Krooninen sairaus

tiivistelmä

Ihmisen haiman adenokarsinooma (PDAC) on syöpä, jossa on synkkä ennuste. Teho PDAC syöpähoitoihin on usein lyhytikäinen; kuitenkin, on vain vähän tietoa siitä, miten tämä tauti kokonaisuus niin usein saa hoito ei tehoa. Otimme käsite syövän kantasoluja (CSCS) selittää mekanismin resistenssin ja arvioitiin tehoa ehdokas syöpälääkettä kohdistaa näitä hoito-resistenttejä CSCS. Olemme tunnistaneet alapopulaatio solujen PDAC CSC: n kanssa toimintoja, jotka rikastettiin aldehydidehydrogenaasin (ALDH), merkkiaine on ilmaistu tietyissä kantasolujen /progenitorisolujen. Nämä solut olivat myös kestävät hyvin, ja ne edelleen rikastaa, gemsitabiinihoidon. Samoin kirurginen näytteitä PDAC potilaista osoitti, että ne, jotka oli tehty ennen leikkausta kemoterapia-sädehoitoa useammin näkyvät syöpiä ALDH vahvasti positiivinen osapopulaatioiden verrattuna hoitamattomien potilaiden. Mikä tärkeintä, nämä ALDH korkea syövän solut olivat herkkiä disulfiraami, joka on ALDH estäjä, kun testataan

in vitro

. Lisäksi

in vivo

ksenograftin tutkimukset osoittivat, että vaikutus disulfiraamin oli additiivinen pieniannoksisen gemsitabiini sovellettuna yhdessä. Lopuksi ihmisen PDAC peräisin olevat solut, jotka ilmentävät korkeita ALDH osoittavat CSC ominaisuuksia ja on keskeinen rooli resistenssin kehittymistä syöpähoitoihin. Disulfiraamia voidaan käyttää vaimentamaan tämä terapia-resistenttejä alaryhmän.

Citation: Kim SK, Kim H, Lee D-h, Kim T-s, Kim T, Chung C, et ai. (2013) kääntäminen Vaikeasti luonne haimasyövän valikoivasti Targeting ALDH-High, Therapy hylkivät syöpäsoluja. PLoS ONE 8 (10): e78130. doi: 10,1371 /journal.pone.0078130

Editor: Benedetta Bussolati, Center for Molecular Biotechnology, Italia

vastaanotettu: 01 heinäkuu 2013; Hyväksytty: 17 syyskuu 2013; Julkaistu: 23 lokakuu 2013

Copyright: © 2013 Kim et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustusta National Creative tutkimusaloitteista Program (2010-001827, https://www.nrf.re.kr). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Co-kirjailija Hoguen Kim on PLoS One toimitusneuvosto jäsen, ja ymmärtää, että tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

ennustetta sairastavien potilaiden haiman adenokarsinooma (PDAC) on erittäin huono. Vain 10-20% PDACs soveltuvat kirurginen resektio alkudiagnoosin, ja kasvain toistumisen määrä on raportoitu päästä jopa 70-90%, jopa potilailla, jotka ovat läpikäyneet parantava resektio [1]. Terapeuttinen vaihtoehtoja enemmistö potilaista lopulta alennettu tehostetun kemoterapian ja /tai sädehoidon [1,2]. Siksi hoito PDAC on erittäin haastavaa, koska se helposti saa vastustuskykyä chemo-sädehoitoa ja tulee hankala.

Yhä useammat tutkimukset tukee ajatusta syövän kantasoluja (CSCS) tai kasvaimeen aloittamista soluihin. CSCS luonnehtia ainutlaatuisia ominaisuuksia, kuten kyky rajoittamaton itseuudistumisen, pitkä käyttöikä, korkea metastaattinen potentiaali, ja kestävyys kemoterapiaa [3,4]. Siten CSCS ovat tulleet tunnustetaan kasvain väestöryhmästä että olisi määrätietoisesti suunnattu [2,3,5]. Mutta käytännön asia, tehokkuudet tällä hetkellä saatavilla CSC kohdistamisen hoidot ovat kaukana tyydyttävästä. Useat tutkimukset ovat vahvistaneet rooli CSCS kehittämisessä terapeuttisen resistenssin PDACs [4], ja osoittivat, että ne ovat usein resistenttejä yleisimmin käytetty syöpälääkkeet, kuten gemsitabiini ja 5-fluorourasiilin [1,4,6].

