Krooninen sairaus

tiivistelmä

Huolimatta olennainen vitamiini, folaatti on ollut mukana parantaa kasvaimen kasvuun, mistä on osoituksena raportit yli-ilmentyminen folaatti reseptorin alfa (FRα) syövissä. Rooli toisen folaatin kuljettajaa, folaatinkuljettajaproteiinin (RFC), ei juurikaan tunneta. Tässä tutkimuksessa selvitettiin roolit folaatin, FRα ja RFC munasarjojen syöpiä. Osoitimme FRα mRNA ja proteiini yli-ilmentymisen ja vähentää RFC ilmentyminen yhdessä FRα geenin monistuminen ja RFC promoottori hypermetylaation, vastaavasti. FRα yliekspressio liittyi taudin etenemiseen, kun RFC ilmaisu aiheutuneet suotuisa kliininen tulos. Tällainen vastavuoroinen ilmentymiskuvio havaittiin myös munasarjasyövän solulinjoissa. Folaatti osoitettiin edistää syöpäsolujen lisääntymistä, muuttoliike ja invaasio

in vitro

, ja alas-säädellä E-kadheriinin ilmentymisen. Tämä vaikutus estettiin jälkeen joko ennallaan knockdovvn FRα tai kohdunulkoisen yliekspressio RFC. Tämä tähän asti ilmoittamattoman ilmiö viittaa siihen, RFC voi toimia tasapainottavana kumppanina FRα ja antaa suojaava vaikutus potilailla, joilla on korkea FRα ilmentävien munasarjakarsinoomat, osoituksena niiden pitkäaikainen yleistä ja taudista vapaan eloon jäämisestä. Lopuksi me raportoimaan paradoksaalinen vaikutus FRα (otaksuttu onkogeeninen) ja RFC (otaksuttu kasvain ehkäisevästä) ihmisen syöpäsairauksia. FRα ja RFC voidaan mahdollisesti tutkittava terapeuttisena kohteena tai ennustetekijöiden merkki vastaavasti. Suosittelemme varovaisuutta ja lisätutkimukset folaatin täydentää syöpäpotilailla.

Citation: Siu MKY, Kong DSH, Chan HY, Wong ESY, Ip PPC, Jiang L, et al. (2012) Paradoksaalista vaikutus Kaksi Folate reseptorien, FRα ja RFC, munasarjasyövässä: Vaikutus Cell Proliferation, invaasio ja kliinistä hyötyä. PLoS ONE 7 (11): e47201. doi: 10,1371 /journal.pone.0047201

Editor: Ming Tat Ling, Queensland University of Technology, Australia

vastaanotettu: 1. kesäkuuta, 2012 Hyväksytty 10 syyskuuta 2012 mennessä; Julkaistu: 07 marraskuu 2012

Copyright: © 2012 Siu ym. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat rahoitusta American Institute for Cancer Research Post doc Award ja University of Hong Kong Seed rahoitus, ja konferenssi ja tutkimus Grant yliopistosta Hong Kong. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

munasarjakarsinoomat osuus korkein kuolleisuuden kaikki gynekologisiin syöpiin maailmassa [1], [2]. Vaikka munasarjojen karsinoomien vaihtelee eri etnisten ryhmien välillä, sen esiintyvyys Aasian maissa on kasvussa [3], [4]. Syyt tähän ovat edelleen suurelta osin tuntematon tai kiistanalainen. Useat elintapoihin liittyviä riskitekijöitä ovat sekaantuneet. Näihin kuuluvat ruokavalio, ylipaino, hedelmällisyyden ja pariteetti statukset. Toisaalta, se on tullut yleinen uskomus, että suuri saanti hivenaineita, kuten folaatin, C-vitamiini, E-vitamiini voi suojata syöpiä [5]. Sinänsä ymmärtää paremmin vaikutuksia ravintoarvoa karsinogeenisuutta on tärkeää parantaa strategioita syövän ehkäisyyn ja hallintaan.

Folaatti on vesiliukoinen B-vitamiini esiintyy useimmissa vihanneksia. Korkea ravinnosta folaatin saanti on raportoitu yhdistää pienempi riski sairastua munasarjojen syöpien, erityisesti ne, jotka käyttävät alkoholia [6], [7], [8], [9]. Se liittyy läheisesti sen tehtävään DNA-synteesiin ja sen osallistumista siihen liittyvä metioniini metaboliareitti välttämätön DNA: n metylaatio. Folaatin puute olisi siis johtaa DNA hypometylaatio, muuttunut geeniekspressiota ja väärinliittymistä urasiilin DNA: ksi, mikä johtaa kromosomivaurio, jotka kaikki ovat avaintekijöitä syövän synnyn [10], [11]. Näyttäisi siltä, ​​että folaatin on tärkeä vitamiini välttämätön normaalin toiminnan solujen, ja estää aloittamisen syöpä. On kuitenkin yhä enemmän näyttöä siitä, että folaatin voi itse asiassa parantaa syövän etenemistä perustettu karsinoomat paksusuolen ja peräsuolen, rinta- ja eturauhassyövän [12], [13], [14].

