Krooninen sairaus

tiivistelmä

Tausta ja tarkoitus

tietoa vaikutusmekanismeista vahvaan tappava vaikutus hiili-ioni nisädesäteilytys syöpäsoluihin kanssa

TP53

tuumorisuppressorigeeniä puutteita .

Materiaalit ja menetelmät

DNA-vaurioita vasteet jälkeen hiili-ionisuihkua tai röntgensäteilytysjakso in isogeenisiin HCT116 kolorektaalisyövässä solulinjoissa ja ilman

TP53

(p53

+ /+ ja p53

– /-, vastaavasti) analysoitiin seuraavasti: solujen selviytymistä klonogeeniset määritystä solukuoleman tilat morfologisia havainto DAPI-värjättyä ytimet, DNA double-säikeen katkoksia (DSB: t) immunovärjäyksellä fosforyloidun H2AX (γH2AX), ja solukierron virtaussytometrialla ja immunovärjäykseen Ser10-fosforyloitu histoni H3.

tulokset

p53

– /- solut vastustuskykyisempi kuin p53

+ /+ solujen X-ray säteilytys, kun taas herkkyydet p53

+ /+ ja p53

– /- solujen hiili-ion beam säteilytys olivat vertailukelpoisia. X-ray ja hiili-ion beam säteilytyksillä pääasiassa indusoi apoptoosin p53

+ /+ solut, mutta ei p53

– /- soluja. P53

– /- solut, hiili-ioni nisädesäteilytys, mutta ei röntgensäteilyn, selvästi aiheuttama mitoosi katastrofin liittyi ennenaikaista mitoosi sisäänkäynnistä kätkeminen pitkän säilytetään DSB 24 tunnin säteilytyksen jälkeisiin.

päätelmät

tehokas mitoottiset katastrofin apoptoosin kestävä p53-vajaiden solujen merkitsee voimakasta syöpäsolu-tappava vaikutus hiili-ionisuihkun säteilytys, joka on riippumaton p53-aseman, mikä viittaa sen biologista etua yli X-ray hoitoon.

Citation: Amornwichet N, Oike T, Shibata A, Ogiwara H, Tsuchiya N, Yamauchi M, et al. (2014) Carbon-Ion Beam Säteilytys osumalla X-Ray hylkivät p53-Null Syöpäsolut aiheuttamalla Mitoottista Katastrofi. PLoS ONE 9 (12): e115121. doi: 10,1371 /journal.pone.0115121

Editor: Peiwen Fei, Havaijin yliopiston Cancer Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 17 heinäkuu 2014; Hyväksytty: 18 marraskuu 2014; Julkaistu: 22 joulukuu 2014

Copyright: © 2014 Amornwichet et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Tällä kirjoittajat vahvistavat, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi- ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat Apurahat-in-tukea opetus-, kulttuuri-, urheilu-, tiede-, ja tekniikka Japanin ohjelmia johtava tutkijakoulut, viljeleminen Global johtajien Heavy Ion Therapeutics ja tekniikan strategisen Young tutkija Overseas vierailut Ohjelma Kiihtyvä aivokierto, ja tieteellisen tutkimuksen innovatiivisia Areas (22131006). Tätä työtä tukivat myös Grants-in-Aid alkaen Japan Society for Promotion of Science nuorten tutkijoiden (B) KAKENHI [10643471]. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Carbon-ioni sädehoitoa on provosoi kiinnostusta alalla syövän hoidossa. Carbon-ionisuihkujen on edullisia ominaisuuksia yli X-ray; ylivoimainen annosjakauma liittyvä terävä Penumbra ja Bragg huippu, ja vahva solu-tappava vaikutus [1], [2]. Suuret lupaavia kliininen tulos hiili-ioni sädehoito on poistaa terapeuttisen vastus syöpäsolujen X-ray sädehoitoa. Esimerkiksi tuore tutkimus, jossa hiili-ioni sädehoito käytettiin potilaiden hoitoon peräsuolen syöpää raportoitu 5-vuoden paikalliset ohjaus ja yleinen eloonjäämisluvut 97% ja 51% post-operative toistuvat tapaukset [3]. Tämä nopeus on parempi kuin 5 vuoden yleinen eloonjäämisluvut (0-40%), joita tyypillisesti saavutetaan tavanomaisilla röntgen- sädehoitoa tai kirurginen resektio [3], [4]. Kuitenkin biologisen perustan vahva soluja tappava vaikutus hiili-ioni nisädesäteilytys X-ray-resistenttejä kasvaimia ei ole selvitetty täysin.

