Krooninen sairaus

tiivistelmä

Taustaa Tavoitteet

peräsuolen syövän ilmaantuvuus ja kuolemat vähenevät havaitsemisen ja poistamisen alkuvaiheen, hoidettavissa neoplasia mutta meillä ei ole osoittautunut biomarkkereita herkkä sekä syövän ja pre-invasiivisia adenoomia. Tavoitteet Tämän tutkimuksen onko adenoomien ja syöpien on tunnusomaisia ​​malleja biomarkkerina ilmaisun ja tutkia, onko kudos löydettiin (ja validoitu) biologisten merkkiaineiden ilmentyy differentiaalisesti plasmassa potilailla, joilla on peräsuolen adenoomien tai syöpä.

menetelmät

Candidate RNA biomarkkerit tunnistettiin oligonukleotidi- microarray kolorektaalisen yksilöt (222 normaali, 29 adenooma, 161 adenokarsinooma ja 50 koliitti) ja validoitu aiemmin testaamaton kohortin 68 peräsuolen yksilöitä käyttämällä mittatilaustyönä oligonukleotidi mikrosirun. Yksi validoitu biomarkkereiden,

KIAA1199

, määritettiin käyttäen qRT-PCR plasma uutetaan RNA: 20 kolonoskopia varmistettujen terveillä verrokeilla, 20: llä adenooma, ja 20 syöpää.

Tulokset

genominlaajuiset analyysi paljasti toistettavan geeniekspression allekirjoitukset sekä adenoomien ja syöpien kontrolleihin verrattuna. 386/489 (79%) kasvain ja 439/529 (83%) ja adenokarsinooman biomarkkereita validoitu itsenäisessä kudoksissa. Havaitsimme myös geenejä differentiaalisesti ilmaistut adenoomien verrattuna syöpään.

KIAA1199

valittiin lisäanalyysiä varten perustuvat johdonmukaisesti ylössäätöä in neoplasia, aiemmat tutkimukset ja kiinnostuksensa kuin tuntemattomia geeni. Plasma

KIAA1199

RNA-tasot olivat merkittävästi suurempi potilailla, joilla on joko tai kasvaimia (31/40) verrattuna neoplasian vapaa valvonta (6/20).

Johtopäätökset

peräsuolen kasvain on ominaiset malleja geenin ilmentymisen.

KIAA1199

ilmentyy differentiaalisesti neoplastisten kudosten ja

KIAA1199

selostukset on runsaammin plasmassa potilailla, joilla on joko tai kasvaimia kontrolleihin verrattuna.

Citation: LaPointe LC, Pedersen SK, Dunne R, Brown GS, Pimlott L, Gaur S, et ai. (2012) Discovery ja validointi Molecular biomarkkereita peräsuolen adenoomien ja syövän Application Blood Testing. PLoS ONE 7 (1): e29059. doi: 10,1371 /journal.pone.0029059

Editor: Libing Song, Sun Yat-sen University Cancer Center, Kiina

vastaanotettu: toukokuu 30, 2011; Hyväksytty: 20 marraskuu 2011; Julkaistu: 19 tammikuu 2012

Copyright: © 2012 LaPointe et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ oli rahoittavat yhdessä Flindersin University of South Australia ja Brittiläisen tieteellisen ja teollisen tutkimuksen Organisation (CSIRO) Australian. Drs. Dunne, Molloy ja Brown työskentelee CSIRO. Nämä rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen. Rahoitusta saatiin myös Clinical Genomics Pty Ltd, yhtiö, löytö ja kaupallistamiseen biomarkkereiden peräsuolen syövän. Drs. LaPointe, Pedersen, Gaur, McEvoy ja Thomas työskentelee Clinical Genomics Pty Ltd Prof. Young on maksettu konsultti Kliinisen Genomics Pty Ltd rahoittaja siis ollut rooleja tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista, ja valmistelu käsikirjoituksen. Mrs Pimlott ja tohtori Wattchow ei ole ilmoitettavaa.

Kilpailevat edut: Tämä työ oli osarahoittama Clinical Genomics Pty Ltd, yhtiö, löytö ja kaupallistamiseen biomarkkereiden peräsuolen syövän. Drs. LaPointe, Pedersen, Gaur, McEvoy ja Thomas työskentelee Clinical Genomics Pty Ltd Prof. Young on maksettu konsultti Kliinisen Genomics Pty Ltd: Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