tässä tutkimuksessa me olettaa, että käsite CSCS voisi selittää, miksi vaikutuksia standardin kemoterapian usein rajoittuu potilaisiin, jotka saavat adjuvanttihoitoa tai kemoterapia-sädehoitoa [7-11]. Olemme lisäksi arveltu, että tietyt ainutlaatuiset piirteet CSCS voidaan hyödyntää uudelleen herkistää PDACs jotta syöpähoitoihin ja myöhemmin peruuttaa hankala luonne; huomiomme kiinnittyi aldehydiä (ALDH), joka on tunnustettu uudeksi CSCS markkeri erityisesti osana paneelin kantasolujen merkkiaineiden [12-18]. Kertyvät todistusaineisto tukee ajatusta, että lisääntynyt ilmentyminen ALDH liittyy haitallisia ennusteeseen rinta-, keuhko-, ja eturauhasen syöpiä [15,16,18]. Lisäämällä tähän luetteloon, Rasheed et al. raportoi äskettäin, että ALDH1-positiiviset haimasyöpäsoluissa vaikuttaa negatiivisesti selviytymisen PDAC potilaista [12].

Disulfiraamia (1- [diethylthiocarbamoyldisulfanyl] -N, N-dietyyli-methanethioamide) on peruuttamaton ALDH-inhibiittoria, joka on käytetty saavuttaa alkoholin välttäminen käyttäytyminen alkoholistien hoidossa [19]. Disulfiraami on saanut huomiota ehdokkaaksi syövänvastainen lääke ja tähän mennessä on testattu useita kiinteitä kasvaimia, kuten rintasyöpää, melanoomaa, ja peräsuolen syöpä [20-22]. Vaikka tarkkaa mekanismia taustalla syövän vastaista aktiivisuutta tämän aineen ei ole täysin selvitetty, useita merkittäviä johtolankoja on ilmennyt [20-26]. Äskettäin Dalla Pozza et ai. raportoitu, että yhdistettynä gemsitabiinihoidon ja disulfiraami kanssa sinkki-ionin esti ksenograftissa kasvaimen kasvua haiman syöpäsoluja [27]. Kuitenkin suora vaikutus disulfiraamin on CSCS of PDACs suhteessa ALDH on määrittelemätön.

Tässä tutkimuksessa selvitimme merkitystä ALDH ilmaisun ja CSC väestön PDAC. Vertasimme vastauksia disulfiraami välillä kasvaimen osapopulaatiosta eri ALDH ilmaisun ja totesi, että ALDH voimakkaasti positiiviset solut olivat herkkiä disulfiraami. Tuloksemme viittaavat siihen soveltuvuutta disulfiraamin anti-CSC ainetta, joka voisi mahdollisesti parantaa tehoa standardin chemotherapies vastaan ​​PDAC.

Materiaalit ja menetelmät

Solulinjat ja reagenssit

seuraavat ihmisen solulinjoja käytettiin: CFPAC-1, MIA PaCa-2, PANC-1 ja AsPc-1 (haimasyöpä solulinjat); hTERT-HPNE (normaali haimatiehyen epiteelisolujen linja). Kaikki solulinjat ostettiin American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) kantavassa solulinjat on testattu AmplFLSTR tunnistetta PCR Amplification Kit (Applied Biosystems, Foster, CA, cat. 4322288) ja todistaa oikeaksi KCLB helmikuussa 2013. Disulfiraami ja gemsitabiini (Sigma) käytettiin

in vitro

elinkelpoisuutta ja

in vivo

ksenograftin määrityksiä.

Human kasvainnäytteestä

Tämä Potilasaineisto hyväksyi Institutional Review Board of Yonsein University Medical Center. Kirjallinen suostumus saatiin kunkin potilaan varastointiin ja käyttöön mallin ja lääketieteellisen tiedon. Meidän kriteereillä määritellään tutkimuksen populaatio 57 PDAC potilasta, joita oli histologisesti diagnosoitu ja ylläpitää Yonsein University Medical Center vuodesta 2005 vuoteen 2008. Clinical arviointi suoritettiin perustuen American sekakomitean Cancer TNM (tuumori-solmu-etäpesäke) luokituksia. Koska vaiheen III ja IV haiman syövät leikkaushoitoon mukaan TNM luokitusten [28], analysoimme vasta vaiheen II PDAC saaneilla potilailla Whipple toiminta tai pylorus säilyttävää pankreatikoduodenektomia kanssa imusolmukedissektiossa. Varten ennen leikkausta kemoterapia /CCRT, gemsitabiini käytettiin suurin osa (18/20; 90%) potilaista.