Folaatti otto liittyy useita kuljettajat , kuten folaatin reseptoreita, ja folaatinkuljettajaproteiinin (RFC) [15], [16]. Folaatti-reseptori alfa (FRα), yhden ketjun glukosylfosfatidyl-inositoli-ankkuroitu kalvon proteiini, lisää folaatti sisäänoton endosytoosin. Sen yli-ilmentyminen on raportoitu munasarjasyövistä, mikä tarkoittaa, että se voi edistää kasvaimen kasvua [17], [18], [19], [20]. RFC on läsnä kaikissa kuljettaja luonnon folaatit ja klassista antifolaatteja, ja voi ohjata folaatin sisäänottoa kaksisuuntaisesti [16]. Menetys RFC myöhempiin vaikutuksiin folaatin puute havaittiin edistää syövän etenemisen kolorektaalisyövässä [16], [21]. Siksi olisi loogista olettaa, että nämä kaksi folaatin kuljettajat, FRα ja RFC, aiheuttavat erilaisia ​​vaikutuksia syövän etenemiseen.

Vaikka yliekspressio FRα munasarjojen syöpien on perustettu, ilmaisu tila ja toiminnallisten roolien RFC pysyvät suurelta osin tuntemattomia. Tässä tutkimuksessa selvitimme ilmaisun geneettiset ja epigeneettiset profiilit FRα ja RFC normaalissa munasarjan epiteelin ja munasarjasyövän, ja korreloi kliinispatologiset parametreja. Niiden toiminnallisten roolien ja mahdollisia alavirran tavoitteet solujen lisääntymisen, migraation ja invaasion suhteessa folaatin munasarjasyöpään arvioitiin myös. Olemme pyrkineet ymmärtämään roolit folaatin ja sen kuljettajat munasarjojen syövän synnyn, ja tutkia mahdollisia vaikutuksia folaatin saannin syöpäpotilailla.

Materiaalit ja menetelmät

Kliiniset näytteet ja solulinjoissa

sata ja viisikymmentäkolme formaliinikiinnitetyt parafiiniin upotettu näytteitä munasarjakasvainten, mukaan lukien 11 osallisuutta kystat /hyvänlaatuinen cystadenomas (22-63 vuotta, keski-ikä 50 vuotta), 19 rajatapaus kasvaimet (20~46 vuotta, keski-ikä , 30 vuotta), 83 karsinoomat (34-83 vuotta; keskimääräinen 51 vuotta) eri histologisia alatyyppejä ja 44 vastaavat metastaasipesäkkeiden (taulukko 1), kerättiin patologian osaston, Queen Mary Hospital, University of Hong Kong. Kaikki potilaat leikattiin ja 67 potilaalla munasarjasyöpiä myös kemoterapiaa kuten platina /paklitakseli. Seuranta-aikana vaihteli viidestä 209 kuukautta (keskiarvo 63 kuukautta). Kolmekymmentä kolme satunnaisesti valittua kliinistä näytettä munasarjojen kasvaimia ja niiden vastaavassa normaalissa kollegansa, kuten munanjohtimet ja /tai kontralateraalista munasarjat, joissa käytettävissä jäädytettyjen palojen myös noutaa. Tietoinen suostumus saatiin kaikki potilaat ja niiden käyttö kliinisissä näytteissä hyväksyi Institutional Review Board of University of Hong Kong /Hospital Authority Hong Kong West Cluster (HKU /HA HKW IRB) (Institutional Review Board numero: UW10-129) . Hema- Eosiini värjätään osissa jäädytettyjen harkkojen kunkin näytteen tarkistettiin kaksi meistä (ANYC ja PPCI) diagnoosin varmistamiseksi ja sen varmistamiseksi, että yli 80% kasvainsoluista olisi läsnä kasvainkudospalasta.

kaksi kuolemattomaksi munasarjojen epiteelin solulinjoja, HOSE 6-3 ja HOSE 17-1, ja yhdeksän munasarjasyövän solulinjoissa, SKOV-3, OVCAR-3, OVCA 420, OVCA433, OC316, Dov13, ES-2, TOV21G, SW626 (ATCC; Manassas, VA) viljeltiin, kuten aikaisemmin on kuvattu [22], [23].