peräsuolen syöpä on hoidettavissa, jos havaitaan ja poistetaan varhaisessa vaiheessa 95% potilaista elossa yli viiden vuoden [1]. On yhä enemmän todisteita siitä, että poistaminen ennalta invasiivisia peräsuolen vaurioita, eli adenoomia, jonka polypektomiaan alentaa esiintyvyys ja kuolleisuus, peräsuolen syöpä [2] – [4]. Näin ollen estetään peräsuolen syöpä poistamalla näytön havaittu adenoomia on yhä enemmän korostuu tärkeänä tavoitteena paksusuolisyövän seulonnan. Yksinkertainen seulontatestien tällä hetkellä käytettävissä ovat kuitenkin optimaalisia adenooma havaitsemiseen, vaikka ulosteen immunokemialliset testit globiini ovat paljon parempia verrattuna aikaisempaan testiin [5] – [7]. Väestöseulonnan ohjelmat voidaan parantaa, jos kätevä verikoe olivat käytettävissä, joka on herkkä ja spesifinen molemmat aikaisintaan kaikkein hoidettavissa vaiheissa paksusuolisyövän ja myös herkkä ennalta invasiivisia adenoomia. Tällainen testi helpottaisi järkevä seulontaan sallimalla suunnata kolonoskopia resursseja potilaisiin, joilla saa todennäköisesti eniten hyötyä invasiivisen menettelystä [8].

geeniekspressiomalleja yhä osoittavat lupaus tunnistamiseen ehdokas biomarkkereita ja peräsuolen syöpä, mutta nämä ehdokkaat usein puuttuu asianmukainen validointi ja vähän tietoja on saatavissa biomarkkerit, jotka ovat myös herkkiä adenoomia. Otaksuttu biomarkkereita johtuvat löytö perustuva tutkimus on tiukasti validoitu, jos se on kliinisesti käyttökelpoinen [9] – [12]. Validation, eli testaus hypoteesi, että ehdokas biomarkkerit ovat aitoja indikaattoreita fenotyypin, mieluiten käyttää potilaan kohortin joka on kliinisesti riippumaton löytö kohortissa. Lisäksi korrelaatio geeniekspressiomalleja kudoksen ja biologisten merkkiaineiden havaitsemiseen veressä ei ole hyvin määritelty.

Tämän tutkimuksen tavoitteena oli selvittää, onko adenoomien ja syöpien on tunnusomaisia ​​malleja biomarkkerina ilmaisun ja tutkia, onko kudos -discovered (ja validoitua) biomarkkereiden ilmentyy differentiaalisesti plasmassa potilailla, joilla on paksusuolen ja peräsuolen adenoomien tai syöpä. Erityistä huomiota kiinnitetään adenooma ilmaisun kuviot adenooma biomarkkereita ovat pitkälti sivuutettu kirjallisuudessa.

nähden tavoitteenamme löytää herkkiä biomarkkereita sekä peräsuolen adenoomien ja syövän jälkeen kolmivaiheinen strategia löytö, validointi ja kliininen määritys testaus. Ensinnäkin, korkea-ulotteinen geeniekspressiota microarray analysoitiin löytää ehdokas biomarkkereita sekä syöpien ja adenoomia päässä colorectum. Jotta vahvista sitten geeniekspression ehdokkaita, mittatilaustyönä oligonukleotidi mikrosiru ( ”adenooma biomarkkereiden Gene Chip”) on suunniteltu ja valmistettu sisältämään laajan valikoiman hypoteettisen markkereita havaitut tietojenkeruuvaiheessa sekä markkereita valittu kirjallisuudessa. Ehdokas biomarkkerit validoitiin käyttäen Adenooma biomarkkereiden Gene Chip riippumattomalla joukko neoplastisten yksilöitä. Lopuksi mahdollinen kliininen hyöty lupaava kudos-validoitu peräsuolen neoplasia biomarkkereiden mitattiin RNA uutetaan plasmasta suolen kasvainten ja syöpäpotilaiden ja kolonoskopia-vahvistettu terveillä verrokeilla. Tämä juokseva prosessi seuraa kaksi ensimmäistä vaihetta viiden vaiheen arviointi biomarkkereiden ehdottaman Pepe et al [13].

Tulokset

Neoplastiset vs. ei-neoplastisia transcriptome

Of 44928 probesets analysoitiin geenin ilmentymisen eron, havaitsimme 11183 (24,9%) probesets voidaan ilmentää eri tavalla neoplastiset kudokset verrattuna ei-neoplastisia kudoksissa, mukaan lukien colitic yksilöitä. Vertailun, havaitsimme 2701 (6,0%) probesets myös ekspressoituu differentiaalisesti normaalin (n = 222) ja koliitti (n = 42) kudosuutteita (taulukko 1). Nämä ekspressiotietojen analysoitiin myös täydellä genomin tasolla käyttäen pääkomponenttianalyysi (PCA) (kuvio 1). Suurin lähde ilmaisun havaittu muutosta näissä 454 mikrosiruja (osoituksena molemmat tarkoittaa ilmaisu muutos ja PCA tontti) korreloi läsnäolon tai puuttumisen neoplasia. Tämä fenotyyppinen vaikutus oli riippumaton siitä, onko ei-neoplastisia kudoksia näytteillä paksusuolentulehdus ja lisäksi riippumaton siitä, neoplastiset kudokset olivat adenomatoottisten tai syöväksi.