Genetic poikkeavuuksia edistää X-ray vastus syöpäsolujen [ ,,,0],5], [6]. Inaktivoivat mutaatiot tuumorisuppressorigeenin

TP53

edustavat kasvaimen vastus, ja näitä poikkeamia liittyvät huonoon ennusteeseen jälkeen X-ray sädehoidon [7], [8]. P53-proteiini pelaa useita rooleja DNA-vaurioita vastaus (DDR) ja röntgensäteilyn, säätely mukaan lukien solukuoleman polkuja ja solusyklin tarkastuspisteitä [9]. Apoptoosin p53 on keskeinen tekijä, joka vaikuttaa herkkyyteen syöpäsolujen röntgensäteilyn. Useita prekliinisiä ja kliiniset tutkimukset ovat osoittaneet, että

TP53

mutaatiot liittyvät vastus syöpäsolujen röntgensäteilytysjakso terapia [7], [10], [11].

Aiemmat tutkimukset osoittivat, että hiili-ionisuihkun säteilytys tappaa tehokkaasti X-ray-resistenttejä p53-mutantti syöpäsoluja [12–15]. Vaikka mekanismeja tässä prosessissa tutkittiin näissä tutkimuksissa, tulokset olivat ristiriitaisia. Epäjohdonmukaisuudet todennäköisesti johtuu siitä, että jokainen tutkimus keskittyi vain muutamia näkökohtia DDR (esimerkiksi apoptoosin tai solusykliä vastaus) [12] – [15] ja jokainen käyttää syövän solulinjoissa erilaisilla geneettiset taustat; siten, vaikutukset poikkeavuuksia muitakin geenejä

TP53

saattanut peittyä tulokset [12], [13]. Täällä, selventää mekanismeista vahva tappava vaikutus hiili-ion beam Säteilytyksen röntgensäteilytysjakso kestävä syöpäsolujen kanssa

TP53

poikkeamia, suoritimme kattavan tutkimuksen useiden näkökohtien DDR käyttämällä erilaisia of isogeenisen ihmisen syöpäsoluja, jotka poikkeavat toisistaan ​​ainoastaan ​​niiden p53 tila.

Materiaalit ja menetelmät

Solulinjat

paksu- ja peräsuolisyövän HCT116-solut kätkeminen villityyppisen p53 (p53

+ /+) ja sen isogeenisistä p53-null johdannainen (p53

– /-) saatiin tohtori B. Vogelstein Johns Hopkins University. HCT116 p53

+ /+ soluilla on ehjät DNA-vaurioita tarkistuspisteitä [16]. p53 ilmentymistä, ja vaikutukset röntgen- ja hiili-ion beam Säteilytyksen p53 ilmentymistä p53

+ /+ ja p53

– /- solut, tutkittiin immunoblottaus vasta-aineita p53 (Santa Cruz) ja β-aktiini (lastaus valvonta, Cell Signaling Technology) (S1a Fig.). Ei ollut mitään merkittävää eroa väestöstä kahdentumisaika kahden solulinjojen (S1B kuvio.).

Ihmisen paksusuolen syöpä (RKO, LS123, ja WiDr-solut), ihmisen keuhkosyöpä (H1299) solut ja ihmisen osteosarkooma (Saos-2-solut) hankittiin ATCC: ltä. RKO solut satama villityyppisen p53. LS123 ja WiDr solujen satama missensemutaatio p53 klo R175H ja R273H, vastaavasti. H1299 ja Saos-2-solut ovat p53-null. H1299-soluja, jotka ekspressoivat stabiilisti p53 missense-mutaation (R175H, R273H, R249S ja R280K) määritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [17]. Kaikki solut viljeltiin RPMI-1640-väliaineessa, jota täydensi 10% naudan sikiön seerumia.

hTERT-kuolemattomiksi normaali ihmisen diploidi esinahan fibroblastit (BJ-hTERT) kätkeminen villityyppisen p53 hankittiin Clontech. BJ-hTERT solut, jotka ilmentävät shRNA vastaan ​​EGFP (BJ-hTERT-WT; ohjaus) tai p53 (BJ-hTERT-shp53) perustettiin aikaisemmin kuvatulla [18], ja viljeltiin Minimum Essential Eaglen.

Säteilytys

X-ray säteilytys suoritettiin käyttäen Faxitron-yksikköön RX-650 säteilylähde (100 kVp, 1,14 Gy /min; Faxitron-yksikköön Bioptics). Carbon-ion beam säteilytys suoritettiin Gunma yliopistossa Heavy Ion Medical Center käyttämällä samaa palkki tiedot, joita käytetään kliinisissä (290 MeV /nukleoni ja keskimääräinen energiansiirtokyvyn (LET) keskellä 6 cm: levitä-out Bragg huippu on noin 50 keV /um). Hiili-ionisuihkun toimitettiin pystysuorassa suunnassa niin, että solut viljelymaljoille voi vastaanottaa annoksen tasaisesti.

klonogeeninen -eloonjäämiskoe

Solut ympättiin 6-kuoppaisille levyille ja valotettiin (tai ei ) X-ray tai hiili-ionisuihkun säteilytys. Kun on inkuboitu vielä 10 päivää, solut kiinnitettiin metanolilla ja värjättiin kristallivioletilla. Pesäkkeitä vähintään 50 solut laskettiin. Elossa fraktio normalisoitiin vastaavaan valvontaa. Annos, joka johti eloonjääntifraktio 10% (D

10) laskettiin käyttäen lineaarista-neliöllinen mallia, kuten aiemmin on kuvattu [19].

