Krooninen sairaus

tiivistelmä

BORIS (CTCFL) on paralogi of CTCF (CCCTC-sitova tekijä; NM_006565), joka on läsnä kaikissa DNA-sitovan proteiinin kanssa erilaisia ​​rooleja geenien ilmentymisessä ja chromatin järjestämisestä. BORIS ja CTCF on lähes identtinen sinkkisormidomeenia, mutta näyttää suuria eroja niiden C- ja N-pään alueisiin. Toisin CTCF, BORIS ilme on raportoitu ainoastaan ​​kiveksissä ja tiettyjä syöpäsairauksia, mikä sen luokittelua ”syöpä-kives” antigeeni. Ilmaisulla kuvio BORIS on sekä merkittävä ja ratkaisematon kysymys alalla DNA: n sitovia proteiineja. Täällä tunnistaa BORIS sytoplasmassa ja tumassa monenlaisia ​​normaalien ja syöpäsolujen. Vertaamme lokalisointi CTCF Boris tumassa ja osoittaa rikastaminen BORIS sisällä nucleolus sisällä nukleoliinin ydin rakenne ja vieressä fibrillarin tiheässä säikeisen komponentti. Sen sijaan, CTCF ei ole rikastettu nucleolus. Elävät kuvantaminen solujen transfektoitiin ohimenevästi GFP tagged BORIS vahvisti nucleolar kertymistä BORIS. Vaikka BORIS transkriptipitoisuuksissa ovat vähäiset verrattuna CTCF, sen proteiinin tasot ovat helposti havaittavissa. Nämä havainnot osoittavat, että BORIS ilme on yleisempää kuin aiemmin uskottiin, ja ehdottaa rooli Boris nucleolar toiminto.

Citation: Jones TA, Ogunkolade BW, szary J, Aarum J, Mumin MA, Patel S, et al. (2011) Laajaa Expression Boris /CTCFL Normal ja syöpäsoluja. PLoS ONE 6 (7): e22399. doi: 10,1371 /journal.pone.0022399

Editor: Pierre-Antoine Defossez, Université Paris-Diderot, Ranska

vastaanotettu 18 maaliskuuta 2011; Hyväksytty: 21 kesäkuu 2011; Julkaistu: 19 heinäkuu 2011

Copyright: © 2011 Jones et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ rahoittivat Cancer Research UK ohjelman avustus C5321 /A8318. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

CTCFL tai BORIS (veli Regulator painettu Sites), joka on paralogi on CTCF, on luokiteltu syöpää kiveksen antigeeni sen jakautumista on raportoitu rajoittuvan kiveksissä ja tiettyjen syöpien [1] . Epänormaalin suurista BORIS transkriptien ovat läsnä erilaisissa ihmisen kasvaimia ja syövän solulinjat ja joissakin lisääntynyt ilmentyminen on liitetty promoottori-erityisiä demetylaatio ja de-tukahduttaminen koekspressoi syöpään kiveksen geenit [2] , [3], [4], [5], [6], [7], [8], [9], [10], [11], [12]. Eri tutkimuksissa on raportoitu ristiriitaisia ​​havaintoja BORIS ilmentymisen joidenkin syöpien. Esimerkiksi on raportoitu lisääntyneen ekspression useissa rintasyöpäsolulinjoissa ja useimmissa ensisijaisen rintasyövistä testattu yhdessä tutkimuksessa ei ole vahvistettu toisessa [3], [13]. Lisäksi lisääntynyt transkriptiotasoja BORIS on havaittu melanoomasolulinjoja, mutta ei ensisijainen melanoomat [7]. Kuitenkin, että on tärkeää BORIS syövän on ehdottanut toteaminen korkeita pitkälle epiteelin munasarjasyöpä [14].

BORIS

ja

CTCF

geenit arvellaan ovat kehittyneet aikana selkärankaisten kehittämiseen geenikahdennustapahtuman [15]. Vaikka sinkkisormidomeenia, jotka sitovat DNA: ta vastaavat proteiinit ovat hyvin samankaltaisia, C- ja N-terminaaliset domeenit, Boris näytteille ei ole merkittävää homologiaa CTCF tai muita proteiineja, [16]. BORIS ei sisällä modulaarisen substraatteja tiettyjä translaation jälkeiset modifikaatiot, jotka ovat kriittisiä CTCF toiminta ja puuttuu konservoitunut C-terminaalinen fosforylaatio motiivi tarvitaan CTCF-välitteistä kasvun hidastuminen. Tämä viittaisi siihen erilaisia ​​toimintoja varten kahta proteiinia.