(A) Discovery mikrosiru aineisto: 222 normaali, musta; 42 paksusuolentulehdus /IBD, vihreä; 29 adenoomia, sininen; ja 161 adenokarsinoomia, punainen. (B) Validation microarray aineisto: 30 normaali, musta; 19 adenoomia, sininen; ja 19 adenokarsinoomia, punainen.

Ottamalla käyttöön vaatimus kaksinkertainen muutos signaalin intensiteetin välillä neoplastisten ja ei-neoplastisten kudosten lukumäärä differentiaalisesti ilmaistuna probesets laski 11183 446 (Pöytä 1). Niinpä vain 4,0% differentiaalisesti ilmaisi probesets (1,0% probesets kokonais-) osoittivat ainakin kaksinkertaiseksi ilme muutos. Mielenkiintoista on, kun taas määrä probesets joka osoittaa ero vaste tahansa suuruus on noin tasan välillä probesets lisääntynyt ekspressio neoplastisten kudosten (6227; 55%) ja probesets on alentunut ilmentyminen (4956; 44%), sen jälkeen soveltamalla kaksitahoinen perusteen määrän alle ilmaisi probesets kanssa intensiteetin laskua pahanlaatuisissa kudoksissa oli paljon suurempi kuin määrä probesets entistä tehokkaammin, 338 (76%) verrattuna 108 (24%), vastaavasti. Suuntaus havaittiin sekä ei-neoplastisia vs. adenooma ja ei-neoplastisia vs. syövän vertailuja. Toisaalta vertailu normaaleissa ja koliitin näytteet osoittivat suurin piirtein saman verran geenejä, joilla on korkeampi (60) ja alempi (73) ilmentymisen tasojen fenotyyppejä. Välillä adenooma ja syöpien, oli kuitenkin huomattavasti enemmän geenejä säädellään ylöspäin (145) syövän versus säädeltiin (43). Yhteenveto differentiaalikaavojen muutoksen fenotyyppi on esitetty taulukossa 1 ja listan validoitu geenien ylä- ja säädellä vähentävästi syövissä verrattuna adenoomia on esitetty taulukoissa S1 ja S2 vastaavasti.

Probesets joka paljasti ero ilmaisun välillä neoplastisten (adenoomia ja syövät) ja ei-neoplastisia kudoksia (normaali ja koliitti) on kartoitettu otaksuttu geeni symboleja käyttäen viimeisintä mikrosirulla merkintätiedostoja. 108 probesets koholla neoplastisten kudosten vähintään kaksinkertaiseksi kartoitettiin 97 geeniä symboleja ja 338 laski probesets kartoitettiin 264 geeniä symboleja (taulukko S3).

Fenotyyppikuvaus-geenit

sarjaa differentiaalisesti ilmentyvien geenien analysoitiin edelleen käyttämällä uutta analyysimenetelmää kehittämiä ennustaa selostukset, jotka voidaan ilmaista yhdellä fenotyypin (esim neoplasia), mutta ei toisessa (esim tervettä verrokkia). Soveltamalla tätä menetelmää, 23 probeset tavoitteet identifioitiin putatiivisiksi ehdokkaita neoplastisen-spesifisen geenin ilmentymisen, eli hypoteettisesti Päälle kytketty pahanlaatuisissa kudoksissa mutta kytketty pois ei-neoplastisia valvontaa. Lisäksi, 35-geenit tunnistettiin ehdokkaita ilmentymistä ei-neoplastisten kudosten vain, eli kytketään päälle ei-neoplastisia kudoksia, mutta virta-off neoplastisia kudoksia. Esimerkki probeset jolla prototyyppinen neoplastisen-spesifinen vaste kuvio on esitetty kuviossa 2A, ja täydellinen luettelo probesets vastaa hypoteettisesti kytketty päälle ja kytketty pois päältä geenien esitetty taulukoissa S4 ja S5, vastaavasti.

(A) Discovery tietokokonaisuus, 222 normaali, musta; 42 IBDs, vihreä; 29 adenoomia, sininen; 161 adenokarsinoomia, punainen. (B) Validation tietokokonaisuus: 30 normaali, musta; 19 adenoomia, sininen; 19 adenokarsinoomia, punainen. Y-akseli: Normalisoitu probeset intensiteetti (log 2).