Reaaliaikainen PCR (qPCR) B

Kokonais-RNA jäädytetty kliinisistä näytteistä ja syöpäsolulinjoissa oli uutettiin käyttäen Trizol-reagenssia (Invitrogen). Genominen DNA-kontaminaatio poistettiin käsittelemällä DNaasi I (Invitrogen) hoitoon. 2,5 ug kokonais-RNA käänteistranskriboitiin, jonka SuperScript-käänteistranskriptaasia (Invitrogen, San Diego, CA). Genominen DNA uutettiin käyttäen fenoli /kloroformilla (Invitrogen). qPCR suoritettiin ABI Prism 7700 Sequence Detection järjestelmän (Applied Biosystems, Foster City, CA), kuten on kuvattu [22], [23], [24]. Alukesekvenssit arvioidaan mRNA: n ilmentymisen FRα, RFC ja GAPDH (sisäinen kontrolli) olivat seuraavat: FRα mielessä, 5’AAGTGCGCAGTGGGAGCT -3 ’, ja antisense, 5′-CATTGCACAGAACAGTGGGTG -3’; RFC mielessä, 5’CGAAACCTCGGCTTCGGAGC -3 ’, ja antisense, 5’GCACGTAGTAGACCACCAGG -3’; GAPDH mielessä, 5’TCCATGACAACTTTGGTATCGTG -3 ’, ja antisense, 5’ACAGTCTTCTGGGTGGCAGTG -3 ”. PCR-puhtaus varmistettiin geelielektroforeesilla. Alukesekvenssit (sense, 5’GTATGCATGGCTTCCTGCAGG -3 ’, ja antisense, 5′-ACTTGTTAAACCCTGTAGAGAGG -3’) arvioimiseksi FRα geenin kopioluku oli suunniteltu perustuen genomisen sekvenssin intronin 3 ja intronin 4 FRα (Ensemble-tietokanta). TRAT1 käytettiin viite-geenin [25]. Munasarjasyöpä näytteitä, joilla ≥ kaksinkertainen lisäys niiden vastaavassa normaalissa kollegansa katsottiin positiivisiksi FRα geenin monistamisen.

immunoblottauksella

Solut kerättiin lyysipuskurilla (0,125 M Tris, pH 6,8 22 ° C: ssa, joka sisälsi 1% NP-40 (v /v), 2 mM EDTA, 2 mM N-etyylimaleimidiä, 2 mM PMSF, 1 mM natriumortovanadaattia ja 0,1 uM natrium- okadate], ja kirkastettiin sentrifugoimalla 4 ° C: ssa. Protein konsentraatio määritettiin DC (pesuaineen kanssa) proteiinin määritys (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). 20 ug proteiinia erotettiin SDS-PAGE: lla, siirrettiin polyvinylideenidifluoridi kalvo, ja hybridisoitiin spesifisten vasta-aineiden FRα (1:1000; Alexis Biochemical, San Diego, CA, ALX-804-439), RFC (1:1000, Affinity Bioreagents, Golden, CO, PA1-9553), E-kadheriinin (1:5000, BD Biosciences, Palo Alto, CA; 610182 ), ja aktiinin (1:1000, Sigma, St. Louis, MO, A5060) ja asianmukaiset toissijainen vasta (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). Täplät kehitettiin Enhanced kemiluminesenssin (ECL) Plus havaitsemisjärjestelmä (Amersham, Arlington Heights, UK), ja visualisoitiin röntgenfilmin (Galen Medical Group, Chattanooga, TN) [22], [23], [24].

immunohistokemia

immunohistokemiallinen värjäys oli kuvatussa aiemmissa raporteissa [22], [23], [24]. Sillä FRα immunohistokemia, parafiinileikkeet käsiteltiin vuohen anti-folaattia reseptorin vasta-ainetta, joka oli konjugoitu piparjuuriperoksidaasiin (1:200, Abcam, Cambridge, MA; ab20572). Koska anti-FRα vasta-aineen Alexis Biochemical käytetään immunoblottauksella jättänyt tyydyttävä tulos immunovärjäyksessä käyttäen parafiinileikkeillä, toinen vasta-aine, Abcam käytettiin. Vaikka tämä vasta-aine voi tunnistaa muita isoformeja FR, beta ja kammi isoformeja FR raportoitiin olevan ekspressoituu pääasiassa istukassa ja hematopoieettisissa soluissa, mutta ei muissa kudoksissa [26], [27]. Tämä vasta-aine voidaan sen vuoksi käyttää havaitsemaan FRα immunoreaktiivisuuden munasarjojen syöpien. RFC immunohistokemia, kanan anti-RFC-aineella (1:200; Affinity Bioreagents) levitettiin sen jälkeen biotiini-kanin anti-kanan IgG (H + L). 3-diaminobentsidiinitetrahydrokloraattia-vetyperoksidi käytettiin kromogeenina. Mikroaaltouuni antigeenin talteenotto käyttämällä sitraattipuskuria (pH 6,0) suoritettiin. Jättäminen tai korvaaminen primaarisen vasta-aineen kanssa, esi-IgG seerumia käytettiin negatiivisena kontrollina. Intensiteetti värjättyä epiteelisolujen pisteytettiin 0 (negatiivinen), 1 (heikko), 2 (kohtalainen) ja 3 (voimakas). Prosenttiosuus värjätään solut arvioitiin 0 (alle 5%), 1 (5% -25%), 2 (26% -50%), 3 (51% -75%) ja 4 ( 75%) . Immunoreaktiivisuus arvioitiin kertomalla värjäyksen intensiteetin prosenttiosuus värjätään solujen antaa komposiitti komposiitti ”Histoscore” [22], [23]. Korkea ja alhainen FRα ja RFC määritteli ”HistoScores” katkaistava keskiarvo.