Virtaussytometria

Kaikki solulinjat analysoitiin ilmentymisen ALDH virtaussytometrialla käyttäen Aldefluor Kit (Aldagen, Inc.) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Vertailun ALDH kirkas ja ALDH-negatiivisia soluja, CFPAC-1 syöpäsolut lajiteltiin perustuu intensiteetti niiden ALDH aktiivisuus mitattiin FACS (fluoresenssilla aktivoitujen solujen lajittelu, BD FACS Aria ™ II solu lajittelija). Biotiinikonjugoitua anti-CD24 ja PerCP-Cy5.5 anti-CD44-vasta-aineita (eBioscience) käytettiin erään Immunofenotyypitys protokollaa sisältyy käsikirja, jonka myyjä. DAPI (4 ’, 6-diamino-2-fenyyli) käytettiin värjäämään tumien elävien solujen. PE-anneksiini V Apoptosis Detection Kit I (BD Bioscience) käytettiin konjugaatio 7-AAD (eBioscience) tunnistaa varhain apoptoottisia syöpäsoluja. Jotta analyysi LSK (lineage- Sca + c-kit +) hematopoieettisten kantasolujen taajuus luuytimen hiiren reisiluusta ja sääriluu, käytimme linjan (CD11-biotiini, Gr1-biotiini, CD4-biotiini, CD8-biotiini, B220- biotiini, Ter119-biotiini) -streptavidin-PerCP-Cy5.5, PEcy7-konjugoitua sca-1, ja APC-konjugoidun c-kit-vasta-aineita (eBioscience).

Western blotting

Proteiiniekstraktit saatiin soluista tai kasvaimen massojen käyttämällä proteiinia uuttoliuosta (Pro-Prep; introni) seuraten valmistajan ohjeita. Vasta-aineet, joita käytetään Western blot-analyysi sisältyy anti-ALDH1A1 (Abcam), GAPDH ja anti-β-aktiini (Sigma).

Reaaliaikainen polymeraasiketjureaktio (PCR) B

n eristäminen RNA: ta ja cDNA-synteesi suoritettiin seuraten valmistajan protokollaa (RiboEx introni). SYBR green-pohjainen array PCR suoritettiin käyttäen iQ5 Multicolor Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad). Sekvenssit eri PCR-alukkeet ovat saatavilla pyynnöstä. Suhteelliset mRNA ekspressiotasoja laskettiin käyttäen vertailevaa Ct menetelmällä normalisoinnin P-aktiini.

Hiiri kokeita

Eläinten hoito ja kokeellisia toimenpiteitä suoritettiin hyväksyntää KAIST Animal Care ja käyttö komitea . Käytimme 6 viikon ikäisiä uros-

Foxn1

nu

SCID-hiirissä ksenograftin määritykset (Orient Bio). Disulfiraami tablettia (Ind-Swift) liuotettiin maissiöljyyn (Sigma) suun kautta kautta luotain. Gemsitabiini (Sigma) intraperitoneaalisesti (i.p.) ja

in vivo

regressio määrityksiä.

mittaamiseen disulfiraami vasteen, jaoimme ksenotransplantaatio hiiriä disulfiraamin käsiteltyihin hiiriin (300 mg /m

2, kahdesti viikossa, ylläpitäjä kautta sondin) ja maissiöljy hoidettuun kontrolliryhmään hiirillä. Mittaamiseksi tehoa yhdistelmähoidon disulfiraamin ja pieniannoksisen gemsitabiinin, jaoimme ksenotransplantaatio hiiret viiteen ryhmään niin, disulfiraamin vain käsiteltyihin hiiriin (300 mg /m

2, kahdesti viikossa, ylläpitäjä kautta luotain) pieniannoksinen gemsitabiini käsiteltyihin hiiriin (40 mg /m

2 kehon pinta-ala, IP, viikoittain) [29], pieniannoksinen gemsitabiinin yhdessä suun kautta disulfiraamin, 10-kertaa suurempi annos gemsitabiinia käsiteltyjen hiirten (400 mg /m

2 kehon pinta-ala, viikoittain), ja PBS-käsiteltyihin kontrollihiiriin (IP).

on suositeltavaa, että suullinen lääke disulfiraami otetaan aloitusannoksena 500 mg seurattava päivittäinen ylläpitoannos 250 mg ihmisen [30]. Annos käännös yhdestä eläinlajista toiseen käyttäen kehon pinta-alaan (BSA) normalisoinnin menetelmää suositellaan [31]. Mukaan tämä kaava, me annetaan disulfiraamin 300 mg /m

2 hiirille kahdesti viikossa

kohden suun

.

Kasvaimen tilavuus mittaukset

Hiiret otettiin huumehoitoa kun niiden kasvaimet olivat saavuttaneet koko on vähintään 200 mm

3. Kasvaimen koko mitattiin paksuus, ja kasvaimen tilavuus laskettiin käyttäen standardin kaavaa, pituus x leveys

2 x 0,5 (mm

3). Kasvain aloittamista syöpäsolu-injektoidaan hiiriin seurattiin päivittäin, ja kasvaimen koko määritettiin viikossa 3-5 viikkoa, kuten on osoitettu.

immunohistokemia

tuumoriksenografteja kiinnitettiin formaliiniin, valettiin parafiiniin leikattuna, ja värjättiin hematoksyliinillä ja eosiinilla (H 0,05. Virhe palkit kuvaavat standardipoikkeamat.