Custom ”adenooma biomarkkereiden” geenilastuun

PCA juoni löytö datan (kuvio 1A) on voimakas neoplasia vs. ei-neoplasia erottelu liittyy kaksi ensimmäistä pääkomponentti akselia, jossa adenoomien ja syöpä ryhmitelty. Validointia tiedot (kuvio 1 B), ensimmäinen pääasiallinen komponentti vahvistaa, että suurin lähde varianssi koko näiden probesets on läsnä tai poissa neoplasia. Toinen pääkomponentti kuitenkin osoittaa, että adenoomia ryhmitellään erillään syöpään yksilöitä.

validointi ehdokas biomarkkereita ja peräsuolen kasvainten

108 probesets joiden tavoitteet arveltu olevan liian ilmaistaan ​​ainakin kaksi kertaisesti neoplastiset löytö kudoksissa, 103 probesets (95%) oli koholla neoplastiset validointi kudokset (

P

≤0.05, MHT), ja näistä 92 (85%) olivat koholla by at vähintään 2-kertainen. Vastaavasti 297 338 (87%) probeset tavoitteet arveltu olevan alle ilmaistu neoplastiset kudokset olivat myös alle ilmaistu validointi kokeita (

P

≤0.05, MHT); neoplastisissa yksilöt, 247 (73%) näistä geeneistä näytteillä enintään puolet ilmaisun nähdään normaaleissa kontrollisilkkipaperia. Validation tuloksia fenotyypin sijaan on esitetty taulukossa 2. Luettelo validoitujen ylä- ja alassäädetty probesets on esitetty taulukoissa S6 ja S7, vastaavasti.

kvantitatiivinen PCR mittaamiseksi RNA biomarkkereiden tasot kudoksen tai plasma

Yksi differentiaalisesti säädelty probesets sekä löytö (kuvio 3A) ja validointi (kuvio 3B) havaittiin selostukset

KIAA1199

, geenin toimintaa ei tunneta. Vuonna datajoukolla, probeset 1008852-HuGene_st (

KIAA1199

) ilmaistiin yli 25-kertainen peräsuolen kasvain verrattuna ei-neoplastisten valvontaa (taulukko S6). Nämä tulokset vahvistivat aikaisempien tutkimusten jossa todettiin, että

KIAA1199

mRNA voi olla ehdokkaana biomarkkeri suolen kasvainten [14]. Perustuu toistuva havainto differentiaalikaavojen neoplastisissa kudoksissa aikaisemmin todettu sääteli ilmaisua sekä adenoomien ja syöpien ja mielenkiintoinen seikka, että

KIAA1199

ei ole aiemmin tunnettu kannalta rakenteen tai toiminnan, me Valitsimme

KIAA1199

testata ajatusta, että kudoksen ekspressiokuvioiden voi ilmetä veressä. Tutkimaan edelleen biomarkkereiden mahdollisuuksia

KIAA1199

suunnittelimme reaaliaikaisen PCR toteamiseen RNA-transkriptien johdetut lokuksesta.

(A)

KIAA1199

ilme mitataan kautta probeset 212942_s_at löytö aineisto 454 kolorektaalisen kudoksen näytteitä (x-akseli indeksoitu fenotyyppi); Norm: 222 normaali yksilöt, musta; IBD: 42 ”koliitti” yksilöitä, vihreä; ADE: 29 adenoomia, sininen; CA: 161 syöpä yksilöitä, punainen. Y-akseli: normalisoitu probeset intensiteetti (log2). (B)

KIAA1199

ilmaisu mitattiin probeset 1008852-HuGene_st validoinnissa aineisto 68 peräsuolen kudosnäytteet. X-akselin suuntaan; Norm: 30 normaali paksusuoli kudosnäytteet, musta; ADE: 19 adenoomia, sininen; CA: 19 kolorektaalisyövän yksilöitä, punainen. Y-akseli: normalisoitu probeset intensiteetti (log2). (C) kvantitatiivinen reaaliaikainen SYBR vihreä

KIAA1199

PCR-määritys sovellettiin RNA uutteet validoimiseksi microarray tiedot: 30 normaali, musta; 21 adenoomia, sininen; 20 kolorektaalisyöpä, punainen yksilöitä. Tulokset ovat kaksoiskappaleita, normalisoidaan HPRT1 ja kuvataan delta-delta-Ct-arvot. Huomaa, että kolme ylimääräistä neoplastisia saatiin näyte PCR kokeita, joita ei ole testattu tavan mikrosirujen.

Ensin SYBR vihreä pohjainen reaaliaikainen PCR

KIAA1199

käytettiin vahvista kudokseen validointi microarray data; tulokset olivat hyvässä kanssa microarray tiedot tämän geenin (kuvio 3C). Seuraavaksi,

KIAA1199

(ja

GAPDH

ohjaus) transkriptin tasot mitattiin RNA uutetaan plasmasta osa 40 potilailla, joilla on peräsuolen neoplasia (adenooma tai adenokarsinooma) ja 20 tervettä verrokkia (kaikki luokat, joiden vahvistanut kliiniset patologisia löydöksiä) käyttämällä kaupallisesti saatavilla TaqMan qPCR määrityksissä.