Demetylaatio hoito

SKOV-3 ja OVCA420 soluja käsiteltiin 0, 5 tai 10 uM 5- atsa-2′-deoksisytidiini (5-atsa-dc, joka on DNA: n metylaatio estäjä) 72 tunnin ajan [28]. Ohjaus soluja käsiteltiin yhtä suurella tilavuudella dimetyylisulfoksidia (DMSO). Kokonais-RNA uutettiin soluista. Transkription aktiivisuus RFC määritettiin qPCR.

DNA: n valmistus, bisulfiittikäsittelyn ja metylaatiospesifistä PCR (MSP) analyysi

Perimän DNA jäädytetystä kliinisistä näytteistä uutettiin käyttäen fenoli /kloroformia. Bisulfiittikäsittelyn suoritettiin, kuten on kuvattu [28]. Alukkeita spesifisiä metyloitu (sense, 5’TTCGTCGTAGTTTGCGAATG -3 ’, ja antisense, 5′-CAACACGTACCTAAACGCGA -3’) ja metyloimattoman (sense, 5’TTTGTTGTAGTTTGTGAATGG -3 ’, ja antisense, 5′-ACAACACATACCTAAACACAA -3’ ) RFC promoottori ia oli raportoitu aiemmin [29]. Hehkutus lämpötila oli 52 ° C ja 56 ° C metyloidulle ja metyloimattomien promoottori a: ksi. MSP-tuotteet havaittiin elektroforeesilla 2% agaroosigeelissä etidiumbromidivärjäyksellä. Normaali lymfosyytin DNA metyloitiin SSSL metyylitransferaasin käytettiin positiivisena kontrollina. Hoitamaton genomista DNA: ta ja vettä aihioita ilman DNA: ta, käytettiin negatiivisina kontrolleina.

Stable knockdovvn FRα, ektooppinen yliekspressio RFC ja folaatin hoidon SKOV-3

SKOV-3, joka on munasarjasyöpäsolujen sopusoinnussa suhteellisen korkea FRα ja matala RFC ilmaisua, käytettiin. Vakaa pudotus FRα, solut transfektoitiin joukko shRNA rakentaa ihmisen FRα, pRS-sh FRα (Origene, Rockville, MD), jotka on valittu puromysiinin kanssa (1,5 ug /ml) [22], [23], [24] . PRS vektoria käytettiin verrokkeina. Jotta ohimenevä yli-ilmentävät RFC, pcDNA3-RFC plasmidi (ystävällisesti professori L Matherly, Michigan Cancer Foundation) ja tyhjän pcDNA3 vektori (kontrolli) transfektoitiin kontrolli SKOV-3-soluihin käyttämällä Lipofectamine 2000 (Invitrogen) [22], [23] , [24]. Soluja viljeltiin Medium 199 (Invitrogen) /MCDB 105 (Sigma), alustaa, joka sisälsi 22,7 nM foolihappoa ja jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia (FBS) (JRH Biosciences, Lenexa, KS) [22], [23]. shFRα solut ja RFC yli-ilmentäviä soluja (2 päivää transfektion jälkeen) esikäsiteltiin folaatti-RPMI 1640-alustassa (Invitrogen), johon oli lisätty 10% dialysoitua FBS: ää, joka sisälsi 0,6 nM foolihappoa (Invitrogen) ja 2 päivää, trysinized, lasketaan, päällystetty toiminnallisia määrityksiä ja sitten käsiteltiin eri annoksilla foolihappoa, synteettinen folaatti, mukaan lukien 0, 6, 12 ja 60 nM. Foolihappo käytetyt pitoisuudet perustuvat fysiologisella alueella plasmassa, joka vaihtelee 7 nM yksilöiden negatiivinen folaatin saldo 50 nM yksilöiden 400 ug /d folaatin kulutuksesta [30], joka on arvioitu folaatti saanti täydentää nonusers Pohjois-Amerikassa [13]. Foolihappo puutos konsentraatio valitaan (12 nM), joka perustuu siihen havaintoon, että tällainen pitoisuus on alhaisin vaatimus solujen kasvua [31]. Proteiini uutettiin 2 päivää käsittelyn jälkeen.

MTT (3- [4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli] -2,5-difenyylitetratsoliumbromidi) määrityksessä

Solujen proliferaatio määritettiin MTT-määritystä (Sigma), kuten on kuvattu [22], [24]. Solut ympättiin 96-kuoppaisille levyille 2000 solua /kuoppa. Tiettyinä ajankohtina, 10 ui MTT lisättiin kuhunkin kuoppaan. Levyjä inkuboitiin 37 ° C: ssa 4 h, minkä jälkeen lisättiin 100 ui DMSO: ta jokaiseen kuoppaan värin poistoon. Solujen lisääntyminen määritettiin mittaamalla näytteiden absorbanssi 570 nm: ssä 630 nm ohjearvon aallonpituus.