rajoittaminen laimennuksen analyysi

arvioida taajuus pesäkkeitä muodostumista, me laimennettiin CFPAC-1 solujen yhteen soluun kuoppaa kohti (100 pl), ja viljeltiin 96-kuoppaisen levyn 5% CO

2-inkubaattorissa 37 ° C: ssa. Kahden viikon kuluttua laskimme kukin pesäke seuraus yhdestä solusta ja laskettiin pesäkkeiden lukumäärä pois koko kaivoja.

elinkyvyn

Suoritimme elinkelpoisuuden määrityksessä WST (vesiliukoinen tetratsoliumsuolaa) väriainetta (EZ-cytox solunelinkykyisyysmääritys kit, itsBIO) mukaan myyjän opetusta. Näytteet luettiin mikrolevylukijalla käyttäen 450 nm: n aallonpituudella absorbanssi. Määrällisesti solujen elinkelpoisuus, määritimme keskiarvoja kolmena tai neljänä lukemat ja saanut standardikäyrä käyttäen GraphPad Prism 5 -ohjelmaa.

Tilastot

Kaikki tilastolliset analyysit suoritettiin käyttäen GraphPad Prism 5 -ohjelmaa. Analysointia varten solun elinkelpoisuuden ja kasvaimen tilavuuden mukaan lääkehoitoa, merkittäviä eroja avulla määritettiin varianssin analyysiä (ANOVA), jota seurasi t-testejä. IHC ja virtaussytometriatuloksia analysoitiin t-testillä ja suhde kasvaimia sisältävien ALDH-vahvasti positiivinen syöpäsoluja kirurgisesti-resektoitiin PDACs vertailtiin chi-neliön menetelmällä. Vertasimme pesäkkeitä muodostavaa tehokkuutta analyysi t-testiä. Kaikki raportoidut P-arvot ovat kaksipuolisia ja P-arvo on alle 0,05 katsottiin osoittavan tilastollista merkittävyyttä.

Tulokset

ALDH1 ilmentymistä vähentämällä tumorous ja ei-tuumori- ihmisen haiman kudokset

Terminal tiehyen solujen on raportoitu haiman kantasolujen /kantasolujen useissa tutkimuksissa [32-34] ja Rovira et ai. ominaista ALDH1 ekspressiokuviota näiden solujen hiirissä [35]. Ilmaisulla kuvio ALDH1 ei-tuumori- ihmisen haiman kudos ei ole raportoitu. Meillä on siis tutkinut ihmisen yksilöitä ja totesi, että samanlainen hiiren haima, ihmisen krooninen haimatulehdus näytteillä regeneratiivista metaplasiaa ja jakautuviin ductal soluja, jotka olisivat välittömästi jälkeläiset haiman kantasolujen /esisolujen [32,35] {Rovira, 2010 # 96} osoittivat myös korkeita ALDH1A1 ilmentymisen (kuvio 1A).

Ihmisen PDAC, ALDH1A1 ilme vaihteli eri soluissa useilla eri negatiivisesta voimakkaasti positiivinen (kuva S1). Erityisesti huonosti eriytetty PDACs näkyy runsaammin ALDH1A1 vahvasti positiivinen syöpäsoluja kuin hyvin erilaistunut PDACs ei (kuvio 1A). Kuvio 1B osoittaa tilastollista eroa taajuus ALDH1A1 vahvasti positiivisten solujen välillä hyvin eriytetty (n = 7) ja huonosti eriytetty (n = 7) PDACs. Laskimme syöpäsolujen 10 korkean tehon kentät (X400) edustajan dia kustakin PDAC yksilöitä.

Seuraavaksi tutkimme kirurgisista näytteistä, jotka joko saivat preoperative kemoterapiaa /samanaikainen kemoterapia-sädehoitoa ( CCRT; n = 20) vai ei (n = 37), ja etsitään läsnäolo ALDH1A1 vahvasti positiivinen (taulukko S1). Nämä solut tunnistettiin vertaamalla ALDH1A1expression tason yksittäisen syöpäsolujen kuin normaalin varren /esisolujen sisältyvät viereiseen kasvaimeen liittyvä krooninen haimatulehdus kudokseen (kuvio S1). Huomasimme, että taajuus kasvaimia, jotka omistavat ALDH vahvasti positiivisia soluja oli suurempi potilailla, jotka saivat kemoterapiaa /CCRT ennen leikkausta (80,0%) verrattuna kuin potilailla, jotka saivat kirurginen resektio yksin (51,4%) (kuvio 1 C) , mikä viittaa siihen, että ALDH vahvasti positiivinen syöpäsolut rikastettiin tavanomaisilla kemoterapiaa /CCRT.