Useat erilliset näytöt viittaavat rooli Boris epigeneettisellä geenin ilmentymisen säätelyyn. Aikana hiiri mies ituradan kehitys, BORIS havaitaan ensisijainen spermatosyyteiksi mutta on vähitellen korvattu CTCF jälkeisissä meioottisiin ituradan soluihin [17]. Tämä kytkin ilmaus Boris ja CTCF osuu uudelleen perustamiseksi paikkakohtaisten DNA-metylaation aikana mies sukusolujen erilaistumiseen [17]. Lisäksi kasvainsolulinjoissa jossa CTCF hiljentää geenejä DNA: n metylaatio, ehtolauseke Boris johtaa korvaamiseen CTCF Boris näitä geenejä, mikä johtaa paikalliseen demetylaatio ja geeniaktivaatioon [6], [10], [11], [18 ].

DNA: ta sitova ja epigeneettiset määritellyistä tehtävistään BORIS Ehdottaisin tumaanohjaussignaali. Kuitenkin viimeaikaiset raportit osoittavat BORIS esittää pääasiassa sytoplasmassa eturauhasen epiteeli, kiveksissä ja eturauhassyövän solulinjoissa [1], kun tumaanohjaussignaali on todettu ainoastaan ​​tietyissä vaiheissa spermatogeneesin ja joissakin 5-atsa-dexoxycytidine käsitellyn eturauhassyövän solulinjoissa [ ,,,0],5]. Täällä näytämme hallitseva paikallistaminen BORIS sisällä nucleolus useissa syöpäsolulinjoissa ja ensiöparit, jossa rikastamiseen sisällä nukleoliinin ydin rakenne ja vieressä fibrillarin tiheässä säikeisen komponentti.

Tulokset ja keskustelu

BORIS ilmentymistä normaaleissa ja syövän solujen ja kudosten

tason määrittämiseksi BORIS ilmentymisen normaaleissa ihmisen kudoksissa, kokonais-RNA saatiin ihmisen rasva-, virtsarakon, aivojen, kohdunkaula, paksusuoli, ruokatorven, munuais-, maksa- , munasarja, istukka, eturauhanen, luurankolihas, ohutsuoli, perna, kives, kateenkorva, kilpirauhanen ja henkitorven (Ambion). Reaaliaikainen RT-PCR osoitti, että korkeimmat BORIS transkriptitasot kiveksissä (10

10 transkriptien /ug kokonais-RNA: ta), kun taas alhaisempi havaittiin muissa kudoksissa (10

5-10

8 transkriptien /ug kokonais-RNA) kanssa muiden raporttien [7] (Fig. 1). Emme havainneet BORIS sydämeltä tai keuhkojen, vaikka tämä saattaa johtua rajoituksen herkkyys meidän määrityksen. CTCF transkriptipitoisuuksissa olivat suhteellisen vakio kaikissa kudoksissa (10

9-10

10 selostukset /ug kokonais-RNA) (kuvio 1).

BORIS transkriptipitoisuuksissa normaaleissa ihmisen kudoksissa (First choice® Human kokonais-RNA Survey Panel, Ambion, UK). Virhepalkit edustavat standardipoikkeamaa.

Seuraavaksi verrattiin transkriptitasot Boris ja CTCF eri normaalia ja syöpäsolulinjoissa. Reaaliaikainen RT-PCR-analyysi osoitti samalla tasolla BORIS ja CTCF mRNA fibroblasteissa, alkion munuaissolut, hermo kantasolut, neuronit, peräsuolen, eturauhasen, medulloblastoma, glioblastooma, melanooma ja neuroblastoomasolu- linjoja luokkaa kuin ihmisen kudoksissa. BORIS ilme oli pienempi (10

6-10

7 selostukset /ug kokonais-RNA), verrattuna runsaammin CTCF (10

9-10

10 selostukset /ug kokonais-RNA) (Fig. 2A). Näin ollen, BORIS ja CTCF on läsnä sekä normaaleissa että syöpäsolujen, joissa ilmentyminen CTCF usein 1000 kertaa suuremmat.