In vitro

maahanmuutto- ja invaasion määritykset

In vitro

muuttoliike ja invaasion määritykset suoritettiin, kuten on kuvattu [22], [23], [24]. 1,25 x 10

5-solut maljattiin yläsivulla Transwell lisätä ja sen annettiin kulkeutua 8 um huokoskoko (siirtymien määritykset) tai hyökätä kautta Matrigel-päällystetty kalvo (invaasio määritykset). Solut yläpuolen kalvo poistettiin ja siirretyn tai tunkeutuu solut kiinnitettiin metanolilla, värjättiin 0,5% kristallivioletilla ja laskettiin valomikroskoopilla 5 random kentät 24 h tai 48 h vastaavasti.

tilastollinen analyysi

tilastollinen analyysi suoritettiin SPSS 15.0 for Windows (SPSS Inc., Chicago, IL). Mann-Whitney testiä käytettiin vertailuun kahden taas Kruskal-Wallisin rank-testiä käytettiin vertailussa keskuudessa useita ryhmiä. Survival-analyysi suoritettiin Kaplan-Meier-analyysi ja log-rank-testi. Coxin regressioanalyysiä käytettiin monimuuttuja selviytymisen analyysiä.

P

arvojen 0,05 pidettiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

yli-ilmentyminen FRα liittyi munasarjojen syövän etenemiseen

qPCR, huomattavasti korkeampi FRα mRNA löydettiin syöpänäytteissä verrattuna vastaavien muiden kuin kasvain kollegansa jälkeen normalisoinnin GAPDH (

P

= 0,015) (kuvio 1A). Immunohistokemiallisesti, vahva FRα immunoreaktiivisuus havaittiin munasarjojen syöpien toisin kohtalainen värjäytyminen FRα rajatapauksissa kasvaimia ja heikko tai värjäytymisen puuttuminen hyvänlaatuisia cystadenomas /osallisuuden kystat (kuvio 1 C). Todellakin, huomattavasti korkeampi FRα immunoreaktiivisuus havaittiin munasarjojen syöpien ja rajatapauksia kasvaimia kuin hyvänlaatuisia cystadenomas /osallisuuden kystat (kaikki

P

0,05, taulukko 1). Solulinjoihin tasolla kuusi yhdeksästä munasarjasyövän solulinjoissa osoitti myös säätely ylöspäin FRα mRNA ja proteiini ilmaisutapoja SKOV-3, OVCAR-3 ja SW626 vahvassa ilme taas OVCA 420, Dov13 ja TOV21G osoittivat heikkoa ilmaisu verrattuna kaksi normaalia munasarjan epiteelin solulinjoja, joissa ei FRα mRNA ja proteiinin ilmentyminen havaittiin (kuvio 1 B).

(A) qPCR analyysi FRα mRNA ovarioiden ja vastaavien muiden kuin kasvain kollegansa. (B) mRNA: n (yläpaneeli) ja proteiini (alempi paneeli) ilmentymistä FRα kaksi kuolemattomaksi munasarjojen epiteelin solulinjoja, HOSE 6-3 ja HOSE-17-1, ja yhdeksän munasarjasyövän solulinjoissa, OVCAR-3, SKOV-3 , OVCA 420, OVCA433, OC316, Dov13, ES-2, TOV21G, SW626, arvioimana qPCR ja immunoblottauksella vastaavasti. (C) immunoreaktiivisuus FRα vuonna vakavien (a) ja mucinous (e) hyvänlaatuinen munasarjojen cystadenomas, vakavien (b) ja mucinous (f) rajatapaus munasarjojen kasvaimia ja vakavien (c), mucinous (g), kirkas solu (d) ja endomet- (h) munasarjojen karsinoomat. Asteikko bar = 100 pm. (D) Kaplan-Meier yleinen (vasen paneeli) ja taudista vapaan (oikea paneeli) eloonjäämiskäyriä munasarjasyöpä potilaille, joilla on korkea ja alhainen FRα (katkaistava keskiarvo).

Kliinisissä näytteitä, korkea FRα mRNA ilmaisun ja immunoreaktiivisuus havaittiin merkitsevästi yhteydessä pitkälle edennyt sairaus ja huono histologinen luokka liittyvät tekijät kasvaimen aggressiivisuus (taulukot 1 ja 2). Ei kuitenkaan ole merkittäviä ero FRα immunoreaktiivisuus havaittiin välillä chemosensitive ja solunsalpaajaresistentti tapauksissa (taulukko 1). Kaplan-Meier-selviytymisen analyysit eivät myöskään paljasta yhdistyksen välillä korkea FRα ilmaisun ja yleisen tai taudista vapaan eloonjäämisen (kuvio 1 D).

RFC oli alassäädetty munasarjojen syöpien ja korreloivat hyvä ennusteeseen potilaat

toisin FRα, munasarjasyöpä näytteitä näkyy huomattavasti pienempi RFC mRNA verrattuna vastaavien muiden kuin kasvain kollegansa arvioituna qPCR (

P

= 0,001) (kuvio 2A). Immunohistokemiallista analyysiä paljasti myös vahva RFC immuunivaste osallisuuden kystat /hyvänlaatuinen cystadenomas ja heikkoa ilmentymistä munasarjasyöpiä (kuvio 2C). Kuusi yhdeksästä munasarjasyövän solulinjoissa näytetään myös alas-säätely RFC mRNA ja proteiinin ilmentyminen verrattuna kaksi normaalia munasarjan epiteelin solulinjoissa (kuvio 2B).