syöpäsolut ilmentyy voimakkaasti ALDH näyttö useita CSC toiminnoista

perustaa

in vitro

alustalla seuloimme yksi normaalin ihmisen haimatiehyen epiteelisolulinja (hTERT-HPNE) ja neljä ihmisen PDAC solulinjat (CFPAC-1, MIA PaCa-2, PANC-1 ja AsPc-1). Mittasimme ALDH aktiivisuus kussakin solulinjassa virtaussytometrialla käyttämällä Aldefluor Kit (kuva S2). Koska ALDH1A1 on tärkeä tuote

ALDH

geeni, fluoresenssin intensiteetti on positiivisesti korreloi ALDH1A1 [36]. Siten solujen alapopulaation erittäin ilmentävien ALDH virtaussytometrialla voitaisiin vastaamaan ALDH1A1 vahvasti positiivisia soluja havaittiin ihmisen PDAC yksilöitä.

on määritelty kolme solujen alijoukon, joka perustuu niiden virtaussytometristen jakautuminen suhteessa ruiskutus ja DEAB negatiivinen kontrolli joko ALDH-negatiivinen (solujen sisäpuolella alueella aidatulla by DEAB ohjaus), ALDH-korkea (solut sijaitsevat alueella yli DEAB ohjaus), ja ALDH-kirkas (alapopulaatio ALDH korkea solut). HTERT-HPNE, ALDH erittäin ilmentäviä alaryhmä oli alle 5% koko väestöstä. Niistä neljä PDAC solulinjat, MIA PaCa-2 ( 90% koko väestöstä) ja CFPAC-1 (noin 50%) osoitti runsas ALDH-korkea syöpäsoluja. In PANC-1 ja AsPc-1-solut, suhteet ALDH-suurten populaatioiden olivat vertailukelpoisia tai vähemmän kuin hTERT-HPNE soluja. Johdonmukaisesti, ALDH1A1-proteiinia ei havaittu merkittäviä määriä MIA PaCa-2 ja CFPAC-1-solujen linjat, mutta vain vähän tasoilla PANC-1 ja AsPc-1-soluissa (kuvio S2).

perusteella aiempien kirjallisuuden [12-14,18,37] ja havaintojemme me päätellä, että ALDH-kirkas syöpäsoluja saattaa itse asiassa edustaa CSCS. Aiemmat tutkimukset ovat hakeneet ALDH osana paneelin muiden kantasolujen merkkiaineita, tunnistaa normaali ja syövän kantasoluja haima [12,13,37]. Testasimme ALDH yksinään voidaan käyttää bona fide kantasolujen markkeri ja onko soluja, joilla on korkea ALDH ilmaisun todella edustettuina CSCS. Tätä varten käytimme CFPAC-1 solulinja koska tiedetään, että ala- populaation CFPAC-1 on rikastettu syövän kantasolujen kaltaisia ​​soluja [38], ja huomasimme, että CFPAC-1 osoitti tasaisesti jakautunut ALDH-korkea ja -negatiivinen syöpä solut Aldefluor määrityksessä. Olemme edelleen lajitellut solut suuruuden perusteella niiden ALDH toiminta tunnistetaan FACS ja verrataan ylemmän ja alemman 5% soluista, jota määritellään ALDH kirkas ja ALDH-negatiivinen osapopulaatioissa, vastaavasti. ALDH1A1 mRNA ja proteiini-tasot olivat yhdenmukaisia ​​ALDH tasot tunnistetaan FACS (kuvio S2).

seuraavan analysoitiin CFPAC-1-soluja, joilla on erilaiset ALDH varten koekspressio CD24 ja CD44, joita käytetään yleisesti kantasolujen merkkiaineita [14]. Tämä paljasti, että ALDH aktiivisuus korreloi positiivisesti kuin CD24 ja CD44 (kuvio 2A). Rajoittava laimennus- pesäkkeitä muodostavien määritys paljasti, että ALDH-kirkas soluilla oli suurempi pesäkkeitä muodostavien aktiivisuus kuin ALDH-negatiivisia soluja (kuvio 2B). Me erikseen viljelty ALDH kirkas ja ALDH-negatiivisia soluja, ja analysoi ALDH aktiivisuus 2 viikon kuluttua (kuvio 2C). Jälkeläiset ALDH-kirkas soluja kuului sekä ALDH kirkas ja ALDH-negatiivisia soluja; Näin, ALDH-kirkas soluja onnistuneesti palautettu alkuperäiseen väestöön. Sen sijaan ALDH-negatiiviset solut eivät pystyneet täysin palauttaa ALDH-kirkas solupopulaation.