Solukuolemaan arvioinnit

Cells kasvatettiin lasipeitinlevyille, alttiina (tai ei) X-ray tai hiili-ion beam säteilytys, ja värjättiin sitten 4 ’, 6-diamino-2-fenyyli-dihydrokloridi (DAPI), kuten aiemmin on kuvattu [20]. Konfokaaliset kuvat kerättiin käyttämällä BX51 mikroskooppia (Olympus) on varustettu CCD-kamera (VB-7000; Keyence). Apoptoosi määritettiin perustuen morfologiaan ytimet, mukaan lukien läsnäolo apoptoottisten kappaleiden, ydin- tiivistyminen ja pirstoutumista [21]. Solut, jotka sisältävät ytimiä on kaksi tai useampia erillisiä lohkoa pisteytettiin positiivisiksi mitoosi katastrofin [20], [22]. Solut, jotka sisältävät ytimet osoittavat vanhenemista liittyvät heterochromatic pesäkkeitä pisteytettiin positiivisiksi vanhenemista [23]. Prosenttiosuudet apoptoosin alaisten solujen mitoosin katastrofin tai vanhenemista kvantitoitiin laskemalla vähintään 300 solua kutakin kokeellista kunnossa.

Solusyklianalyysiä

altistuneet solut (tai ei) X-ray tai hiili-ion beam säteilytyksen kerättiin osoitetuissa aikapisteissä, kiinteä etanolilla, värjättiin propidiumjodidilla läsnä RNaasi, ja sitten analysoitiin käyttämällä virtaussytometriaa, kuten aiemmin on kuvattu [19].

immunovärjäys

altistuneet solut (tai ei) X-ray tai hiili-ioni nisädesäteilytys värjättiin vasta-aineiden Ser139-fosforyloitiin histoni H2AX (γH2AX; Millipore) tai Ser10-fosforyloitua histoni H3 (pH 3; Millipore), kuten aiemmin on kuvattu [24]. γH2AX pesäkkeitä per ydin pisteytettiin peräkkäisessä 2D otettuja kuvia useilta polttotasojen. Vähintään 500 solua arvioitiin kunkin kokeellisen kunnossa.

Tilastollinen analyysi

Kokeet suoritettiin kolmena kappaleena vähintään ellei toisin mainita. Tilastollisesti merkitseviä eroja ei määritettiin parittomia Studentin

t

-testaukset käyttäen StatMateIII ver. 3,17 ohjelmistot (pankkiautomaatit).

P

0,05 pidettiin merkittävänä.

Tulokset

Carbon-ionisuihkujen on voimakkaampi syöpäsolu-tappamisen aktiivisuutta kuin röntgensäteilyä riippumatta p53:

herkkyydet p53

+ /+ ja p53

– /- HCT116 solujen röntgen- ja hiili-ioni nisädesäteilytys arvioitiin klonogeeniset eloonjäämisen määritykset (Fig. 1). Kuten odotettua perustuu tuloksiin aikaisempia tutkimuksia [14], [15], p53

– /- solut olivat resistenttejä röntgensäteilytysjakso kuin p53

+ /+ soluja; D

10 arvot näiden kahden solulinjan oli 6,8 Gy ja 3,8 Gy, vastaavasti. Sitä vastoin herkkyydet p53

+ /+ ja p53

– /- solut hiili-ion nisädesäteilytys olivat vertailukelpoisia; D

10-arvot näissä solulinjoissa oli 1,7 Gy ja 1,9 Gy, vastaavasti. Näin ollen, suhteellinen biologinen tehokkuus hiili-ionisuihkun säteilytys X-ray säteilytys D

10 oli 2,2 p53

+ /+ -solujen ja 3,6 p53

– /- soluja. Nämä tiedot osoittavat, että hiili-ionisuihkun säteilytys tappaa tehokkaasti X-ray-resistenttejä

p53

-null syöpäsoluja.

Solut ympättiin 6-kuoppalevyille, niitä inkuboitiin yön yli, ja sitten altistettiin röntgen- tai hiili-ionisuihkun säteilytys. Kun on inkuboitu vielä 10 päivää, solut kiinnitettiin, värjättiin ja laskettiin. Elossa fraktio normalisoitu arvo vastaavan valvonnan. Tiedot ilmaistaan ​​keskiarvona ± SD. C-ioni, hiili-ioni.