(A) qPCR analyysi RFC mRNA munasarjakasvainten ja vastaavat ei-kasvain kanssa. (B) mRNA (yläpaneeli) ja proteiini (alempi paneeli) ilmentymistä RFC kahdessa kuolemattomaksi munasarjojen epiteelin solulinjoja, HOSE 6-3 ja HOSE-17-1, ja yhdeksän munasarjasyövän solulinjoissa, SKOV-3, OVCAR-3 , OVCA 420, OVCA433, OC316, Dov13, ES-2, TOV21G, SW626, arvioimana qPCR ja immunoblottauksella vastaavasti. (C) immunoreaktiivisuus RFCin osallisuuden kysta (a) ja vakavien munasarjakarsinoomat (b). Asteikko bar = 100 pm. (D) Kaplan-Meier yleinen (vasen paneeli) ja taudista vapaan (oikea paneeli) eloonjäämiskäyriä munasarjasyöpä potilaille, joilla on korkea ja alhainen RFC (katkaistava keskiarvo). (E) Kaplan-Meier yleinen (vasen paneeli) ja taudista vapaan (oikea paneeli) eloonjäämiskäyriä korkea FRα ilmaisi munasarjasyöpää sairastavien potilaiden korkea ja alhainen RFC (katkaistava keskiarvo).

RFC mRNA ja immunoreaktiivisuus ei korreloinut vaiheissa taudin, histologisia laatu ja histologisia alatyyppejä (taulukot 1 ja 2). Kiinnostavaa, oli merkittävä yhdistyksen välillä heikkoa ilmentymistä RFC, ja lyhyempi yleinen (

P

= 0,034) ja taudista vapaan (

P

= 0,011) eloonjääminen (kuvio 2D). Lisäksi joukossa munasarjojen syöpiä korkea FRα ilme, yleinen (

P

= 0,007) ja taudista vapaan (

P

= 0,008) eloonjääminen oli merkitsevästi pidempi joilla korkea RFC ilme (kuva 2E).

FRα geenin monistuminen ja RFC promoottori metylaatio vaikutti säädeltyyn geeniekspression munasarjasyöpiä

qPCR, 11 ulos 33 (33,3%) syöpänäytteissä näkyvissä FRα geeni (FOLR1, kromosomi 11q13.3) vahvistus verrattuna vastaaviin ei-kasvain kollegansa. Kaikki monistettu tapaukset osoittivat kohonneet mRNA ilmaisun. FRα monistus korreloi sen mRNA: n ekspression (

P

0,001, Fisherin eksakti testi) (taulukko 3).

Toisaalta, vähentää ilmentymistä RFC munasarjojen syöpien liittyi hypermetylaation. Käsittelyn jälkeen SKOV-3 ja OVCA420 munasarjasyöpäsoluja 5-atsa-dc, joka on DNA: n metylaatio estäjä, kaksi-kertaiseksi ja 2,5-kertainen nousu RFC-geenin ilmentymistä havaittiin (kuvio 3A). Lisäksi promoottori hypermetylaatiota RFC geenistä (kromosomissa 21q22.2) havaittiin 14: ssä 33 (42,4%) munasarjasyöpä näytteiden MSP. Edustavia esimerkkejä MSP oli kuviossa 3B on esitetty. Sitä vastoin, vain 3 ulos 33 (9%) ei-kasvain näytteet osoittivat hypermetylaatiota. Metyloitumattomat alleelit havaittiin kaikissa kasvain- ja ei-kasvain näytteitä. Promoottori hypermetylaatiota RFC merkittävästi korreloi käänteisesti sen mRNA: n ilmentymisen (

P

= 0,005, Fisherin testi) (taulukko 3). MSP, myös havaittu RFC promoottorin hypermetylaatio viiden munasarjasyövän solulinjoissa SKOV-3, OVCA 420, OVCA433, TOV21G ja SW626 (kuvio 3B), ne kaikki osoittivat alassäädetty RFC mRNA ja proteiinin ilmentyminen (kuvio 2B). Sen sijaan ei ole metyloituja alleeleja ei havaittu (kuvio 3B) normaalissa munasarjan epiteelin solulinja HOSE 6-3 ja kaksi syöpäsolulinjoissa OVCAR-3 ja OC316, joka näytetään RFC mRNA ja proteiinin ilmentyminen (kuvio 2B),

(A) suhteellinen mRNA: n ilmentymisen RFC in SKOV-3 ja OVCA 420 sen jälkeen, kun 5-atsa-dC-hoito osoitetun pitoisuuksilla 72 tunnin ajan. Kukin koe suoritettiin kolmena rinnakkaisena. Bars, keinot kertaluokkamuutos ± SD. *,

P

0,05. (B) edustaja munasarjasyöpiä (CA) (ylempi paneeli) ja munasarjojen solulinjoissa (alempi paneeli) MSP RFC metylaatiostatuksen. M, DNA markkeri; P, positiivinen kontrolli; N, negatiivinen kontrolli; M, metyloitu alleelit; U, metyloitumattomien alleelit.