A, Boris-transkriptitasot valituissa solulinjoissa. B, Western blotting ja BORIS osoittaa päävyöhykettä (*) noin 76 kDa (BORIS teoreettinen koko), 60 kD ja 45 kD. Pienempi kaistat voivat edustaa BORIS isoproteins, kuten on kuvattu äskettäin [19]. C, Western blotting ja CTCF osoittaa päävyöhykettä (*) noin 130 kDa, 60 kDa ja 48 kDa. Nämä eri taajuusalueilla saattaa olla osoitus ilmentyvät eri CTCF isomuodot kuvatulla äskettäin [36]. BORIS ja CTCF esiintyy normaaleissa soluissa (neuronien, hermo kantasolut (NSC) ja MRC5 sikiön keuhkojen fibroblasteja), neuroblastooma solulinjat (ACN, IMR32 ja LAN-1), Melanoomasolulinjojen (26258M, A375M ja WM983B), glioblastoomasolulinjan linjat (CRL-2365, U87MG, CRL-2610, CRL-1620, U138MG ja U251) ja peräsuolen solulinjat (HCT55, HCT116, HCT15 ja LoVo). D, GAPDH käytettiin kontrollina lastaus eroja. Invitrogen Novex®Sharp Pre-Stained Protein Standard, LC5800, käytettiin määritettäessä kaistan koon. Virhepalkkeina (A) edustavat keskihajonta.

Yllättäen, Western-blottaus osoitti samalla tasolla Boris ilmentymisen normaalissa ja kasvaimen solulinjojen (Fig. 2B). Havaitsimme vahvan päävyöhykettä 60-70 kDa kanssa teoreettinen molekyylipaino BORIS [19]. Olemme myös havainneet joitakin alemman ja korkeamman molekyylipainon bändejä. Vielä ei ole selvää, mitkä näistä ryhmistä vastaa äskettäin kuvattua isoformia Boris [19] tai jotka ovat BORIS kanssa translaation jälkeiset modifikaatiot. Kuitenkin inkuboidaan BORIS vasta-Boris peptidi täysin tukossa kaikki bändit (Fig. S1). Mikään näistä BORIS reaktiiviset vyöhykkeet havaittiin, kun kalvot tutkittiin CTCF vasta-aineilla (Fig. 2C).

spesifisyyden varmistamiseksi Boris-vasta-aineen, HEK293T-solut transfektoitiin GFP-merkityn BORIS tai GFP- tagged CTCF konstruktioita. Western-analyysi vahvisti, että läsnä Boris proteiinin transfektoiduissa soluissa GFP-merkityn BORIS, kun taas vain endogeenisen BORIS havaittu transfektoimattomissa soluissa tai soluissa, jotka on transfektoitu GFP-CTCF tai tyhjän vektorin (kuvio. S2).

sitten käytetyt reaaliaikainen RT-PCR määrittää tasot BORIS ilmentymisen normaaleissa hiiren kudoksissa kuten pikkuaivot, suolistossa, munuaisissa, maksassa, munasarjoissa, pernassa ja kiveksissä. Kuten ihmisen kudoksissa, löysimme paljon alhaisempi BORIS verrattuna CTCF hiiren kudoksissa, lukuun ottamatta kiveksissä (Fig. 3A). Western blotting valikoiduista hiirikudoksissa paljasti useita bändejä, runsaimmat osa oli 60-70 kDa (Fig. 3B). Olemme myös havainneet bändi noin 48 kDa munuaisissa, hippokampuksessa, suolen ja aivokuori, kun taas muut vähemmän vahvan viivan yläpuolella 200 kDa oli läsnä kiveksissä, perna, keuhkot ja maksa (Fig. 3B). Nämä korkeamman molekyylipainon kaistat voivat vastata homo /heterodimeerin Boris, tai poly (ADP) -ribosylation kuten on kuvattu CTCF [20]. Jälleen, ei vyöhykkeet havaittiin, kun kalvot tutkittiin BORIS vasta-aineita esi-inkuboitiin free BORIS peptidit (Fig. S3), ja ei havaitsemme saman taajuusalueilla, kun kalvot tutkittiin CTCF vasta-aineilla (Fig. 3C). Vaikka BORIS proteiini on selvästi havaittavissa, me vain havaita alhainen BORIS transkriptien, sekä solujen ja kudosten (kuvio 1, kuvio 2A ja kuvio 3A). Kuitenkin ristiriita välillä mRNA-tasolla ja proteiinia runsaasti on raportoitu olevan heikko tiettyjä muita geenejä [21], [22], [23].