Aberrations p53 muuttaa muotoa säteilyn aiheuttama syöpä solukuolemaa apoptoosin mitoottisiin katastrofin

tutkia mekanismeista p53 TILA- itsenäinen solu-tappavaa aktiivisuutta, hiili-ionisuihkun säteilytys, tilat solukuoleman aiheuttama X-ray tai hiili-ioni nisädesäteilytys arvioitiin (kuviot. 2, 3). p53

+ /+ ja p53

– /- solut säteilytettiin annoksilla röntgen- tai hiili-ionisuihkun jotka olivat samanlaisia ​​kuin D

10 p53

+ /+ soluja (X ray, 4 Gy, hiili-ionisuihkun 1,5 Gy). Apoptosis, mitoosi katastrofi ja vanhenemista määritettiin tutkimalla ominaisuus morfologioita ydinten värjättiin DAPI (Fig. 2a-c) [20] – [23]. P53

+ /+ solujen apoptoosin oli hallitseva muoto solukuolema, X-ray ja hiili-ionisuihkun säteilytys (kuviot. 2d, f, 3a). Sitä vastoin p53

– /- solut olivat vähemmän herkkiä apoptoosin aiheuttaman molempia säteilytys (kuviot. 2e, g, 3b). Mielenkiintoista on, että p53

– /- solut, hiili-ionisuihkun säteilytys indusoi mitoosi katastrofin enemmän ilmeisesti kuin röntgensäteilytyksen (kuviot. 2 g, 3b). Suurempi annos röntgensäteilytysjakso vastaa D

10 (6,8 Gy) ja p53

– /- solut indusoi samantasoisen mitoosi katastrofin että aiheuttama hiili-ion beam säteilytys 1,5 Gy (S2 Kuva.). Induktion Vanheneminen ei ollut ilmeistä kaikissa koeolosuhteissa (Fig. 2). Tämä tulos vahvistettiin vanhenemista liittyvä β-galaktosidaasi värjäys määrityksissä, joissa osa värjäys-positiivisten solujen oli vähemmän kuin 2% sekä solulinjoja altistettiin X-ray tai hiili-ionisuihkun säteilytys (tuloksia ei ole esitetty). Nämä tiedot osoittivat, että apoptoosin ja mitoosi katastrofin on suuren tilan solukuoleman p53

+ /+ -solut ja p53

– /- solut, vastaavasti, sekä altistumisen jälkeen X-ray ja hiili-ionisuihkua säteilytys, ja että hiili-ionisuihkun säteilytys indusoi mitoosi katastrofin tehokkaammin kuin röntgensäteilyn apoptoosin kestävä p53

– /- solut.

solut ympättiin lasipeitinlevyille inkuboitiin yön yli, altistetaan (tai ei; 0 h) X-ray (4 Gy) tai hiili-ion beam (1,5 Gy) säteilytys, ja sitten värjättiin DAPI. Apoptosis, mitoosi katastrofi, ja vanhenemista määritettiin mukaan ominaisuus ydinaseiden morfologioita (katso ”Materiaalit ja menetelmät” määritelmät). (A-c) edustaja kuvat osoittavat ydin- morfologia solujen apoptoosin (a), mitoottinen katastrofin (b), tai vanhenemista (c). Kuvat p53

– /- solut otettiin 72 tunnin kuluttua hiili-ionisuihkun säteilytys. (D, e) tila solukuoleman p53

+ /+ (d) ja p53

– /- (e) soluihin 0, 12, 24, 48, 72, 96 ja 120 tunnin kuluttua X- ray säteilytys. (F, g) tila solukuoleman p53

+ /+ (f) ja p53

– /- (g) soluja 0, 12, 24, 48, 72, 96 ja 120 h kuluttua hiili ion beam säteilytys. IR, säteilytys; C-ioni, hiili-ioni.

Solut ympättiin lasipeitinlevyille, inkuboitiin yön yli, altistettiin hiili-ionisuihkuilla (1,5 Gy), ja värjättiin sitten DAPI 72 tuntia myöhemmin. Apoptosis, mitoosi katastrofi, ja vanhenemista määritettiin mukaan ominaisuus ydinaseiden morfologioita (katso ”Materiaalit ja menetelmät” määritelmät). (A) p53

+ /+ solut: 12,5%, 0% ja 0% soluista osoitti apoptoosin, mitoosi katastrofi, ja vanhenemisen merkkejä, tässä järjestyksessä. (B) p53

– /- solut: 0%, 12,8% ja 0% soluista osoitti apoptoosin, mitoosi katastrofi, ja vanhenemisen merkkejä, tässä järjestyksessä. Nuolet (a) ja (b) osoittavat apoptoosin alaisten solujen ja mitoosi katastrofi, vastaavasti. Mittaviivat 10 pm.