(A) FACS-analyysin CD24

+ CD44

+ CFPAC-1-solut luokitellaan ALDH

kirkas, ALDH

korkea ja ALDH

negatiivisia ryhmiä. (B) Rajoittavan laimennoksen pesäkkeitä muodostavien määritykset suoritettiin FACS-lajiteltu CFPAC-1-soluissa. (C) ALDH aktiivisuus mitattiin FACS-analyysin ALDH

negatiivinen ja ALDH

kirkas CFPAC-1-soluja viljeltiin erikseen 2 viikkoa. (D) Pitoisuus ALDH

valoisa ja ALDH

negatiivinen CFPAC-1 solujen elävyyden jälkeen gemsitabiinihoidon. (E) edustaja kuva ja kaavio, jossa verrataan kasvaimen esiintymistiheys injektion jälkeen FACS-lajiteltu ALDH

kirkas tai ALDH

negatiivinen CFPAC-1-soluissa. Hiiret injektoitiin ilmoitettu määrä soluja (ALDH

Br, 5 x 10

5 [

n

= 5]; ALDH

Ng, 5 x 10

5 [

n

= 5] ja ALDH

Ng, 1 x 10

6 [

n

= 5]; ALDH

Br, 1 x 10

6 [ ,,,0],

n

= 10]) oikealla kylki ja havaittu 5 viikon ajan. 1×10

5ALDH

negatiivinen syöpäsolut eivät kehitä lainkaan kyhmy, vaikka havainto pidennettiin enintään 14 viikon ajan. ALDH

Br, ALDH-valoisa ja ALDH

Ng, ALDH-negatiivinen. * P 0,05 ja *** P 0,0005.

Toinen hyvin tunnettu ominaisuus CSCS on niiden vastustuskyky kemoterapiaa ja /tai sädehoitoon [3]. Näin ollen meidän arvioida herkkyys ALDH kirkas ja -negatiivinen syöpäsolujen tavanomaiseen syöpälääkettä, gemsitabiini. ALDH-kirkas syöpäsolut olivat erittäin resistenttejä gemsitabiinin verrattuna ALDH-negatiivinen syöpäsoluja, jotka vaativat merkittävästi suurempia pitoisuuksia tappamaan 50% soluista (puoli maksimaalinen estävä pitoisuus, IC

50) (kuvio 2D). Tämä tulos on sopusoinnussa kyseisten ihmisten tietojen ALDH vahvasti positiivinen syöpäsolut rikastettiin tavanomaisilla kemoterapiaa /CCRT (kuvio 1 C).

Seuraavaksi injektoidaan subkutaanisesti 5 x 10

5, FACS-lajiteltu CFPAC-1 ADLH kirkas ja -negatiivinen syöpäsolujen osaksi paljaiden hiirien kylkiin, vastaavasti. ALDH kirkas ksenosiirrettyjä solut alkoivat muodostua kyhmy 1 viikon kuluttua injektion, ja 5 viikkoa 60% hiiristä oli onnistuneesti muodostaneet kyhmy (kuvio 2E). Kuitenkin sama määrä ALDH-negatiivisten syöpäsolujen epäonnistui tuottamaan mitä tahansa kyhmy, vaikka havainto pidennettiin enintään 14 viikon ajan. ALDH-negatiivinen syöpiä voi osoittaa kasvaimen kyhmyjä vain silloin, kun injektion solujen lukumäärä nostettiin 1 x 10

6. On histologisen tutkimuksen perusteella ksenograftissa kyhmyt peräisin ALDH-kirkas syöpäsolujen näytteillä rakenteita eriasteista erilaistumisen, jotka vaihtelevat hyvin erilaistuneet solut, jotka onnistuneesti muodostettu järjestetty rauhaset kanssa lumenesta huonosti erilaistuneet solut, jotka tuskin muodostuu epäonnistuneen rauhas arkkitehtuureihin (kuva S2). Kasvain solut sijaitsevat huonosti eriytetty alueilla usein esillä melko epätyypillinen ja pleomorphic morfologia ja näytetään outo ytimet verrattuna peräisin hyvin erilaistunut alueilla. IHC for ALDH1A1 osoitti voimakkaammin positiivisten solujen kiinteä levy- kuin hyvin muodostuneita rauhaset (kuvio S2), joka näiden samojen ihmisten PDAC yksilöt (kuvio 1A-B).

Nämä tulokset osoittivat, että ALDH tasoa riittää määritellä alapopulaatio haimasyöpäsoluissa joka osoittaa huono erilaistuminen, uudelleensijoittamis kykyjä, vastustuskykyä gemsitabiinin, ja suurempi tuumorigeenisyyteen, jotka ovat yhteensopivia tyypillisiä CSCS.

ALDH-kirkas PDAC solut selektiivisesti ja tehokkaasti poistaa disulfiraami

koska me tunnistettu ALDH-kirkas syöpäsolujen erittäin gemsitabiini kestävä, me epäillään, että ALDH voimakkaasti positiiviset solut olivat vastuussa kemoterapian resistenssin. Selektiivisesti poistaa ALDH-kirkas soluja, käännyimme disulfiraami, joka on tunnettu palautumaton inhibiittori ALDH [19], ja tutki korrelaatio tason ALDH ilmaisun ja disulfiraami herkkyys kaikissa neljässä ihmisen PDAC solulinjoissa. Käsittelimme disulfiraami ja laskettiin IC

50-arvot perustuvat luelinkykymäärityksillä. Havaitsimme käänteinen korrelaatio ekspressoivien solujen prosenttiosuus ALDH ja IC

50-arvot disulfiraami (kuvio 3A ja kuvio S3).