GAPDH

RNA-transkriptien olivat havaittavissa kaikissa 60 plasmanäytteistä testattu (kuvio 4A) ja kohtalaisen korkeampi

GAPDH

RNA tasot havaittiin plasmassa potilas jolta näyte diagnosoitu peräsuolen adenoomien tai syöpä verrattuna terveisiin luovuttajien (ei merkitsevä, p-arvot 0,05). Korkeammat pitoisuudet

KIAA1199

RNA-transkriptien havaittiin plasmassa potilailla, joilla peräsuolen kasvain kuin plasmassa terveillä verrokeilla (Kuva 4B).

KIAA1199

RNA havaittiin plasmassa 31 ulos 40 (77,5%) potilailla, joilla on peräsuolen kasvainten ja 6 ulos 20 (30%) neoplasian vapaa potilailla.

(A )

GAPDH

ja (B)

KIAA1199

RNA plasmassa 20 terveillä koehenkilöillä (musta) ja 20 potilaalta, paksusuolen adenoomia (sininen) ja 20 CRC potilasta (punainen). Tulokset ovat Ct-arvoja (triplikaatit) normalisoitu louhinta saantieroja ja kuvataan kertamuutosta eroja suhteessa mediaani ilmaisun mitattuna 20 normaalihenkilöihin. P-arvot laskettiin käyttäen kaksisuuntainen Mann-Whitneyn t-testi.

Keskustelu

Tämä tutkimus osoittaa, että peräsuolen mRNA-transkriptien ilmentyvät eri sekä adenooma ja syöpä kudoksiin verrattuna verrokkiryhmään , joidenkin selostukset ovat säädellään ylöspäin neoplasia kun taas toiset ovat alassäädetty. Olemme vahvistaneet, että 103 108 (95%) probesets havaittu olevan säädellään ylöspäin neoplasia tehtiin vastaavat ilmentyvät eri aikana validointitestausta. 87% (297/338) ja alassäädetty probesets vahvistettiin myös aikana validointitestausta. Genominlaajuisten kovarianssi kuviot osoittivat, että läsnäolo tai puuttuminen neoplasian korreloi suurin lähde varianssi kaikissa probesests ja kaikki taulukot ilmaisu tietoja (kuvio 1A). Noin 25%: n 44928 löytö probeset tavoitteet ilmentyvät differentiaalisesti välillä kasvainkudoksessa ja ei-neoplastisia valvontaa. Kaikki muut fenotyyppi kontrasteja johti vähemmän probesets osoittaa ero vasteen. Nämä tulokset osoittavat, että neoplastisia tila on suurempi vaikutus geenien ilmentyminen kuin esimerkiksi koliitti tai jopa eroa ennalta invasiivisia adenooma kudosten ja pahanlaatuinen syöpä.

Tuloksemme samaa mieltä yleisesti havaittu suuntaus kolorektaalisyövässä geenin ilmentymisen tutkimus, joka osoittaa suurempi määrä geenejä säädellä vähentävästi adenooma ja syövän kudoksissa verrattuna ei-neoplastisia valvontaa [15]. Tämä ilmaus malli voi heijastaa kohonneeseen hypermetylaation liittyvien oncogenesis [16].

Toisaalta, tämä tutkimus osoittaa, että enemmän geenejä näyttävät olevan säädellään ylöspäin siirryttäessä adenooma ja adenokarsinooma (taulukko S1) . Tämä havainto saattaa heijastaa taustalla lisääntynyt histologisia monimutkaisuus syövän verrattuna adenooma kudokseen tai enemmän mielenkiintoisesti, voi osoittaa suhde lisääntyneenä määränä ilmaistuna geenien ja eteneminen invasiivisen fenotyypin ja etäpesäke. Suurin ryhmä (14%) geenien säädelty syövän verrattuna adenoomia ovat peräisin kollageeni perheen mutta luettelo sisältää myös neljä erilaista lajia matriisi metaloproteinases viittaa lisääntyneeseen aktiivisuuteen geenien kanssa invaasion potentiaali (taulukko S1).

Lisäksi tässä tutkimuksessa mukana suunnittelussa mukautetun mikrosirun, joka sisälsi joukon geenejä, jotka osoittavat adenoomia voidaan erottaa syöpään yksilöt perustuu geeniekspressiomalleja (kuvio 1 B). Nämä tulokset tukevat käsitystä, että ei vain neoplastisen geenien ilmentymisen allekirjoitus konservoitunut löytämisen ja validointitiedot mutta myös adenooma vs. syöpä ilmaisu allekirjoitus on samoin säilynyt. Emme ole tietoisia mistään edellisen geenin ilmentymisen tutkimus, joka on osoittanut kykyä erottaa ei-neoplasia pre-invasiivisia neoplasian ja invasiivisen fenotyyppejä. Tämä valinta Geenien avaa tien tunnistamiseksi biomarkkerit käyttöön herkkä ja havaitsemiseen adenoomien.