Tämän tutkimiseksi tarkemmin, tarkastelimme tila solukuoleman usean ihmisen solulinjoissa eri p53 asema jälkeen röntgen- tai hiili-ion beam säteilytys (Fig. 4 ). RKO -solut villityyppisen p53 osoitti apoptoosin-hallitseva fenotyyppi jälkeen joko röntgen- tai hiili-ioni nisädesäteilytys, kun taas p53-null H1299 ja Saos-2-solut osoittivat mitoosi katastrofi-hallitseva fenotyyppi. Niinpä tukahduttaminen p53 ilmentymistä BJ-hTERT fibroblastit edisti mitoottiset katastrofin upon röntgen- tai hiili-ioni nisädesäteilytys (S3 kuvassa.). Mielenkiintoista, LS123 ja WiDr soluja (ilmentävät p53 kätkeminen missense klo R175H ja R273H, vastaavasti), osoitti myös mitoosi katastrofi-hallitseva fenotyyppi (Fig. 4). Nämä mutaatiokohdat sijaitsevat DNA: ta sitovan domeenin p53-proteiinin, jolla on keskeinen rooli transkriptionaalisessa aktivaatiossa useiden kohdegeenien, jotka ovat mukana apoptoosin [25]. Siksi tutkimme seuraavaksi tila säteilytyksen indusoiman solukuoleman käyttämällä sarjaa isogeenisten H1299-soluja, jotka ekspressoivat stabiilisti p53-proteiinien kätkeminen missense mutaatioita DNA: ta sitovan domeenin, joka on havaittu usein ihmisen syövissä (eli R175H, R273H, R249S ja R280K ) [25]. Kaikki nämä solulinjat osoittivat mitoosi katastrofin hallitseva fenotyypin säteilytys (Fig. 5). Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että toimintahäiriö p53 DNA: ta sitovan domeenin vaihtaa tilaa säteilytyksen aiheuttaman syöpäsolun kuoleman apoptoosin mitoottisiin katastrofin. Nämä tulokset vahvistavat myös, että hiili-ioni nisädesäteilytys oli parempi kuin röntgensäteilyn on saada mitoosi katastrofin syöpäsoluissa kätkeminen poikkeava p53.

Solut lasipeitinlevyille, inkuboitiin yön yli, säteilytetään röntgenkuvat ( D

10 annosta) tai hiili-ionisuihkuilla (D

10 annosta), ja sen jälkeen värjättiin DAPI 72 tuntia myöhemmin. Apoptosis, mitoosi katastrofi, ja vanhenemista määritettiin mukaan ominaisuus ydinaseiden morfologioita (katso ”Materiaalit ja menetelmät” määritelmät). Tiedot ilmaistaan ​​keskiarvona ± SD. Ap, apoptoosin; MC, mitoosi katastrofi; SNS, vanhenemista; IR, säteilytys; C-ioni, hiili-ioni.

Solut lasipeitinlevyille, inkuboitiin yön yli, säteilytetään röntgenkuvat (10,9 Gy, D

10 röntgensäteitä tai 3,8 Gy, D

10 hiili-ionisuihkujen) tai hiili-ionisuihkuilla (3,8 Gy, D

10 hiili-ionisuihkujen), ja sen jälkeen värjättiin DAPI 72 tuntia myöhemmin. Apoptosis, mitoosi katastrofi, ja vanhenemista määritettiin mukaan ominaisuus ydinaseiden morfologioita (katso ”Materiaalit ja menetelmät” määritelmät). Tiedot ilmaistaan ​​keskiarvona ± SD. MC, mitoosi katastrofi; C-ioni, hiili-ioni; IR, säteilytys. Huomaa, että osa p53-null H1299 paneeli on sama kuin kuviossa. 4 (mutta yhteydessä on nyt erilainen).

Solut vapautuu säteilyn aiheuttamien G2 /M pidätyksen 24 h kuluttua röntgen- tai hiili-ion nisädesäteilytys

Mitoottista katastrofi ajatellaan tapahtuvan, kun solut etenevät poikkeavien mitoosin korjaamattomat DNA-vaurioita [26]. Siksi tutkia mekanismia taustalla mitoottiset katastrofin p53-null-soluissa hiili-ioni nisädesäteilytys, vaikutukset röntgen- ja hiili-ion beam Säteilytyksen solusyklin statukset p53

+ /+ ja p53

– /- HCT116-soluja määritettiin virtaussytometrialla (Fig. 6a, b). Kuten solukuoleman analysoi solut säteilytettiin annoksilla röntgen (4 Gy) tai hiili-ionisuihkuilla (1,5 Gy). Induktion G2 /M pidätyksen että huipussaan 12 tunnin säteilytyksen jälkeen havaittiin molemmissa solulinjoissa jälkeen röntgen- tai hiili-ioni nisädesäteilytys, joka selvempää p53

– /- solut kuin p53

+ /+ solut. Erityisesti, sekä solulinjoja altistettiin X-ray tai hiili-ionisuihkua säteilytys, G2 /M pidätys on täysin vapautettu 48 h säteilytyksen jälkeen.

Solut ympättiin 35 mm: n viljelylevyillä (a, b) tai lasipeitinlevyille (c), inkuboitiin yön yli, ja altistuvat (tai ei; 0 h) X-ray (4 Gy) tai hiili-ionisuihkun (1,5 Gy) säteilytys. (A, b) solut säteilytetään röntgensäteillä (a) tai hiili-ionisuihkun (b) inkuboitiin 0, 12, 24, 48, 72, 96 tai 120 tuntia, kiinteä etanolilla, värjättiin propidiumjodidilla, ja solusyklin tilan analysoitiin virtaussytometrialla. (C) Soluja säteilytetty röntgensäteillä tai hiili-ionisuihkun inkuboitiin 1 tunnin, ja sitten suoritettiin immunovärjäyty- varten pH-arvoon 3, erityinen merkki M olevilla soluilla. Tiedot ilmaistaan ​​keskiarvona ± SD. *

P

0,05 ja †

P

0,01 verrattuna vastaaviin kontrolleihin. IR, säteilytys; C-ioni, hiili-ioni.

