasot eivät johtuneet yleistetty tukahduttaminen proteiinin kuljetuksen mitokondrioita.

(A ) Immunoblotit ja STAT3, α-tubuliinin tai COX IV soluliman (CF) ja mitokondrioiden (MF) fraktioiden MIA PaCa-2-soluja käsiteltiin PV 5 tuntia. (B) Immunoblotit ja STAT3, Hsp90, Hsp60, α-tubuliinin ja COX IV mitokondrion fraktioista MIA PaCa-2-soluja käsiteltiin P-V, VPA tai fosfo-aspiriini (P-A) 3 tuntia. (C) Immunoblotit p-STAT3

Ser727, STST3 ja Hsp90 mitokondrion jakeet eristetään MIA PaCa-2 ksenografteissa kontrollista tai 150 mg /kg P-V-käsitellyistä hiiristä. β-tubuliinia = soluliman ristikontaminaation ohjaus; COX IV = mitokondrion latauskontrollina. Kukin kaista vastaa eri kasvaimen näyte. (D) P-V vähentää aktiivisuutta mitokondrion elektronin siirto ketjun kompleksi I (NADPH-dehydrogenaasi). Aktiivisuus mitokondrioiden kompleksin I mitattiin, kuten on kuvattu menetelmät. Arvot ovat keskiarvo ± SEM (n = 3); *

p

0,05 vs.

. ohjaus. (E) MitoSOX Red, DCFDA ja DHE fluoresenssi mitattiin virtaussytometrialla in BxPC-3-soluja käsiteltiin P-V 1 tunnin ajan. Positiivisina kontrolleina, käsittelimme solut fosfo-aspiriinia (P-A) 1 h, jonka indusoi sekä DCFDA ja DHE [13].

Oikea paneeli

: Mitokondrioiden O

2

– tasot kuusijäseninen PC soluja käsiteltiin P-V 1.5 × IC

50 1 h. (F) BxPC-3-soluja käsiteltiin PV jopa 2 tuntia, minkä jälkeen lisättiin n MitoSOX Red koetin ja solut analysoitiin konfokaalimikroskopialla (x40).

Nuclear-koodatut proteiinit ovat tuotu mitokondrioita pääasiassa translocases mitokondriaalisen ulkokalvon (TOM) kompleksi. TOM20, osa tämän monimutkaisen, on välttämätöntä spesifisyyttä tämän prosessin [27]. P-V heikentynyt yhdistyksen välillä STAT3-TOM20, osoittama immuunisaostamiseksi mitokondrioiden fraktioiden anti-TOM20 ainetta ja immunoblottaus varten STAT3 (Fig. S13a). Tämä havainto viittaa siihen, että P-V vähentää mitokondrioiden tuonti STAT3. Tämä varmistettiin mitokondrioiden tuonnin määrityksessä.

35S-metioniinia leimatun STAT3, syntyy

in vitro

kääntäminen

STAT3

, käsiteltiin tai ilman P-V ennen sen vuorovaikutusta ehjä mitokondrioita. P-V puolestaan ​​laskenut

35S-STAT3 mitokondrioissa perustamisesta sen kyky estää mitokondrioiden kuljetusta STAT3 (Fig. S13B). Tämä PV inhiboi mitokondrion STST3 vahvistettiin in vivo: p-STAT3

Ser727 ja STAT3 tasot laskivat eristettyjä mitokondrioita PC ksenografteista PV-käsiteltyjen hiirten, kun taas on Hsp90-proteiinin pysyivät muuttumattomina (Fig. 3C).

STAT3 optimoi toimintaa elektroninsiirtoketju, [5] päägeneraattorilta ROS. In MIA PaCa-2-solut, P-V väheni 29% (p 0,05) saatavien mitokondrion kompleksin I (Fig. 3d), jotka vaikuttavat ROS tuotanto. Käyttämällä MitoSOX Red, molekyyli- spesifistä koetinta mitokondrioiden superoksidianionia (O

2

-), osoitimme, että PV kasvoi O

2

– tasot mitokondrioita kuudessa PC solulinjoissa (kuvio. 3E -F). Tämä vaikutus oli mitokondrioiden erityisiä, kuten P-V ei onnistunut indusoimaan solun muiden ROS, määritetään DCFDA (havaitsee useita ROS lajia) ja DHE (koettimia solun kokonais O

2

-). Positiivisiksi kontrolleiksi käytimme fosfo-aspiriini, aiemmin osoitettu aiheuttavan sekä DCFDA ja DHE [13]. Huomattavaa on, että VPA ei ollut vaikutusta ROS, mukaan lukien mitokondrion O