(A) IC

50 disulfiraamin mukaan ALDH ilme. (B) Aldefluor määritys ALDH aktiivisuuden CFPAC-1-solut käsiteltiin disulfiraamin (top paneelit) tai käsitelty lyhytaikaisesti saavat disulfiraamia seurasi vieroitusoireista (alhaalla paneelit). (C) virtausytometrisiä määritys 7AAD

-AnnexinV

+ varhain apoptoottisia soluja jälkeen 12 tunnin hoidon disulfiraamin (10 uM). (D) edustaja Western blotit osoittavat ALDH1A1 proteiinin tasot CFPAC-1 kontrolloiduissa olosuhteissa, disulfiraamin käsiteltyjä soluja ja lyhytaikaisesti disulfiraamin käsiteltyjen solujen myöhempi peruuttaminen disulfiraamia. (E) RT-PCR ja qRT-PCR mittaukset ALDH1A1 mRNA: n ekspression kontrolli ja disulfiraami käsiteltyjä soluja. * P 0,05.

myrkyllisyys kemoterapia-aineiden normaali kudos on toinen tärkeä näkökohta aikana syöpähoidon. Siksi me simuloitu toksisuutta disulfiraamin mittaamalla niiden vaikutukset normaalin haiman epiteelisolulinja, hTERT-HPNE (kuvio S3). hTERT-HPNE solut juurikaan vaikuta suhteellisen korkeita pitoisuuksia disulfiraamia. Huomattavaa on, että IC

50 disulfiraamin varten hTERT-HPNE soluissa ylittäneet selvästi Mia PaCa-2 ja CFPAC-1-soluissa, mikä osoittaa, että riittävän laaja terapeuttinen ikkuna voidaan turvata. Toisin vaikutuksia disulfiraamin on MiaPaca-2 ja CFPAC-1-solut, IC

50-arvot disulfiraami varten PANC-1 ja AsPc-1 syöpäsolulinjoja olivat erittäin korkeita, ero, että me attribuutin alhaisesta of PANC-1 ja AsPc-1-solut, jotka ilmentävät ALDH.

Seuraavaksi tarkastellaan lähemmin vaikutuksia disulfiraamin on ALDH-kirkas syöpäsoluja, arvioimalla ALDH tasot virtaussytometrialla jäljellä elinkelpoisten CFPAC-1 syöpäsolujen käsittelyn jälkeen disulfiraamin (10 uM) 12 tunnin ( kuvio 3B). Nämä kokeet paljastivat, että disulfiraamin ei merkittävästi vaikuta ALDH-harvaan. Sen testaamiseksi, disulfiraami vaikutus säilyi, vaikka se on poistettu, se oli vetäytynyt median ja soluja viljeltiin sen jälkeen vielä 2 viikon ajan. Mielenkiintoista, kun disulfiraami oli peruutettu, solut eivät palauttaa alkuperäisen kasvaimen hierarkia ja näytteillä jatkuva siirtyminen vasemmalle puolelle virtaussytometrianalyysin jakeluun. Lisäksi, disulfiraami näytti indusoivan apoptoottista solukuolemaa CFPAC-1-soluissa, suhde kasvaa 7AAD-negatiivisia ja anneksiini V-positiivisia soluja, jotka ovat väestön läpi aikaisen apoptoosin (kuvio 3C ja kuvio S3). ALDH1A1 mRNA ja proteiini pysyivät jatkuvasti vähentynyt uusitun soluissa, mikä osoittaa, että ALDH ilmentyminen ei palautettu (kuva 3D-E). Yhdessä nämä tulokset korostavat mahdollisuuksia disulfiraamin selektiivisesti ja tehokkaasti kohdistaa ja poistaa CSCS, joka muuten olisi vastustuskykyisiä standardin syöpähoitoihin. Lisäksi teimme

in vitro

pesäkkeitä muodostavien määrityksessä käytetään disulfiraamin esikäsitellyt CFPAC-1-soluissa. Kuten odotettua, disulfiraamin esikäsitellyt solut muodostivat pesäkkeitä huomattavasti harvemmin kuin kontrollisolut teki (kuva S3).