A, BORIS ja CTCF mRNA-tasot on valittu normaalin hiiren kudoksissa. B, Western blotting ja BORIS osoittaa päävyöhykettä (*) 60-70 kD ja 45 kDa hiiren kudoksissa. C, Western blotting ja CTCF osoittavat bändejä (*) välillä 70-100 kDa hiiren kudoksissa. D, GAPDH käytettiin kontrollina lastaus eroja. GE Healthcare Full Range Rainbow Marker, RPN800E, käytettiin määritettäessä kaistan koon. Virhepalkkien (A) edustaa keskihajonta

Kun otetaan huomioon samankaltaisuuden niiden sinkkisormidomeenia, BORIS on ehdotettu olevan antagonisti, kilpailija tai säätelijä CTCF sukusolujen ja ihmisen syövissä [17]. Todellakin, BORIS ja CTCF kilpailevat sitoutumisesta yhteisiin DNA-kohteisiin. Esimerkiksi CTCF käyttöasteen

MAGE-A1

promoottori ilmenee vain, jos BORIS ekspressiotasot ovat alhaiset [11]. Koska N- ja C-päät ovat BORIS ja CTCF ovat erilaisia, ne ovat todennäköisesti vastuussa erilaisia ​​toiminnallisia tuloksia, kuten välittäjänä DNA demetylaation jälkeen DNA: han sitoutumisen. Suhteelliset tasot BORIS ja CTCF ovat siten todennäköisesti ratkaiseva vakauden säilyttämiseksi normaalissa geeniekspressioprofiilien.

Nucleolar lokalisoinnin BORIS

Immunofluoresenssikoe värjäys osoitti, että BORIS sijaitsee sytoplasmassa ja tuma useissa ihmisen solutyypeissä, MRC5-fibroblasti, HEK293T embryomaisesta munuaissolut, hermo kantasolut, peräsuolen, neuroblastooma, melanooma, eturauhasen ja glioblastoomasolulinjoissa. Kaikissa solutyypeissä tutkittiin, Boris-immunoreaktiivisuus oli rikastettu nucleolus (Fig. 4 ja kuvio. S4). Yön yli inkubaation Boris vasta-peptidin kanssa esti täysin immunofluoresenssimenetelmällä signaali edelleen vahvistaa spesifisyyttä BORIS vasta-aineita (kuvio. S5). Ei immunoreaktiivisuus havaittiin, kun solut värjättiin ei-spesifisiä IgG-vasta-aineita. Co-solujen värjäys BORIS tai CTCF ja fibrillarin, erittäin konservoituneen proteiini, joka liittyy pieni nucleolar RNA: t [24], vahvistivat rikastaminen BORIS mutta ei CTCF on nucleolus (Fig. 4A, B). Edelleen co-värjäys osoitti BORIS sisällä nucleolar viemä tila nukleoliinin, runsas ei-ribosomaalinen nucleolar proteiini [25] (Fig. 4C). Konfokaalimikroskopia ja 3D-rekonstruktio vahvistivat, että BORIS oli sisällä nucleolus vieressä fibrillarin sekä normaaleissa ja syöpäsolujen (Fig. 5A, B ja elokuvat S1, S2, S3 ja S4).

A, B Immunofluorescence kuvantaminen Boris tai CTCF värjäyksen vihreänä (Alexa 488) yhdessä fibrillarin värjäytymistä punaisella (Alexa 594) vuonna MRC5 ja peräsuolen solulinja HCT116 osoittaa rikastamisen BORIS, mutta ei CTCF sisällä nucleolus. Solut vastavärjättiin 4 ’, 6-diamino-2-fenyyli (DAPI) näkyy sinisenä. BORIS ja fibrillarin ovat lähellä naapureita keskenään ja tiheä säikeisen komponentti (DFC) ja nucleolus. Kuvat näkyvät 100x suurennuksella. C Double Immunovärjäyksen osoittaa BORIS värjäytymistä vihreänä (Alexa 488) sisällä nukleoliinin alueella (punainen, Alexa 594) ihmisen hermo kantasoluja ja glioblastoomasolulinjan CRL2365. Solut vastavärjättiin 4 ’, 6-diamino-2-fenyyli (DAPI) näkyy sinisenä. Kuvat näkyvät 100x suurennuksella.

kolmiulotteisen konfokaali kuvat osoittavat BORIS värjäytymistä vihreänä (Alexa 488) ja fibrillarin värjäytymistä punaisella (Alexa 594). Solut vastavärjätään 4 ’, 6-diamino-2-fenyyli (DAPI, sininen). A MRC5 fibroblastit ja B, C99 peräsuolen solulinja. Kuvat näkyvät 63x suurennuksella.