knockdovvn FRα muuttunut folaatti välittämä soluproliferaation SKOV-3-solujen

Kun olet vahvistanut erityiset knockdovvn FRα mRNA ja proteiinin ilmentyminen in Skov-3-solut (kuvio 4A), ensin määritetään vaikutuksia FRα on folaatti-välitteisen soluproliferaation MTT-määrityksellä. Päivinä 2 ja 4, mitään merkittävää muutosta soluproliferaation havaittiin ohjaus ja shFRα SKOV-3-soluja jälkeen folaatti hoidon. Päivällä 6, ohjaus solut osoittivat lisääntymistä 12 ja 60 nM folaatin hoitoa. Päivänä 8, 6, 12 ja 60 nM folaatti hoidettuun kontrolliryhmään solut osoittivat ei-riippuvaista proliferaatiota. Sen sijaan, knockdovvn FRα estetty folaatti-välitteisen soluproliferaation (kuvio 4B).

(A) Vakaa knockdovvn FRα mRNA: ta ja proteiinia SKOV-3, kuten havaitaan qPCR (vasen paneeli) ja immunoblottaus (oikea paneeli ), vastaavasti. **,

P

0,005. (B) Solujen proliferaatio nopeuden valvontaa ja shFRα SKOV-3-soluja käsiteltiin 6, 12 ja 60 nM folaatin 2, 4, 6 ja 8 päivää näytetään kertainen muutos verrattuna kontrolliin ilman folaattia hoitoa (0 nM). n = 3; *,

P

0,05. (C)

In vitro

muuttoliike (vasen paneeli) ja invaasio määritykset (oikea paneeli) valvonta ja shFRα SKOV-3-solut käsiteltiin 0, 12 ja 60 nM folaatin käyttäen TranswellTM kalvoa ilman tai matrigeelin pinnoitteella vastaavasti. Ylempi paneeli: edustavat kuvat muuttavien tai tunkeutumaan SKOV-3-soluissa. Alempi paneelit: Cell kulkeutumista tai invaasion SKOV-3 esitetään prosentteina ohjaus käsiteltiin 0 nM folaatin; n = 3; *,

P

0,05; **,

P

0,005. (D) immunoblottausta FRα ja E-kadheriinin käyttäen proteiini lysaatit valmistettiin ohjaus ja shFRα SKOV-3 (vasen paneeli). Suhteellinen E-kadheriinin proteiinin tason analysoituna ImageJ ohjelmisto (US National Institutes of Health); n = 3; *,

P

0,05; **,

P

0,005 (oikea paneeli).

Folaatti kautta FRα aiheuttama SKOV-3 solumigraation ja invaasion ja alas-säänneltyjen E-kadheriinin

Seuraavaksi testasimme vaikutus folaatin ja FRα SKOV-3 solumigraation ja invaasiota. Perustuen vaikutuksista folaatin soluproliferaatioon, 12 ja 60 nM annokset valittiin hoitoon ohjaus ja shFRα SKOV-3-soluissa. TranswellTM muuttoliike ja hyökkäys määritykset osoittivat, että 12 ja 60 nM folaatin merkittävästi indusoi solujen vaeltamiseen ja hyökkäyksen kontrollisolujen taas knockdovvn FRα estetty folaatti välittämiä solun muuttoliikettä ja invaasiota (kuvio 4C). Sitten määritetään mahdolliset myötävirtaan tavoite folaatin välittämä vaikutus solujen vaeltamiseen ja invaasiota. Ilmaisua E-kadheriinin, joka on tärkeä solun adheesiomolekyyli välttämättömiä säätelemiseksi solun liikkuvuus, havaittiin voidaan vähentää ei-riippuvasti jälkeen folaatti hoidon (kuvio 4D). Tällainen säätely alaspäin E-kadheriinin jälkeen folaatin hoidon myös kumottu jälkeen knockdovvn FRα.

Kohdunulkoinen yliekspressio RFC korkean FRα ilmentävien SKOV-3 torjua folaatti välittämä solujen lisääntymisen, migraation ja invaasion ja palauttaa E -cadherin ilmaisu

Olemme osoittaneet yli-ilmentyminen FRα ja vähentää ilmentymistä RFC munasarjojen syöpien, viittaa siihen, että ne voivat käyttää vastapäätä rooleja etenemistä munasarjasyöpä. Vielä tärkeämpää on, potilailla, joilla on korkea FRα, yleinen ja taudista vapaan eloonjäämisen oli merkitsevästi pidempi niille korkean RFC ilme, syyllistämättä suojaava rooli RFC korkean FRα syövissä. Selvittämiseksi tällaisia ​​suojaava tehtävä,

in vitro

toiminnallisia tutkimuksia tehtiin FRα-positiivisten SKOV-3 solujen ektooppisesti ilmaistu RFC jälkeen folaatti hoidon. RFC todettiin vastapainoksi folaatti välittämää solujen lisääntymistä (kuvio 5A), muuttoliikkeen ja invaasiota (kuvio 5B). Lisäksi alas-säätely E-kadheriinin soluissa jälkeen folaatti hoidon myös kumottu jälkeen yliekspressoivat RFC (kuvio 5C).