anto suun disulfiraamin poistaa selektiivisesti ALDH korkea syöpäsolujen ja estää kasvaimen kasvua yhdessä pienen annoksen gemsitabiini

vaikutuksen testaamiseksi disulfiraamin

in vivo

, me injektoidaan subkutaanisesti hiirten CFPAC-1 syöpäsolujen ja jakoivat ksenotransplantaatio hiiriä disulfiraamin käsitelty ja maissiöljy käsiteltyä kontrolliryhmiin. Kasvaimen kasvu viivästyi merkittävästi antamalla disulfiraamin (kuvio 4A). IHC varten ALDH1A1 on ksenograftikasvaimissa paljasti, että taajuus ALDH1A1 voimakkaasti positiivinen syöpäsoluja oli merkittävästi vähennetty disulfiraamin käsittely (kuvio 4B). Laskimme syöpäsolujen 10 korkean tehon kentät (X400) edustajan dia ksenograftikasvaimissa valvonnan (n = 3) ja disulfiraami käsiteltiin (n = 3) ryhmää. ALDH1A1 proteiini tasot pieneni myös disulfiraamin käsiteltyjen kasvainten (kuvio 4C). Virtaus sytometrinen analyysi ALDH ilmentävien solujen erottaa kasvaimia paljasti siirto vasemmalle jakauman disulfiraamin-käsitellyillä hiirillä, mikä osoittaa, että ALDH-aktiivisuus tukahdutettu disulfiraami (kuvio 4D ja kuviossa S4). Suoritimme

in vivo

kasvainten muodostumiseen määrityksiä käyttäen disulfiraamin esikäsitellyt CFPAC-1-soluissa. Kuten odotettua, disulfiraamin esikäsitellyt solut oli taipumus tuottaa vähemmän kyhmyjä verrattuna vastaavaan kontrolliin soluja (kuvio S4, P 0,05).

(A) kasvuvauhti CFPAC-1 ksenografteissa mitattiin ja esitettiin prosentteina määrän muutos jälkeen käsittelemällä disulfiraamin (300 mg /m

2, PO, n = 4). (B) histologisen analysointia ja vertaamalla taajuuden ALDH1A1 vahvasti positiivisten solujen kontrolli ja disulfiraamin käsiteltiin CFPAC-1 ksenosiirrettyjä hiirillä. Kuvaaja osoittaa määrällisesti ALDH1A1 vahvasti positiivinen soluja X400 suurennus hallinnassa ja disulfiraamin käsiteltyjen ryhmien. (C) edustaja Western blot, joka osoittaa ALDH1A1 proteiinin ilmentymistä hallinnassa ja disulfiraamin käsitelty kasvaimia. (D) Aldefluor määritys ALDH aktiivisuuden dissosioituneissa syöpäsolujen noudetaan ohjaus ja disulfiraamin käsiteltiin CFPAC-1 -ksenografteja. (E) Kasvuvauhti CFPAC-1 ksenografteissa mitattiin ja esitettiin prosentuaalinen muutos tilavuuden jälkeen hiirten käsittely kantajaa (kontrolli), disulfiraami (300 mg /m

2, PO), pieniannoksisen gemsitabiini (40 mg /m

2, IP), korkea-annos gemsitabiinia (400 mg /m

2, IP), tai disulfiramand pieniannoksisen gemsitabiinia yhdessä (n ≥ 3). * P 0,05, ** P 0,005, ja *** P 0,0005.

Lisäksi selvitimme, että mahdolliset hyödyt yhdistetyn disulfiraamin ja Gemsitabiinihoidon. Useat aiemmat kliiniset kokeet ovat antaneet yhdistelmähoidot perustuu pienen annoksen gemsitabiini protokollia välttää Vaikea toksisuus [29,39-41]. Samoin suunnittelimme protokolla, joka antoi pienen annoksen gemsitabiini [29] yhdessä suun kautta disulfiraamin. On rohkaisevaa, yhdistelmä pienen annoksen gemsitabiini ja disulfiraami tehokkaasti esti tuumorin kasvua siinä määrin verrattavissa 10 kertaa suurempi annos gemsitabiinia (kuvio 4E). Tämän vuoksi päättelemme, että disulfiraamin paitsi voisi saavuttaa lisäaineiden /synergistisiä syöpää ehkäisevistä vaikutuksista yhdistelmähoidon aikana meidän

in vivo

PDAC malleja, mutta sallisi lisäksi merkittävä väheneminen tarvittava annos sytostaattien.

keskustelu

hoito PDAC on erittäin haastavaa, koska tämä kasvain on usein tulenkestävä perinteisiin syöpähoitoihin. Useimmat potilailla esiintyy leikkaushoitoon kasvain kun alun perin diagnosoitu; siksi, intensiivinen neo-adjuvanttia ja /tai leikkauksen jälkeinen kemoterapia /CCRT on tarkoitettu useimpien potilaiden lievittävä tarkoitukseen. Nykyisessä tutkimuksessa olemme kuvattu skenaario, jolla PDAC tulee hankala ja syöpähoitoihin näkökulmasta CSCS.