Seuraavaksi prosenttiosuudet p53

+ /+ ja p53

– /- solut M vaiheessa ennen ja jälkeen X-ray (4 Gy) tai hiili-ionisuihkun (1,5 Gy) säteilytyksen arvioitiin immunovärjäyksellä käyttäen vasta-ainetta vastaan, pH-arvoon 3 (kuvio. 6c) [24]. Noin 2% ei säteilytetty p53

+ /+ ja p53

– /- solut olivat M vaiheessa. Yksi tunti sen jälkeen, kun hiili-ionisuihkua säteilytys, prosenttiosuudet näiden solujen M-vaiheessa oli vähentynyt huomattavasti, vaikka p53

– /- solut olivat vähemmän herkkiä kuin p53

+ /+ solujen X-ray säteilytys. Erityisesti 24 h jälkeen röntgen- tai hiili-ionisuihkua säteilytys, prosenttiosuudet p53

+ /+ ja p53

– /- solut M vaiheessa talteen perusuran, mikä viittaa siihen, että molemmat solulinjat uudelleen mitoosin 24 h käsittelyn jälkeen.

DNA double-säikeen katkoksia syntyy hiili-ioni nisädesäteilytys osoittavat hitaampaa korjaus kinetiikka kuin tuottaman röntgensäteilyn

Lopuksi korjaus kinetiikka DNA double säikeen tauot (DSB: t), kaikkein vaarallisin tyyppi DNA-vaurioita syntyy ionisoivaa säteilytystä, tutkittiin p53

+ /+ ja p53

– /- HCT116-soluissa [27]. Säteilytettyjä soluja altistettiin immunovärjäyksellä käyttäen vasta-ainetta vastaan ​​γH2AX, ja numerot γH2AX pesäkkeitä solua kohden 15 min ja 24 tuntia säteilytyksen jälkeen laskettiin (Fig. 7, S1 taulukko) [24], [28]. Solut säteilytetään 2 Gy annoksen röntgen- tai 1 Gy annoksen hiili-ionisuihkujen; näillä annoksilla määrä γH2AX pesäkkeitä solua kohden ohjaus aikapisteessä (15 min jälkisäteilytys) oli noin 20-30, mikä oli asianmukainen arvioitaessa [24], [28]. Kaksikymmentä neljä tuntia röntgensäteilyn, numerot γH2AX pesäkkeitä p53

+ /+ ja p53

– /- solut 24 ± 4,3% ja 23 ± 5,3%: lla vastaavan valvonnan (klo 15 min ajankohtana), vastaavasti (Fig. 7a, b), mikä osoittaa, että suuri määrä DSB tuottaman röntgensäteilyn korjattiin 24 tunnin sisällä. Sitä vastoin 24 h kuluttua hiili-ionisuihkua säteilytys, numerot γH2AX pesäkkeitä p53

+ /+ ja p53

– /- solut 93 ± 11% ja 85 ± 7,3% näistä vastaavan valvonnan vastaavasti (Fig. 7a, c), mikä osoittaa, että DSB tuottama hiili-ioni nisädesäteilytys ei korjata tehokkaasti, johtunee rakenteellinen monimutkaisuus DSB päättyy [29]. Todellakin, p53

+ /+ ja p53

– /- solut, jotka värjätty kaksinkertainen positiivinen γH2AX ja pH 3 havaittiin 24 tunnin kuluttua hiili-ion beam säteilytys, joka osoittaa, että solut kätkeminen DSB oli tullut mitoosin (Fig. 7d). P53 tila ei vaikuttanut kinetiikkaa menetys γH2AX pesäkkeitä jälkeen röntgen- tai hiili-ionisuihkun säteilytys. Yhdessä nämä tiedot viittaavat siihen, että p53-null-solut kätkeminen korjaamatta DSB syöttää mitoosia 24 h kuluttua hiili-ion beam säteilytys, joka johtaa mitoottisiin katastrofin.