(A) Solujen lisääntyminen nopeudella SKOV-3 solujen ektooppisesti ilmaistu RFC tai kontrollivektorin ( kontrolli) käsiteltiin 60 nM folaatin 5 päivän jälkeen näytetään kertainen muutos verrattuna kontrolliin ilman folaattia hoitoa (0 nM); n = 3; *,

P

0,05. (B)

In vitro

muuttoliike (vasen paneeli) ja invaasio määritykset (oikea paneeli) in SKOV-3 solujen ektooppisesti ilmaistu RFC tai kontrollivektorille käsitelty 0 ja 60 nM folaatin näytetään prosentteina ohjaus käsiteltiin 0 nM folaatti; n = 3; *,

P

0,05; **,

P

0,005. (C) Immunoblottaus RFC ja E-kadheriinin käyttäen proteiinilysaattien valmistettu SKOV-3 solujen ektooppisesti ilmaistu RFC tai kontrollivektorille (vasen paneeli). Suhteellinen E-kadheriinin proteiinin tason analysoituna ImageJ ohjelmisto (US National Institutes of Health); n = 3; **,

P

0,005 (oikea paneeli).

Keskustelu

Tässä tutkimuksessa osoitimme asteittainen kasvu FRα mRNA ja proteiini ilmentyminen ei-kasvain kudosten, hyvänlaatuiset ja raja kasvaimia karsinoomat. Lisäksi, FRα geenin monistamisen mahdolliseksi mekanismi sen yli-ilmentymisen on myös osoitettu ensimmäistä kertaa munasarjojen syöpien. Yliekspressio FRα munasarjojen syöpien [19], [20] sekä syöpien munuaisten, keuhkojen ja rinnan on aiemmin raportoitu [32]. Tuloksemme osoittavat myös, että suuri FRα ilmaus korreloi huonon histologisia laatu ja myöhemmissä vaiheissa taudin, mikä viittaa sen roolit munasarjojen syövän etenemiseen.

Toisin FRα, alempi RFC mRNA ja proteiini ilmaisun munasarjasyöpiä oli löytyi verrattaessa normaalin kudosten tai hyvänlaatuisia kasvaimia. RFC ilmentyy kaikkialla normaalissa kudoksessa ja on merkittävä folaatin liikenteen kuljettamiseen luonnolliset folaatit, kuten 5-metyyli tai 5-formyyli tetrahydrofolaatti (THF), ja antifolaatit kuten metotreksaatti (MTX) ja pemetreksedin [16]. 5-metyyli THF on kofaktori välttämätön DNA: n metylaatio, joka normaalisti johtaa tukahduttaminen onkogeenien [33]. Näin ollen menetys RFC on kuvattu edistää paksusuolen karsinogeneesin [21]. Tässä tutkimuksessa havaitsimme, että alentunut ilmentyminen RFC oli merkitsevästi yhteydessä lyhyempi yleistä ja taudista vapaan eloon jäämisestä, mikä viittaa siihen, että RFC voidaan pitää merkkiaineena hyvän ennusteen munasarjasyöpä potilaille. Lisäksi potilailla, joilla on korkea FRα ilmentävien munasarjasyöpiä, yleinen ja taudista vapaan eloonjäämisen oli merkitsevästi parempi niillä, joilla on korkea RFC ilme kuin ilman, syyllistämättä suojaava rooli RFC potilaille, joilla on kasvain.

osoittivat myös, että FRα vahvistus ja RFC promoottori metylaatio korreloi mRNA ilmaisun munasarjasyöpiä. Aiemmissa raporteissa, RFC promoottori metylointi on löydetty rintasyövän soluissa [34] ja ensisijainen lymfoomat [35]. Meidän havainnot ehdotti, että säätely ylöspäin FRα (oletetun kasvaimia synnyttävän folaatin kuljettaja) ja alas-säätely RFC (oletetun tuumorisuppressoriproteiinia tyyppi folaatin kuljettaja) oli ohjattu geneettisesti ja epigeneettiseltä vastaavasti aikana munasarjasyövän kehitystä.

Kuten johdannossa edellä, folaatti on välttämätön DNA-synteesin [12], [13], [14], mikä epäsuorasti vaikuttaa siten soluproliferaatioon. Yliekspressio FRα NIH /3T3-soluissa on raportoitu aiheuttavan lisääntynyttä solukasvua in vitro ja in vivo [36]. Käyttämällä folaatti eri annoksina 12 nM (pidetään ruokavalion puutteellinen Pohjois-Amerikassa) 60 nM (pidetään normaalina täydentää ei-käyttäjät), pystyimme osoittamaan soluproliferaation FRα-positiivisten SKOV-3-soluissa [13]. Kääntäen, kun FRα oli pudotus by shRNA lähestymistapa, tämä folaatti välittämä soluproliferaation SKOV-3-soluissa oli menetetty, mikä vahvistaa sen, että folaatin todellakin kuljettaa läpi FRα prosessin aikana munasarjasyövän solujen lisääntymisen.