2

– (Fig. S14). Kuten yhdistelmäpartnereilla, P-V ja simetidiini synergized lisätä mitokondrioiden O

2

– tasoja. P-V ja simetidiini kukin yksinään kasvattanut MitoSOX Punainen (+) PC solujen 3.7- ja 0.1-kertaiseksi, ja 5,6-kertaiseksi yhdistettynä (Fig. S15A). Vaikutus P-V STAT3 oli ratkaiseva sukupolveen mitokondrioiden O

2

-. Tätä käsitystä tukee se havainto, että kun STST3 pudotettiin tasot mitokondrioiden O

2

– lisääntynyt (Fig. 4A), mikä osoittaa, että STAT3 inhiboi O

2

– on mitokondrioita. Sitä vastoin, kun yli-ilmentynyt STAT3, joka sisältyy sen yliekspressio mitokondrioita, kasvu mitokondrioita O

2

– tasot vastauksena PV kumottiin (Fig. 4B).

(A) koputtaa alas STAT3 lisää mitokondrioiden O

2

– tasot BxPC-3-soluissa. Ohjaus-siRNA ja STAT3-siRNA solut esiladattu MitoSOX Red, ja mitokondrioiden O

2

– määritettiin virtaussytometrialla (

vasemmalle

) tai konfokaalimikroskopia (

oikeus

, x40). (B) STAT3 yliekspressio vähentää kasvua mitokondrioiden O

2

– aiheuttama P-V. BxPC-3-solut transfektoitiin STAT3 ilmentävän plasmidin tai kontrolli-plasmidi (tyhjä vektori) 48 h, ja sitten käsiteltiin P-V 4 tunnin ajan, minkä jälkeen lisättiin koetin MitoSOX Red. Sitten solut tutkittiin konfokaalimikroskopiaa (x40). (C) P-V romahtaa mitokondrion kalvon potentiaali (ΔΨm) on aikaa (

Top) ja pitoisuudesta riippuva (

alhaalla

) tavalla. Fluoresenssi histogrammit kvantitoitiin ja tulokset esitetään keskiarvona ± SEM; *

p

0,05 vs.

. ohjaus. (D) Immunoblotit sytokromi c, pro-kaspaaseiksi ja caspases 9 ja 3 sytosoliproteiiniin otteita BxPC-3-solut käsiteltiin P-V. (E) BxPC-3 mitokondrioiden-vähemmän (ρ

0) solut ovat huomattavasti vastustuskykyisempiä P-V: n indusoiman apoptoosin.

Top: Immunoblotit COX IV ja STAT3 vanhempien (-) ja ρ

0 BxPC-3-soluissa. Kuormituksen valvonta: p-aktiini.

kasvun seurauksena mitokondrioiden ROS tasoilla oli romahduksen mitokondrion kalvon potentiaali (ΔΨm). Hoito PC solujen P-V romahti heidän ΔΨm, osoituksena vähentynyt punainen /vihreä fluoresoiva suhde solujen esiladattu kanssa koetin JC-1 (Fig. 4C). Romahdus ΔΨm aktivoitua luontaisen apoptoottisen reitin, joka ilmenee julkaisun sytokromi c sytosoliin (alkaen 4 h kuluttua hoidon aloittamisesta); pilkkominen prokaspaasi 9 (alkaen 12 h); ja kaspaasi 3 (alkaen 18 h) (Fig. 4D). Välinen synergia P-V ja simetidiini näkyi myös apoptoosin. 24 tunnin kuluttua hoidon PV /simetidiini, kansi-lisäys anneksiiniV (+) solut oli 2,6, verrattuna 1,1 PV ja ei yhtään simetidiini yksinään (Fig. S15B).

Nämä havainnot viittaavat siihen, että mitokondrioita saattaa välittää PC solun tappaminen vaikutus PV. Näin ollen emme syntyy mitokondrioiden vähemmän (ρ

0) BxPC-3-solut (ilman mitokondriaalisen proteiinin sytokromi-c-oksidaasin alayksikkö IV (COX IV) päässä ρ

0-solut vahvistivat puute mitokondrioita). Verrattuna vanhempien soluihin, ρ

0 solut olivat 43% vastustuskykyisempiä PV: n indusoiman apoptoosin, todetaan, että mitokondriot välittävät osittain induktion solukuoleman PV (Fig. 4E).