Solut lasipeitinlevyille, inkuboitiin yön yli, altistuu X- säteet (2 Gy) tai hiili-ionisuihkun (1 Gy), niitä inkuboitiin vielä 15 min tai 24 h, ja sitten suoritettiin immunovärjäys γH2AX ja pH-arvoon 3. Sitten solut värjättiin DAPI. (A) Numerot γH2AX pesäkkeitä solua kohden 15 minuuttia tai 24 tuntia säteilytyksen jälkeisiin. Tulokset kustakin solulinjasta normalisoitiin määrä γH2AX pesäkkeestä 15 min ajankohtana. Ainakin 500 solut laskettiin per koeolosuhteissa. Tiedot ilmaistaan ​​keskiarvona ± SD. *

P

0,05 verrattuna vastaavaan näytteitä 15 min. (B, c) edustaja mikroskooppiset kuvat, joissa ytimet altistetaan X-ray (b) tai hiili-ionisuihkun (c) säteilytys, ja immunovärjättiin γH2AX. Kussakin paneelissa ääriviivat ytimen havaitaan DAPI-värjäyksellä on osoitettu katkoviivalla. (D) edustaja mikroskooppiset kuvat ytimet altistetaan hiilen-ioni nisädesäteilytys ja immunovärjättiin γH2AX ja pH 3 24 tunnin post-säteilytys. Nuolet osoittavat kaksinkertainen positiivinen ytimiä. C-ioni, hiili-ioni.

Keskustelu

Tässä osoitamme, että hiili-ion beam säteilytys indusoi erilaisuudeen solukuoleman mukaan mutaatio aseman

TP53

. Kun molemmat X-ray ja hiili-ioni nisädesäteilytys, apoptoosin oli hallitseva tila solukuolemaa p53

+ /+ solut, mutta ei p53

– /- soluja. Erityisesti määrä mitoosi tulon ja kinetiikka DSB korjaus säteilytyksen jälkeen, joka voi olla keskeisiä tekijöitä, jotka indusoivat mitoosi katastrofi, olivat samanlaisia ​​p53

+ /+ ja p53

– /- solut riippumatta tyypistä säteilytys käytetty. Nämä tiedot osoittavat, että apoptoosin on ensisijainen rooli syöpäsolujen kuolemasta säteilyttämällä läsnä ollessa p53. Koska p53: n, syövän solut osoittivat resistenssiä apoptoosin ja mitoosi katastrofin jälkeen havaittiin sekä X-ray ja hiili-ionisuihkun säteilytys. Tämä havainto on todennäköisesti selittää rajoitus G2 /M tarkastuspiste säteilytyksen jälkeen. Aktivointi Tämän tarkistuspisteen mahdollistaa vaurioituneen DNA ennen sen välitetään tytär soluja ja muodostaa esteen estää ennenaikaista pääsyn mitoosiin [30]. Aikaisemmat tutkimukset ovat osoittaneet, rajoittamisesta G2 /M tarkastuspiste jälkeen IR; G2 /M tarkastuspiste vapautuu, kun määrä DSB on alhaisempi kuin ~10-20, jota seuraa mitoosi tulo [24], [31]. Sen jälkeen G2 /M tarkastuspiste release, solut kätkeminen 10-20 DSB pystyvät saattamaan mitoosi tapahtuma ja anna G1 vaiheeseen [32], [33]. DSB korjaus on vaimentua siinä M vaiheessa; Siksi, tämä vahinko korjataan seuraavassa solusyklin, vaikka korjausprosessin tytärsoluksi vielä selvittämättä [34]. Toinen mahdollinen syy tehokkaaseen mitoottiset katastrofin p53

– /- solut on suurempi taipumus näiden solujen Sakkaukseen G2 /M vaiheessa säteilytyksen jälkeen kuin p53

+ /+ soluja. Tämä G2 /M vaiheessa kerääntyminen on seurausta viasta p53-p21 signalointireitin vaimentavaa G1 pidätyksen jälkeen säteilytys [16]. Tämä ominaisuus p53 puutteesta syöpäsoluja saattaa lisätä mahdollisuus säteilytettyjen solujen kätkeminen korjaamatta DSB syöttämällä mitoosia, joka johtaa lisälaitteen mitoosi katastrofin.

tulokset Tämän tutkimuksen mukaan molemmat puute p53 ja missense mutaatioita p53 edistää siirtymistä apoptoosin mitoottisiin katastrofin. Kaiken kaikkiaan 75% p53 mutaatioiden tunnistettu ihmisen syövissä ovat yhden missensemutaatioita. Useimmat aminohapot, joiden mutaatiot, mukaan lukien ne, joita tarkasteltiin esillä olevassa tutkimuksessa, sijaitsevat p53 DNA: ta sitova domeeni, jolla on keskeinen rooli transkriptionaalisessa aktivaatiossa monien kohdegeenien, mukaan lukien ne, jotka indusoivat apoptoosin [25]. Useimmat mutantti p53-proteiinien on dominanttinegatiivivaikutus, johtaa toimintahäiriöön jäljellä normaalia p53-proteiineja. Näin ollen, se on kohtuullista, että yhdessä puuttuminen p53, joiden mutaatiot p53-DNA: ta sitova domeeni edistää myös apoptoosin kestävä fenotyypin häiritsemällä kyky normaali p53-proteiinien transkriptionaalisesti aktivoida apoptoosiin liittyvien geenien; Tämä saattaa tehdä säteilytettyjä soluja kätkeminen korjaamatta DSB alttiimpia mitoottisiin katastrofin. On kuitenkin syytä huomata, tutkimus rajoitus tässä vaiheessa: emme pystyneet luomaan H1299 soluihin, jotka ilmentävät villityyppistä p53 (joko ohimenevästi tai pysyvästi); Näin ollen, vertailu villityyppisen p53: n ja mutantti-p53 oli mahdotonta. Tulevaisuuden tutkimukset pitäisi verrata tila säteilytys aiheuttaman solukuoleman isogeenisiin solulinjoissa kätkeminen villityypin, mutantti, ja nolla-p53.