Vahvista Näiden havaintojen HEK293T solut transfektoitiin GFP-merkityn BORIS tai GFP-leimatun CTCF konstruktioita. Käyttämällä elävien solujen kuvantaminen, GFP havaittiin kerääntyä asteittain nucleoli transfektoitujen solujen GFP-BORIS. 71,3% +/- 1,7 GFP-BORIS transfektoidut solut osoittivat selkeitä nucleolar lokalisointi (873 solua analysoitiin yhteensä kahdesta itsenäisestä kokeesta). Sitä vastoin solut, jotka on transfektoitu GFP-CTCF osoitti tasaisen jakautumisen GFP koko ytimen, ja ne, jotka on transfektoitu tyhjällä GFP-vektorilla osoitti pääasiassa GFP sytoplasmassa (Fig. 6). Lisäksi immunovärjäys soluja 72 tuntia transfektion jälkeen HEK293T-solujen BORIS erityisiä shRNA plasmidit, mutta ei ole tyhjä vektori, merkitsevästi (

p

0,05) pienensi nucleolar immunovärjäys BORIS (Fig. S6A, B). Tämä liittyy vastaava väheneminen BORIS transkriptipitoisuuksissa (Kuva S7).

Live solun kuvantaminen HEK293T soluja transfektoitiin väliaikaisesti GFP-tagged BORIS (vihreä), GFP-tagged CTCF (vihreä) tai tyhjän vektorin ( vihreä), vastavärjättiin Hoechst 333412 (sininen). Kuvat näkyvät 40x suurennuksella.

Oletetut Nucleolar Localization sekvenssit

Computational analyysi BORIS proteiinisekvenssin Q8NI51, [26], paljasti 2 oletetun nucleolar lokalisaatiosekvenssit sinkkisormen verkkotunnuksen :

LIQHQKTHKNEKRFKCKHCSYACKQ (asemien 473 ja 497) (ZF6 /7) B

AKSAASGKGRRTRKRKQTILKEATKGQK (asemien 573 ja 600) (ZF9 /10)

Five otaksuttu nucleolar lokalisointi sekvenssit ennustettu CTCF, joista kolme ovat N-pään ja päällekkäisiä CTCF K /R asetylaatio sivustoja ennustaa Klenová, et ai. [17]. Ennustetut nucleolar lokalisaatiosekvenssit vuonna CTCF ovat seuraavat:

ESETFIKGKERKTYQRRREGGQEE (asemien 12 ja 35) B

KDPDYQPPAKKTKKTKKSKLRYTEEGKDV (asemien 193 ja 221) B

VGNMKPPKPTKIKKKGVKKTFQCEL (asemien 246 ja 270) (N-päästä) B

GENGGETKKSKRGRKRKMRSKKEDSSDSENA (asemien 585 ja 615) (ZF 9/10) B

QPVTPAPPPAKKRRGRPPGRTNQPKQNQPTAI (asemien 639 ja 670).

Nämä sekvenssit tukisi päätelmää BORIS että nucleolus sekä translokaatiota CTCF tumaan erilaistumisen aikana ihmisen hematopoieettisten solujen [27].

SYP (ylävirtaan sitova tekijä) on äskettäin tunnistettu ensimmäinen yhteinen vuorovaikutus kumppani Boris ja CTCF [28]. Tämä vuorovaikutus osoitettiin olevan suoraan ja vaatia sinkkisormidomeenia Boris ja CTCF, suuri liikkuvuus ryhmä (HMG) -kohtaan 1 ja dimerisaatiodomeeni of SYP. CTCF havaittiin sitoutuvan välittömästi ennen ribosomin välike promoottorin metylaatioherkät tavalla, jossa ehdotetaan ladata SYP päälle rDNA muodostamaan osa verkostoa, joka ylläpitää rDNA geenit valmis transkriptio. Meidän immunofluoresenssivärjäyksen eivät osoittaneet rikastuminen CTCF että nucleolus kuitenkin alhainen CTCF voi olla läsnä, mutta alle havaitsemisen meidän määrityksessä. Torrano et al., Osoittivat, että translokaatiota CTCF että nucleolus induktion jälkeen erilaistumista ihmisen ja rotan solujen säädeltiin poly (ADP-ribosyl) ation [27]. UBF on hyvin runsaasti tumajyväseen ja sen on osoitettu olevan erittäin dynaaminen [29]. Näin ollen suoraa vuorovaikutusta CTCF ja SYP voi olla ohimenevää, ja koska BORIS tunnistaa saman DNA sitoutumiskohdat [1], voi olla kilpailua CTCF Boris sitoa SYP [22]. Yhdessä esitettyjen päätelmien kanssa täällä, suora vuorovaikutus Boris kanssa SYP viittaa BORIS tärkeä rooli ribosomien biogeneesissä.