Toinen Tämän tutkimuksen tavoitteena oli tutkia, onko valittu ehdokas biomarkkereita löydettiin kudosten olivat havaittavissa ja ilmennetty eri plasmassa potilailla, joilla on adenoomien tai peräsuolen syöpä verrattuna ei-neoplastisia ohjaus plasma. Tämä vaihe on ratkaiseva käännös kudoksen tuloksensa kliinisesti hyödyllinen päätepisteitä. Muussa tapauksessa merkki löytö on aloitettava diagnostisia kliinisissä näytteissä (esimerkiksi veren) joka aiheuttaa suurempia haasteita kuin aloittaen suhteellisen RNA-rikas tuore kudosta. Tässä raportissa kuvataan proof-of-concept plasma-pohjainen qPCR menetelmällä, joka mittaa mRNA-transkriptit

KIAA1199

geeni tuntemattoman funktion että me vahvistamme ilmentyä erilailla sekä kudosten ja plasma syövän ja adenooma potilaille.

biomarkkereita ja peräsuolen kasvainten

on suuri ja kasvava kirjallisuus paksusuolen geeniekspression liittyviä kokeiluja [17], [18]. Tutkimuksessa esitetään tässä ulottuu ja jolla parannetaan kyseisen elimen työtä. Suhteellisen suuri meta-analyysin Chan et ai. 25 geenin ilmentymisen löytö liittyviä tutkimuksia peräsuolen syöpä tunnistettu viisi geeniä olevan säädellään ylöspäin vähintään seitsemän erillistä määritystä lukien

TGFBI

,

IFITM1

,

MYC

,

SPARC

,

GDF15

[17]. Kaikki viisi näistä geeneistä vahvistettiin olevan säädellään ylöspäin tutkimuksessamme.

Harvat tutkimukset puuttua ilmaisun eroja peräsuolen adenoomien ja normaali peräsuolen kudokseen. Galamb et ai. käytetyt mikrosiruja tunnistaa joukko kolme geeniä (

KIAA1199

,

FOXQ1

, ja

CA7

), jotka ilmentyvät eri adenoomissa suhteessa normaaliin valvontaa, sekä joukko viisi geeniä (

VWF

,

IL8

,

CHI3L1

,

S100A8

, ja

GREM1

), joka voisi syrjiä syöpä kudoksia terveillä [19]. Näistä geeneistä, meidän tutkimuksessa todettiin, että

KIAA1199

,

FOXQ1

ja

IL8

oli differentiaalisesti ilmaistut adenoomien (ja syövät) suhteessa normaaliin valvontaa.

KIAA1199

Tämä tutkimus vahvistaa aiemmat raportit että

KIAA1199

osoittaa kohonnut mRNA ilmaisun precancerous adenoomien, ylös-asetus, joka jatkuu syöpäkudoksessa [14]. Tämä geeni oli myös yksi alkuun merkkiaineiden tunnistetaan Marra laboratoriossa kuin aiemmin tuntematon kohde Wnt aiheuttaman ilmaisun ja mahdollinen uusi biomarkkereiden peräsuolen neoplasia. Sabates-Bellver et ai. osoitti, että

KIAA1199

ilmentyminen normaalissa limakalvon rajoittui soluihin alaosaan suolen kryptojen, kun taas kohonnut

KIAA1199

ekspressiota havaittiin kaikissa adenoomien, että ne tutkittiin.

rooli

KIAA1199

ei tiedetä, mutta näyttö Wnt-indusoitavuus ehdottaa tämän geenin voi olla osa loppupään lukuisiin Tcf /LEF transkriptionaalisesti aktivoida geenejä, jotka ovat yleisesti levoton ruoansulatuskanavan neoplasia [14] . Mahalaukun adenokarsinooman ilmentävät korkeita

KIAA1199

korreloivat huonommin viiden vuoden eloonjääminen tulosten suhteen niitä potilaita, joilla on alhainen

KIAA1199

ilmaisun [20]. Koolonkarsinoomasoluissa käsitelty selektiivisten COX-2-estäjät osoittavat alensi

KIAA1199

ilmaisun [21], kun taas korkeita

KIAA1199

mRNA korreloivat positiivisesti solujen kuolleisuuteen ihmisen fibroblasteissa [22].