yli-ilmentyminen mitokondrioiden STAT3 kumoaa syövänvastainen vaikutus PV

Varmista, että STST3 on keskeinen tavoite PV, me syntyy MIA PaCa-2-soluissa stabiilisti yli-ilmentävät STAT3 (STST3

korkea

), käyttäen valvoo niiden vanhemman soluja, on pohjapinta taso STAT3 (STAT3

normaali

). STAT3 yli-ilmentyminen kumosi kasvua estävän ja proapoptoottiset vaikutuksista P-V in vitro (Kuva. S16). Esimerkiksi apoptoosin induktio PV STST3

korkea

soluja oli alle puolet siitä mitä se STAT3

normaali

soluja (2,2 vs. 5,2 kertainen anneksiini V (+) solujen 24 tunnin kuluttua hoidon, Fig. hammastuksen S 16b). Vastaavasti yli-ilmentyminen STAT3 vähennetään puolet induktion mitokondrioiden O

2

– tasot PV (6,1-kertainen MitoSOX Punainen (+) solujen STST3

korkea

solujen vs . 12.6-kertainen STST3

normaali

soluissa; Fig. S16C). Yli-ilmentyminen STST3 mitokondrioita of STAT3

korkea

soluissa varmistettiin immunoblottauksella.

arvioimiseksi nämä havainnot in vivo, meidän istutettu ortotooppisesti paljaisiin hiiriin STST3

korkea

tai STST3

normaali

soluissa. Kun 18 päivän hoidon, PV jättänyt vaikuttaa kasvuun STAT3

korkea

kasvaimia, toisin kuin 72% eston STAT3

normaali

kasvaimet (p 0,001; kuva 5A). PV ei tukahduttaa tasoja STAT3 tai sen riippuvainen proteiinien Bcl-x

L, Mcl-1 ja Bcl-2 in STAT3

korkea

kasvaimia, vaikka se on tehnyt tukahduttaa ne kaikki STAT3

normaali

kasvaimia (Fig. 5B-C ja S17).

(A) MIA PaCa-2-solujen pohjapinta (STST3

normaali

) tai ilmentynyt STAT3 (STST3

korkea

) tasot ortotooppisesti istutettiin nude-hiirissä, joita käsiteltiin sitten ilman (kontrolli) tai PV 150 mg /kg 18 päivän ajan.

Top: Kuvia edustaja haiman kasvaimia.

Bottom

: Haiman kasvaimen paino (keskiarvo ± SEM). *

p

0,01 vs.

. ohjaus;

#

p

0,01 vs.

. STAT3

high

P-V-hoidetussa ryhmässä. (B) STST3 ja Mcl-1 ilmentymisen STST3

normaali

ja STAT3

korkea

MIA PaCa-2 potilaalle tehdä kasvainkudossektioista kontrollista ja PV-käsiteltyihin hiiriin (x20 ). (C) Immunoblotit varten STST3 ja Bcl-x

L potilaalle tehdä kasvain näytteissä. Kukin kaista edustaa eri kasvaimen näyte. Kuormituksen valvonta: β-aktiini. (D) MIA PaCa-2-solujen yli-ilmentynyt STAT3 Y705F mutantin (STAT3

Y705F

) tasot ortotooppisesti istutettiin nude-hiirissä, joita käsiteltiin sitten ilman (kontrolli) tai PV 150 mg /kg 18 päivää. Haiman kasvaimen paino (keskiarvo ± SEM). (E) AsPC-1-solujen pohjapinta (STST3

normaali

) tai yli-ilmentyy mitokondrion kohdistettuja STAT3 (MLS-STAT3) tasot ortotooppisesti istutettiin nude-hiirissä, joita käsiteltiin sitten ilman (kontrolli) tai PV 150 mg /kg 21 päivän ajan. Haiman kasvaimen paino (keskiarvo ± SEM). *

p

0,01 vs.

. ohjaus;

#

p

0,01 vs.

. MLS-STAT3 PV-hoidetussa ryhmässä.

Varmista, että mitokondrion STST3 on merkittävä tavoite PV, me syntyy MIA PaCa-2-soluissa stabiilisti yli-ilmentävät STST3

Y705F

mutantti [16], joka säilyttää mitokondrioiden toimintaa, mutta siitä puuttuu ydin- transkriptioaktiviteettia [5]. Me istutettiin nämä solut ortotooppisesti nude-hiiriin, ja kohteli heitä tai ilman P-V 18 päivää. Lopetettaessa PV jättänyt vaikuttaa kasvuun STAT3

Y705F

kasvaimia, joiden paino oli verrattavissa kontrollihiirten (Fig. 5D).

edelleen tutkia roolia