Päätelmät

Tämä on ensimmäinen raportti osoittaa BORIS lokalisointiin pääasiassa nucleolus monissa eri pahanlaatuiset ja ei-pahanlaatuiset solutyyppejä. Tumajyvänen on monikäyttöinen sub-ydin- osastossa, jos esimerkiksi ribosomaalisen RNA: t syntetisoidaan, käsitellään ja yhdistetty ribosomaalisten proteiinien [30], [31], [32]. Kuitenkin laaja proteomiikka-analyysi on paljastanut dynaaminen luonne nucleolar proteomista ja ehdottaa, että nucleolus voi suorittaa monia muita biologisia rooleja lisäksi ribosomin biogeneesin kuten sääntely erityisiä näkökohtia mitoosin ja solusyklin etenemisen [24], [33] , [34]. Tässä osoitamme, että BORIS on selvästi enemmän kuin kiveksen-spesifistä proteiinia, ja näyttää selvästi solunosasijaintia useissa solulinjoissa sekä normaalin ihmisen ja hiiren kudoksissa. BORIS on rikastettu nucleolus sisällä nukleoliinin sydänrakenteen ja vieressä fibrillarin. Meidän uusi havainto laajaa ilmentymisen BORIS yhdessä nucleolar lokalisoinnin optio lisätutkimuksia selvittääkseen sen tarkka toiminta tässä yhteydessä.

Materiaalit ja menetelmät

Cell Culture

syöpäsolun linjat ylläpidettiin RPMI tai DMEM täydennetty 10% naudan sikiön seerumia (ellei toisin mainita), 100 yksikköä /ml penisilliiniä, 100 mg /ml streptomysiiniä, ja 0,29 mg /ml L-glutamiinia (Invitrogen). Käytetyt solulinjat olivat ihmisen keuhkojen fibroblasteja MRC5 (ECACC); alkion munuais- solulinja HEK293T-; peräsuolen solulinjat C99, HCT55, HCT116, HCT15, LoVo ja SW837; medulloblastoma solulinja Daoy; eturauhassyöpäsolulinjoissa Du45 ja PNT2; melanoomasolulinjoja A375M, Mel 501, SBCL2, UISO, Mel 6, WM115, WM1158, M2629bM ja WM278; neuroblastoomasolu- linjat ACN, IMR-32 ja LAN1 ja glioblastoomasolulinjoissa CRL-2365, CRL-2610 (LN-18), CRL-1620 (A-172), CRL-2020, CRL-2611, U-118 mg, U- 138 MG, U251 ja U87 MG (ATCC). MRC5-soluja kasvatettiin edellä media, johon on lisätty 20% naudan sikiön seerumia. Ihmisen hermo kantasoluja, jotka on saatu solulinja H9 (46, XX) (EnStem-A, Millipore) viljeltiin Neurobasal väliaineessa (Invitrogen, 21103-049), jota oli täydennetty B27 (Invitrogen, 12587-010), FGF-2 10 ng /ml (PeproTech), 1% penisilliini /streptomysiiniä (Invitrogen) ja 2 mM glutamiinia (Invitrogen). Puolet väliaine vaihdettiin joka toinen päivä. In vitro erilaistuminen indusoitiin jättämällä FGF-2 väliaineesta.

Tissue proteiinien eristämiseksi

Hiiren kudoksista eristettiin 3 kuukauden ikäiset C57BL6 tai NOD-hiiristä, ja jäädytettiin nestemäisessä typessä. Kaikki koemenettelyn joihin hiirikudoksissa hyväksyi sisäministeriö Animal menettelyt lausunnon hankkeen lisenssinumeroa PPL 70/6693. Kudokset hajotettiin Qiagen RLT-hajotuspuskuria RNA, tai osaksi 1X RIPA-puskuria (50 mM Tris-HCI, pH 8,0, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0,5% Na-deoksikolaattia, 0,1% SDS), joka sisälsi proteaasi-inhibiittoreita (proteaasi- Inhibitor Cocktail Set III EDTA-vapaa, Calbiochem) ja fosfataasi estäjät (fosfataasinestäjällä Cocktail Set II, Calbiochem) proteiinien analyysiä. Kokonaisproteiinista lysaatit valmistettiin 10

8 solua 1X RIPA puskuriin. Hajotettiin soluja sonikoitiin lyhyesti kanssa Bioruptor ja roskia kirkastettiin sentrifugoimalla. Proteiinipitoisuus uutteiden arvioitiin käyttäen BCA Kit (Thermo Fisher Scientific) mukaan valmistajan protokollaa.