proof-of-concept verikoe adenoomia

huolimatta nopeasti kasvava tietokanta otaksuttu syöpä biomarkkereita, muutamia lupaavia ehdokkaita aikana alkuperäisen keksintötutkimus hengissä myöhemmin validointitesteihin riippumattomien kudoksiin. Vielä pienempi osa ehdokkaista edelleen lupaavilta kun noita geenejä kokeeseen valittu kehittämisen ja kliinisten tutkimusten. Olemme tunnistaneet satoja biomarkkereita ja peräsuolen kasvainten, jotka ovat selvinneet validointi itsenäisissä kliinisissä näytteissä. Yhdelle pakottavia kasvainkudoksessa biologisten merkkiaineiden,

KIAA1199

, olemme myös testannut yhden geenin qPCR määritys, joka osoittaa lupaus kohdella eri plasmanäytteistä kanssa potilailla, joilla on peräsuolen kasvain ja terveistä yksilöistä. Tämä geeni, joka oli yksi monista ”validoitu” geenejä, valittiin lisätutkimuksia perustuu biomarkkereiden suorituskykyä raportoitu täällä, aiemmissa raporteissa joka osoitti

KIAA1199

olevan koholla peräsuolen neoplasian ja koska biologinen toiminta tämän geeni on tuntematon. Plasma

KIAA1199

tasot olivat koholla potilailla, joilla oli kolonoskopia varmistettujen adenoomia tai syöpien vertailuryhmään nähden plasmaa neoplasian-vapaiden yksilöiden, vaikka näennäinen herkkyys Tämän yksittäisen markkerin oli suurempi syöpään kuin adenoomia.

Kuten biomarkkereiden jolla on kyky diagnoosi ei-invasiivisia potilaan näytteitä,

KIAA1199

pitäisi nyt harkita sisällytettäväksi mRNA (ja mahdollisesti proteiini) määritykset ja tutkittu suurempia kliinisissä ja seulonta tutkimuksissa. Erityisen kiinnostavaa on suhde

KIAA1199

ilmaisun eri geneettisen reitit peräsuolen syövän synnyn, kuten

Wnt

signalointireitistä, joita yleisesti levoton peräsuolen syöpiä ja adenoomia.

peräsuolen kasvain on ominaiset malleja geenin ilmentymisen.

KIAA1199

ilmentyy differentiaalisesti neoplastisten kudosten ja

KIAA1199

selostukset on runsaammin plasmassa potilailla, joilla on joko tai kasvaimia kontrolleihin verrattuna.

KIAA1199

ja muut validoitu biomarkkerit Tässä kuvatut takaa arvioida tarkemmin veripohjaisten seulontatestien peräsuolen neoplasia. Keskeinen haaste tämän arvioinnin mukaisesti on myös puuttua testin suhteellinen herkkyydet adenoomien ja syöpien antanut paljon suurempi esiintyvyys hyvänlaatuisia neoplastisten peräsuolen adenoomien verrattuna pahanlaatuinen neoplastisia peräsuolen syöpä.

Materiaalit ja menetelmät

Kaikki microarray data tässä tutkimuksessa käytetty dokumentoitiin mukaisesti MIAME standardien microarray kokeiluja.

Discovery tiedot

peräsuolen kudosnäytteiden käytetään biomarkkereiden löytö kerättiin Genelogic Inc (Gaithersburg, MD, USA) potilailla, joiden kirjallisen suostumuksensa mukaisesti eettinen asetettuja normeja riippumattoman kistusneuvostolta koostuttava tutkijoista ja bioeetikoita jotka eivät olleet työntekijöitä Gene Logic. Kukin toimielin, joka toimitetaan kudosnäytteitä GeneLogic saatu tietoisen suostumuksen kultakin luovuttajalta tai tarvittaessa näiden edustaja, ja täyttänyt asianomaisen Institutional Review Board ja kaikkia soveltuvia lakeja, geeniekspressioprofilointi tiedot mitataan 548 peräsuolen kudosnäytteitä käyttäen Affymetrix HGU133A HGU133B geenilastut (44928 probesets yhdistetty) (Affymetrix, Santa Clara, CA, USA) ja liittyvän kliiniset tiedot ostettiin GeneLogic Inc. Experimental ja kliiniset kuvaukset olivat tarjotaan kaikille siru datatiedostojen lisäksi digitaalisesti arkistoitu mikroskoopilla kuvia kudospreparaatit. Ennen suorittamalla keksintötutkimus näiden tietojen, tiukka laadunvalvonta testaus soveltaa näihin tietoihin. Kaikkiaan 454 mikrosiruja täyttänyt laadunvalvontavaatimukset ja arvosteli sopiva tähän keksintötutkimus. Lisätietoja laadun valvonta perustuu nämä tiedot uudelleen annetaan tukeminen Information S1 Quality Control Analysis. Kuvaus kudoksen fenotyyppien näitä löytö tiedot esitetään taulukossa 3 syöpään fenotyyppiin jaottelun 4.