On huomioitava, että tässä esitetyt tulokset osoittavat tehokasta mitoottiset katastrofin hiili ionisuihkua säteilytys p53-null ja p53-mutanttisoluista. Itse asiassa kaikki p53-null ja p53-mutantin solujen linjat testattu annos, joka vaaditaan aiheuttamaan tietyn tason mitoosi katastrofin oli ilmeisesti pienempi hiili-ioni palkit kuin röntgenkuvat. Tämä tulos voidaan selittää ongelmat, jotka liittyvät korjaus DSB syntyy hiili-ioni nisädesäteilytys, jotka säilyttävät monimutkaisempia rakenteita vaurioitunut DNA päättyy kuin tuottama röntgensäteilytys [35]. Tehoton DNA vahinkosaneeraus aiheuttama monimutkaisuus DSB päät voidaan taustalla tehokas solu-tappava vaikutus hiili-ioni nisädesäteilytys syöpäsoluihin kätkeminen p53 poikkeavuuksia.

kuvatut tulokset tässä ovat osittain ristiriitaisia ​​kuin edellisten tutkimukset, joissa tutkittiin DDR jälkeen hiili-ionisuihkun säteilytys p53-mutantin syöpäsoluja. Vaikka muutamissa tutkimuksissa havaittu tehokas apoptoosin (S2 taulukko) [12] – [15], on huomattava, että tämä tila on solukuolema oli vain indusoi tehokkaasti LET arvo on suurempi kuin 70 keV /um. Sitä vastoin keskimääräinen LET arvo keskellä kliinisesti käytetty levinnyt-out Braggin huippu, kuten käytetään tässä, on noin 50 keV /um. Lisäksi, toisin kuin tulokset on kuvattu tässä, induktio vanhenemista ja pitkäaikainen (yli 3 päivää) G2 /M pidätys on havaittu myös aiemmissa tutkimuksissa käytetään hiili-ionisuihkun säteilytys suuri LET-arvot [12], [36] . Nämä tiedot viittaavat siihen, että DDR vaihtelee riippuen LET arvoon hiili-ioni nisädesäteilytys käytetty. Muita

in vitro

ja

in vivo

tutkimuksissa erilaisia ​​solulinjoja edellytetään vahvistamaan terapeuttisia vaikutuksia hiili-ion beam säteilytys LET käytetty kliinisissä ympäristöissä.

Yhteenvetona, tämä kattava analyysi DDR säteilytettyyn isogeenisiin solulinjoissa osoittaa, että röntgensäteilyn kestävä p53-null syöpäsolut ovat herkkiä hiili-ion beam säteilytys, joka tehokkaasti indusoi mitoottisia katastrofi (Fig. 8). Induktio mitoosi katastrofin apoptoosin vastustuskykyisten kasvainten voi olla tärkeä biologinen etu hiili-ioni sädehoito yli X-ray sädehoitoa. Lisätutkimukset käyttäen eläinmalleja tai kliinisiä näytteitä tarvitaan selvittämään asiaa tarkemmin.

C-ioni, hiili-ioni.

tukeminen Information

S1 Kuva. Etsinnän p53

+ /+ ja p53

– /- solut.

doi: 10,1371 /journal.pone.0115121.s001

(PDF)

S2 Kuva.

tilat solukuoleman aiheuttama röntgensäteilytysjakso varten D

10 HCT116 p53

– /- solut.

doi: 10,1371 /journal.pone.0115121.s002

( PDF)

S3 Fig.

tilat solukuoleman aiheuttama röntgen- tai hiili-ion beam säteilytys BJ hTERT-WT tai -shp53 soluja.

doi: 10,1371 /journal.pone.0115121.s003

(PDF)

S1 Taulukko.

lukumäärä γH2AX pesäkkeitä per solu jälkeen säteilytyksen.

doi: 10,1371 /journal.pone.0115121.s004

(PDF)

S2 Taulukko.

LET-riippuvuus tehon apoptoosin induktion hiili-ioni nisädesäteilytys p53-mutantin syöpäsoluja.

doi: 10,1371 /journal.pone.0115121.s005

(PDF) B

Kiitokset

Kiitämme tohtori Tetsushi Sadakata, tohtori Kohta Torikai, ja tohtori Mayumi Komachi (Gunma yliopisto) teknistä tukea. Kiitämme tohtori Volgenstein (Johns Hopkins University) tarjoamiseksi solulinjat.