RNA: n eristäminen ja Käänteinen transkriptio

Yhteensä-RNA eristettiin käyttämällä piipohjaisia ​​spin-pylväs liuuttovälinepakkausta (RNeasy mini kit, Qiagen) seuraten valmistajan protokollaa. Kokonais-RNA käsiteltiin RNaasi-vapaa DNase1 (Ambion) vähentää genomisen DNA-kontaminaation. RNA eheys arvioitiin käyttämällä Agilent Bioanalyzer. Kaksi mikrogrammaa kokonais-RNA: ta käänteistranskriptio SuperScriptase III (Invitrogen) käyttämällä Oligo-dT-alukkeita tai satunnaisia ​​heksameereja mukaan valmistajan protokollaa. Negatiivinen (-RT) sisältyvän valvonnan RNaasittomalla vesi korvataan käänteiskopioijaentsyymin.

Quantitative Real-Time PCR

Sekä julkaistut alukkeet [3] ja oman suunniteltu Primer Express 2.0 käytettiin tässä tutkimuksessa. Yhdessä nämä alukkeet monistamaan 19 niistä 23 isomuotojen Boris kuvattu äskettäin [19]. Ihmisen alukkeet olivat seuraavat:

BORIS eksoni 4-5 eteenpäin:

5′-AAAACCTTCCGTACGGTCACTCT-3 ’

ja reverse: 5′-TGTTGCAGTCGTTACACTTGTAGG-3′

ja koetin: Fam-TAACACCCACACAGGAACCA-Tam

CTCF eksoni 5-6 eteenpäin: 5′-GAGAAGCCATTCAAGTGTTCCAT-3 ’

ja reverse: 5′-CTCCAGTATGAGAGCGAATGTGA-3′

ja koetin: Fam-ATTACGCCAGTGTAGAAGTCAGC-Tam.

hiiri-alukkeet olivat seuraavat:

BORIS eksoni 5-6 eteenpäin:

5′-AGTGCTCCCTGTGCAAGTACG-3 ”

ja reverse 5′- GTAAGCACACTGGCAACACTGG-3 ’

ja koetin: Fam-AAGCAAGATGAAGCGTCACAT-Tam

CTCF eksoni 5-6 eteenpäin:

5 ’-TCGTTATAAACACACTCATGAGAAACC-3’

ja reverse: 5′-TCTCCAGTATGAGAGCGAATGTG-3 ’

ja koetin: Fam-AGTGTTCCATGTGTGATTGTCAG-Tam.

mRNA kvantitoitiin koskevasta ABI7500 väline käyttämällä SYBR Green JumpStart Taq READYMIX kit (Sigma-Aldrich) tai platinau- Taq-polymeraasia (Invitrogen) 50-100 ng cDNA (paitsi BORIS alukkeiden kun 150-200 ng cDNA: ta käytettiin) ja 100-200 nM alukkeita. Käytimme alukkeita ulottuu eksonin 4/5 risteyksessä BORIS ja havainnoista vahvistettiin käyttäen julkaistuja alukkeita eksonia 6/7 [2], [3], ja eksoni 9/10 [13] on qRT-PCR-määritystä eri pitoisuuksilla solun kokonais-RNA: ta. Absoluuttinen pitoisuudet arvioitiin käyttäen standardia käyrät syntyvät sarjalaimennokselle amplikonien. Kynnys sykli sarjalaimennoksia yksijuosteisia oligonukleotideja piirrettiin log kopio numerot kohde PCR-tuotteiden, ja ilmoitetaan kopiomääränä /ug kokonais-RNA [35].