Fenotyyppikuvaus ilmentymistä kuviot

Lisäksi standardi ero ilmentymisanalyysit otimme käyttöön analyyttinen tekniikka on suunniteltu suodattamaan ilmentyvät eri probeset ehdokkaita transkriptien että me arveltu oli laadullisesti ”kääntyi-on” yhdessä fenotyyppi luokassa ja laadullisesti ”kääntyi-off” in vertailuryhmässä fenotyypin. Tätä menetelmää varten tunnistaminen ”off” geenejä perustui suhteellisen yksinkertainen oletus, että useimmat geenit tietyllä kudoksessa oli

ei

konstitutiivisesti edellä nimellistä suhteellisen alhainen tausta tasolle. Näin ollen microarray suunniteltu hybridisoitumaan koko ihmisen transcriptome ei näin ollen pitäisi esiintyä transkriptio-spesifinen sitoutuminen useimpien probesets tietyssä kokeessa. Kääntäen, fluoresoiva intensiteetti probesets joka hybridisoitui tasapaino ei ilmaissut transkriptien tulisi heijastaa ”epäspesifinen” probeset-transkriptin hybridisaatio. Oletus, että suuri osa probesets mille tahansa koetta ei transkriptio-merkinannoista tarjotaan keinoja arvioida teoreettinen päälle /pois kynnys geenien koko genomin kokeiluja, kuten käytetään tässä löytö. Keskimääräinen ilmentymistaso kaikissa 44928 probesets vuonna 454 löytö mikrosiruja rankattiin ja probeset arvo, joka vastaa 30

persentiili merkitystä koko data valittiin kynnyksen transkription hiljaisuutta. Tämä raja edustaa konservatiivista ylöspäin pyöristetty arvio epäspesifisten tai taustan ilmaisun.

Validation Data: Tissue yksilöt

Kaikille validointi (ts hypoteesin testaus) kokeissa itsenäisesti kerätään tuore kudosnäytteet saatiin tertiäärisen lähetteen sairaalaan kudospankkia (Flinders Medical Centre, Adelaide, SA Australia). Kuvaus tapauksissa käytetään validointitesteihin on esitetty taulukossa 3. Tutkimus hyväksyi tutkimus- ja eettinen komitea paluumuutosta General Hospital ja eettisen komitean Flinders Medical Centre. Kirjallinen potilas suostumus saatiin kunkin kudoksen tutkittu. Kirurginen näytteet kerätään ja käsitellään kuten aikaisemmin on kuvattu [23].

Validation Data: Custom mikrosirujen suunnittelun

Voit testata monia hypoteettisen geenin biomarkkerit tunnistaa löytö analyysejä, mittatilaustyönä mikrosirun, The ”adenooma biomarkkereiden Gene Chip”, valmistettiin (Affymetrix). Kasvain biomarkkereiden Gene Chip array sisältyvät kaikki HGU133-A /B probesets havaitut löytö sekä eksoni tason probesets, jotka eivät olleet tuolloin käytettävissä alkuperäisen löytö harjoituksen. Jokainen HGU133 löytö probeset annetun Adenooma biomarkkereiden Gene Chip oli lisätty huomautusta yhden tai useamman ihmisen geeni symboleja perustuu NCBI käsinkirjoitustyökalut (NCBI36 /hg18) ja nämä geeni symbolit sitten kääntää kartoitettiin takaisin eksonia tason probesets suunnitellut Affymetrix varten HuGene ST 1.0 GeneChip-. Mukautettu microarray sisältyi ”täydellinen-ottelu” probesets vain.

Validation Data: RNA Extraction

fenotyyppinen jakautuminen kudoksiin käytetty validointitesteihin on esitetty taulukossa 3. RNA eristettiin pakastetusta kudoksesta näytteitä Trizol (Invitrogen, San Diego USA) suosittelemia valmistaja. Lyhyesti, pakastetut kudokset homogenisoitiin 300 ul Trizol reagenssia käyttäen modifioitua Dremel pora ja steriili kertakäyttöinen pestles. 200 ui Trizol-reagenssia lisättiin homogenaattiin ja näytteitä inkuboitiin huoneen lämpötilassa (RT: 25 ° C) 10 minuutin ajan. 100 ui (% v /v), kloroformia lisättiin sitten, näytteitä ravisteltiin 15 sekunnin ajan, ja inkuboitiin RT: ssa 3 minuuttia. Vesipitoinen faasi, joka sisältää kokonais-RNA: ta hankittiin sentrifugoimalla 12000 x g 15 min, 4 ° C: ssa. RNA saostettiin sitten inkuboimalla näytteitä huoneenlämpötilassa 10 min ajan 250 ul: isopropanolilla.