Western Blot analyysi

20-50 ug proteiinia uutetta ja 10 ui Molekyylipainostandardien (Invitrogen Novex®Sharp Pre-Stained Protein Standard, LC5800 tai GE Healthcare Full Range Rainbow Marker, RPN800E) erotettiin 4-12% kaltevuus NuPAGE polyakryyliamidigeelissä (Invitrogen), ja sitten blotattiin nitrocelluose kalvo (Invitrogen) mukaisesti valmistajan protokollaa. Nitroselluloosakalvolle inkuboitiin Tris-puskuroidussa suolaliuoksessa esto, joka sisälsi 5% rasvatonta maitoa ja 0,1% Tween-20. Sitten membraania koetettiin primaaristen vasta-aineiden avulla vakio-olosuhteissa. Valitsimme kaksi vasta-aineita BORIS; kanin polyklonaalinen vasta-aine ab18377 (Abcam), vastaan ​​nostetut synteettistä peptidiä ensimmäisten 100 aminohapon ja kanin polyklonaalinen vasta-aine HPA001472 (Sigma), vastaan ​​nostetut aminohappoja 33-172. Nämä kaupallisesti saatavilla vasta olisi tunnustettava useimmat 23 isoformeja Boris ja on ominaista aiemmin [13], [28]. BORIS vasta-aine ab18337 (1:1000 laimennus, Abcam) käytettiin kaikkiin Western esitetyt tiedot Boris-vasta-aineen HPA001472 (1:200 laimennos, Sigma) käytettiin varmistamaan nauhojen (tuloksia ei ole esitetty). Sillä CTCF käytimme vasta-07-729 (1:1000 laimennus, Millipore) ja GAPDH käytimme vasta-14C10 (1:2000 laimennus, Cell Signalling). Usean pesun jälkeen, nauhojen paljastui vastaavan piparjuuriperoksidaasiin kytketty sekundaarinen vasta-aine ja havaitaan käyttämällä ECL detektioreagenssipakkaus (GE Healthcare) mukaisesti valmistajan protokollan.

Immunofluoresenssi

Soluja kasvatettiin peitinlaseilla ja kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä (Electron Microscopy Sciences), fosfaatilla puskuroitu suolaliuos, 0,14 M NaCl, 2,7 mM KCI, 8,1 mM Na2HPO4, 1,5 mM KH2PO4, pH 7,2-7,4: ssa 10 minuutin ajan huoneenlämpötilassa, minkä jälkeen läpäiseväksi estopuskurissa (fosfaattipuskuroitu suolaliuos, joka sisälsi 0,1% Triton X-100, 0,01% saponiinia ja 10% vuohen seerumia) 30 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Sitten soluja inkuboitiin spesifisten vasta-aineiden estopuskurissa yön yli 4 ° C: ssa. BORIS vasta-ab18337 (1:100 laimennus, Abcam) käytettiin kaikkiin tavallisiin kuvantamisen. BORIS vasta-HPA001472 (1:25 laimennus, Sigma) käytettiin konfokaali kuvantamisen ja elokuvia. Värjäämällä molemmat vasta osoittivat identtiset lokalisointi. Käytimme CTCF vasta-07-729 (1:1000 laimennus, Millipore), nukleoliinin (C23) vasta-aine sc-8031 (1:1000 laimennus, Santa Cruz Biotechnology) ja Fibrillarin vasta-ab18380 (1:1000 laimennus, Abcam). Solut pestiin PBS: ssa, ja ensisijainen immunoreaktioita visualisoitiin inkubaation jälkeen 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa Alexa Fluor 594 kanan anti-hiiri-IgG, A-21201 ja Alexa Fluor 488 kanan anti-kani-IgG, A-21441 (molemmat Invitrogen). Tumat vastavärjättiin 0,1 mg /ml 4 ’, 6-diamino-2-fenyyli (DAPI, Molecular Probes) ja peitinlasit kiinnitettiin Mowiol (Calbiochem). Tavallisessa 2 ulotteinen analyysi Näytteet visualisoidaan Zeiss Axiophot mikroskooppi varustettu epifluoresenssiin käyttäen Zeiss suunnitelma-neofluar 20x, 40x tai 100x tavoitteita. Erillinen harmaasävykuvia kirjattiin jäähdytetyllä CCD-kameralla (Hamamatsu, Welwyn Garden City, UK). Kuva-analyysi tehtiin käyttämällä SmartCapture X ohjelmisto (Digital Scientific, Cambridge, UK). 3 ulotteinen analyysiä näytteitä tutkittiin käyttäen Zeiss Meta 510 LSM käyttäen 63x tavoite. Dekonvoluutio kuvien suoritettiin käyttäen Huygens Essential -ohjelmisto ja kuvien sitten käsitellä Imaris x64 (v7.1.1).

Peptide Competition